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Publication number: DEL0018593MA
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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 17. April 1954 Bekanntgemacht am: 8. September 1955Registration date: April 17, 1954. Advertised on: September 8, 1955

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung antigenreicher Impfstoffe.The invention relates to a method for producing antigen-rich vaccines.

Es ist bekannt, daß Impfungen eine spezifische Immunisierung im menschlichen und tierischen Organismus gegenüber gewissen Krankheitserregern verursachen können. Diese Immunisierung rührt von Antigenen her, die fähig sind, aktive Antikörper zu bilden. Antigene, denen man im allgemeinen eiweißartigen Charakter zuschreibt, haben die Eigenschaft, sich mit den entsprechenden Antikörpern nach einem unbekannten Mechanismus zu verbinden, wobei sie einen immunisierenden Komplex bilden.It is known that vaccinations are a specific immunization in human and animal Organism against certain pathogens. This immunization is stirring from antigens capable of producing active antibodies. Antigens that one generally faces Ascribing protein-like character, have the property of interacting with the corresponding antibodies according to an unknown mechanism to connect, forming an immunizing complex form.

Es ist von größter Bedeutung, bei der Herstellung der Impfstoffe die Denaturierung der Antigene zu vermeiden, da diese für die Bildung des immunisierenden Komplexes unerläßlich sind.It is of the utmost importance in the manufacture of the vaccines the denaturation of the antigens to be avoided as these are essential for the formation of the immunizing complex.

Bisher stellte man Impfstoffe aus abgeschwächten Lebendkulturen der Krankheitserreger her. Man beschränkte sich auf eine Abschwächung durch andauernde Nährbödenpassagen oder durch Wirtswechsel, wobei durch .die Anwendung vonUp to now, vaccines have been produced from attenuated live cultures of the pathogens. One limited oneself to a weakening through continuous nutrient medium passages or through Change of host, whereby by .the application of

509 551/79509 551/79

L 18593 IVa 130 hL 18593 IVa 130 h

Chemikalien zur Abtötung der Bakterien, gleichzeitig die Antigene denaturiert wurden.Chemicals to kill the bacteria, at the same time the antigens have been denatured.

Alle bisher bekannten l'ilzwirkstofte schädigten niclil nur clic Hakterienzelle, sondern auch das Antigen, das ein Bestandteil der Baktericnzelle ist und dem sicherlich eine ganz bestimmte chemische Struktur zukommt.All the active ingredients known to date did not damage only the bacterial cell, but also the antigen, which is a component of the bacterial cell and which certainly has a very specific chemical structure comes to.

ICs wurde nun gefunden, daß unter allen PiIzwirksloffen das Patulin und seine Derivate eine ίο ganz besondere Stellung einnehmen. Diese besitzen nämlich die Eigenschaft, die Bakterienzelle zu töten, ohne das Antigen zu denaturieren. Hierauf beruht die vorliegende Erfindung.ICs have now been found that among all PiIzwirkslopen the patulin and its derivatives ίο occupy a very special position. Own this namely the property of killing the bacterial cell without denaturing the antigen. On that the present invention is based.

Ks ist zwar bekannt, daß das Patulin eine abtötende Wirkung gegenüber einzelnen Bakterienarien hat. Seine Eigenschaft, trotz der bakterienabtötenden Wirkung die Antigene zu erhalten, war jedoch bisher unbekannt. Diese hervorragende Eigenschaft haben (lit- anderen bekannten Pilzwirkstoffe, wie Streptomycin, Aureomycin u. a. aber nicht, obwohl sie gegenüber Brucellen und anderen palhogeneu Keimen ebenfalls abtötende Wirkung Wirkung besitzen.It is known that patulin has a killing effect on individual bacteria has. Its ability to preserve the antigens despite the bactericidal effect was but so far unknown. This excellent property has (lit- other known mushroom active ingredients, such as streptomycin, aureomycin and others. but not, although they are towards Brucellen and others palhogeneu germs also have a killing effect.

Die Eifmdnng bezweckt die Herstellung von Impfstoffen, wobei man von der überraschenden Eigenschaft des Palulius und seiner Derivate üakterienkeimc abzutöten, ohne die Antigene zu verändern oder zu denaturieren Gebrauch macht.The purpose of the application is the production of Vaccines, mentioning the surprising property of Palulius and its derivatives to kill bacterial germs without changing or denaturing the antigens Use power.

Die Erfindung betrifft demnach ein Verfahren zur I lerstclliiug antigenreicher Impfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß man von pathogenen Keimen durch Ausleseverfahren eine Mutante gewinnt, die einen hohen Anligengehalt besitzt, und die man durch Anwendung von Patulin oder eines seiner Derivate abtötet, ohne dabei das Antigen zu denaturieren. The invention accordingly relates to a method for the preparation of antigen-rich vaccines, thereby characterized in that one wins a mutant from pathogenic germs by selection process, the has a high content of Anligen, and can be obtained by using patulin or one of its Kills derivatives without denaturing the antigen.

Nach einer Ausführungsforni der Erfindung wird in eine 10" bis 10¹- pro ecm gegenüber Patulin oder einem seiner Derivate empfindliche Bakterienkeime enthaltende Suspension eine solche Menge dieses Antibiotikums eingetragen, so dat.! die Bakterienkeime vernichtet werden. I Herbei muß ein Überschuß des l'atulins oder eines seiner Derivate im Verhältnis zu der benötigten Menge vermieden werden, damit die Abtötung der Bakterien vollständig ist.According to one embodiment of the invention, ^{such an amount of this antibiotic is introduced into a suspension containing 10 "to 10 1} per ecm of bacterial germs sensitive to patulin or one of its derivatives that the bacterial germs are destroyed. atulins or one of its derivatives should be avoided in relation to the amount required so that the killing of the bacteria is complete.

Das l'attilin hat eine abtötende Wirkung gegenüber verschiedenen Bakterienarten, ■/.. B. Brucella abortus, Typhusbaktcrien, Tuberkelbakterien ti. a. Die verschiedenen Bakterienarten sind aber wieder in verschiedene Stämme aufgeteilt, z. B. beim Brucella abortus die S-Stämme und R-Stämme. Selbstverständlich ist die Konzentration an Patulin, die notwendig ist, um eine ablötende Wirkung auf die einzelnen Bakterienarten auszuüben, verschieden. Diese Konzentration an Patulin kann mir festgestellt werden, wenn man eine Vorprüfung der Empfindlichkeit des Bakterienstammes gegenüber Patiifio lin macht.The l'attilin has a killing effect on various types of bacteria, ■ / .. B. Brucella abortus, typhus bacteria, tubercle bacteria ti. a. However, the different types of bacteria are again divided into different strains, e.g. B. in Brucella abortus the S-strains and R-strains. Of course, the concentration of patulin that is necessary to have a desoldering effect on the individual types of bacteria is different. This concentration of patulin can be determined by doing a preliminary test of the sensitivity of the bacterial strain to patulin.

Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele mitgeteilt, die jedoch den Umfang der Erfindung nichl einschränken sollen.Some exemplary embodiments are given below, which, however, encompass the scope of the invention nichl should not restrict.

Beispiel ι
Herstellung eines Antibrucella-ImpfstoffcsExample ι
Manufacture of an antibrucella vaccine

Man stellt einen Stamm Ma₀, eine Abart des Stammes S (smooth) der Brucella abortus nach einem bekannten Verfahren in einer Bouillon dar. Wenn die maximale Entwicklung erreicht ist, werden die Bakterien aus ihren Kulturen durch Zentrifugieren entfernt. Das durch Zentrifugieren erhaltene Produkt wird darauf mittels eines Tampons und einer Flüssigkeit λόιι einem p₍|-Wert von 6,5 abgewaschen, um die Bakterien der Nährflüssigkeit zu entfernen, die zu ihrem Wachstum gedient hat. Die auf diese Weise von der Nährflüssigkeit befreite untere Schicht des Zentrifugierungsprocluktcs wird in einem sterilen Mittel suspendiert, so daß die Bakterienkonzentration io^<J bia 10¹² Keime pro ecm beträgt. Man gibt hierauf Patulin in genügender Menge hinzu, um die Abtötung der Bakterien zu vervollständigen, wobei jedoch ein Überschuß vermieden wird. Die Patulin enthaltende Bakteriensiispension wird hierauf in einen Eisschrank während 8 Wochen bis zum Erhalt eines Autolysats gestellt.A Ma ₀ strain, a variant of the S (smooth) strain of Brucella abortus, is prepared in a broth according to a known method. When the maximum development is reached, the bacteria are removed from their cultures by centrifugation. The product obtained by centrifugation is then washed off by means of a tampon and a liquid λόιι a p ₍ | value of 6.5 in order to remove the bacteria of the nutrient fluid that served for their growth. The lower one freed from the nutrient fluid in this way The layer of the centrifugation product is suspended in a sterile agent so that the bacterial ^{concentration is 10 <J} bia 10 ¹² germs per cm. Patulin is then added in sufficient quantity to complete the killing of the bacteria, but avoiding an excess Bacterial suspension containing patulin is then placed in a refrigerator for 8 weeks until an autolysate is obtained.

Nach dieser Zeit wird eine Probe entnommen, um festzustellen, ob alle Bakterien abgetötet sind und die Autolyse vollständig ist. Zu diesem Zweck kann man z. B. eine Probe des Autolysats auf eine für das Wachstum der Brucella abortus geeignete Nährlösung übertragen. Falls das Abtöten der Keime und die Autolyse vollständig sind, ist das Ergebnis der Kultur negativ.After this time, a sample is taken to determine whether all bacteria have been killed and the autolysis is complete. For this purpose you can z. B. a sample of the autolysate on a Transfer suitable nutrient solution for the growth of Brucella abortus. If killing the Germs and the autolysis are complete, the result of the culture is negative.

Man gibt dem Autolysat 0,5 bis 1 % Aluminiumhydroxyd hinzu, das nach dem Verfahren von M.yrbäch und Bar man η (Handbuch der Enzymforschung) hergestellt wurde. Hierauf wird das mit dem Aluminiumhydroxyd versetzte Autolysat während 24 Stunden geschüttelt, um die Adsorption des Antigens-an dem Hydrat zu bewirken.The autolysate is given from 0.5 to 1% aluminum hydroxide added, according to the method of M.yrbäch and Bar man η (Handbook of Enzyme Research) was produced. Then the autolysate mixed with the aluminum hydroxide is during Shaken for 24 hours to cause the antigen to adsorb onto the hydrate.

Zur Feststellung, ob alles Antigen an dem Ahl·- miniumhydroxyd adsorbiert ist, wird eine Fraktion der nach dem Schütteln erhaltenen Suspension entfernt. Diese Fraktion wird zentrifugiert und das Filtrat Mäusen injiziert, denen man eine letale Dosis Brucella abortus hierauf einimpft. Falls die Mäuse diese Behandlung überstehen, hat man den Beweis, daß das betreffende Filtrat noch Antigene enthielt und daher die Adsorption der Antigene an dem Aluminiumhydroxyd unvollständig war. Wenn dagegen die Mäuse sterben, kann man annehmen, daß die Antigene im wesentlichen vollständig absorbiert waren.To determine whether all of the antigen on the Ahl - Miniumhydroxyd is adsorbed, a fraction of the suspension obtained after shaking is removed. This fraction is centrifuged and the filtrate is injected into mice which have been given a lethal Dose of Brucella abortus then inoculated. If the mice survive this treatment, you have that Proof that the filtrate in question still contained antigens and therefore the adsorption of the antigens the aluminum hydroxide was incomplete. If, on the other hand, the mice die, one can assume that the antigens were essentially completely absorbed.

In diesem Fall erhält man einen Impfstoff, der bei der Verwendung bei Tieren diesen eine langdauernde Immunität gegenüber der Infektion durch Brucella abortus verleiht. Die Herstellung der Impfstoffe muß selbstverständlich ohne die Einwirkung von Fremdkeimen erfolgen.In this case a vaccine is obtained which, when used in animals, gives them long-term immunity to infection Brucella abortus confers. The manufacture of the vaccines must of course be carried out without the action from foreign germs.

Example 2

Herstellung eines Antibrucella-Impfstoffcs
Man verfährt wie in Beispiel 1, nur wird an Stelle von Patulin das Thiosemicarbazon des Patulins verwendet.Manufacture of an antibrucella vaccine
The procedure is as in Example 1, except that the thiosemicarbazone of patulin is used instead of patulin.

509 551/79509 551/79

L 18593 IVa/30 hL 18593 IVa / 30 h

B e i s ρ i e 1 3
Herstellung eines Antityphus-ImpfstoffesB is ρ ie 1 3
Manufacture of an antityph vaccine

Man verfährt wie im Beispiel ι oder 2, wobei man von einem Typhusbazillenstamm von bekannter antigenischer Eigenschaft ausgeht.The procedure is as in Example ι or 2, using a typhus bacilli strain of known antigenic property.

Beispiel 4
Vergleichsversuche mit verschiedenen ImpfstoffenExample 4
Comparative experiments with different vaccines

Bei den Versuchen werden folgende Produkte verwendet:The following products are used in the tests:

a) Impfstoff, der nach Beispiel 1 erhalten wurde,a) vaccine obtained according to example 1,

b) Impfstoff Buck 19,b) vaccine Buck 19,

c) Pseudo-Impfstoff, der nach Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Streptomycin an Stelle von Patulin erhalten wurde.c) Pseudo vaccine according to Example 1, however using streptomycin in place of patulin.

Zwei Dosen von je 1 ecm der obigen Produkte a) und c) werden mit einem Zwischenraum von einigen Tagen jungen Rindern injiziert, die keine Brucellose haben. Nach bekanntem Verfahren werden 5 ecm Impfstoff Buck 19 (b) jungen Rindern injiziert, die frei von Brucellose sind. Nach einigen Wochen wird Serum von den 3 Gruppen der geimpften Tiere entfernt. Mäuse werden hierauf mit 2Xo,iccm Serum mit einem Zwischenraum von 10 Tagen geimpft. Nach der Impfung mit dem Serum erhalten die Mäuse eine letale Dosis Bruceila abortus.Two doses of 1 ecm each of the above products a) and c) young cattle not showing brucellosis are injected with an interval of a few days to have. According to a known procedure, 5 ecm vaccine Buck 19 (b) are injected into young cattle, that are free from brucellosis. After a few weeks, serum from the 3 groups of vaccinated Animals away. Mice are then given 2Xo Vaccinated for 10 days. After vaccination with the serum, the mice are given a lethal dose of Bruceila abortus.

ProdukteProducts

Durchschnittsprozentsatz Average percentage

der überlebenden Mäuseof the surviving mice

Impfstoff gemäß Erfindung Vaccine according to the invention

Impfstoff Buck 19 Vaccine Buck 19

Pseudo-Impfstoff (mittels Streptomycin)Pseudo vaccine (using streptomycin)

± 98 % ±30%± 98% ± 30%

Claims

PATENT CLAIMS:

1. A process for the preparation of antigen-rich vaccines, characterized in that one a mutant with a high antigen content wins from pathogenic germs by selection process and which can be killed by using patulin or one of its derivatives, without denaturing the antigen.

2. The method according to claim i, characterized in that one enters ^{such an amount of this antibiotic into a suspension containing io 9} to io ¹² per ecm against patulin or one of its derivatives sensitive bacterial germs that the bacterial germs are killed.

Referred publications:
Chem. Zentralblatt, 1950, II., 63.