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Publication number: DEK0016850MA
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 24. Januar 1953 Bekanntgemacht am 12, Januar 1956Filing date: January 24, 1953 Advertised on January 12, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

PATENTANMELDUNGPATENT APPLICATION

KLASSE 30h GRUPPE 2soCLASS 30h GROUP 2so

K 16850 IVa 130 hK 16850 IVa 130 h

Die Erfinder haben beantragt, nicht genannt zu werdenThe inventors have requested not to be named

Charles B. Knox Gelatine Co., Inc., Carnden, N.J. (V. St. A.)Charles B. Knox Gelatin Co., Inc., Carnden, N.J. (V. St. A.)

Vertreter: Dipl.-Ing. A.Bohr, Dipl.-Ing. H.Bohr, München 5, und Dr.-Ing. H. Fincke, Berlin-Lichterfelde West, PatentanwälteRepresentative: Dipl.-Ing. A. Bohr, Dipl.-Ing. H.Bohr, Munich 5, and Dr.-Ing. H. Fincke, Berlin-Lichterfelde West, patent attorneys

Verfahren zur Herstellung von als Blutplasmastreckmittel dienenden serologisch verträglichen ProteinderivatenProcess for the preparation of blood plasma diluents serologically compatible protein derivatives

Die Priorität der Anmeldungen in den V. St. v. Amerika vom 24. Januar und 3. April 1Θ52The priority of registrations in the V. St. v. America January 24th and April 3rd 1,52

ist in Anspruch genommenis used

Die Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von Derivaten vom menschlich serologisch verträglichen Proteinen,, insbesondere Gelatine und menschlichen Blutproteimen, wie Serumalbumin, Globulin und Globin, um sie als Blutplasmaersa.tz oder zur Vergrößerung des Blutplasmavolumeiis geeigneter zu machen.The invention relates to manufacture and cleaning of derivatives of human serologically acceptable proteins, especially gelatin and human blood proteins, such as serum albumin, globulin and globin, to be used as blood plasma remedies or to increase blood plasma volume to make more suitable.

Bekanntlich eignem sich Gelatinelosungen, wennIt is well known that gelatin solutions are suitable if

sie richtig hergestellt, steril, pyrogen- und antigenfrei gemacht und so behandelt sind, daß sie eine verhältnismäßig hohe¹ mittlere Molekulargröße und einen geregelten osmotischen Druck besitzen, zur paren.teralen Verabfolgung, um das umlaufende Blutvolumen bei der experimentellen und klinischen Behandlung, von Schocken zu regulieren.they are properly manufactured, sterile, made pyrogen-free and antigen-free and treated so that they have a relatively high ¹ mean molecular size and a controlled osmotic pressure, for paren.teral administration, to the circulating blood volume in the experimental and clinical treatment of shock to regulate.

Versuche, die Eignung vom Gelatine als Blutplasmaersatz oder -streckmittel zu verbessern, wurden in zwei Richtungen unternommen:Attempts to improve the suitability of gelatin as a blood plasma substitute or diluent have been made undertaken in two directions:

i. Abbau des Gelatinemoleküls in Lösung entweder durch Wärme oder durch chemische oder enzymatische Hydrolyse bis zu einer bestimmten Stufe derart, daß eine 3- bis 6°/oige Lösung bei 21 °i. Degradation of the gelatin molecule in solution either by heat or by chemical or enzymatic hydrolysis up to a certain level Stage such that a 3 to 6% solution at 21 °

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kein Gel mehr bildet. Die hierdurch erzielte Verringerung der mittleren Molekulargröße der Gelatine ist aber von einer sehr beträchtlichen. Verringerung der Retentionsperiode bei Injektion in ein intaktes Blutsjstem begleitet. .no longer forms gel. The resultant reduction in the mean molecular size of the gelatin but is of a very considerable one. reduction the retention period when injected into an intact blood system. .

2. Die Kupplung von Gelatinemolekülen zu größeren Komplexen durch chemische Behandlung mit Glyoxal und anschließende Oxydation mit Wasserstofifperoxyd zur Erhöhung der Anzahl der2. The coupling of gelatin molecules too larger complexes by chemical treatment with glyoxal and subsequent oxidation with Hydrogen peroxide to increase the number of

ίο ionisierbaren Gruppen bei einem p_H-Wert von 7,3 hatte gewissen Erfolg. Diese Reaktion läßt sich aber schwer regeln und führt zu einem Präparat, das .wahrscheinlich bezüglich der Molekülgröße ungleichmäß iger zusammengesetzt ist als unbehandelteίο ionizable groups at a _pH value of 7.3 had some success. However, this reaction is difficult to regulate and leads to a preparation which, with regard to the molecular size, is probably more unevenly composed than untreated

Gelatine. . . -Gelatin. . . -

Die Erfindung schlägt nun ein Verfahren zur Herstellung stabiler 'Derivate¹ von menschlich serologisch verträglichen Proteinen aus Gelatine, Serumalbumin, Globulin oder Globin vor, die verbesserte Eigenschaften in ihrer Verwendung als Blutplasmaersatz oder Blut streck mittel besitzen. Nach diesem Verfahren wird das Verhältnis von freien Amino- zu freien Carboxylgruppen verändert, so daß Derivate entstehen, deren isoelektrischer Punkt niedriger liegt als der des Ausgangsproteins, wodurch die kolloide osmotisch© Funktion derartiger Stoffe, bei der Verwendung als Blutplasmaersatzstoffe verbessert wird.The invention now proposes a process for the production of stable 'derivatives ¹ of human serologically acceptable proteins from gelatin, serum albumin, globulin or globin, which have improved properties in their use as blood plasma substitutes or blood stretch agents. According to this process, the ratio of free amino to free carboxyl groups is changed so that derivatives are formed whose isoelectric point is lower than that of the starting protein, which improves the colloidal osmotic function of such substances when used as blood plasma substitutes.

Weiter umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Fraktionieren und Reinigen ausgewählter Fraktionen oder Produkte, die durch Umsetzung menschlich serologisch verträglicher Proteine mit Polycarbonsäureanhydriden. oder -Chloriden entstehen. The invention further comprises a method for fractionating and purifying selected fractions or products, which by reacting human serologically compatible proteins with Polycarboxylic anhydrides. or chlorides arise.

Es wurde nämlich gefunden, daß Anhydride und Chloride gewisser Polycarbonsäuren, insbesondere Berns tei ns au reanhy dri d, C i tr aeon s äureanhy d r i d, 11 aco η sau reanhy d rid, Aconi ts.äur eanhy d r id, M alei η säureanhydrid, Bernsteins au rechl or id und Fumarsäurechlorid, mit Gelatine und Blutproteinen zu stabilen Derivaten umgesetzt werden können (die auch als Additioneprodukte oder Anlagerungsverbindungen bezeichnet werden können) und die durch Ausnutzung ihrer isoelektrischen Eigem-It has been found that anhydrides and chlorides of certain polycarboxylic acids, in particular Berns tei ns au reanhy dri d, C i tr aeon säureanhy d r i d, 11 aco η acid anhydride, aconite acid anhydride, M alei η acid anhydride, Amber au rechl or id and fumaric acid chloride, can be converted into stable derivatives with gelatine and blood proteins (the can also be referred to as addition products or addition compounds) and the by utilizing their isoelectric properties

,45 schäften von unerwünschten Reaktionsprodukten - abigetrennt werden können. Physiologisch scheint kein Unterschied zwischen den Derivaten der Anhydride und denen der Chloride zu bestehen., 45 stocks of undesirable reaction products - can be separated. Physiologically, there seems to be no difference between the derivatives of the Anhydrides and those of chlorides.

Es wurde weiterhin gefunden, daß man, wenn man mit Gelatine als serologisch verträglichem Material arbeitet, durch entsprechende Auswahl erreichen kann, daß das Material aus Gelatinemole-. külen besteht, die innerhalb eines bestimmten engen mittleren Molekulargrößeihereiches fallen,, so daß man durch Umsetzung mit Polycarbonsäuren anhydriden oder -Chloriden Gelatinederivate erhält, die fraktioniert werden können und in einer wirk-, samen oncotiischen Konzentration jeden gewünschten Flüssigkeitsgrad besitzen.'It has also been found that if you use gelatin as being serologically acceptable Material works, by appropriate selection can achieve that the material from Gelatinemole-. kulen, which fall within a certain narrow mean molecular size range, so that anhydrides or chlorides of gelatin derivatives are obtained by reaction with polycarboxylic acids, which can be fractionated and any desired in an effective, oncotic concentration Have fluidity. '

Geht man von Gelatine eines mittleren Moleku-. largrößenbereichs von etwa 15 000 bis 36 000 aus, so entstehen Additionsprodukte, die durch geeignete Fraktionier- und Reinigungsbehandlung von den anderen Reaktionsprodukten abgetrennt und in Form eines pyrogen- und antigenfreien nicht toxisehen Materials gewonnen werden können, das als Blutplasmastreickmittel geeignet ist.
. Es wurde weiterhin gefunden, daß die bisher beschriebenen Gelatinederivate von Carbonsäureanhydriden oder -Chloriden, wie Bernsteinsäureanhydrid, wechselnde Zusammensetzung und toxische Eigenschaften besitzen, wie durch chemische Analyse, das 'physikalisch-chemische Verhalten und physiologische Reaktionen festgestellt wurde. Diese Produkte enthalten nämlich physiologisoh toxische Stoffe, welche aus ihnen nicht ohne Anwendung der hier beschriebenen isoelektrischen Fälliungs- und Fraktionierungsbehandlungen entfernt werden können.Assuming gelatin of a medium molecule. Large size range from about 15,000 to 36,000, addition products are formed which can be separated from the other reaction products by suitable fractionation and purification treatment and obtained in the form of a pyrogen-free and antigen-free, non-toxic material that is suitable as a blood plasma stripper.
. It has also been found that the gelatin derivatives of carboxylic acid anhydrides or chlorides, such as succinic anhydride, described so far have varying composition and toxic properties, as has been determined by chemical analysis, the physico-chemical behavior and physiological reactions. This is because these products contain physiologically toxic substances which cannot be removed from them without using the isoelectric precipitation and fractionation treatments described here.

Im folgenden ist eine allgemeine Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung des primären GelatineiadditionspiOduktes nach', der Erfindung (Fraktion I) geigeben, das neue Anwendungsmögliehkeiten hat und sich von den bisher beschriebenen Gelatinederivaten wesentlich unterscheidet. .The following is a general description of the process for making the primary Gelatine addition products according to the invention (Fraction I), which has new application possibilities and differs from those previously described Gelatin derivatives differ significantly. .

Die Reaktion zwischen Gelatine eines bestimmten Molekulargrößenbereichs und einem der genannten Anhydride oder Chloride kann innerhalb eines pH-Bereichs von 6 bis 12 und eines Temperaturbereichs von 20 bis 40⁰ durchgeführt werden. Man kann auf diese Weise eine .große Anzahl Gelatinederivate erhalten, die von der jeweiligen Molekulargewichtsfraktion der Gelatine und dem Umsetzungs-■grad der Gelatine mit dem sauren Radikal abhängen. Aus den Rohprodukten lassen sich die isoelektrisehen Produkte durch Einstellen des p_H innerhalb eines Bereichs von 2,5 bis 3,5 herausfraktionieren. Bei dem isoelektrischen Punkt des jeweiligen Säureanhydrid- oder OhI or id derivate scheidet sich das entsprechende Produkt als nicht mischbarer Sirup von hoher Dichte in Form einer scharf abgegrenzten ölartigen Schicht am Boden des Gefäßes ab. Dieses Material wird sorgfältig durch Dekantieren, Zentrifugieren oder im Scheidetrichter von den niedrigmolekularen Additionsprodukten und unvollständig umgesetzten Fraktionen der Gelatine sowie von den Niahtgelatinestoffen, die gewöhnlich in der handelsüblichen Gelatine enthalten sind, und von den sauren Nebenprodukten der Reaktion getrennt. Der iisoelektrische Punkt des Additionsprodukts hängt von dem jeweils verwendeten Säureanhydrid oder -chlorid ab.The reaction between gelatin of a certain molecular size range and one of the anhydrides or chlorides mentioned can be carried out within a pH range from 6 to 12 and a temperature range from 20 to 40 ⁰ . In this way, a large number of gelatin derivatives can be obtained, which depend on the particular molecular weight fraction of the gelatin and the degree of conversion of the gelatin with the acidic radical. From the crude products, the products can isoelektrisehen herausfraktionieren to 3.5 p _H is within a range of 2.5 by adjusting. At the isoelectric point of the respective acid anhydride or OhI or id derivative, the corresponding product is deposited as an immiscible syrup of high density in the form of a sharply defined oil-like layer at the bottom of the vessel. This material is carefully separated by decanting, centrifuging or in a separating funnel from the low molecular weight addition products and incompletely converted fractions of the gelatine as well as from the non-toxic gelatine substances which are usually contained in the commercially available gelatine and from the acidic by-products of the reaction. The isoelectric point of the addition product depends on the particular acid anhydride or chloride used.

Diese Fraktion (— Fraktion Γ —) kann weiter giereinigt werden, indem man¹ sie in destilliertem Wasser'bei einem mittels Natriiumhydroxyd eingestellten p_H von 5 bis 8, vorzugsweise von 4 bis 6 wieder auflöst und dann wieder ausfällt, indem man die Lösung auf den isoelektri sahen Punkt mit Salzsäure ansäuert und gegebenenfalls Kochsalz zusetzt. Die Reinigungsbehandlung kann erf orderliehenfalls wiederholt werden und ist zur. Abscheidung niedTigniolekularer Additioinsprodukte, unvollständig umgesetzter Produkte und saurer Nebenprodukte von Bedeutung, die bei intravenöser Anwendung anormale pharmakologische und bzw. oder toxische Wirkungen hervorbringen können. ¹An dieThis fraction (- fraction Γ -) can be further yaw agrees by a set ^1, it means Natriiumhydroxyd p _H 5-8, preferably 4-6 dissolves in distilled Wasser'bei again and then stops by the solution to the isoelectrically seen point is acidified with hydrochloric acid and, if necessary, table salt is added. The cleaning treatment can be repeated if necessary and is essential. Separation of low molecular weight additive products, incompletely converted products and acidic by-products of importance, which can produce abnormal pharmacological and / or toxic effects when administered intravenously. ¹ To the

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Wieder aus fäll ung bei dem isoelektrischen Punkt unter Zugabe von Kochsalz kann sich eine weitere Reinigungsbehandlung durch Dialyse gegen-Wasser durch halbdurchlässige Membranen, beispielsweise Celluloseacetatfilme, anschließen. Ein anderes Reinigungsverfahren für däiS' Additionsprodukt ist das Ausfällen von Methylalkohol, Äthylalkohol, Isopfopylalkohol oder Aceton beim isoelektrischen Punkt. Das mit Natriumchlorid ausgefällte MaterialAgain precipitation at the isoelectric point With the addition of table salt, a further cleaning treatment can be carried out by dialysis against water through semi-permeable membranes such as cellulose acetate films. Another cleaning method for the addition product this is Precipitation of methyl alcohol, ethyl alcohol, isopfopyl alcohol or acetone at the isoelectric point. The material precipitated with sodium chloride

ίο schließt etwas konzentrierte Kochsalzlösung ein, und diese kann als Ausgangsquelle für das Natriumchlorid dienen, welches zur Herstellung einer fertigen Salzlösung (mit 0,9 °/o Natriumcihloridgehalt) des Produkts erforderlich ist. Ein Überschuß an eingeschlossenem Kochsalz kann durch Dialyse oder anderweitig entfernt werden.ίο includes some concentrated saline, and this can serve as a starting source for the sodium chloride, which is used to produce a prepared saline solution (with 0.9% sodium chloride content) of the product is required. An excess of trapped saline can be removed by dialysis or otherwise.

Die SO' fraktionierten und gereinigten Derivate werden schließlich zu isotonischen Lösungen von dem ungefähren p_H des Blutes verarbeitet. Andererseits können sie auch getrocknet und später wieder zu entsprechend eingestellten Lösungen gelöst werden.The SO 'fractionated and purified derivatives are ultimately processed to isotonic solutions of the approximate p _H of the blood. On the other hand, they can also be dried and later dissolved again to form appropriately adjusted solutions.

Die nach der ersten isoeleikirischen Ausfällung in der überstehenden Lösung verbleibenden Nebenprodukte wurden einer weiteren Fraktionierung unterwOTfen, wobei zwei weitere Fraktionen von geringerem Molekulargewicht isoliert wurden, die jedoch andere Eigenschaften aufwiesen als die erste Fraktion.After the first Isoeliciric precipitation in By-products remaining in the supernatant solution were subjected to further fractionation subjugated, with two other fractions of lower molecular weight were isolated, but which had different properties than the first Fraction.

Die erfindungsgemäß. hergestellten Additionsprodukte haben höhere Molekulargewichte als die angewandte Gelatine. Außerdem sind ihre Moleküle symmetrischer und enthalten ionisierbare Carboxylgruppen, weswegen der isoelektrische Punkt dieser Derivate beträchtlich unter dem der Gelatine liegt. Zur Verwendung als Blutvolumenstreckmittel eignen sie sich deswegen besser, weil sie in dem Blutvaskularsystem sowohl bei normalem ails auch bei experimentell hervorgerufenem Schock besser zurückgehalten werden als nicht modifizierte Gelatine. Außerdem ist die Natur der ionisierbaren Gruppen in dem Additionsprodukt eine andere,^; so daß der wirksame osmotische Druck bei einem pjj von 7,3 wesentlich höher ist als der des Ausg.angsmateri.als.According to the invention. The addition products produced have higher molecular weights than the gelatin used. In addition, their molecules are more symmetrical and contain ionizable carboxyl groups, which is why the isoelectric point of these derivatives is considerably lower than that of gelatin. They are more suitable for use as blood volume extenders because they are better retained in the blood vascular system in the event of both normal and experimental shock than unmodified gelatin. In addition, the nature of the ionizable groups in the addition product is different ^; so that the effective osmotic pressure at a pjj of 7.3 is significantly higher than that of the output material.

Die folgenden Merkmale machen die erfindungsgemäßen, Additionsprodukte als Blutplasmas-treckmittel wertvoll:The following features make the invention, Addition products as blood plasma extenders valuable:

i. Die hohe Symmetrie des Moleküls erhöht die kapillare Retention.i. The high symmetry of the molecule increases that capillary retention.

2. Die Produkte sind nicht toxisch und deshalb brauchbare kolloidosmo.ti.sche Mittel.
. ,.3. Die vergrößerte molekulare Symmetrie der schweren isoelektri sehen Fraktion verringert die Neigung zur Gelbildung bed Gefrier temperatur en und bei einem p_H von etwa 7,3, wodurch ein günstiger Flüssigkeitsgrad erreicht und einer der Mängel überwunden, wird, der gewöhnlicher Gelatine als Plasmaersatz anhaftet, insbesondere bei Massenunfällen, wo die Schockbehandlung häufig im Freien durchgeführt werden muß.2. The products are non-toxic and therefore useful colloid osmotic agents.
. , .3. The increased molecular symmetry of the heavy isoelektri see fraction reduces the tendency to gel bed freezing temperature s and at a p _H of about 7.3, thus achieving a favorable fluidity and overcome one of the faults, is the ordinary gelatin adheres as plasma substitutes, in particular in mass accidents where shock treatment must often be carried out outdoors.

4. Die erhöhte Anzahl ionisierbarer Carboxylgruppen in den fraktionierten Additionsprodukten setzt den isoelektrischen Punkt herab, wodurch der wirksame osmotische Druck des Deriivats bei einem Ph von 7,3 erheblich vergrößert wird. '4. The increased number of ionizable carboxyl groups in the fractionated addition products lowers the isoelectric point, whereby the effective osmotic pressure of the derivative is increased considerably at a pH of 7.3. '

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht· darin, daß hier zum ersten Mal von dem isoelektrischen Eigenschaften der Reaktionsprodukte Gebrauch gemacht wird, um sie in Fraktionen verschiedener Molekulargrößenbereiche und von verschiedenem Reaktionsgrad mit den Proteinen zu zerlegen.An essential feature of the invention is · that here for the first time from the isoelectric Use is made of the properties of the reaction products to divide them into different fractions Molecular size ranges and of varying degrees of reaction with the proteins disassemble.

Obwohl es sich als vorteilhaft erwiesen hat, von Gelatine auszugehen, die auf ein mittleres Molekulargewicht von 15 000 bis 36 000 abgebaut ist, läßt sich das Verfahren auch auf nicht abgebaute Gelatine¹ oder Gelatine anderer Molekulargrößenbereiche anwenden. Wenn eine nicht abgebaute Gelatine oder eine Gelatine mit einem größeren Molekulargrößenbereich verwendet wird, entsteht eine halbheterogene Mischung von Derivaten. Infolgedessen wird eine geringere Ausbeute des ,gewünschten Additionsprodukts erzielt, und es bedarf dann einer größeren Anzahl von Reinigungsstufen zur Erzielung eines befriedigenden Pro- dukts. Bei Verwendung von Gelatine eines wesentlich verschiedenen Molekulargrößenbereichs kann eine entsprechend andere p_H-Eins'tellung erforderlich sein, um den Säuregehalt deir Reaktionsmischung auf den isoelektri sehen Punkt des jeweili- gen Addiitionsprodukts zu bringen.Although it has been found to be advantageous to start from gelatin which has been degraded to an average molecular weight of 15,000 to 36,000, the method can also be applied to undegraded gelatin ¹ or gelatin of other molecular size ranges. If an undegraded gelatin or a gelatin with a larger molecular size range is used, a semi-heterogeneous mixture of derivatives results. As a result, a lower yield of the desired addition product is achieved, and a larger number of purification stages is then required to achieve a satisfactory product. When using gelatin a significantly different molecular size range a correspondingly different p _H -Eins'tellung may be required to the acidity deir reaction mixture to the isoelektri see point to bring the respective gen Addiitionsprodukts.

Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung bezieht sich in erster Linie auf Gelatine, weil diese kein körpereigener .Stoff ist und daher besondere Probleme mit sich bringt, die bei den Blutproteinen nicht auftreten. Beim Arbeiten mit Blutproteinen beginnt das erfindungsgemäße¹ Verfahren natürlich mit der aus dem Blut isolierten Proteinfraktion, ohne daß ein Abbau dieses Proteins erfolgt. Im übrigen ist das Verfahren das gleiche, wie es für Gelatine beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die isoeleiktrischen Punkte: der verschiedenen¹ Derivate verschieden sind und diese Derivate sich bei ihren neuen i.soelektriseihen Punkten schärfer als unlösliche Produkte abscheiden..The description of the present invention relates primarily to gelatin because it is not an endogenous substance and therefore brings with it special problems that do not occur with blood proteins. When working with blood proteins ¹ method of the invention, of course, begins with the isolated from the blood protein fraction, without any degradation of this protein takes place. Otherwise, the procedure is the same as that described for gelatine, with the exception that the isoelectric points of the various ¹ derivatives are different and these derivatives are more sharply separated as insoluble products at their new i.soelectric points.

Semmalbumin eignet sich gut als Blutplasmaersatz oder -streckmittel, da es eine hohe kolloidosmotische Wirkung besitzt. Die Derivate nach der Erfindung besitzen jedoch niedrigere isoelektrische Punkte und demgemäß eine verhältnismäßig höhere kolloid osmotische Wirkung in dem physiologischen Bereich.Semmalbumin works well as a blood plasma substitute or diluent because of its high colloid osmosis Has an effect. However, the derivatives according to the invention have lower isoelectric Points and, accordingly, a relatively higher colloid osmotic effect in the physiological Area.

¹ Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der neuen Klasse von gereinigten menschlich serologisch verträglichen Proteinderivaten nach der Erfindung. ¹ The following examples illustrate the preparation of the new class of purified human serologically acceptable protein derivatives according to the invention.

. Beispiel 1. example 1

3000 ecm einer 6°/oigen Gelatinelösung (180 g) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 36000 (H₀ = o>30 bei 55°) wurden bei 36⁰ gehalten und durch Zusatz einer konzentrierten Natriumhydroxydlösung auf ein p^ von 9 eingestellt. 60 g.pulverisiertes Bernsteinsäureanhydrid Wurden der Gelatinelösung allmählich¹ unter Rühren zugesetzt. Mit fortschreitender Reaktion wurde das3000 ecm of a 6% gelatin solution (180 g) with an average molecular weight of about 36,000 (H ₀ = o> 30 at 55 °) were kept at 36 ⁰ and adjusted to a p ^ of 9 by adding a concentrated sodium hydroxide solution. 60 g of powdered succinic anhydride were gradually ^{added 1 to} the gelatin solution with stirring. As the reaction progressed, it became

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p_H durch weitere Zusätze konzentrierter Natriumhydroxydlösung auf 8,5 bis 10 gehalten. Nachdem die Zugabe des Bemsteinsäureanhydrids beendet war und keine weitere Änderung des pn mehr eintrat, wurde die Reaktion als beendet angesehen. Die Mischung wurde dann durch Zugabe von 132 ecm konzentrierter Salzsäure auf ein p_H von 2,7 eingestellt. Nach einer kurzen Absetz zeit schied sich am Boden des Gefäßes eine nicht mischbare sirupartige Fraktion hoher Dichte in Form einer klaren Schicht ab. Die überstehende Flüssigkeit enthielt niedrigmolekulare Stoffe und Reaktioms- _H p maintained by further additions of concentrated sodium hydroxide to 8.5 to 10 degrees. After the addition of succinic anhydride was complete and there was no further change in pn, the reaction was considered complete. The mixture was then adjusted by adding 132 cc of concentrated hydrochloric acid to a p _H of 2.7. After a short settling time, an immiscible, syrupy fraction of high density separated out in the form of a clear layer at the bottom of the vessel. The supernatant liquid contained low molecular weight substances and reactive

■ nebenprodukte: und wurde abgehebert, worauf die schwere Schicht vollkommen in einem Scheidetrichter abgeschieden wurde-. Diese'schwere Ölfraktion wurde in 2I destillierten Wassers bei einem p_H von 4,5 bis 5,0 gelöst; dann wurde das p_H auf 2,5 bis 3,0 eingestellt und das Produkt durch allmählichen Zusatz von 584 g festem Natriumchlorid ausgefällt, wobei «ine etwa, 30%ige NaCl-Lösung entstand. Der Niederschlag verteilte sich zunächst als Dispersion in der ganzen Lösung und bildete mit steigender Konzentration an Natriumchlorid ein flockiges Koagulat, das nach oben stieg. Während der Zugabe der letzten Koch sal zmenge muß darauf geachtet werden, daß das Salz nicht von dem Koagulat eingeschlossen wird. Die Kochsalz- und Reaktionsprodukte von niedrigerem Molekulargewicht enthaltende Lösung wurde von diem Koagulat abgetrennt, aus welchem die eingeschlossenen Tropfen der Kochsalzlösung soweit wie möglich entfernt wurden. Eine praktisch, vollkommene . Entfernung der Kochsalzlösung ist notwendig, um in dem Produkt zu einem Verhältnis von nicht mehr als 1 Teil Natriumchlorid auf 3,33 Teile des gereinigten Additionsprodukts zu gelangen und in dem endgültigen intravenös anwendbaren Präparat eine isatanische Natriumchloridkonzentration von 0,9%, bezogen auf ein 3°/oiges .Gelatine-Bernsteinsäureadditiioinspirodukt, zu erhalten. Das gereinigte Produkt wurde dann in sterilem, pyrogenfxeiem destilliertem Wasser unter Zusatz von konzentriertem Natriumhydroxyd aufgelöst, um eine Lösung mit einem p_H vom 7,0 zu erhalten. Diese wurde weiter bei einem p_H von 7,3 auf eine endgültige Konzentration von 3 °/o in isotoni schein Natriumchlorid eingestellt. Die Ausbeute an gereinigtem Gelatine - Bernsteiinsaureadditiionsprodukt betrug 105 g, was einer 58,3°/aigen Ausbeute, bezogen auf die Ausgangsmenge, der Gelatine, entspricht. Die Lösung wurde nitriert, in Soo-ccm-Flaschen eingefüllt und unter einem Dampfdruck von 1 at 20 Minuten lang sterilisiert, worauf sie sofort intravenös angewandt werden konnte. 'Das Produkt in einer 3%igen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung gelierte bei etwa io°.■ by-products: and was siphoned off, whereupon the heavy layer was completely separated in a separating funnel. Diese'schwere oil fraction was dissolved in 2 l of distilled water at a p _H of 4.5 to 5.0; then the p _H was adjusted to 2.5 to 3.0 and the product is precipitated by gradual addition of 584 g of solid sodium chloride, wherein "about ine, 30% NaCl solution. The precipitate was initially distributed as a dispersion throughout the solution and, as the concentration of sodium chloride increased, formed a flocculent coagulate which rose to the top. During the addition of the last amount of cooking salt, care must be taken that the salt is not enclosed by the coagulate. The solution containing the saline and reaction products of lower molecular weight was separated from the coagulum, from which the entrapped drops of saline were removed as far as possible. A practical, perfect one. Removal of the saline solution is necessary in order to achieve a ratio of no more than 1 part sodium chloride to 3.33 parts of the purified addition product in the product and an isatanic sodium chloride concentration of 0.9%, based on a 3 Gelatin-succinic acid addition product. The purified product was then dissolved in sterile distilled water pyrogenfxeiem with the addition of concentrated sodium hydroxide to obtain a solution with a p _H of 7.0. This was further adjusted to a p _H of 7.3 to a final concentration of 3 ° / o in isotoni translucent sodium chloride. The yield of purified gelatin-succinic acid addition product was 105 g, which corresponds to a 58.3% yield based on the initial amount of gelatin. The solution was nitrated, filled into Soo-ccm bottles and sterilized under a steam pressure of 1 at 20 minutes, after which it could be immediately applied intravenously. The product in a 3% concentration in an isotonic sodium chloride solution gelled at about 10 °.

Will man eine mehr als 3°/«ige Lösung des gereinigten Additionsprodukts herstellen, so muß man die Lösung des mit Natriumchlorid ausgefällten und gewaschenen Materials gegen Wasser dialysieren, um weitere Mengen Natriumchlorid zu entfernen, so daß die endgültige Lösung nicht mehr als 0,9 % Natriumchlorid enthält. Anstatt des Aussalzens und deir Dialyse kann auch eine Ausfällung mit Methylalkohol, Äthylalkohol, Isopropylalkohol oder Aceton erfolgen.If you want a more than 3% solution of the purified To produce addition product, you have to make the solution of the precipitated with sodium chloride and dialyze washed material against water to remove additional amounts of sodium chloride, so that the final solution does not contain more than 0.9% sodium chloride. Instead of salting out and deir dialysis can also involve precipitation with methyl alcohol, ethyl alcohol, isopropyl alcohol or acetone.

Example 2

Die Arbeitsweise nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Reaktion in einem pH-Bereich von 5,5 bis 6,5 durchgeführt wurde. Die Reakt ions mischung wurde dann der Fraktionierungsbehahdlung unterworfen, um das gewünschte AdditionspTOdukt zu erhalten/, und dieses wurde wiederholtein Reinigungsbehandlungen nach Bedspiel ι unterworfen. Die Ausbeute war beträchtlich geringer als im Fall des Beispiels 1.The procedure of Example 1 was repeated with the exception that the reaction in one pH range from 5.5 to 6.5 was carried out. The reaction mixture then became the fractionation treatment subjected to obtain the desired addition pTOduct /, and this became repeatedly subjected to cleaning treatments according to Bedspiel ι. The yield was considerable less than in the case of example 1.

Example 3

Das Verfahren nach Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß das Gelatineausgangsmaterial ein mittleres' Molekulargewicht von etwa 20000 besaß (H₀ = 0,18 bei 55°). Die schwere Fraktion des Additionsprodukts ergab eine Ausbeuite von 49,5⁰Zo, bezogen auf Gelatine. Das ge-' reinigte Additionsprodukt ergab in !satanischem Natriumchlorid eine 3%ige Lösung mit einem pjj von 7,3, die noch unterhalb 5⁰ flüssig war.The process of Example 1 was repeated with the exception that the gelatin starting material had an average molecular weight of about 20,000 (H ₀ = 0.18 at 55 °). The heavy fraction of the adduct yielded a Ausbeuite 49.5 ⁰ Zo, based on gelatin. The overall 'cleaned adduct showed in! Satanic sodium chloride, a 3% solution with a PJJ of 7.3, which was still liquid below 5 ^0th

90 'Beispiel 490 'Example 4

1500 ecm einer 6%igen Lösung von Gelatine (90 g) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20 000 bis 25 000 wurden auf eine Temperatur von 13⁰ und mit Nätriumhydroxyd auf ein Ph von 9 eingestellt. Dann wurden langsam unter Umrühren 30 g Itaconsäureanhydrid zugesetzt, wobei das Ph durah Zugabe von Nätriumhydroxyd im Bereich von 9 bis 10 gehalten wurde. Sobald keine iqo weitere Änderung des p_H mehr feststellbar war, wurde die Reaktion als> beendet betrachtet und das Ph mittels konzentrierter ' Salzsäure auf 3,5 eingestellt, wobei sich beim isoelektrischen Punkt die schwere Phase abschied. Diese wurde in einem Scheidetrichter abgetrennt und unter Zugabe von Nätriumhydroxyd in 1 1 destilliertem Wasser bei einem p_H von 3,95 gelöst, dann bei einem p_H von 3,5 mit Salzsäure wieder ausgefällt. Dieses Produkt ergab eine Ausbeute von 102 °/o, bezogen auf das Ausgangsmiaterial. Von dem Produkt wurde eine 6°/oiige Lösung in isatonischem Kochsalz bei einem Ph von 7,3 hergestellt und in einem Autoklav 20 Minuten lang bei einem Druck von 1 at mit Dampf behandelt. Diese Lösung war zur intravenösen Anwendung geeignet. Die 6°/oige Lösung bildete nach 18 Stunden langem Stehen bei 5⁰ kein Gel.1500 cc of a 6% solution of gelatin (90 g) having an average molecular weight of about 20,000 to 25,000 were set at a temperature of 13 ⁰ with Nätriumhydroxyd to a pH of. 9 Then 30 g of itaconic anhydride were slowly added with stirring, the pH being kept in the range from 9 to 10 by adding sodium hydroxide. As soon as no further change in the iqo p _H was longer detectable, the reaction was considered> terminated and the pH adjusted with concentrated 'hydrochloric acid to 3.5, wherein the heavy phase separated out at the isoelectric point. This was separated in a separatory funnel and dissolved by addition of Nätriumhydroxyd in 1 1 distilled water at a p _H of 3.95, then at a p _H of 3.5 reprecipitated with hydrochloric acid. This product gave a yield of 102% based on the starting material. A 6% solution was prepared from the product in isatonic table salt with a pH of 7.3 and treated with steam in an autoclave for 20 minutes at a pressure of 1 atm. This solution was suitable for intravenous use. The 6 ° / o solution formed after 18 hours standing at 5 ⁰ no gel.

Example

1500 ecm einer 6°/oigen Lösung von Gelatine (90 g), die ein mittleres Molekulargewicht von 15000 bis 20000 besaß (H₀ = 0,14 bis 0,18 bei 55°), wurden bei Zimmertemperatur mit Nätriumhydroxyd auf ein p_H von, 9 eingestellt. 30 g Citraconsäureanhydrid wurden allmählich unter Um-1500 cc of a 6 ° / o solution of gelatin (90 g), which has an average molecular weight from 15,000 to 20,000 possessed (H ₀ = 0.14 to 0.18 at 55 °), were added at room temperature with Nätriumhydroxyd to a p _H of , 9 set. 30 g of citraconic anhydride were gradually

627/183627/183

K 16850 IVa/30hK 16850 IVa / 30h

rühren zugegeben, .wobei das p_H zwischen 9 und 10 gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann auf den i.soelektrischen Punkt (p_H 2,78) eingestellt, bei dem sich die sah were Fraktion abschied. Diese wurde in 1 1 destilliertem Wasser unter Einstellung des p^-Wertas mittels konzentrierter Natronlauge gelöst. Nach dem Ansäuern auf ein p_H von 2,78 wurde das Additionsprodukt durch Zugabe von 150 g Natriumchlorid ausgefällt.was added with stirring, kept .wobei the p _H 9 to 10 The reaction mixture was then adjusted to the i.soelektrischen point (p _H 2.78), in which the saw fraction were separated. This was dissolved in 1 l of distilled water while adjusting the p ^ value by means of concentrated sodium hydroxide solution. After acidification to a p _H of 2.78, the addition product was precipitated by addition of 150 g of sodium chloride.

Eine 6°/oiige Lösung des Produkts in, isotonischem Kochsalz bei einem Ph von 7,3 bildete nach 18 Stunden bei 5° ein Gel. Nach einer zweiten Reinigung in der gleichen Waise wurde das Produkt in konzentrierter wäßriger Lösung bei einem p_H von 7 in einem Viskingirohr gegen fließendes Wasser 2 Stunden lang diialysiert, um den Salzgehalt auf unter 0,9 g je 6 g des Gelatineadditionsprodukts herabzusetzen. A 6% solution of the product in isotonic common salt with a pH of 7.3 formed a gel after 18 hours at 5 °. After a second purification in the same orphan the product in concentrated aqueous solution at a p _H of 7 in a Viskingirohr against flowing water was diialysiert 2 hours to the salt content to below 0.9 g per 6 g of gelatin addition product reduce.

Example 6

3000 ecm einer 6°/«igen Lösung von Gelatine (180 g) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20000 (H₀ = 0,18) wurden bei 28 bis 37⁰ mit konzentrierter Natriumhydroxydlösung auf ein3000 ecm of a 6% solution of gelatin (180 g) with an average molecular weight of about 20,000 (H ₀ = 0.18) were ^{diluted at 28 to 37 0} with concentrated sodium hydroxide solution

^a5 Ph ^von 9 eingestellt. Dann wurden unter Umrühren allmählich 60 g Bemsteinsäurechlorid zugegeben. Mit dam Fortschreiten der Reaktion wurde das p_H durch regelmäßigen Zusatz von konzentrierter NaOH zwischen 8,5 und 10 gehalten, bis 128 ecm NaOH-Lösung zugegeben waren. Sobald keine weitere Änderung des p^ mehr festzustellen war, würde die Reaktion als beendet betrachtet. Die Mischung wurde dann durch Zugabe von, 89 ecm korn zentrierter Salzsäure auf ein p_H von 2,3 eingestellt. Die schwere ölige Fraktion des Gelatinederivats wurde in 1,5 1 destilliertem.Wasser gelöst und durch allmähliche Zugabe von 607 g festem Natriumchlorid bei einem p_H von 3 ausgefällt. Das gereinigte Produkt wurde dann unter Zusatz von konzentrierter Natriumhydroxydlösung in sterilem, pyrogenfreiem destilliertem Wasser zu einer Lösung vom p_H 7 gelöst. Diese Lösung wurde schließlich zu einer 3%igen Gelatinederivatlösung· in einer o,9°/oigen Kochsalzlösung mit einem pjj von 7,3 eingestellt. Die Ausbeute beitrug 94 g =52,2 °/o, bezogen auf die Ausgangsmenge der Gelatine. Die Lösung wurde filtriert, in 500 com enthaltende Flaschen abgefüllt und unter einem Dampfdruck von ι at 20 Minuten lang sterilisiert. Sie war dann für intravenöse Anwendung geeignet. Das Produkt blieb' unterhalb 5⁰ flüssig. ^a 5 ph ^of 9 set. Then 60 g of succinic chloride was gradually added with stirring. With dam progress of the reaction, the p _H was maintained by periodic addition of concentrated NaOH 8.5 to 10, to 128 cc of NaOH solution were added. As soon as there was no further change in the p ^, the reaction would be considered to have ended. The mixture was then adjusted by adding, 89 cc grain centered hydrochloric acid to a p _H of 2.3. The heavy oily fraction of the gelatin derivative was dissolved in 1.5 1 destilliertem.Wasser and precipitated by gradual addition of 607 g solid sodium chloride at a p _H of 3rd The purified product was then dissolved with addition of concentrated sodium hydroxide solution in sterile, pyrogen-free distilled water to a solution of p _H. 7 This solution was finally adjusted to a 3% gelatin derivative solution in a 0.9% saline solution with a pjj of 7.3. The yield was 94 g = 52.2%, based on the initial amount of gelatin. The solution was filtered, filled into bottles containing 500 μm and sterilized under a vapor pressure of ι at 20 minutes. It was then suitable for intravenous use. The product remained 'below 5 ⁰ liquid.

Example 7

3000 ecm einer 6%igen Lösung von Gelatine (180 g) mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20 000 (H₀ = 0,18) wurden bei 22 bis 30⁰ mit Natriumhydroxydlösung auf ein p_H von 9 eingestellt. Dann wurden langsam unter Umrühren 60 g Fumarsäurechlorid zugegeben. Mit fortschreitender Reaktion, wurde das p^ durch regelmäßige Zugabe von Natronlauge auf 8,5 bis 10 gehalten, bis insgesamt 133 ecm zugesetzt waren. Sobald keine weitere Änderung des pu mehr festzustellen war, wurde die Mischung mit 80 ecm konzentrierter Salzsäure auf ein p_H von 2,5 eingesäuert. Die schwere ölfraiktion wurde in 2 1 destilliertem Wasser gelöst und die Lösung mit Natriümhydroxyd auf ein p_H von 7 eingestellt. Es wurde eine geringe Menge unlöslicher Flocken abfiltriert und dann die schwere Fraktion durch allmählichen Zusatz von 600 g festem Natriumchlorid bei p_H 3 ausgefällt. Das gereinigte Produkt wurde unter Zusatz von konzentrierter Natronlauge in sterilem, pyrogenfreiem Wasser zu einer Lösung mit einem p_H von 7 gelöst. Diese Lösung wurde dann nach der Analyse weiter in o,9°/oiger Natriumahloiridlösung zu einer 3%igen Gelatinederivatlösung mit einem p_H von 7,3 gelöst. Die Ausbeute beitrug 80 g = 44,4 %>, bezogen auf die Ausgangsmenge der Gelatine. Die Lösung wurde nitriert, in 500 ecm fassende Flaschen abgefüllt und unter einem Dampfdruck von 1 at 20 Minuten lang sterilisiert, wonach sie für intravenöse Anwendung geeignet war. Das Produkt blieb unterhalb 5° flüssig.3000 cc of a 6% solution of gelatin (180 g) having an average molecular weight of about 20,000 (H ₀ = 0.18) were set at 22 to 30 ⁰ with sodium hydroxide to a p _H of the ninth Then 60 g of fumaric acid chloride were slowly added with stirring. As the reaction progressed, the p ^ was kept at 8.5 to 10 by regularly adding sodium hydroxide solution until a total of 133 ecm had been added. As soon as no further change was pu determine more of the mixture with 80 cc of concentrated hydrochloric acid to a p _H of 2.5 was eingesäuert. The heavy ölfraiktion was dissolved in 2 1 of distilled water and the solution adjusted with Natriümhydroxyd to a p _H of the seventh It was filtered off, a small amount of insoluble flakes and then precipitated the heavy fraction by gradual addition of 600 g solid sodium chloride at p _H. 3 The purified product was dissolved with the addition of concentrated sodium hydroxide solution in sterile, pyrogen-free water to a solution with a p _H of the seventh This solution was then after the analysis continues in o dissolved 9 ° / Natriumahloiridlösung cent to a 3% aqueous gelatin derivative solution with a p _H of 7.3. The yield was 80 g = 44.4%, based on the initial amount of gelatin. The solution was nitrated, filled into 500 ecm bottles and sterilized under a steam pressure of 1 at 20 minutes, after which it was suitable for intravenous use. The product remained liquid below 5 °.

Es können auch andere Halogenide der Polycarbonsäuren an Stelle der Chloride zur Herstellung brauchbarer Proteinderivate nach dem obigen Verfahren, verwendet werden. Die Reinigung erfolgt in gleicher Weise.Other halides of the polycarboxylic acids can also be used in place of the chlorides for the preparation useful protein derivatives can be used according to the above method. The cleaning takes place in the same way.

Es ist wesentlich, daß Proteinstoffe einer milden Behandlung unterworfen werden, um ihre Hydrolyse zu vermeiden. Deshalb ist die Anwendung niedriger Temperaturen und kurzer Reaktionszeiten angezeigt. Für die Reaktion zwischen. Gelatine und Säureanhydrid oder -Chlorid beträgt die günstigste Zeitdauer 10 bis 30 Minuten. In dieser Zeit findet kein merklicher Abbau des Proteinmoleiküls statt.It is essential that protein substances be a mild one To be subjected to treatment in order to avoid their hydrolysis. That is why the application low temperatures and short reaction times are displayed. For the reaction between. Gelatin and Acid anhydride or chloride is the most favorable time 10 to 30 minutes. During this time it takes place no noticeable degradation of the protein molecule takes place.

Claims

PATENT CLAIMS:

ι. Process for the production of serologically compatible, stable protein derivatives which can be used as blood plaisma diluents in human medicine, characterized in that a human serologically compatible protein is reacted with an anhydride or a chloride of a polycarboxylic acid in an aqueous medium at a ρ ^ between 6 and 12 is adjusted to a p _H after which the acid content of the reaction mixture, which corresponds to about the isoelectric point of the protein derivative to this P rotein a coagulate derivative in the form of precipitate, then this is separated from the Reaktionsmischunig and further processed to imperfect he unreacted protein and to separate off non-coagulated reaction products.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the protein to be converted from gelatin, from human serum albumin, Consists of globulin or blood protein.

3. The method according to claim 2, characterized in that the gelatin in itself is

509 628/183

K 16850 IVa/30 hK 16850 IVa / 30 h

is known to initially have an average molecular weight within the range of 15,000 until 36,000 is dismantled.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized characterized in that succinic anhydride as the anhydride or chloride of a polycarboxylic acid, Citraconic anhydride, itaconic anhydride, aconitic anihydride, maleic anhydride, Succinic acid alcohol or fumaric acid alcohol is used.