DE930170C

DE930170C - Process for the production of pure thrombin

Info

Publication number: DE930170C
Application number: DEB18968A
Authority: DE
Inventors: Hermann Eduard Dr Schultze; Gerhard Schwick
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1952-02-08
Filing date: 1952-02-08
Publication date: 1955-07-11

Description

Verfahren zur Herstellung von Reinthrombin Die Erfindung betrifft die Herstellung von Reinthrombin aus Prothrombin.Process for the preparation of pure thrombin The invention relates to the production of pure thrombin from prothrombin.

Es ist bereits bekannt, in Lösung befindliches Prothrombin dadurch in Thrombin überzuführen, daß eine geeignete Menge einer wäßrigen Calciumchloridlösung und etwas Kinase zugesetzt werden. Kinase und Ca-Ionen wirken hierbei als biologische Aktivatoren.It is already known to cause prothrombin in solution to convert into thrombin that a suitable amount of an aqueous calcium chloride solution and some kinase added. Kinase and Ca ions act here as biological Activators.

Weiterhin ist bekannt, isoliertes Prothrombin ohne Zusatz biologischer Aktivatoren durch vielstündiges Stehenlassen in konzentrierten Salzlösungen, z. B. in 25°/oiger Natriumcitratlösung, bei Raumtemperatur in Thrombin von, gutem Reinheitsgrad zu überführen (vgl. W. H. Seegers in »Proc. Soc. exp. Biol. Med.« 72, S. 677 LI9491)-Es wurde nun gefunden, daß die Überführung von Prothrombin auch ohne Anwendung biologischer Aktivatoren und ohne die Anwendung konzentrierter Salzlösungen, gelingt, wenn eine wäßrige Lösung von Prothrombin mit kleinen Mengen von Trypsin versetzt wird und die Lösung zweckmäßig in Gegenwart einer niedermolekularen Polyoxyverbindung, wie Glycerin, oder eines körpereigenen oder eines nicht antigenen Proteins bis zum Erreichen der maximal gebildeten. :Menge an Thrombin stehengelassen wird. Nach Erreichen, des Maximums der Thrombinbildung wird die Fermentaktivität des Trypsins durch Zusatz einer adäquaten Menge Antitrypsins aufgehoben und die Thrombinlösung gegebenenfalls weiterverarbeitet. Unter kleinen Mengen an Trypsin werden solche von I bis 2o y Reintrypsin je Milligramm Prothrombin verwendet.It is also known isolated prothrombin without the addition of biological Activators by standing for many hours in concentrated salt solutions, e.g. B. in 25% sodium citrate solution, at room temperature in thrombin of a good degree of purity to transfer (cf. W. H. Seegers in "Proc. Soc. exp. Biol. Med." 72, p. 677 LI9491) -Es it has now been found that the transfer of prothrombin even without the use of biological Activators and without the use of concentrated salt solutions succeed if one aqueous solution of prothrombin is mixed with small amounts of trypsin and the solution expediently in the presence of a low molecular weight polyoxy compound, such as Glycerin, or an endogenous or a non-antigenic protein until it is reached the most educated. : Amount of thrombin is left to stand. After reaching The fermentation activity of the trypsin becomes the maximum of the thrombin formation an adequate amount of antitrypsin and the thrombin solution if necessary further processed. With small amounts of trypsin, those from 1 to 2o y Reintrypsin used per milligram of prothrombin.

Zur Vermeidung einer Denaturierung des gebildeten Thrombins in der Reaktionslösung werden gemäß der Erfindung die obengenannten Stabilisatoren verwendet. Diese Stabilisatoren selbst haben keine umwandlungsfördernde Wirkung. Sie vermögen jedoch das sich unter dem Einfluß des Trypsins gegenüber bekannten Verfahren besonders schnell bildende Thrombin zu stabilisieren.To avoid denaturation of the thrombin formed in the Reaction solution are according to Invention the above stabilizers used. These stabilizers themselves do not have any conversion-promoting effect. However, they are able to do this under the influence of trypsin Method to stabilize particularly rapidly forming thrombin.

Es ist bereits bekannt, Kohlehydratverbindungen, nämlich Pentosen, Hexosen, Hexose-Disaccharide und Methyl- oder Äthylglycoside von Pentosen oder Hexosen als Stabilisatoren zu verwenden. Diese Verbindungen sind jedoch keine reinen Polyoxyverbindungen ; sie enthalten vielmehr auch noch Oxogruppen. Im Rahmen dieser Erfindung wird ein Anspruch auf Kohlehydrate, die zugleich Polyoxy- und Polyoxogruppen enthalten, nicht gestellt.It is already known to use carbohydrate compounds, namely pentoses, Hexoses, hexose disaccharides and methyl or ethyl glycosides of pentoses or hexoses to use as stabilizers. However, these compounds are not pure polyoxy compounds ; rather, they also contain oxo groups. In the context of this invention, a Entitlement to carbohydrates, which also contain polyoxy and polyoxo groups, not posed.

Bei der Verwendung von mehrwertigen Alkoholen als Stabilisatoren können diese nach Beendigung der Umsetzung durch Dialyse entfernt werden. Bei Verwendung von Glycerin ist die Dialyse in 3 bis 4 Stunden beendigt, während die dialytische Entfernung der nach dem Salzverfahren anzuwendenden Salze ein Vielfaches dieser Zeit erfordert und überdies mit erheblichen Verlusten an Thrombinaktivität verbunden war.When using polyhydric alcohols as stabilizers you can these are removed by dialysis after the reaction has ended. Using dialysis of glycerine is completed in 3 to 4 hours, while dialytic Removal of the salts to be used after the salt process many times this Requires time and, moreover, is associated with a considerable loss of thrombin activity was.

Die wäßrige, glycerinfreie Lösung des Thrombins läßt sich in bekannter Weise sterilisieren und in gefrorenem Zustand ohne wesentliche Einbuße an Thrombinaktivität im Hochvakuum zur Trockne bringen. i mg eines so erhaltenen schneeweißen und in Wasser spielend löslichen Thrombins enthält etwa 7oo NIH-Einheiten (unter NIH-Einheiten versteht man die vom National Institut of Health in Washington vorgeschlagenen Einheiten). Es ist jedoch nicht nötig, wäßrige, vom Glycerin befreite Lösungen des Thrombins in trockenes Reinthrombin überzuführen. Vielmehr kann die glycerinhaltige Ansatzlösung auch nach Einstellung auf gewünschte Konzentrationen gegebenenfalls zur Verwendung gelangen.The aqueous, glycerol-free solution of the thrombin can be used in a known manner Sterilize manner and in the frozen state without significant loss of thrombin activity Bring to dryness in a high vacuum. i mg of a snow-white obtained in this way and in Water easily soluble thrombin contains about 700 NIH units (below NIH units one understands the units proposed by the National Institute of Health in Washington). However, it is not necessary to use aqueous solutions of the thrombin from which the glycerol has been removed to be converted into dry pure thrombin. Rather, the glycerine-containing batch solution can also after adjustment to the desired concentrations, if necessary for use reach.

Als Stabilisator kann weiterhin ein, körpereigenes Protein oder ein, nicht antigenes Protein verwendet werden. Außer Gelatine und Casein ist insbesondere das menschliche Serumalbumin, geeignet, das nach entsprechender Reinigung frei von Antitrypsin und Antithrombin ist und in hohen Konzentrationen und bei Anwesenheit von Trypsin sowohl auf Prothrombin umwandlungsfördernd wie auf Thrombin stabilisierend wirkt. Die Herstellung eines unmittelbar in der Ansatzlösung anwendbaren Thrombinpräparates ist bei Anwendung der genannten Proteine in besonders einfacher Weise durchführbar, weil nach erfolgter Thrombinbildung, die durch die Bestimmung in kleinen Ansatzmengen laufend kontrolliert werden kann und nach Neutralisierung des Trypsins durch eine ausreichende Menge reinen Trypsinhemmstoffs unter Verzicht auf die Entfernung des zur Reaktionslösung zugegebenen arteigenen bzw. nicht antigenen Eiweißes, der gesamte Reaktionsansatz nach Vornahme geeigneter Sterilisierungsmaßnahmen unmittelbar zur lokalen Blutstillung angewandt werden kann. Es ist selbstverständlich auch möglich, das eiweißhaltige Thrombin aus dem Lösungszustand in ein Trockenerzeugnis überzuführen.An endogenous protein or a antigenic protein cannot be used. Besides gelatin and casein is particular the human serum albumin, suitable, which after appropriate purification free of Antitrypsin and antithrombin is and is in high concentrations and in the presence of trypsin promotes conversion to prothrombin as well as stabilizing thrombin works. The production of a thrombin preparation that can be used directly in the batch solution can be carried out in a particularly simple manner when using the proteins mentioned, because after the formation of thrombin, which is determined by the determination in small batches can be continuously monitored and after the trypsin has been neutralized by a sufficient amount of the pure trypsin inhibitor without removing the Species-specific or non-antigenic protein added to the reaction solution, the entire Reaction batch immediately after taking suitable sterilization measures local hemostasis can be applied. It is of course also possible to convert the protein-containing thrombin from the solution state into a dry product.

Der Verlauf der Bildung von Thrombin aus Prothrombin in Gegenwart des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Umwandlungsmittels Trypsin geht aus nachstehenden Umwandlungskurven in den Abb. i und 2 in allen Einzelheiten hervor. Die Kurven geben an, welche Einheiten Thrombin pro Milligramm angewandtes Prothrombin unter dem Einfluß der verschiedenen Reaktionsmedien entstehen.The course of the formation of thrombin from prothrombin in the presence of the conversion agent trypsin proposed according to the invention is based on the following Conversion curves in Figs. I and 2 emerge in great detail. Give the curves what units of thrombin per milligram of prothrombin applied under the influence of the various reaction media arise.

Abb. i der Zeichnung zeigt den Einfluß steigender Trypsinmengen auf die Thrombinbildung in 25°/oiger Citratlösung bei einem pH-Wert von 7,2.Fig. I of the drawing shows the influence of increasing amounts of trypsin the thrombin formation in 25% citrate solution at a pH of 7.2.

Die gestrichelte Linie hat folgende Bedeutung: Prothrombin Nr. 2851 (90o SE) i°/oig in 25°/oiger Citratlösung von pH 7,2.The dashed line has the following meaning: Prothrombin No. 2851 (90o SE) i% in 25% citrate solution of pH 7.2.

Die ausgezeichnete Linie hat folgende Bedeutung: Prothrombin Nr. 2851 (90o SE) i°/°ig in 25°/oiger Citratlösung von pH 7,2 mit Mengen von 2 bis ?,o y krist. Armour-Trypsin (65,6 °/o Trypsin, 34,4 % Mg S 04) versetzt.The marked line has the following meaning: Prothrombin No. 2851 (90o SE) i% in 25% citrate solution of pH 7.2 with amounts of 2 to?, O y crystall. Armor trypsin (65.6 % trypsin, 34.4% Mg S 04) added.

Abb.2 zeigt den Einfluß von Trypsin auf die Thrombiabildung in verschiedenen Reaktionsmedien. Prothrombin Nr. 26 (9oo SE) + 8 y krist. Armour-Trypsin je i mg. Hierin haben die Kurven i bis 4a folgende Bedeutung: i = Prothrombin i°/oig in 25°/oiger Citratlösung, p$ 7,2 2 = - 5°/oig in 5o°/oigem Glyzerin, p$ 7,2 2a= - i°/oig in 5o°/oigem Glyzerin, p$ 7,2 3 = - i°/oig in 2o°/°igem Humanalbumin, PH 7,- 4 = - 5°/°ig in dest. H20, pH 7,2 4a= - i°/oig in dest. H20, PH 7,2 Die Eifindung wird an Hand nachstehender Beispiele erläutert.Fig. 2 shows the influence of trypsin on the formation of thrombi in various reaction media. Prothrombin No. 26 (900 SE) + 8 y crystall. Armor trypsin i mg each. Curves i to 4a have the following meaning: i = Prothrombin i% in 25% citrate solution, p $ 7.2 2 = - 5% in 50% glycerine, p $ 7.2 2a = - 100% in 50% glycerine, p $ 7.2 3 = - 10% in 20% human albumin, PH 7, - 4 = - 5% in dist. H20, pH 7.2 4a = - i% in dist. H20, PH 7.2 The process is explained using the following examples.

Beispiel i i g Prothrombin (iooo Einheiten nach Seegers in i mg) wird in 2o ccm einer auf PH 7,2 eingestellten 5o°/oigen wäßrigen Glycerinlösung aufgelöst, mit 8 mg krist. Trypsin, 65,6010 Reintrypsin, 34,404 M9S 04 versetzt und im Thermostaten auf 28° erwärmt. Die Umwandlung des Prothrombins inThrombinwird durch Bestimmung des freigelegten Thrombins in kleinen Ansatzproben, die im Abstand von etwa 30 Minuten entnommen werden, verfolgt. Nach 21/2 Stunden, d. h. zum Zeitpunkt optimaler Thrombinausbeute, werden i2 mg reines Antitrypsin aus Sojabohnen zugefügt und das im Ansatz enthaltene Glycerin durch eine 31/2stündige Dialyse gegen neutrales Wasser entfernt. Nach Gefriertrocknung der dialysierten Lösung erhält man schließlich 850 mg eines leichtlöslichen Thrombinpräparates, das 75o NIH-Einheiten im Milligramm enthält. Ist das Thrombin für die Anwendung als Hämostyptikum beim Menschen bestimmt, so wird das geschilderte Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt oder die erhaltene Thrombinlösung vor der Trocknung, die in sterilen Gefäßen vorgenommen wird, durch ein Entkeimungsfilter filtriert.Example iig Prothrombin (iooo Seegers units in i mg) is dissolved in 2o ccm of a 50% aqueous glycerol solution adjusted to pH 7.2, with 8 mg of crystalline solution. Trypsin, 65.6010 pure trypsin, 34.404 M9S 04 added and heated to 28 ° in the thermostat. The conversion of prothrombin to thrombin is monitored by determining the exposed thrombin in small batch samples which are taken about 30 minutes apart. After 21/2 hours, ie at the time of optimum thrombin yield, 12 mg of pure antitrypsin from soybeans are added and the glycerol contained in the batch is removed by dialysis for 31/2 hours against neutral water. After freeze-drying the dialyzed solution, 850 mg of a readily soluble thrombin preparation containing 75o NIH units per milligram are finally obtained. If the thrombin is intended for use as a hemostatic agent in humans, the process described is carried out under sterile conditions or the thrombin solution obtained is filtered through a sterilization filter before drying, which is carried out in sterile vessels.

Beispiel 2 i g Prothrombin (iooo SE je Milligramm) wird in 2o ccm einer auf p$ 7,2 eingestellten sterilen 2o°/oigen wäßrigen Auflösung reinen menschlichen Serumalbumins in einem sterilen Gefäß gelöst, mit 8 mg krist. Trypsin versetzt und der Verlauf der Thrombinbildung bei 28' wie im Beispiel i kontrolliert. Nach 3 Stunden nimmt, wie durch einen Testversuch nach 3'/4 Stunden ermittelt wird, die Thrombinausbeute nicht weiter zu. Es wird daher zu dem letztgenannten Zeitpunkt eine Menge von 12 mg krist. Trypsininhibitor aus Sojabohnen dem Reaktionsansatz zugefügt. Derselbe enthält gooooo NIH-Einheiten Thrombin und wird, gegebenenfalls nach Verdünnung mit steriler wäßriger Human.albuminlösung, einer erneuten Sterilisation durch Filtration unterzogen oder mit einem Konservierungsmittel versetzt und auf kleine Behälter für den Gebrauch als Hämostyptikum abgefüllt.Example 2 i g of prothrombin (iooo SE per milligram) is in 2o ccm a sterile 20% aqueous solution of pure human, adjusted to p $ 7.2 Serum albumin dissolved in a sterile vessel, with 8 mg of crystalline. Trypsin spiked and the course of thrombin formation controlled at 28 'as in example i. After 3 hours, as is determined by a test attempt after 3 '/ 4 hours, the thrombin yield does not increase any further. It will therefore be at the latter point in time an amount of 12 mg of crystalline. Trypsin inhibitor from soybeans in the reaction mixture added. It contains gooooo NIH units of thrombin and is, if necessary after dilution with sterile aqueous human albumin solution, a renewed sterilization subjected by filtration or mixed with a preservative and on small containers filled for use as a hemostatic agent.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for the production of pure thrombin from prothrombin in aqueous solution, characterized in that prothrombin in aqueous solution and in the presence of a low molecular weight polyoxy compound such as glycerol or an endogenous or a non-antigenic protein is mixed with trypsin in amounts of 1 to 20 mg per gram of prothrombin and the fermentation activity of trypsin is expediently abolished when the maximum amount of thrombin formed is reached by adding an adequate amount of antitrypsin.

2. The method according to claim i, characterized in that the low molecular weight polyoxy compound after finished Thrombin formation is removed by dialysis and the resulting thrombin solution is optionally removed is dried after sterilization in the frozen state.

3. The method according to claim i, characterized in that the endogenous or non-antigenic protein-containing thrombin solution is sterilized in a manner known per se and either adjusted to concentrations required for direct use in humans or dried in the frozen state. Cited U.S. Patent Nos. 2495298, 2433299.