DE8817263U1 - Enzyme immunoassay for the detection of anti-tetanus antibodies - Google Patents
Enzyme immunoassay for the detection of anti-tetanus antibodiesInfo
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Description
BeschreibungDescription
Die Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay zum Nachweis von AntiTetanus-Antikörpern, der zur Ablösung der bisher üblichen Methoden zur Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen Tetanustoxin, den Mausneutraiisationstest, geeignet ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik. Zur Bestimmung von Tetanus-Antitoxin stehen eine Reihe von Testsystemen zu Verfügung. Neben der passiven Hämagglutination und der radialen Immundiffusion ist der Toxin-Neutralisationstest (TNT) mit seinen Modifikationen von großer Bedeutung (Berger.U., M.Frey-Weltstein und H.Dey, Schweiz, med. Wochenschrift 111 (1981) 61-66; Ipsen, J., Z. Immun.forsch. 102 (1942) 347-368). Diese in-vivo-Methode ist relativ störanfällig und sehr zeitaufwendig (Barile.M.F., M.C.Hardergree und M.Pittmann, Bull. World Health Organ. 43 (I970), 453-459). Eine der üblichen Methoden zur Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen Tetanustoxin stellt der TNT dar (von Behring.E.A. und S.B.Kitasato, Dtsch. Med. Wochenschrift 16 (1890) 1113-1114). Großer Zeitaufwand bei geringem Probendurchsatz sowie hohe Kosten sind dabei wesentliche /Nachteile (Melville-Smith, M.E., V.A. Seagrott, JT. Watkins, Biol. Standard. 11 (1983) 137-144). Zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikörpern und damit zum Beispiel für die Differenzierung von Patienten mit einer ausreichenden Immunisierung von Patienten ohne eine ausreichende Menge schützender Antikörper wurde bereits ein ELISA mit Tetanustoxoid (Td) an der festen Phase zur klinischen Nutzung empfohlen (Gentili.G., C.Pini und C.Collotti, J. Bioi. Standard. 12 (1984) 167-173; Layton.G.T., Med. Lab. Sei. 37(1980) 323 -329). Ambrosch et al. (Ambrosch, F.,G.Wiedermann und H.Müller, ZbI. Bakt. Hyg. A 258 (1984) 173-182) konnten eine Korrelation zwischen dem TNT und einem Toxoid-ELISA nachweisen.The invention relates to an enzyme immunoassay for the detection of anti-tetanus antibodies, which is suitable for replacing the previously common methods for determining neutralizing antibodies against tetanus toxin, the mouse neutralization test. The field of application of the invention is medical diagnostics. A number of test systems are available for determining tetanus antitoxin. In addition to passive hemagglutination and radial immunodiffusion, the toxin neutralization test (TNT) with its modifications is of great importance (Berger.U., M.Frey-Weltstein and H.Dey, Schweiz, med. Wochenschrift 111 (1981) 61-66; Ipsen, J., Z. Immun.forsch. 102 (1942) 347-368). This in-vivo method is relatively susceptible to interference and very time-consuming (Barile.M.F., M.C.Hardergree and M.Pittmann, Bull. World Health Organ. 43 (I970), 453-459). One of the usual methods for determining neutralizing antibodies against tetanus toxin is TNT (von Behring.E.A. and S.B.Kitasato, Dtsch. Med. Wochenschrift 16 (1890) 1113-1114). The large amount of time required, low sample throughput and high costs are the main disadvantages (Melville-Smith, M.E., V.A. Seagrott, JT. Watkins, Biol. Standard. 11 (1983) 137-144). To detect anti-tetanus antibodies and thus, for example, to differentiate between patients with sufficient immunization and patients without sufficient amounts of protective antibodies, an ELISA with tetanus toxoid (Td) on the solid phase has already been recommended for clinical use (Gentili.G., C.Pini and C.Collotti, J. Bioi. Standard. 12 (1984) 167-173; Layton.G.T., Med. Lab. Sci. 37(1980) 323 -329). Ambrosch et al. (Ambrosch, F., G.Wiedermann and H.Müller, ZbI. Bakt. Hyg. A 258 (1984) 173-182) were able to demonstrate a correlation between TNT and a toxoid ELISA.
Es ist das Ziel der Erfindung, den TNT zur Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen Tetanustoxin zu ergänzen und der medizinisch-diagnostischen Praxis eine neue Möglichkeit zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikörpern zur Verfügung zu stellen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Enzymimmunoassays (ELISA) zum Nachweis von Anti-Tetanus-Antikörpern zu entwickeln. Die Aufgabe wurde durch den Einsatz von gereinigtem Tetanustoxin an der festen Phase eines ELISA gelöst. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß die Verwendung von Tetanustoxin zur Festphasenimmobilisierung zum Nachweis von spezifischen Antikörpern geeignet ist und gegenüber dem Tetanustoxoid-ELISA vor allem den Vorteil der besseren Korrelation zum TNT aufweist sowie gleichzeitig eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität beim Nachweis gestattet (Tab. 1). Mit dem gereinigten (präparierten) Antigen werden bei den erfindungsgemäßen Verfahren die besten Ergebnisse erzielt. Als Nachweismethoden eignen sich sowohl Antiglobulin- als auch Capturetechniken (Bosworth, J.M., A.A.Brimfield, J.A.Naylor und K.W.Hunter, J. Immunol. Meth. 62 (1983) 331-336). Die Korreiationsanalyse allein zeigt unabhängig vom Festphasenantigen eine weitgehende Übereinstimmung der Werte aus TNT und ELlSA an (Tab.1). Eine genauere Aussage ergibt sich aus dem Anstieg der Ausgleichsgeraden (Passing, H., W. Bablok, J. Clin. Chem. Ciin. Biochem. 21 (1983) 709-720). Bestimmt man in beiden Methoden den annähernd gleichen Antikörper-Gehalt je Serum, weicht der Anstieg b nicht signifikant von 1 ab. Dies traf unter den Bedingungen von Passing & Bablok nur für präpariertes Tetanustoxin (T F4 ) mit b = 0,80 zu (Tab. 2). Alle anderen Antigene wiesen eine signifikante Abweichung von b = 1 auf- (Tab. 2). Da Anstieg b in diesen Fäilen kleiner 1 ist, wird bei Verwendung dieser Antigene im ELISA ein höherer Anti-Tetanus-Antikörper-Gehalt als im TNT bestimmt.The aim of the invention is to supplement the TNT for the determination of neutralizing antibodies against tetanus toxin and to provide medical diagnostic practice with a new option for the detection of anti-tetanus antibodies. The invention is based on the task of developing a new enzyme immunoassay (ELISA) for the detection of anti-tetanus antibodies. The task was solved by using purified tetanus toxin on the solid phase of an ELISA. Surprisingly, it has been shown that the use of tetanus toxin for solid phase immobilization is suitable for the detection of specific antibodies and, compared to the tetanus toxoid ELISA, has the advantage of better correlation with the TNT and at the same time allows for greater sensitivity and specificity in the detection (Table 1). The best results are achieved with the purified (prepared) antigen in the methods according to the invention. Both antiglobulin and capture techniques are suitable as detection methods (Bosworth, J.M., A.A.Brimfield, J.A.Naylor and K.W.Hunter, J. Immunol. Meth. 62 (1983) 331-336). The correlation analysis alone shows a large agreement between the values from TNT and ELISA, regardless of the solid phase antigen (Tab.1). A more precise statement can be made from the slope of the best fit line (Passing, H., W. Bablok, J. Clin. Chem. Ciin. Biochem. 21 (1983) 709-720). If the antibody content per serum is determined to be approximately the same in both methods, the slope b does not deviate significantly from 1. Under the conditions of Passing & Bablok, this was only true for prepared tetanus toxin (T F4 ) with b = 0.80 (Tab. 2). All other antigens showed a significant deviation from b = 1 (Tab. 2). Since the increase b in these cases is less than 1, a higher anti-tetanus antibody content is determined when using these antigens in the ELISA than in the TNT.
Das präparierte Antigen T F4 wurde sowohl in der Antiglobulin- als auch in der Capture-Technik getestet. Dabei fand sich die bessere Korrelation zum TNT mit der Antiglobulin-Variante. Mit ihr kann in Abhängigkeit vom verwendeten Konjugat gezielt igG und IgM nachgewiesen werden. Da neutralisierende Anti-Tetanus-Antikörper nur der Klasse G angehören (Ourth, D.D. und A.B. Mac Donald, Immunology 33 (1977) 807 - 815), läßt sich auf diese Weise eine hohe Spezifität erzielen. Beim Capture-Test speziell in der Brückenvariante werden die im Serum simultan vorhandenen Anti-Tetanus-AntikörperThe prepared antigen T F4 was tested using both the antiglobulin and capture techniques. The antiglobulin variant showed a better correlation with TNT. Depending on the conjugate used, it can be used to specifically detect IgG and IgM. Since neutralizing anti-tetanus antibodies only belong to class G (Ourth, D.D. and A.B. Mac Donald, Immunology 33 (1977) 807 - 815), a high level of specificity can be achieved in this way. In the capture test, especially in the bridge variant, the anti-tetanus antibodies present simultaneously in the serum are
der Klassen G und M (Kießig, S.T., S. Jahn, T. Porstmann und R. v. Baehr, Allerg. Immunol. 33 (1987) 79- 87) gleichzeitig erfaßt, so daß eine signifikante Abweichung von b = 1 und a = 0 resultiert (Tab. 2), da nur Antikörper der Klasse G neutralisierend wirken können (Ourth, D.D. et al., a.a.O.). Die klassenspezifische Capture-Technik wurde nicht in diese Untersuchungen einbezogen, da Voruntersuchungen eine zu geringe Empfindlichkeit aufgewiesen hatten.of classes G and M (Kießig, S.T., S. Jahn, T. Porstmann and R. v. Baehr, Allerg. Immunol. 33 (1987) 79- 87) are recorded simultaneously, resulting in a significant deviation from b = 1 and a = 0 (Table 2), since only class G antibodies can have a neutralizing effect (Ourth, D.D. et al., a.a.O.). The class-specific capture technique was not included in these studies because previous studies had shown too low a sensitivity.
Der vorgestellte ELISA ist aufgrund der einfachen Handhabbarkeit für klinisch relevante Anwendungen gut geeignet. Titerverläufe, wie dargestellt, erlauben Aussagen über den Immunstatus bestimmter Untersuchungsgruppen; Erfolge von Immunisierungen lassen sich kontrollieren; schließlich eignet sich der Test auch insbesondere zum Screening monoklonaler Antikörper.The ELISA presented is well suited for clinically relevant applications due to its ease of use. Titer curves, as shown, allow statements to be made about the immune status of certain test groups; the success of immunizations can be monitored; finally, the test is also particularly suitable for screening monoclonal antibodies.
1.1. Präparation:1.1. Preparation:
,Die Präparation erfolgte aus Rohtoxin zunächst durch Ultrafiltration über eine Membran (Abscheidegrenze: 300000 MG) und dann über eine weitere Membran {Abscheidegrenze: 30000 MG). Der Überstand wurde mittels Gelchromatographie (Trennbereich: 10000 - 4 &khgr; 106) [3 cm &khgr; 108 cm, 3,8 ml/cm2/h) weiter aufgetrennt. Die Fraktionen wurden nach dem Elutionsprofii gepoolt und anschließend konzentriert.,The preparation was carried out from crude toxin first by ultrafiltration through a membrane (separation limit: 300,000 MG) and then through another membrane (separation limit: 30,000 MG). The supernatant was further separated by gel chromatography (separation range: 10,000 - 4 x 10 6 ) [3 cm x 108 cm, 3.8 ml/cm 2 /h). The fractions were pooled according to the elution profile and then concentrated.
1.2. Konjugate:1.2. Conjugates:
Die Enzymmarkierung von Toxin erfolgte nach Wilson und Nakane (Wilson, IVI.B., Nakane, P.K. (1978) In: W. Knapp, K. Holubarand G. WiCk(EdS.), Immunofluorescence and related staining techniques (Eisevier, Amsterdam), 215) im molaren Verhältnis vonThe enzyme labeling of toxin was carried out according to Wilson and Nakane (Wilson, IVI.B., Nakane, P.K. (1978) In: W. Knapp, K. Holubarand G. WiCk(EdS.), Immunofluorescence and related staining techniques (Eisevier, Amsterdam), 215) in the molar ratio of
· I I ♦» »* &iacgr; &iacgr; »»·· II ♦» »* &iacgr;&iacgr; »»·
1:4 (Tetanustoxin : POD). Ebenso wurde monospezifisches Schaf-Anti-IgG bzw. ein monoklonaler Maus-Anti-igG gekoppelt.1:4 (tetanus toxin: POD). Monospecific sheep anti-IgG and a monoclonal mouse anti-IgG were also coupled.
1.3. Enzymimmunoassay:1.3. Enzyme immunoassay:
Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 10 mg/l Antigen in 0,1 mol/l Carbonatpuffer pH 9,6 benetzt (&dgr;&Ogr;/&mgr;&Igr;/Kavität). Die Inkubation erfolgte über Nacht. Nach dem Waschen mit PBS, 0,1 % Tween 20, pH 7,2, konnten die so behandelten Platten über 6 Monate bei 20 0C gelagert werden. Zur Bestimmung der unteren (UNG) und Analytischen Nachweisgrenze (ANG) wurden nach dem Auftauen und Waschen 20fach-Bestimmungen von 4 Konzentrationen eines Standardserums im ansteigenden Teil der Bezugskurve eingesetzt, wobei sich die Bezugskurve durch die GleichungPolystyrene microtest plates were wetted with 10 mg/l antigen in 0.1 mol/l carbonate buffer pH 9.6 (δΩ/μΩ/cavity). Incubation took place overnight. After washing with PBS, 0.1% Tween 20, pH 7.2, the plates treated in this way could be stored for 6 months at 20 0 C. To determine the lower (UNG) and analytical detection limit (ANG), 20-fold determinations of 4 concentrations of a standard serum were used in the rising part of the reference curve after thawing and washing, whereby the reference curve was given by the equation
y=.y=.
"'c ln* *"' c ln * *
darsteilen läßt (&khgr; = Konzentration, y = Extinktion). Als Verdünnungspuffer für Proben und Standard diente PBS, 0,1 % v/v Tween 20; 5 % v/v Gelatine, 2 % w/v Polyethylenglycol, 1mg/l Phenolrot pH 7,2).(&khgr; = concentration, y = absorbance). The dilution buffer for samples and standard was PBS, 0.1% v/v Tween 20; 5% v/v gelatin, 2% w/v polyethylene glycol, 1mg/l phenol red pH 7.2).
Zur Messung der intraserieilen Präzision wurden 20fach-Bestimmungen von 4 verschiedenen Konzentrationen im unteren, mittleren und oberen Bereich der ^ezugskurve durchgeführt. Anhand des Präzisionsprofils erfolgte die Bestimmung des Meßbereiches auf den Antikörper-Konzentrationsbereich, der die Bestimmung mit einer prozentualen Abweichung von weniger als 10 % zuläßt.To measure the intra-series precision, 20-fold determinations of 4 different concentrations were carried out in the lower, middle and upper range of the reference curve. The precision profile was used to determine the measuring range for the antibody concentration range that allows the determination with a percentage deviation of less than 10%.
Die Reaktionszeit betrug 90 min bei Raumtemperatur. Nach zweimaligem Waschen wurde 90 min das peroxidasemarkierte Konjugat (anti-human-lgG-POD, anti-human-IgM-POD oder Tetanustoxin-POD), dessen optimale Konzentration durch Vorversuche ermittelt wurde, hinzugesetzt.The reaction time was 90 minutes at room temperature. After washing twice, the peroxidase-labeled conjugate (anti-human IgG-POD, anti-human IgM-POD or tetanus toxin-POD), the optimal concentration of which was determined by preliminary tests, was added for 90 minutes.
Danach setzte gebundenes Konjugat das Substrat (5 mmol/l ortho-Phenylendiamin, 5 mmol/i H2O2 in 0,1 mol/i Citratpuffer pH 5.0) um. Der Reaktionsabbruch erfolgte nach 25+-2 min mit 2 mol/l H2SO4, 0,05 mol/l Na2SO3.Subsequently, bound conjugate reacted with the substrate (5 mmol/l ortho-phenylenediamine, 5 mmol/i H 2 O 2 in 0.1 mol/i citrate buffer pH 5.0). The reaction was terminated after 25+-2 min with 2 mol/l H 2 SO 4 , 0.05 mol/l Na 2 SO 3 .
Die Messung erfolgte bichromatisch bei 492 nm und 690 nm. Als UNG galt die läßt. Sie wird durch die Gleichung UNG = xL + 1,5(sL + si) [x = Mittelwert des Leerwertes, sL = Streuung der Extinktion des Leerwertes, si = Streuung der Extinktion im ansteigenden Teil der Bezugskurve] beschrieben. Die ANG gibt an, ab welchem Bereich man zwei benachbarte Werte eindeutig voneinander unterscheiden kann. Sie läßt sich durch die Gleichung ANG = xL + 3(sL + si) ermitteln. Die intraserielie Präzision ergibt sich aus den Streuungen der Konzentrationen im Meßbereich.The measurement was carried out bichromatically at 492 nm and 690 nm. The UNG was considered to be the let. It is described by the equation UNG = xL + 1.5(sL + si) [x = mean value of the blank value, sL = scatter of the extinction of the blank value, si = scatter of the extinction in the rising part of the reference curve]. The ANG indicates the range from which two neighboring values can be clearly distinguished from one another. It can be determined by the equation ANG = xL + 3(sL + si). The intra-series precision results from the scatter of the concentrations in the measuring range.
2.1. Seren:2.1. Serums:
Auf Anti-Tetanus-Antikörper wurden Seren von 22 chronisch niereninsuffizienten Patienten und 10 klinisch gesunden Probanden vor und nach einer Boosterimpfung mit Tetanustoxoid (SSW Dresden, DDR, Kennziffer: Arp 12/17/360) untersucht. Die Seren sind prävakzinal sowie am 7. und 28. Tag postvakzinai gewonnen worden. Die Aufbewahrung bis zur Bestimmung erfolgte bei -2O0C.Sera from 22 patients with chronic renal insufficiency and 10 clinically healthy volunteers were tested for anti-tetanus antibodies before and after a booster vaccination with tetanus toxoid (SSW Dresden, GDR, code number: Arp 12/17/360). The sera were obtained prevaccinally and on the 7th and 28th day postvaccination. They were stored at -20 0 C until determination.
2.2. ELISA:2.2. ELISA:
Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit 50 /&mgr;&Igr; Antigen je Kavität (10 mg/l) in Carbonatpuffer, pH 9,55, über Nacht bei 4 °C benetzt.Polystyrene microplates were wetted with 50 μl of antigen per well (10 mg/L) in carbonate buffer, pH 9.55, overnight at 4 °C.
Die zu untersuchenden Seren wurden mit PBS TPPG (PBS, 0,1 % Tween 20 , 2 % Polyethyienglycol, 5 % Gelatine , 1 mg/l Phenolrot, pH 7,2) verdünnt und nachfolgend in der benetzten und gewaschenen Platte für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die nach Vorversuchen verwendeten Serumverdünnungen lagen im Bereich von 1 : 61 bis 1The sera to be examined were diluted with PBS TPPG (PBS, 0.1% Tween 20, 2% polyethylene glycol, 5% gelatin, 1 mg/l phenol red, pH 7.2) and then incubated in the wetted and washed plate for 90 minutes at room temperature. The serum dilutions used after preliminary tests were in the range of 1:61 to 1
Der Antikörper-Nachweis erfolgte in Doppeibestimmungen bei jeweils zwei verschiedenen Serumverdünnungen. Für die Erstellung der Bezugskurve wurde der Standard (Human Immunglobulin Anti-Tetanus "Dessau", Charg. Nr. 068/04/82, IFID1 Dessau, DDR) geometrisch in PBS TPPG 1:4 über 7 Stufen von 250 IE/I bis 0,061 IE/I verdünnt.Antibody detection was carried out in duplicate determinations using two different serum dilutions. To create the reference curve, the standard (Human Immunoglobulin Anti-Tetanus "Dessau", batch no. 068/04/82, IFID 1 Dessau, GDR) was geometrically diluted in PBS TPPG 1:4 over 7 steps from 250 IU/I to 0.061 IU/I.
Nach erneutem Waschen wurden die gebundenen, tetanusspezäfischen Antikörper bei der Antigiobuiintechnik mit einem peroxidasemarkierten anti-human-igG (1 mg/l) und bei der Capturetechnik mit enzymmarkiertem Tetanustoxin (0,5 mg/i) in PBS TPPG nachgewiesen. Die Inkubation erfolgte wieder für 90 min bei Raumtemperatur. Bei den bisherigen wie bei den folgenden Schritten betrug das Arbeitsvolumen 50 /&mgr;&Igr; je Vertiefung. Mit PBS Tween 20 wurde gewaschen.After washing again, the bound, tetanus-specific antibodies were detected in the anti-glycoprotein technique with a peroxidase-labeled anti-human IgG (1 mg/l) and in the capture technique with enzyme-labeled tetanus toxin (0.5 mg/l) in PBS TPPG. Incubation was again carried out for 90 minutes at room temperature. In the previous and following steps, the working volume was 50 /μλ per well. The well was washed with PBS Tween 20.
Durch Zugabe der Substratlösung (0,1 mol/l Citratpuffer, pH 5,5, 5 mmol/l ortho-Phenylendiamin , 5 mmol/l H2O2) startete die farbbildende Substratreaktion, die mit Stoppreagens (1 mol/l H2SO4, 0,05 mol/l Na2SO3) nach 25 min beendet wurde. Die Extinktionen wurden am Photometer mit Differenzlängenwellenmessung (Lambda = 492 nm, Lambda = 690 nm) ermittelt. Die Berechnung der Antikörper-Konzentrationen anhand der Bezugskurve erfolgte rechnergestützt am Robotron BC 5120 (5).The addition of the substrate solution (0.1 mol/l citrate buffer, pH 5.5, 5 mmol/l ortho-phenylenediamine, 5 mmol/l H 2 O 2 ) started the color-forming substrate reaction, which was terminated after 25 min with stop reagent (1 mol/l H 2 SO 4 , 0.05 mol/l Na 2 SO 3 ). The extinctions were determined on the photometer with differential wavelength measurement (lambda = 492 nm, lambda = 690 nm). The calculation of the antibody concentrations based on the reference curve was carried out computer-aided on the Robotron BC 5120 (5).
2.3. TNT:2.3.TNT:
Die Ermittlung der Anti-Tetanus-Antikörper-Konzentrationen der Seren mittels dieses Tests nahm das Staatliche Kontrollinstitut für Seren und Impfstoffe Berlin entsprechend AB 2 der DDR vor.The determination of the anti-tetanus antibody concentrations of the sera using this test was carried out by the State Control Institute for Sera and Vaccines in Berlin in accordance with AB 2 of the GDR.
Lineare Regression und Korrelationsanalyse
bi : Test auf Hypothese
a0 : Test auf Hypothese
r : Korrelationskoeffizient
+ : Hypothese angenommen
- : Hypothese abgelehntLinear regression and correlation analysis
bi : test for hypothesis
a 0 : Test for hypothesis
r : correlation coefficient
+ : Hypothesis accepted
- : Hypothesis rejected
• <• <
Messung nach Passing & BablokMeasurement according to Passing & Bablok
Claims (2)
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|---|---|---|---|
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ID=25748226
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE8817263U Expired - Lifetime DE8817263U1 (en) | 1988-08-23 | 1988-08-23 | Enzyme immunoassay for the detection of anti-tetanus antibodies |
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|---|---|
| DE (1) | DE8817263U1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918880A (en) * | 2018-04-26 | 2018-11-30 | 武汉生命科技股份有限公司 | Tetanus immune globulin blood sample screening reagent box, preparation method and application method |
-
1988
- 1988-08-23 DE DE8817263U patent/DE8817263U1/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108918880A (en) * | 2018-04-26 | 2018-11-30 | 武汉生命科技股份有限公司 | Tetanus immune globulin blood sample screening reagent box, preparation method and application method |
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