DE7406769U1

DE7406769U1 - Device for measuring antigen-antibody reactions

Info

Publication number: DE7406769U1
Application number: DE19747406769
Authority: DE
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Filing date: 1974-02-27
Publication date: 1980-05-22

Description

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29. Februar 1980 Dr.Ha/BlFebruary 29, 1980 Dr Ha / Bl

Vorrichtung zum Messen von AntIgen-Antikörper-ReaktionenDevice for measuring anti-gene-antibody reactions

Gegenstand der Erfindung Ist eine Vorrichtung zum Messen von Antigen-Antikörper-Reaktionen mit Laserlicht.The invention relates to a device for measuring antigen-antibody reactions with laser light.

Quantitative Angaben über Proteine in Körperflüssigkeiten charakterisieren den untersuchten Organismus in entscheidenden Punkten.Quantitative information on proteins in body fluids characterize the examined organism in decisive Points.

Immunologische Bestimmungsmethoden von Antigenen beruhen auf der Eigenschaft der Antigene, mit spezifisch gegen sie gerichteten Antikörpern stöchiometrisch unter Ausbildung von Präzipitaten zu reagieren. Auf diesem Prinzip aufbauend wurde eine Reihe von Verfahren entwickelt, von denen die wichtigsten nachfolgend in der Reihe steigender Empfindlichkeit einschließlich ihrer Nachweisgranzen aufgeführt sind.Immunological methods of determination of antigens are based on the property of the antigens with specifically directed against them Antibodies stoichiometric with the formation of precipitates to react. Building on this principle, a number of procedures have been developed, the most important of which are given below in the series of increasing sensitivity including their limits of proof are listed.

DoppeldIffus ion
Präzipitatanalyse Lineare Immundiffusion Radiale Immundiffusion Flockungstest
R i ngtestDouble effusion
Precipitate analysis Linear immunodiffusion Radial immunodiffusion Flocculation test
R i ngtest

Komplementbi ndungsreakt ion Indirekte Hämagglutination Hämagg1ut i nat i ons-Hemmtest Rad Io immunassayComplement binding reaction Indirect hemagglutination Haemagg1ut i nat i ons inhibition test Rad Io immunassay

40 ,ug/ml40 µg / ml

12,5-20 ,ug/ml12.5-20 µg / ml

12,5 ,ug/ml12.5 µg / ml

10 ,ug/ml10 µg / ml

1,3-3,0 ,ug/ml1.3-3.0 µg / ml

0,2-0,4 ,ug/ml0.2-0.4 µg / ml

0,1 ,ug/ml0.1 µg / ml

0,02-0,04 ,ug/ml0.02-0.04 µg / ml

0,006-0,01 ,ug/ml0.006-0.01, µg / ml

0,00005-0,005 ,ug/ml0.00005-0.005, µg / ml

Wie aus dieser Aufstellung zu ersehen, ist die Diffusionsmethode für eine Anzahl von Antigenen in Körperflüssigkeiten oder KuI-turfiltraten von Mikroorganismen häufig nicht empfindlich genug. Wegen der erforderlichen Diffusionszeit sind diese Methoden zudem langwierig. Während die empfindlicheren Testsysteme wie die Haemagglutination relativ aufwendig sind, sind die radioimiiiunologischen Verfahren durch den hohen Preis der Reagenzien und der erforderlichen Meßgeräte sehr kostspielig.As can be seen from this list, the diffusion method is for a number of antigens in body fluids or culture filtrates often not sensitive enough to microorganisms. Because of the diffusion time required, these methods are also tedious. While the more sensitive test systems such as haemagglutination are relatively complex, the radioimmunological ones are The process is very expensive due to the high price of the reagents and the required measuring equipment.

Einen Fortschritt in der Steigerung der Empfindlichkeit der schnell ablaufenden und mit bloßem Auge ablesbaren Flockungsreaktionen brachte der Einsatz von optischen Trübungsmeßgeräten, sogenannten Nephelometern.An advance in increasing the sensitivity of the Fast flocculation reactions that can be read with the naked eye were brought about by the use of optical turbidity measuring devices, so-called nephelometers.

Nephelometrische Konzentrationsbestimmungen sind spezifisch, schnell und preisgünstig. Hierbei wird das Streulicht, das von Präzipitatteilchen einer trüben Lösung ausgeht, gemessen. Es wird zunächst die Streulichtintensität von Lösungen unterschiedlicher, aber bekannter Konzentrationen gemessen und eine Eichkurve aufgestellt. Unter gleichen Versuchsbedingungen erfolgt dann die Streulichtmessung der unbekannten Lösung.Nephelometric concentration determinations are specific, quick and inexpensive. Here, the scattered light from Precipitate runs out of a cloudy solution, measured. First, the scattered light intensity of solutions of different, but measured concentrations of known and established a calibration curve. Takes place under the same test conditions then the scattered light measurement of the unknown solution.

Die verwendeten Meßgeräte bestehen aus einer inkohärenten Lichtquelle/einer optischen Spaltsystemanordnung, einer Küvette und einem Photodetektor. Nachteilig bei diesen Geräten ist die den Anforderungen häufig nicht genügende Nachweisempfindlichkeit, sowie die mangelnde Reproduzierbarkeit an der unteren Nachweisgrenze .The measuring devices used consist of an incoherent light source / one optical slit system arrangement, a cuvette and a photodetector. The disadvantage of these devices is the den Requirements often insufficient detection sensitivity, as well as the lack of reproducibility at the lower detection limit .

Diese Analysengeräte sind zudem sehr kostspielig. Automatische Geräte werden vereinzelt in Großkliniken eingesetzt, wo große Probenmengen analysiert werden. Beim Wechsel zur Bestimmung eines anderen Antigens muß die Anlage in mehreren Spülgängen gereinigt werden. Es werden daher für Mehrfachbestimmungen teure, parallel laufende Analysenstraßen verwendet.These analysis devices are also very expensive. Automatic devices are occasionally used in large clinics, where large Sample quantities are analyzed. When changing to the determination of a different antigen, the system must be rinsed in several cycles getting cleaned. Expensive analysis lines running in parallel are therefore used for multiple determinations.

In kleineren Kliniken, in der Arztpraxis oder in wissenschaftlichen Laboratorien benötigt man in der Bedienung flexiblereIn smaller clinics, in the doctor's office or in scientific Laboratories need more flexible operation

und preislich günstigere Geräte.and cheaper devices.

Es stellt sich daher die Aufgabe, eine Vorrichtung zu finden, mit der die Nachweisempfindlichkeit und deren Reproduzierbarkeit erheblich verbessert wird und die flexibler anwendbar ist.The task is therefore to find a device with which the detection sensitivity and its reproducibility is significantly improved and which is more flexible to use.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Messen von Antigen-Antikörper-Reaktionen, bei dem die Lösung des zu bestimmenden Antigens mit dem korrespondierenden Antikörper vermischt, die Mischung in den Strahlengang einer Lichtquelle gestellt und das nach vorwärts gestreute Licht mit einem Photodetektor gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mischung mit Laserlicht durchstrahlt und ausschließlich das unter kleinem Raumwinkel nach vorwärts gestreute Licht mit dem Photodetektor mißt und anschließend quantitativ analysiert.The invention relates to a method for measuring antigen-antibody reactions, in which the solution of the antigen to be determined is mixed with the corresponding antibody, the mixture is placed in the beam path of a light source and the forward scattered light is measured with a photodetector is, characterized in that the mixture is irradiated with laser light and exclusively that under small Measures the solid angle of the forward scattered light with the photodetector and then quantitatively analyzes it.

Darüber hinaus wurde eine Vorrichtung zur Durchführung des oben bezeichneten Verfahrens gefunden, die dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Meßk.üvette in der optischen Achse eines Meßsystems, bestehend aus einem Laser, mindestens zwei Blenden, einem Linsensystem und einem Photodetektor, zwischen den Blenden und dem Linsensystem angeordnet ist und, daß das Meßsystem zwischen Meßküvette und Linsensystem in der optischen Achse eine Lichtfalle aufweist, deren Durchmesser das 1,1- bis l,7fache des Laserstrahldurchmessers beträgt.In addition, a device has been found for carrying out the above-mentioned method, which is characterized in that that a measuring cuvette in the optical axis of a measuring system, consisting of a laser, at least two diaphragms, a lens system and a photodetector, between the diaphragms and the Lens system is arranged and that the measuring system between the measuring cuvette and lens system is a light trap in the optical axis whose diameter is 1.1 to 1.7 times the laser beam diameter amounts to.

Unter Lichtfalle werden z.B. Einrichtungen zum Absorbieren des Lichtes oder Umlenken des Lichtes wie Spiegel, Prismen, Lichtleiter u.dgl. verstanden.Light traps include, for example, devices for absorbing light or deflecting light such as mirrors, prisms, light guides and the like. Understood.

Die Vorrichtung kann dadurch verbessert werden, daß man innerhalb des Linsensystems eine Einrichtung zum Ausblenden des von den Blenden herrührenden Streulichts anordnet.The device can be improved by having a device within the lens system for masking out the from arranges scattered light originating from the aperture.

Besteht die Lichtfalle aus einem Spiegel, so kann bei entsprechender Justierung zu den Laserendflächen oder zu einem zwischen Laser und Meßküvette angeordneten Spiegel eine Intensitätsverbesserung erreicht werden.If the light trap consists of a mirror, then with the appropriate Adjustment to the laser end faces or to a mirror arranged between the laser and the measuring cell improves the intensity can be achieved.

Die Figuren zeigen die Erfindung in beispielsweiser Ausführung Fig. 1 zeigt einen schematischen Aufbau der Vorrichtung mit der Anordnung des Strahlenganges.The figures show the invention in an exemplary embodiment. FIG. 1 shows a schematic structure of the device the arrangement of the beam path.

Die Fig.2 und 3 zeigen zwei Ausführungsbeispiele. Aufgetragen ist das Streulichtsignal U als Funktion der Konzentration C.FIGS. 2 and 3 show two exemplary embodiments. Applied is the scattered light signal U as a function of the concentration C.

fj In das Lichtbündel 11, eines Lasers 1, beispielsweise eines p He-Ne-Lasers, werden die beiden Blenden 2 und 3 gebracht. Hinterfj In the light beam 11, a laser 1, for example one p He-Ne laser, the two diaphragms 2 and 3 are brought. Behind

den Blenden durchdringt das Laserlicht eine beispielsweise 10 mmThe laser light penetrates the aperture, for example 10 mm

rj . -rj. -

tiefe, 4 mm breite und 20 mm hohe Küvette 4. Eindeep, 4 mm wide and 20 mm high cuvette 4. A

einseitig verschlossenes geschwärztes Röhrchen 5(Durchmesser 1,5 mm) o.a. dient als Lichtfalle für den direkten Laserstrahl und ist vorzugsweise direkt hinter der Küvette angeordnet. In die Küvette werden 0,1 ml des Antigens, beispielsweise menschliches Serum, und 0,1 ml Antiserum, das Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen enthält, gefüllt. Die in der Reaktionslösung entstehenden Präzipitatteilchen streuen Licht. Das unter kleinem Raumwinkel in Vorwärtsrichtung gestreute Licht wird mit Hilfe eines Linsensystems 9 auf einen Photodetektor 7 gesammelt. Bei Verwendung der oben beschriebenen Küvette gelangt auch unter größeren Winkeln gestreutes Licht durch Reflexion an den Innenwänden der Küvette noch in das Linsensystem. Die Signale des Photodetektors 7, ζ.3. einer Photodiode, werden einem Nachweisinstrument 8, z.B. einem Schreiber, zugeführt. Eine kleine schwarze Blende 6 (Durchmesser ist ca, Laserstrahldurchmesser) ■ wird innerhalb des Linsensystems 9 an vier dünnen Fäden 10 befestigt. Hierdurch kann das an den Blenden 2 und 3 entstehende Streulicht ausgeblendet und der Störuntergrund verkleinert werden. blackened tube 5 (diameter 1.5 mm) closed on one side serves as a light trap for the direct laser beam and is preferably arranged directly behind the cuvette. 0.1 ml of the antigen, for example human Serum, and 0.1 ml of antiserum, the antibody against the one to be determined Contains antigen, filled. The ones in the reaction solution resulting precipitate particles scatter light. The light scattered at a small solid angle in the forward direction is with With the help of a lens system 9 collected on a photodetector 7. When using the cuvette described above, it also gets under Light scattered from larger angles through reflection on the inner walls of the cuvette into the lens system. The signals of the photodetector 7, ζ.3. a photodiode, become a detection instrument 8, e.g. fed to a writer. A small black aperture 6 (diameter is approx, laser beam diameter) ■ is attached to four thin threads 10 within the lens system 9 attached. In this way, the scattered light generated at the diaphragms 2 and 3 can be masked out and the background interference can be reduced.

Im Versuch zum Nachweis der Empfindlichkeit und Reproduzierbar keit des Verfahrens wurde als Antigen-Antikörper-Reaktion das System Albumin/Antialbumin eingesetzt. Dazu wurde als AntigenIn an attempt to demonstrate the sensitivity and reproducibility of the method, the antigen-antibody reaction was used System albumin / anti-albumin used. It was used as an antigen

ein albuminhaltiges menschliches Blutserum 1:52 verdünnt. Als Antikörper wurde ein Anti-Humanalbumin-Serum vom Kaninchen in zwei Verdünnungen (1:5 bzw. 1:40) eingesetzt. Die Reagenzlösungen wurden durch ein Membranfilter, vom Porendurchmesser vorteilhaft kleiner als 0,3 pm, filtriert und gleiche Volumina in die Küvette gefüllt. Nach 45 Minuten wurde die Küvette kräftig geschüttelt, um den selbst noch bei niedrigen Konzentrationen, d.h. ·<£1Ο~2 mg/100 ml, auftretenden Bodensatz aufzuwirbeln. Die Küvette wurde in den Strahl des Lasers gebracht und das Streulicht gemessen. Bei hoher wie auch bei niedriger Antikörperkonzentration wurde ein linearer Zusammenhang in doppellogarithmischer Darstellung über 4 Zehnerpotenzen der Albuminkonzentration festgestellt.an albumin-containing human blood serum diluted 1:52. An anti-human albumin serum from rabbits in two dilutions (1: 5 or 1:40) are used. The reagent solutions were passed through a membrane filter, the pore diameter advantageous smaller than 0.3 pm, filtered and equal volumes in the cuvette is filled. After 45 minutes the cuvette was shaken vigorously in order to i.e. <£ 1Ο ~ 2 mg / 100 ml to stir up any sediment. the The cuvette was brought into the laser beam and the scattered light was measured. With high as well as low antibody concentration became a linear relationship in a double logarithmic representation over 4 powers of ten of the albumin concentration detected.

Fig. 2 zeigt Antigen-Antikörper-Reaktionskennlinien A, B und C von drei verschiedenen gegen das Antigen Albumin gerichteten Kaninchen-Antiseren. Die Streulichtintensität U ist über 4 Zehnerpc cenzen hinweg in doppellogarithmischer Darstellung linear von der Albuminkonzentration abhängig.Fig. 2 shows antigen-antibody reaction characteristics A, B and C. of three different rabbit antisera directed against the antigen albumin. The scattered light intensity U is over 4 tens in a double logarithmic representation linearly dependent on the albumin concentration.

Die Abweichungen der Meßpunkte von der zeichnerisch gemittelten Funktion betrugen oberhalb 0,1 mg/100 ml nur etwa ± 5%. Bei relativ hohen Konzentrationen von Standard-Human-Serum von 10 mg/ 100 ml lösten sich die Präzipitatteilchen teilweise wieder auf und das Streulichtsignal nahm ab. In diesen Fällen empfiehlt sich eine entsprechende Vorverdünnung der Antigenlösung.The deviations of the measuring points from the graphically averaged Function was only about ± 5% above 0.1 mg / 100 ml. At relatively high concentrations of standard human serum of 10 mg / 100 ml, the precipitate particles partially redissolved and the scattered light signal decreased. Recommended in these cases a corresponding pre-dilution of the antigen solution.

Bei herkömmlichen Streulichtmessungen erreicht man Genauigkeiten von ί 10%, wobei die untere Nachweisgrenze im günstigsten Falle bei etwa 10"^ mg/100 ml liegt. Durch den Einsatz eines Gaslasers, wie eines He-Ne-Lasers von 1 mW und durch Messen des in Vorwärtsrichtung gestreuten Lichtes kann bei nephelometrischen Untersuchungen eine Empfindlichkeitssteigerung um einen Faktor von etwa 100 erreicht werden. Der quantitative Nachweis von Antigenkonzentrationen von 10"^ mg/100 ml = 0,01 ja g/ml wird heim Einsatz von sorgfältig filtrierten Lösungen möglich. Die Reproduzierbarkeit der Meßpunkte der Eichkurve ist sehr gut.With conventional scattered light measurements, accuracies of ί 10% are achieved, with the lower detection limit in the most favorable case is about 10 "^ mg / 100 ml. By using a gas laser, like a He-Ne laser of 1 mW and by measuring the light scattered in the forward direction, nephelometric examinations an increase in sensitivity by a factor of about 100 can be achieved. The quantitative detection of Antigen concentrations of 10 "^ mg / 100 ml = 0.01 yes g / ml will Possible using carefully filtered solutions. The reproducibility of the measuring points of the calibration curve is very good.

Die einmal festzustellende Abhängigkeit der Antigenkonzentrationen von der entsprechenden Signalintensität des Laserstreulichts erlaubt wiederholt die Zuordnung des gemessenen Signals zur gesuchten Konzentration des Antigens. Dadurch erscheint es nicht erforderlich, bisher übliche Kontroll- und Parallelmessungen mit Eichsubstcinzen durchzuführen.The dependency of the antigen concentrations to be determined the corresponding signal intensity of the laser scattered light allows the measured signal to be assigned repeatedly to the desired concentration of the antigen. This is how it appears it is not necessary to carry out the control and parallel measurements with calibration substances that have been customary up to now.

Es wurde weiter gefunden, daß durch Erhöhung der Leistung der Lichtquelle um das Dreifache, beispielsweise durch Ersatz eines 1 mW-Lasers durch einen 3 mW-Laser, und durch eine verbesserte Fokussierung des Streulichts auf den photoelektrischen Empfänger, z.B. durch Verwendung einer Mikroskoplinse als Linsensystem 9, die Empfindlichkeit des Gerätes wesentlich gesteigert werden kann. Mit diesem empfindlicheren Gerät gelingt es, um eine weitere Zehnerpotenz bis in den 0,001 ug/ml-Meßbereich vorzustoßen und Spurenantigene nachzuweisen. Für quantitative Untersuchungen in diesem Bereich ist es jedoch erfordsrlich, Vorkehrungen gegen Staubverunreinigungen im Meßraum durch Laminarflow zu treffen.It was further found that by increasing the power of the light source by three times, for example by replacing one 1 mW laser by a 3 mW laser, and by an improved one Focusing the scattered light on the photoelectric receiver, e.g. by using a microscope lens as a lens system 9, the sensitivity of the device increased significantly can be. With this more sensitive device it is possible to advance by a further power of ten down to the 0.001 µg / ml measuring range and detect trace antigens. However, for quantitative studies in this area it is necessary to take precautions against dust contamination in the measuring room by laminar flow.

Bekanntlich läßt sich durch Zugabe von Äthylenglykol die Zeit der Antigen-Antikörper-Reaktion verkürzen, d.le auch bei den Laserstreulichtmessungen genutzt werden kann.It is known that the time of the antigen-antibody reaction can be shortened by adding ethylene glycol, i.e. also with the Laser scattered light measurements can be used.

Es ist weiter bekannt, daß bei hohen Antigen-Konzentrationen ein Teil der Präzipitatteilchen noch innerhalb der Reaktionszeit sedimentiert. Der Reaktionsansatz wird daher vorteilhaft nach Beendigung der Reaktion kräftig geschüttelt. Diese Meßwerte sind häufig besser zu reproduzieren als Werte von Reaktionsansätzen, die nicht geschüttelt wurden. It is also known that at high antigen concentrations, some of the precipitate particles still occur within the reaction time sediments. The reaction mixture is therefore advantageously shaken vigorously after the reaction has ended. These readings are often easier to reproduce than values from reaction mixtures that have not been shaken.

Erfindungsgemäß lassen sich alle Antigene in Lösungen bestimmen, gegen die spezifisch Antiseren erhalten werden können. Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet der Methode liegt in der quantitativen Bestimmung der Bestandteile von Körperflüssigkeiten, insbesondere des Blutplasmas, und von antigenen mikrobiellen Stoffwechselprodukten oder Pflanzeninhaitsstoffen.According to the invention, all antigens can be determined in solutions against which specific antisera can be obtained. A preferred one The method is used in the quantitative determination of the constituents of body fluids, in particular of the blood plasma, and of antigenic microbial metabolic products or plant ingredients.

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Durch geeignete Abwandlungen der Anordnung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, läßt sich das Verfahren auch automatisieren, wie dies in ähnlicher Weise bei Nephelometern mittels Fluoreszenz-Spektral -Photometern bereits bekannt ist.The process can also be automated by suitable modifications of the arrangement, as described above, like this in a similar way with nephelometers by means of fluorescence spectral Photometers is already known.

An einem nachfolgenden Beispiel soll die quantitative Bestimmung eines Spurenproteins aus Plasma die Erfindung näher erläutern.The quantitative determination of a trace protein from plasma is intended to explain the invention in more detail using the following example.

/8/8th

EXAMPLE

2 ml eines Patientenserums werden durch ein Membranfilter der Firma Millipore (Porendurchmesser 0,05 um) filtriert. 0,2 ml eines IgE-Antiserums, das 1:5 mit isotonischer Kochsalzlösung vorverdünnt wurde, werden in die MeßTcüvette der Apparatur gegeben und mit 0,2 ml des filtrierten Patientenserums vermischt. Die Küvette wird luftdicht verschlossen und bei Zimmertemperatur 16 Stunden stehengelassen. Danach wird die Küvette dreimal kurz geschüttelt. Nach 10 Minuten in Ruhe wird die Küvette in den Strahlengang des Laser-Streulicht-Meßgerätes gestellt. Fig. 3 zeigt die Kennlinie des Iiranunglobulin E(IgE)-Spurenproteins, die durch Verdünnung des bei der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Verfügung stehenden Standards gewonnen wurde. Das abgelesene Signal U in mV wird mit den Werten diesier Kennlinie in Beziehung gesetzt. Es ergeben sich 300 Einheiten IgE/ml im getesteten Serum.2 ml of a patient's serum are filtered through a membrane filter of the Millipore (pore diameter 0.05 µm) filtered. 0.2 ml of an IgE antiserum that is 1: 5 with isotonic saline was prediluted, are placed in the measuring cell of the apparatus and mixed with 0.2 ml of the filtered patient serum. The cuvette is sealed airtight and at room temperature Left for 16 hours. The cuvette is then briefly shaken three times. After 10 minutes of rest, the cuvette is placed in the Set the beam path of the laser scattered light measuring device. Fig. 3 shows the characteristic curve of the Iranoglobulin E (IgE) trace protein, obtained by diluting the standard available from the World Health Organization (WHO). The read Signal U in mV is related to the values of this characteristic. There are 300 units IgE / ml in the tested Serum.

Mit der Vorrichtung ist es erstmals möglich, schnell, einfach und sehr empfindlich den IgE-Proteingehalt im Serum bis zu 150 E/ml zu bestimmen. Mit der radialen Immundiffusion war es bisher nur möglich, erhöhte IgE-Konzentrationen oberhalt 800 E/ ml zu messen.With the device it is possible for the first time to quickly, easily and very sensitively the IgE protein content in the serum up to 150 U / ml to be determined. With radial immunodiffusion it was previously only possible to detect increased IgE concentrations above 800 U / to measure ml.

Claims

G * 7 ^ 'O6 769.9

Hoe 74 / Β 004 H-Ma

February 29, 1980 Dr Ha / Bl

New claim:

An apparatus for measuring antigen-antibody reactions, characterized in that CD are arranged in the beam path of a laser light source: a measuring cell ⁽¹ O and a photodetector (7), between the laser light source and measuring cuvette two diaphragm C2 and 3) undesirable for extracting edge radiation , between the measuring cuvette and the photodetector a lens system (9) for focusing the forward scattered light and at the light exit of the measuring cuvette a light trap (5) whose diameter is 1.1 to 1.7 times the laser beam diameter.