DE69929248T2 - CONTAINER FOR IMMUNOASSAYS - Google Patents
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Abstract
Description
Diese Erfindung betrifft einen Behälter, der für die Lagerung, Verdünnung oder Reaktion eines Reagenzes und/oder einer Testprobe in einem Immunoassay zum Ermitteln eines Antigens oder eines Antikörpers durch Antigen/Antikörperreaktion verwendet wird.These Invention relates to a container, the for storage, dilution or reaction of a reagent and / or a test sample in one Immunoassay for detecting an antigen or an antibody Antigen / antibody reaction is used.
Allgemeine Immunoassays verwenden einen Behälter aus Polystyrol oder Polypropylen zur Lagerung und Verdünnung eines Reagens oder einer Probe, die verwendet werden. Moleküle, die in dem Reagens oder der Probe enthalten sind, werden nicht spezifisch an einen solchen Behälter adsorbiert, und eine solche Adsorption verursacht notwendigerweise einen Verlust des Reagenzes oder der Probe ebenso wie eine Variation der Konzentration einer Lösung, die das Reagens oder die Probe enthält.General Immunoassays use a container made of polystyrene or polypropylene for storage and dilution of a Reagent or a sample used. Molecules that in the reagent or the sample are not specific to such a container adsorbed, and such adsorption necessarily causes a loss of the reagent or the sample as well as a variation of the Concentration of a solution, containing the reagent or sample.
In den letzten Jahren wurden entsprechend der Variation der Immunoassay-Verfahren in den meisten Fällen natürlich auftretende Substanzen nach Extraktion und Reinigung, insbesondere bei der Arzneimittelproduktion von Arzneimittelherstellern verwendet. Allgemein gesprochen werden solche Substanzen in sehr kleinen Mengen erhalten und sind ziemlich teuer. Daher ist die Reduktion der Menge an Substanzen während der Lagerung und Verdünnung, die durch physikalische Adsorption an einen Behälter verursacht wird, nicht vernachlässigbar.In Recent years have been consistent with the variation of immunoassay procedures in most cases Naturally occurring substances after extraction and purification, in particular used in drug production by drug manufacturers. Generally speaking, such substances are in very small quantities get and are pretty expensive. Therefore, the reduction of the amount on substances during storage and dilution, which is caused by physical adsorption to a container, not negligible.
Wenn Proben, die für die klinische Diagnose verwendet werden, wie Serum und Urin von Patienten gesammelt werden, in einem Behälter angeordnet und darin gelagert werden, bis die Proben untersucht werden, werden klinisch wichtige Proteine, die in den Proben enthalten sind, wie Albumin, Transferrin und Immunoglobulin an den Behälter adsorbiert. Die meisten Behälter, die für die klinische Diagnose, einschließlich Spritzen und Deckel bei der Sammlung einer Probe verwendet werden, Rohre, die bei der Lagerung der Probe verwendet werden und Zentrifugationsrohre und Testrohre, die beim Reinigen, Konzentrieren oder verdünnen der Probe verwendet werden, sind aus Polypropylen oder Polystyrol gebildet, und ein solcher Behälter wird keiner Oberflächenbehandlung unterworfen. Selbst wenn eine Spurenmenge an Proteinen, die in der Probe enthalten sind, an den Behälter bei jedem Schritt adsorbiert wird, wird erwartet, daß die Konzentration der Proteine stark variiert, nachdem alle Schritte durchgeführt sind, im Vergleich zu der Konzentration der Proteine beim Sammeln der Probe.If Samples for Clinical diagnosis can be used, such as serum and urine from Patients are collected, placed in a container and stored therein until the samples are examined become clinically important Proteins contained in the samples, such as albumin, transferrin and immunoglobulin to the container adsorbed. Most containers, the for clinical diagnosis, including syringes and lids The collection of a sample used pipes during storage the sample can be used and centrifugation tubes and test tubes, used in cleaning, concentrating or diluting the sample, are made of polypropylene or polystyrene, and such container will no surface treatment subjected. Even if a trace amount of proteins present in the Sample are included in the container is adsorbed at each step, it is expected that the concentration the proteins varies greatly after all the steps are done compared to the concentration of proteins in collecting the Sample.
Im allgemeinen macht der Preis eines Reagenzes in immobilisierter Form etwa 80 % der Kosten für ein klinisches Testkit aus, das durch einen Arzneimittelhersteller für klinische Versuche verkauft wird. Wenn daher die Reduktion des Reagenzes durch Adsorption an einen Behälter unterdrückt wird, werden die Produktionskosten stark vermindert.in the general makes the price of a reagent in immobilized form about 80% of the cost of one Clinical test kit approved by a clinical drug manufacturer Attempts is sold. Therefore, if the reduction of the reagent by Adsorption to a container repressed becomes, the production costs are greatly reduced.
Bei einem Festphasenverfahren (eine Art eines Immunoassayverfahrens) wird ein Assay durch Verwendung von Proteinen durchgeführt, die an der Oberfläche eines Behälters für einen Immunoassay immobilisiert sind. Daher verwendet ein Festphasenverfahren einen Behälter, mit dem eine "hohe Adsorptionsbehandlung" durchgeführt wird, bei dem zur Erhöhung der Menge eines Reagenzes, das an die Oberfläche des Behälters immobilisiert werden soll, ein hydrophiles/hydrophobes-Gleichgewicht an der Oberfläche durch Einfügung einer funktionellen Gruppe wie Hydroxyl-Gruppe, reguliert wird, um hierdurch die Sättigungsadsorptionsmenge des Reagenzes zu erhöhen.at a solid phase method (a kind of immunoassay method) For example, an assay is performed by using proteins that on the surface a container for one Immunoassay are immobilized. Therefore, uses a solid phase method a container, with the one "high Adsorption treatment "is carried out at which to increase the amount of a reagent immobilized on the surface of the container should, a hydrophilic / hydrophobic balance at the surface by insertion of a functional group such as hydroxyl group, is regulated to thereby the saturation adsorption amount of the reagent.
In den letzten Jahren wurden zur Verkürzung der Immunoassayzeit und zur Durchführung eines Immunoassays im großen Umfang Immunoassayverfahren entwickelt, die einen automatischen Analysator (Roboter) verwenden. Solche Verfahren wurden hauptsächlich angewandt, insbesondere bei der Arzneimittelherstellung von Arzneimittelherstellern.In Recent years have seen the shortening of the immunoassay time and to carry out of an immunoassay on a large scale Scope immunoassay method developed an automatic Use analyzer (robot). Such procedures were mainly applied especially in drug manufacturing by drug manufacturers.
Wenn ein Assay mit Hilfe eines konventionellen Festphasenverfahrens durchgeführt wird, ist ein Waschschritt zum Eliminieren von nicht-immobilisierten überflüssigen Molekülen erforderlich. Ein automatischer Analysator hat jedoch Probleme bei der Durchführung des Waschschrittes, bei dem die fraktionelle Injektion und Saugen einer Waschlösung wiederholt werden. Daher wurde ein sequentielles Additionsverfahren als Immunoassayverfahren entwickelt, das für einen automatischen Analysator geeignet ist, weil ein solches Verfahren keine Trennung einer reagierten Substanz und einer nicht-reagierten Substanz durch einen Waschschritt erfordert.If an assay is performed using a conventional solid phase method, a washing step is required to eliminate non-immobilized redundant molecules. An automatic analyzer, however, has problems performing the Washing step, in which the fractional injection and suction of a wash solution be repeated. Therefore, a sequential addition method was used as Immunoassay method developed for an automatic analyzer is suitable because such a method did not react a separation Substance and a non-reacted substance through a washing step requires.
In einem sequentiellen Additionsverfahren wird die Immobilisierung von Molekülen während der Reaktion durchgeführt, und die Reaktion wird in einer Lösung durchgeführt. Wenn ein Behälter mit einer Oberfläche verwendet wird, mit dem die oben genannte starke Adsorptionsbehandlung durchgeführt ist, behindert die unerwünschte Adsorption der Moleküle die Reaktion in der Lösung oder erniedrigt die Reaktionseffizienz.In a sequential addition process, the immobilization of molecules is carried out during the reaction, and the reaction is carried out in a solution. If a container is used with a surface with which the above-mentioned strong adsorption treatment is performed, hinders the un desired adsorption of the molecules, the reaction in the solution or lowers the reaction efficiency.
In den letzten Jahren wurden entsprechend dem Fortschritt der Meßtechniken Auswertungen durch ein Fluoreszenzverfahren oder Emissionsverfahren entwickelt, wobei das Verfahren eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zum Absorbanzassay mit Hilfe eines konventionellen kolorimetrischen Verfahrens aufweist. Daher wird in der Zukunft erwartet, daß die unerwünschte Adsorption von Molekülen an einen Behälter Probleme in einem solchen Assayverfahren mit hoher Empfindlichkeit verursacht.In Recent years have been consistent with the progress of measurement techniques Evaluations by a fluorescence method or emission method developed, the method compared a high sensitivity to absorbance assay using a conventional colorimetric Has method. Therefore, in the future, it is expected that the unwanted adsorption of molecules to a container Problems in such a high sensitivity assay method caused.
Gegenwärtig gibt es einen Behälter, der für ein solches Verfahren verwendet wird, ohne Berücksichtigung der molekularen Adsorption; das heißt der Behälter ist aus Polystyrol oder Polypropylen angesichts der Formbarkeit, Transparenz und Niedrigtemperaturresistenz gebildet, und mit dem Behälter wird keine Oberflächenbehandlung zur Unterdrückung der Adsorption der Moleküle durchgeführt. Angesichts der Eigenschaften des Behälters wurde kein Versuch durchgeführt, um die Probleme wie Verlust eines Reagenzes und die Reduktion der Empfindlichkeit zu lösen.Currently there there is a container, the for Such a method is used without regard to the molecular Adsorption; this means the container is made of polystyrene or polypropylene in view of formability, Transparency and low temperature resistance formed, and with the container will not be a surface treatment for suppression the adsorption of the molecules carried out. In view of the properties of the container, no attempt was made to the problems like loss of a reagent and the reduction of sensitivity to solve.
Zur Steuerung der spezifischen Adsorption der Moleküle an der Oberfläche eines Behälters für Immunoassays wurden bisher mehrere Techniken untersucht und durchgeführt.to Controlling the specific adsorption of molecules on the surface of a container for immunoassays So far, several techniques have been studied and performed.
Beispielsweise wird ein Blockierverfahren am häufigsten durchgeführt, worin ein Behälter mit einem Protein beschichtet ist, das für eine Probe, die untersucht werden soll, inaktiv ist. Weil das Verfahren grundsätzlich die nicht-spezifische Adsorption des Proteins an dem Behälter anwendet, können Blockierwirkungen von Behälter zu Behälter variieren und von dem Zustand des Proteins abhängen. Weil das inaktive Protein an dem Behälter nicht spezifisch adsorbiert ist, löst sich das Protein leicht von dem Behälter in eine Lösung, und somit kann der Behälter für die Lagerung der Lösung nicht verwendet werden. Die offengelegten japanischen Patentanmeldungen (Kokai) 6-174726 und 7-128336 offenbaren eine Technik, bei der eine solche Ablösung eines Proteins durch chemisches Immobilisieren des Proteins an einen Behälter eliminiert wird. Die Struktur des Proteins kann mit der Trocknungstemperatur, Lagerungstemperatur und Lagerungszeit variieren, und somit wird der Behälter in der Praxis nicht in großem Ausmaß verwendet.For example is a blocking method most common carried out, wherein a container coated with a protein that is probing for a sample to be, is inactive. Because the procedure basically the non-specific adsorption of the protein to the container applies, can Blocking effects of container to container vary and depend on the state of the protein. Because the inactive protein on the container is not specifically adsorbed, the protein dissolves easily from the container into a solution, and thus the container for the Storage of the solution Not used. Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) 6-174726 and 7-128336 disclose a technique in which a such replacement of a Protein is eliminated by chemically immobilizing the protein to a container becomes. The structure of the protein may vary with the drying temperature, Storage temperature and storage time vary, and thus will the container not great in practice Extent used.
Wenn die Struktur höherer Ordnung eines Proteins, das an einen Behälter adsorbiert ist, variiert, induziert das Protein eine sekundäre Adsorption. Wenn ein Protein, das in einem freien Zustand inaktiv ist, an einen Behälter adsorbiert oder chemisch gebunden wird, kann das Protein nicht vollständig seinen inaktiven Zustand aufrechterhalten, und zwar aufgrund der Änderung der Struktur höherer Ordnung. Selbst wenn die Adsorption eines anderen Proteins an den Behälter verhindert werden kann, induziert die Varianz der Struktur höherer Ordnung die sekundäre Adsorption zwischen den Proteinen.If the structure higher Order of a protein that is adsorbed to a container varies, the protein induces a secondary adsorption. If a protein, which is inactive in a free state, adsorbed to a container or becomes chemically bound, the protein can not completely be maintained inactive condition, due to the change the structure higher Order. Even if the adsorption of another protein to the container can be prevented, inducing the variance of the higher order structure the secondary Adsorption between the proteins.
Die sekundäre Adsorption zwischen Proteinen variiert mit der Art der Proteine und somit muß ein Protein, das zum Blockieren geeignet ist, jedes Mal ausgewählt werden, wenn eine Probe, die untersucht werden soll, geändert wird. Wenn eine Lösung mit unterschiedlichen Proteinen wie Serum als Probe verwendet wird, kann ein Nicht-Blockieren des Proteins die Adsorption aller Proteine kontrollieren, die in der Probe enthalten sind.The secondary Adsorption between proteins varies with the type of proteins and thus one must Protein that is suitable for blocking to be selected each time when a sample to be examined is changed. If a solution with different proteins such as serum can be used as a sample a non-blocking of the protein adsorption of all proteins control contained in the sample.
Angesichts des oben Beschriebenen haben diese Erfinder intensive Untersuchungen bezüglich der Eigenschaften eines Behälters durchgeführt und festgestellt, daß dann, wenn die Sättigungsmenge der Moleküle, die an dem Behälter adsorbiert sind, die für einen Immunoassay verwendet werden, auf einen bestimmten Wert oder weniger eingestellt werden, ein Verlust des Reagenzes oder einer Probe während der Lagerung, Verdünnung und Reaktion verhindert wird und die Probe mit hoher Empfindlichkeit untersucht werden kann.in view of of the above, these inventors have intensive investigations in terms of the characteristics of a container carried out and found that then, if the saturation amount the molecules, the on the container are adsorbed for an immunoassay can be used to a certain value or be set less, a loss of the reagent or a Sample during storage, dilution and reaction is prevented and the sample with high sensitivity can be examined.
Demzufolge gibt diese Erfindung einen Behälter für einen Immunoassay an, worin die Sättigungsadsorptionsmenge von Molekülen, gemessen durch den kolloidalen Goldmarkierungsimmunoassay, die für den Assay verwendet werden, 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger ist, worin zumindest eine Innenoberfläche des Behälters aus einem 2-Methacryloyloxyethylphosphocholin (MPC)/Butylmethacrylat (BMA)-Copolymer (Verhältnis von MPC zu BMA = 3/7) gebildet oder mit diesem beschichtet ist, worin der Kontaktwinkel der Innenoberfläche des Behälters und Wasser 30° oder weniger ist.Accordingly, this invention provides a container for an immunoassay, wherein the saturation adsorption amount of molecules as measured by the colloidal gold labeling immunoassay used for the assay is 1 x 10 -1 pmol / cm 2 or less, wherein at least one inner surface of the container is made of a 2-methacryloyloxyethylphosphocholine (MPC) / butylmethacrylate (BMA) copolymer (behaves or MPC to BMA = 3/7), wherein the contact angle of the inner surface of the container and water is 30 ° or less.
In einem konventionellen Behälter aus Polystyrol oder Polypropylen für einen Immunoassay ist die Adsorptionsmenge der Moleküle (z.B. Proteine) etwa 1-10 pmol/cm2 oder mehr; d.h. etwa 20-50 % der Moleküle (z.B. Proteine), die für einen Immunoassay verwendet werden, werden an dem Behälter adsorbiert, obwohl die Adsorptionsmenge entsprechend der Konzentration einer Lösung, die solche Moleküle enthält, und der Kontaktfläche zwischen den Molekülen und dem Behälter variiert. Wenn die adsorbierten Moleküle (20-50 % aller Moleküle) für die Reaktion in der Lösung essentiell sind, ist die Reaktionseffizienz, d.h. Assayempfindlichkeit um 20-50 % vermindert. Wenn die adsorbierte Substanz so ist, daß sie eine molekulare strukturelle Änderung aufgrund der Adsorption eingeht, um hierdurch eine nicht erwünschte Reaktion zu verursachen, wird eine beachtliche Störung resultieren.In a conventional container of polystyrene or polypropylene for immunoassay, the adsorption amount of the molecules (eg, proteins) is about 1-10 pmol / cm 2 or more; that is, about 20-50% of the molecules (eg, proteins) used for an immunoassay are adsorbed on the container, though the amount of adsorption varies according to the concentration of a solution containing such molecules and the contact area between the molecules and the container , If the adsorbed molecules (20-50% of all molecules) are essential for the reaction in the solution, the reaction efficiency, ie assay sensitivity, is reduced by 20-50%. If the adsorbed substance is such that it undergoes a molecular structural change due to adsorption to thereby cause an undesirable reaction, a considerable disturbance will result.
Ein Behälter, bei dem keine Moleküle, die für einen Immunoassay verwendet werden, adsorbiert sind, ist besonders ideal, aber wenn die Adsorptionsmenge der Moleküle auf 1/10-1/100 im Hinblick auf das gegenwärtige Niveau wesentlich reduziert wird, werden zufriedenstellende Wirkungen erhalten.One Container, where no molecules, the for An immunoassay used, adsorbed, is special ideal, but if the adsorption amount of the molecules to 1 / 10-1 / 100 in terms of the current level is substantially reduced, satisfactory effects are obtained.
Obwohl die Adsorptionsmenge der Moleküle, die in einer Lösung enthalten sind, mit der Identität der Moleküle, Temperatur, Konzentration der Lösung und pH des Lösungsmittel variiert, erfüllt der Behälter wünschenswert die folgenden Bedingungen: die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle, die beim Immmunoassay verwendet werden, ist 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger unter den spezifischen Bedingungen – angesichts der Konzentration der Lösung, Temperatur und pH des Lösungsmittels -, unter denen die Reaktion und der Assay durchgeführt werden. Wenn Serum für einen Immunoassay verwendet wird, kann, weil Serum üblicherweise bis zu 1/10 verdünnt wird, die Wirkung dieser Erfindung erhalten werden, wenn die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle, die am Assay teilnehmen und/oder diesen beeinflussen, unter allen Molekülen, die in dem verdünnten Serum enthalten sind, immer 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger bei der verdünnten Konzentration des Serums und unter den spezifischen Bedingungen – angesichts der Konzentration der Lösung, Temperatur und pH des Lösungsmittels – unter denen die Reaktion und der Assay durchgeführt werden, ist.Although the adsorption amount of the molecules contained in a solution varies with the identity of molecules, temperature, concentration of the solution and pH of the solvent, the container desirably satisfies the following conditions: the saturation adsorption amount of the molecules used in the immunoassay 1 x 10 -1 pmol / cm 2 or less under the specific conditions - in view of the concentration of the solution, temperature and pH of the solvent - in which the reaction and assay are carried out. When serum is used for an immunoassay, because serum is usually diluted to 1/10, the effect of this invention can be obtained when the saturation adsorption amount of the molecules participating in and / or affecting the assay among all the molecules present in the diluted serum is always 1 × 10 -1 pmol / cm 2 or less at the diluted concentration of the serum and under the specific conditions - considering the concentration of the solution, temperature and pH of the solvent - under which the reaction and the assay are carried out be, is.
Wenn der Behälter für die Lagerung und Verdünnung eines Reagenzes verwendet wird, kann gleichermaßen die erfindungsgemäße Wirkung erreicht werden, wenn die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle, die eine Lagerung und Verdünnung eingehen, immer 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger unter den spezifischen Bedingungen – bezüglich Konzentration der Lösung, Temperatur und pH des Lösungsmittels – unter denen das Reagens von dem Lagerungsbehälter entfernt oder die Verdünnung durchgeführt wird, ist. In vielen Fällen wird das Reagens in dem Behälter bei einer Temperatur von –80°C gelagert. Die Adsorption der Moleküle ist jedoch eine Gleichgewichtsreaktion und somit ist es ausreichend, wenn die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger unter den spezifischen Bedingungen bezüglich Konzentration, Temperatur und pH, bei denen das Reagens vom Behälter entfernt wird, ist.Similarly, when the container is used for storage and dilution of a reagent, the effect of the present invention can be attained even if the saturation adsorption amount of the molecules undergoing storage and dilution are always 1 × 10 -1 pmol / cm 2 or less under the specific conditions With respect to concentration of the solution, temperature and pH of the solvent - under which the reagent is removed from the storage tank or the dilution is carried out. In many cases, the reagent is stored in the container at a temperature of -80 ° C. However, the adsorption of the molecules is an equilibrium reaction and thus it is sufficient if the saturation adsorption amount of the molecules is 1 × 10 -1 pmol / cm 2 or less under the specific conditions of concentration, temperature and pH at which the reagent is removed from the container. is.
Die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle ist mehr bevorzugt 1 × 10–2 pmol/cm2 oder weniger, mehr bevorzugt 1 × 10–3 pmol/cm2 oder weniger.The saturation adsorption amount of the molecules is more preferably 1 × 10 -2 pmol / cm 2 or less, more preferably 1 × 10 -3 pmol / cm 2 or less.
Beispiele der Moleküle, die in einem Immunoassay verwendet werden, umfassen Proteine (z.B. Enzyme, physiologisch aktive Proteine und Antikörper), Nukleinsäuren und physiologisch aktive Substanzen. Von diesen sind Proteine besonders bevorzugt. Die Sättigungsadsorptionsmenge der Moleküle kann mit Hilfe des kolloidalen Goldmarkierungsimmunoassays gemessen werden.Examples the molecules, used in an immunoassay include proteins (e.g. Enzymes, physiologically active proteins and antibodies), nucleic acids and physiologically active substances. Of these, proteins are special prefers. The saturation adsorption amount of the molecules can be measured by the colloidal gold labeling immunoassay become.
Wenn die Adsorption eines Proteins verhindert wird, entfaltet diese Erfindung ausgezeichnete Wirkungen zusätzlich zu den oben erwähnten charakteristischen Merkmalen. Wenn ein Protein an einen Behälter adsorbiert wird, variiert die Struktur des Proteins. Wenn ein Immunoassay durchgeführt wird, kann, obwohl ein Zielprotein in einer zu untersuchenden Probe enthalten ist, das Protein durch einen Antikörper aufgrund der Variation der Struktur des Proteins nicht ermittelt werden. Wenn ein klinischer Test durchgeführt wird, wird in der Praxis ein Serum, dessen Struktur durch Adsorption geändert ist, untersucht, selbst wenn Serum in dem gleichen Zustand untersucht werden muß, in dem das Serum in dem Organismus vorhanden ist. Erfindungsgemäß wird, weil ein Protein nicht an den Behälter adsorbiert wird, die Struktur des Proteins nicht geändert, und wenn somit ein klinischer Test durch Verwendung des Behälters durchgeführt wird, kann ein Serum in einem Zustand untersucht werden, der ähnlich dem ist, wenn ein Serum in einem Organismus vorhanden ist. Daher wird der Behälter dieser Erfindung sehr vorteilhaft als Behälter für einen Immunoassay verwendet.When the adsorption of a protein is prevented, this invention exhibits excellent effects in addition to the above-mentioned characteristic features. When a protein is adsorbed to a container, the structure of the protein varies. When an immunoassay is performed, although a target protein is contained in a sample to be examined, the protein can not be detected by an antibody due to the variation of the structure of the protein. In practice, when a clinical test is performed, a serum whose structure is changed by adsorption is examined, even if serum must be examined in the same condition in which the serum is present in the organism. Fiction Accordingly, because a protein is not adsorbed to the container, the structure of the protein is not changed, and thus, when a clinical test is performed by using the container, a serum can be assayed in a state similar to that of a serum present in an organism. Therefore, the container of this invention is most advantageously used as a container for an immunoassay.
Für einen Immunoassay muß die Sättigungsadsorptionsmenge von Molekülen in einem Anteil vermindert werden, in dem ein Reagens oder eine Probe in Kontakt gebracht wird, spezifrisch mit einer inneren Oberfläche des Behälters. Daher sollte die molekulare Sättigung der Adsorptionsmenge der inneren Oberfläche des Behälter zumindest 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger sein.For immunoassay, the saturation adsorption amount of molecules must be reduced in a proportion in which a reagent or a sample is brought into contact, specifically with an inner surface of the container. Therefore, the molecular saturation of the adsorption amount of the inner surface of the container should be at least 1 × 10 -1 pmol / cm 2 or less.
Wenn der inneren Oberfläche des Behälters durch Verwendung des spezifischen Copolymers eine Hydrophilizität verliehen wird, um hierdurch die Adsorptionsmenge der Moleküle zu vermindern, ist der Kontaktwinkel zwischen der Oberfläche und Wasser bevorzugt 30° oder weniger (stark hydrophil), mehr bevorzugt 15° oder weniger, deutlich bevorzugt 1° oder weniger (ultrahydrophil).If the inner surface of the container imparted hydrophilicity by using the specific copolymer is reduced to thereby reduce the adsorption amount of the molecules, For example, the contact angle between the surface and water is preferably 30 ° or less (highly hydrophilic), more preferably 15 ° or less, clearly preferred 1 ° or less (ultrahydrophilic).
Wenn ein 2-Methacryloyloxyethylphosphocholin/Butylmethacrylat-Copolymer, das das Polymer enthält, verwendet wird, wird der Kontaktwinkel zwischen der Oberfläche des resultierenden Behälters und Wasser 1° oder weniger (d.h, der Behälter ist ultrahydrophil) und die Sättigungsadsorptionsmenge der Proteine 1 × 10–3 pmol/cm2 oder weniger, was besonders bevorzugt ist.When a 2-methacryloyloxyethylphosphocholine / butylmethacrylate copolymer containing the polymer is used, the contact angle between the surface of the resulting container and water becomes 1 ° or less (ie, the container is ultrahydrophilic) and the saturation adsorption amount of the proteins is 1 × 10 . 3 pmol / cm 2 or less, which is particularly preferred.
Die Produktform des Behälters dieser Erfindung ist nicht besonders beschränkt und der Behälter kann konventionelle Formen annehmen, einschließlich Probenrohr, Zentrifugationsrohr, Multiwellplatte und Küvette. Zur Durchführung der Lagerung, Verdünnung, Reaktion und eines Assays einer Probe in einem Behälter nimmt der Behälter bevorzugt die Form einer Multiwellplatte ein.The Product shape of the container This invention is not particularly limited and the container may be conventional Take forms, including Sample tube, centrifugation tube, multiwell plate and cuvette. to execution storage, dilution, Reaction and an assay of a sample in a container takes the container prefers the shape of a multiwell plate.
Diese Erfindung wird nachfolgend detailliert unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.These Invention will be described in detail below with reference to FIGS Examples are described.
Referenzbeispiel 1 Reference Example 1
Eine 2,0 Gew./Vol.%ige Methanol-Lösung aus Polyhydroxyethylmethacrylat (P-3932, Produkt von SIGMA) (2,5 ml) wurde in ein kommerziell erhältliches Rohr aus Polystyrol (Eiken-Rohr für RIA Nr. 3, 70-12458) injiziert. Dann wurde die Lösung von dem Rohr entfernt, das Rohr wurde umgedreht, um zu verhindern, daß die restliche Lösung am Boden verbleibt, und das Rohr wurde bei Raumtemperatur 24 h getrocknet und anschließend wurde die Oberfläche des Rohres mit Polyhydroxyethylmethacrylat beschichtet. Im resultierenden Rohr war die Sättigungsadsorptionsmenge an Proteinen 8,7 × 10–4 pmol/cm2, und der Kontaktwinkel zwischen der Oberfläche und Wasser ist 0°.A 2.0 w / v% methanol solution of polyhydroxyethyl methacrylate (P-3932, product of SIGMA) (2.5 mL) was charged to a commercially available polystyrene tube (Eiken tube for RIA # 3, 70th) -12458). Then, the solution was removed from the tube, the tube was inverted to prevent the residual solution from remaining on the bottom, and the tube was dried at room temperature for 24 hours, and then the surface of the tube was coated with polyhydroxyethyl methacrylate. In the resulting tube, the saturation adsorption amount of proteins was 8.7 × 10 -4 pmol / cm 2 , and the contact angle between the surface and water is 0 °.
(Beispiel 1)(Example 1)
Eine 0,5 Gew./Vol.%ige Ethanol-Lösung eines MPC-Polymers (2,5 ml) wurde in ein kommerziell erhältliches Polystyrol-Rohr (Eiken-Rohr für RIA Nr. 3, 70-12458) injiziert und das Rohr konnte 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wurde die Lösung aus dem Rohr entfernt, das Rohr wurde umgedreht, um zu verhindern, daß die restliche Lösung am Boden verblieb, und das Rohr wurde bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet und anschließend wurde die Oberfläche des Rohres mit dem MPC-Polymer beschichtet. Im resultierenden Rohr war die Sättigungsadsorptionsmenge der Proteine 6,5 × 10–4 pmol/cm2 und der Kontaktwinkel zwischen der Oberfläche und Wasser ist 0°.A 0.5 w / v% ethanol solution of MPC polymer (2.5 mL) was injected into a commercially available polystyrene tube (Eiken tube for RIA # 3, 70-12458) and the tube could stand at room temperature for 10 minutes. Then, the solution was removed from the tube, the tube was inverted to prevent the residual solution from remaining on the bottom, and the tube was dried at room temperature overnight, and then the surface of the tube was coated with the MPC polymer. In the resulting tube, the saturation adsorption amount of the proteins was 6.5 × 10 -4 pmol / cm 2, and the contact angle between the surface and water is 0 °.
Das MPC-Polymer wurde aus einem MPC-BMA (Butylmethacrylat)-Copolymer (Verhältnis von MPC zu BMA = 3/7) synthetisiert, das entsprechend der Vorgehensweise hergestellt ist, beschrieben in "Release of a drug from a hydrogel membran having a structure analogous to that of phospholipid", (Kobunshi Ronbunshu, 46, 591-595 (1989)).The MPC polymer was made from a MPC-BMA (butyl methacrylate) copolymer (ratio of MPC to BMA = 3/7), according to the procedure is prepared described in "Release of a drug from a hydrogel membrane having a structure analogous to that of phospholipid ", (Kobunshi Ronbunshu, 46, 591-595 (1989)).
Vergleichsbeispiel 1Comparative Example 1
Ein kommerziell erhältliches Polystyrol-Rohr (Eiken-Rohr RIA Nr. 3, 70-12458) wurde "so wie es war" als Vergleichsrohr verwendet.One commercially available Polystyrene tube (Eiken tube RIA No. 3, 70-12458) was "as it was" as a comparison tube used.
(Vergleich für die Assay-Empfindlichkeit)(Comparison for the assay sensitivity)
Zur Auswertung der Assay-Empfindlichkeit einer Reaktion in einer Lösung wurde der folgende Test durch Verwendung der Rohre von Referenzbeispiel 1, Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 als Reaktionsbehälter und einer ELISA-Kugel (Aminogruppen-haltige Kugel, Produkt von Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) als Träger für die Reaktion durchgeführt.To evaluate the assay sensitivity of a reaction in a solution became the following test by using the tubes of Reference Example 1, Example 1 and Comparative Example 1 as a reaction vessel, and an ELISA ball (amino group-containing sphere, product of Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) as a carrier for the reaction.
Phosphatpufferlösungen (pH 7,4) von Biotinhydrazid (Produkt von Dojindo) wurden zuvor hergestellt (Konzentration von Biotinhydrazid: 0,125 μg/ml, 0,250 μg/ml und 0,500 μg/ml). Durch Verwendung der Lösungen wurde Biotinhydrazid auf den ELISA-Kugeln durch kovalentes Binden über Glutaraldehyd immobilisiert, unter Erzeugung von ELISA-Kugeln mit drei unterschiedlichen Immobilisierungsdichten von Biotinhydrazid.Phosphate buffer solutions (pH 7.4) of biotin hydrazide (product of Dojindo) were previously prepared (Concentration of biotin hydrazide: 0.125 μg / ml, 0.250 μg / ml and 0.500 μg / ml). By using the solutions was biotin hydrazide on the ELISA beads by covalent bonding over glutaraldehyde immobilized to produce ELISA beads of three different types Immobilization densities of biotin hydrazide.
Ein Anteil einer jeden ELISA-Kugel, bei der Biotinhydrazid nicht mobilisiert war, wurde durch Verwendung von Magermilch zu Verhinderung der Adsorption blockiert.One Proportion of each ELISA ball in which biotin hydrazide is not mobilized was, by using skim milk to prevent adsorption blocked.
Jede der oben hergestellten ELISA-Kugeln wurden in die Rohre von Referenzbeispiel 1, Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 (drei Rohre für jedes Beispiel) gegeben, eine Phosphatpufferlösung (pH 7,4) von Peroxydase-markiertem Avidin (Produkt von Cappel) (Konzentration von Avidin: 1 μg/ml) wurde in jedes Rohr (500 ml pro Rohr) injiziert und die Reaktion 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.each of the ELISA beads prepared above were placed in the tubes of Reference Example 1, Example 1 and Comparative Example 1 (three tubes for each Example), a phosphate buffer solution (pH 7.4) of peroxidase-labeled Avidin (product of Cappel) (concentration of avidin: 1 μg / ml) injected into each tube (500 ml per tube) and the reaction for 30 minutes carried out at room temperature.
Nach Vollendung der Reaktion wurde nicht-reagiertes, mit Peroxydase markiertes Avidin mit einer Waschlösung (Phosphatpuffer, pH 7,4 + 0,05 % Tween 20) gewaschen. Anschließend konnte jede ELISA-Kugel eine Farbe durch Verwendung eines kommerziell erhältlichen Chromophor-Kits für Peroxidase (ML-1120T, Produkt von Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) entwickeln, und dann wurde die Absorbans bei 450 nm durch Verwendung eines Plattenlesegerätes gemessen.To Completion of the reaction was unreacted, peroxidase labeled Avidin with a wash solution (Phosphate buffer, pH 7.4 + 0.05% Tween 20). Then could Each ELISA ball a color by using a commercially available Chromophore kits for Peroxidase (ML-1120T, product of Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and then the absorbance at 450 nm was measured by using a plate reader.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Referenzbeispiel 1 und Beispiel 1 die Absorbans linear im Hinblick auf die Dichte des Biotinhydrazides variiert, das auf die Oberfläche der ELISA-Kugel gegeben wurde, und daß bei Vergleichsbeispiel 1 die Absorbans nicht mit den unterschiedlichen Dichten von Biotinhydrazid variiert.The Results are shown in Table 3. The results show that in Reference Example 1 and Example 1, the absorbance linear with respect to the density of the biotin hydrazide placed on the surface of the ELISA ball, and that at Comparative Example 1, the Absorbans not with the different densities varies from biotin hydrazide.
In Referenzbeispiel 1 und Beispiel 1 wird Peroxydasemarkiertes Avidin nur mit Biotinhydrazid reagiert, das auf der Oberfläche der ELISA-Kugel eingefügt ist, und somit ist die Absorbans proportional zur Dichte des Biotinhydrazides. Im Gegensatz dazu verbleibt bei Vergleichsbeispiel 1 das Peroxydase-markierte Avidin in dem Rohr durch Adsorption und das verbleibende Avidin kann als Hintergrund agieren, um hierdurch die Assayempfindlichkeit zu erniedrigen.In Reference Example 1 and Example 1 is peroxidase-labeled avidin reacts only with biotin hydrazide on the surface of the ELISA ball inserted and thus the absorbance is proportional to the density of the biotin hydrazide. In contrast, in Comparative Example 1, the peroxidase-labeled remains Avidin in the tube by adsorption and the remaining avidin can act as a background, thereby increasing the assay sensitivity to humiliate.
Tabelle
3 Biotin-Avidin-Reaktion
durch Verwendung der ELISA-Kugel 
(Vergleich des Protein-Wiedergewinnungsprozentsatzes in Behältern, die als Lagerbehälter verwendbar sind)(Comparison of protein recovery percentage in containers, as a storage container are usable)
Zum Vergleich der nicht-spezifischen Adsorption wurden Lösungen aus Enzym-markiertem Anti-Rinderalbumin-Antikörper (Produkt von Cosmo Bio) hergestellt (Konzentration des Antikörper: 0,1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml und 100 ng/ml); jede Lösung wurde in 24 Wells einer jeden Platte injiziert; die Platten wurden 48 Stunden bei –80°C gelagert; nach Vollendung der Lagerung wurde die Konzentration des Proteins in jeder Lösung durch Verwendung einer Substratlösung gemessen.To the Comparison of non-specific adsorption were solutions Enzyme-labeled anti-bovine albumin antibody (product of Cosmo Bio) prepared (concentration of the antibody: 0.1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml and 100 ng / ml); every solution was injected in 24 wells of each plate; the plates were Stored at -80 ° C for 48 hours; After completion of storage was the concentration of the protein in every solution Use of a substrate solution measured.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß der Prozentsatz der Proteinwiedergewinnung am höchsten in der Platte von Beispiel 1 im Vergleich zu der Platte von Vergleichsbeispiel 1 und Referenzbeispiel 1 ist.The Results are shown in Table 4. The results show that the percentage the highest protein recovery in the plate of Example 1 compared to the plate of Comparative Example 1 and Reference Example 1.
Tabelle
4 Protein-Konzentration
nach Lagerung (Vergleich
der Adsorbans) 
Industrielle AnwendbarkeitIndustrial applicability
Im Behälter für einen Immunassay dieser Erfindung ist die Adsorptionsmenge der Moleküle oder Serum, die für den Assay verwendet werden, 1 × 10–1 pmol/cm2 oder weniger, und somit wird ein Verlust eines Reagenzes durch Adsorption während der Lagerung oder Verdünnung des Reagenzes verhindert. Wenn der Behälter für eine Flüssigphasenreaktion verwendet wird, kann daher ein Assay mit hoher Empfindlichkeit und mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden, weil die Verminderung der Reaktionseffizienz, die durch Adsorption von zu untersuchenden Molekülen verursacht wird, oder die Verhinderung der Reaktion durch Adsorption von nicht-erwünschten Molekülen verhindert wird.In the container for immunoassay of this invention, the adsorption amount of the molecules or serum used for the assay is 1 x 10 -1 pmol / cm 2 or less, and thus there is a loss of a reagent by adsorption during storage or dilution of the reagent prevented. Therefore, when the container is used for a liquid phase reaction, an assay with high sensitivity and high accuracy can be conducted because the reduction of the reaction efficiency caused by adsorption of molecules to be examined or the prevention of the reaction by adsorption of undesired ones Molecules is prevented.
Wenn der Behälter für einen klinischen Test verwendet wird, der ein Serum verwendet, kann der Test unter ähnlichen Bedingungen wie im Körper eines Organismuses durchgeführt werden, weil die Variation der Struktur der Serumkomponenten, die durch Adsorption verursacht wird, in dem Behälter nicht auftritt.If the container for one Clinical test that uses a serum can be used Test under similar Conditions as in the body of an organism be because the variation of the structure of the serum components, the caused by adsorption, does not occur in the container.
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