DE69634782T2 - METHODS FOR TREATING EXISTING COLITIS BY USING ANTIBODIES TO IL-12 - Google Patents

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Abstract

The present invention provides a method for treating the inflammatory response of an established colitis in a subject with inflammatory bowel disease (IBD), comprising administering to a subject diagnosed with an established colitis from an IBD an amount of an antibody to interleukin-12 effective in reducing the colitis-inducing effect of interleukin-12. Also provided is a method for screening a substance for its effectiveness in reducing the inflammatory response of an established colitis comprising obtaining an animal having an established colitis; administering the substance to an animal; and assaying the animal for an effect on interleukin-12 which results in the reduction of the inflammatory response of the colitis, an amount of reduction of the inflammatory response greater than the amount of reduction produced by the administration of antibodies against interferon-gamma or tumor necrosis factor-alpha indicating an effective substance. Additionally, the present invention provides a method for screening a substance for its effectiveness in preventing inflammatory bowel disease comprising administering the substance to an animal susceptible to colitis; subjecting the animal to a treatment that will induce a colitis; assaying the animal for the development of a colitis; and comparing the effectiveness of the substance in preventing development of a colitis to the effectiveness of antibodies to interferon-gamma or tumor necrosis factor-alpha in preventing development of a colitis, a substance more effective in preventing the development of a colitis than antibodies to interferon-gamma or tumor necrosis factor-alpha indicating an effective substance.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNGBACKGROUND OF THE INVENTION

GEBIET DER ERFINDUNGFIELD OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Möglichkeit des Behandelns der etablierten Colitis einer entzündlichen Darm-Erkrankung durch Inhibieren der Colitis- induzierenden Effekte des Cytokins Interleukin-12 (IL-12). Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Antikörpers gegen Interleukin-12 zur Verfügung, welche effektiv in der Reduktion des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin 12 ist, für die Herstellung eines medizinischen Produkts zur Behandlung der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Krankheit.The The present invention relates to a way of treating the established colitis of an inflammatory Intestinal disease by inhibiting the colitis-inducing effects of the cytokine interleukin-12 (IL-12). In particular, the present invention Invention a use of an antibody against interleukin-12 to available which is effective in reducing the colitis-inducing effect Interleukin 12 is for the manufacture of a medical product for the treatment of inflammatory Response to an established colitis in a subject with inflammatory Bowel Disease.

Des Weiteren wird ein Verfahren zum Screening nach Substanzen bereitgestellt hinsichtlich ihrer Effektivität in der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis. Illustriert wird das Verhindern der entzündlichen Darm-Krankheit in einem Maus-Modell.Of Furthermore, a method for screening for substances is provided in terms of their effectiveness in the reduction of the inflammatory Answer to an established colitis. Illustrated is preventing the inflammatory Intestinal disease in a mouse model.

STAND DER TECHNIKSTATE OF TECHNOLOGY

Die entzündliche Darm-Krankheit (inflammatory Bowel disease, IBD) schließt die Crohn Krankheit (Crohn's disease, CD) und ulzeröse Colitis (ulcerative colitis, UC) ein, welche idiopathische chronische Erkrankungen sind, welche in ansteigender Häufigkeit in westlichen Populationen auftreten (1, 2). In jüngster Zeit wurden verschiedene Tier- Modelle der chronischen intestinalen Entzündung etabliert, welche wahrscheinlich neue Einblicke in die Pathogenese von IBD geben werden (3). Diese schließen Mäuse ein, welche Transgene von NLA-B27 und β2-Mikroglobulin (4) tragen, sowie Mäuse, in welchen die Gene für Interleukin-2 (IL-2) (5), Interleukin-10 (IL-10) (6) und die α- oder β-Kette des T-Zellen-Rezeptors (7) durch homologe Rekombination inaktiviert worden sind. Darüber hinaus wurde ein Colitis- Modell jüngst etabliert durch adoptiven Transfer von normalen CD45Rbhi T-Zellen von BALG/C-Mäusen zu C. B.-17 SCID-Mäusen, in wel chen die transferierten T-Zellen eine Th1-Cytokin-Antwort manifestierten, assoziiert mit granulomatöser Entzündung. Diese experimentelle Colitis kann verhindert werden durch systemische Verabreichung von Anti-Interferongamma (Anti-IFN-γ) (zwei Dosen) und durch systemische, tägliche Verabreichung von rekombinanten IL-10 (rIL-10), wenn man zur gleichen Zeit die Krankheit induziert, jedoch nicht mit rekombinantem Interleukin-4 (rIL-4) (8). Jedoch die Behandlung von etablierter IBD unter Verwendung dieser Methoden wurde nicht vorgeschlagen. Die Beobachtung, dass Verabreichung von IL-10 ein Produkt der Th2-Zell-Differentiation, jedoch nicht IL-4, welches auch ein Produkt der Th2-Zell-Differentiation ist, die experimentelle Colitis verhindern kann, unterstreicht die Unvorhersagbarkeit der Verabreichung von Cytokinen, um IBD zu verhindern oder behandeln.The inflammatory Bowel disease (inflammatory bowel disease, IBD) includes the Crohns Disease (Crohn's disease, CD) and ulcerative Colitis (ulcerative colitis, UC), which is idiopathic chronic Diseases are increasing in frequency in Western populations occur (1, 2). Most recently Time became different animal models of chronic intestinal inflammation which probably provides new insights into the pathogenesis from IBD (3). These include mice which transgene from NLA-B27 and β2-microglobulin (4) carry, as well as mice, in which the genes for Interleukin-2 (IL-2) (5), interleukin-10 (IL-10) (6) and the α or β chain of the T cell receptor (7) inactivated by homologous recombination have been. About that In addition, a colitis model has recently been established by adoptive Transfer of normal CD45Rbhi T cells from BALG / C mice C.B.-17 SCID mice, in which the transferred T cells have a Th1 cytokine response manifested, associated with granulomatous inflammation. This experimental Colitis can be prevented by systemic administration of Anti-interferon gamma (anti-IFN-γ) (two doses) and by systemic daily administration of recombinant IL-10 (rIL-10), at the same time inducing the disease, but not with recombinant interleukin-4 (rIL-4) (8). However the Treatment of established IBD using these methods was not suggested. The observation that administration of IL-10 a product of Th2 cell differentiation, but not IL-4, which is also a product of Th2 cell differentiation, the experimental one Can prevent colitis, underscores the unpredictability of Administration of cytokines to prevent or treat IBD.

IL-12 ist ein jüngst charakterisiertes Cytokin mit einzigartiger Struktur und pleiotropen Effekten (9–12). Es besteht aus zwei Disulfid- verknüpften Untereinheiten, p40 und p35, welche funktionell aktive p40/p35-Heterodimere oder inhibitorische p40-Homodimere ausbilden. IL-12 wird in erster Linie durch Macrophagen/Monocyten zur Verfügung gestellt und kann effizient induziert werden durch intrazelluläre Parasiten, Bakterien und bakterielle Produkte. Funktionelle Untersuchungen haben gezeigt, dass IL-12 zytolytische Aktivität von natürlichen Killer(NK)-Zellen und Macrophagen verstärkt und in Synergismus mit der B7/CD28-Wechselwirkung die Cytokin-Produktion und die Proliferation der aktivierten NK-Zellen und T-Zellen induziert (13). Des Weiteren spielt IL-12 eine entscheidende Rolle in der Th1-T-Zell-Differentiation und induziert naive T-Zellen, um IFN-γ zu erzeugen. Als ein Ergebnis dieser Fähigkeit, T-Zell-Antwort in Richtung des Th1-Phänotyps zu lenken, wurde für IL-12 gezeigt, dass es eine effektive Behandlung etablierter Parasiten-Infektionen in Mäusen darstellt (14, 15), welche eine Th2-T-Zell-Antwort auslösen. Während Antikörper gegen IL-12 als bedeutsam bei der Verhinderung bei experimenteller autoimmuner Enzephalitis gezeigt wurden, einer Erkrankung mediatisiert durch Th1-T-Zellen (16), wurden diese Ergebnisse nicht auf die Behandlung von etablierter autoimmuner Enzephalitis ausgedehnt.IL-12 is a youngest characterized cytokine with unique structure and pleiotropic Effects (9-12). It consists of two disulfide-linked Subunits, p40 and p35, which are functionally active p40 / p35 heterodimers or forming inhibitory p40 homodimers. IL-12 becomes first Line provided by macrophages / monocytes and can be efficient be induced by intracellular parasites, bacteria and bacterial Products. Functional studies have shown that IL-12 cytolytic activity of natural Killer (NK) cells and macrophages are enhanced and synergized with B7 / CD28 interaction cytokine production and proliferation of activated NK cells and T cells (13). Furthermore, plays IL-12 plays a crucial role in Th1-T cell differentiation and induce naive T cells, to IFN-γ too produce. As a result of this ability, T cell response in Direction of the Th1 phenotype to steer was for IL-12 has been shown to be an effective treatment for established parasite infections in mice (14, 15), which elicit a Th2 T cell response. While antibodies against IL-12 as significant in preventing autoimmune in experimental Encephalitis has been shown mediated by a disease Th1 T cells (16), these results were not due to treatment extended from established autoimmune encephalitis.

Es wurde gezeigt, dass Antikörper gegen den Tumomekrosisfaktor alpha (TNF-α) in der Behandlung von CD (29) eingesetzt wurden. In dieser unkontrollierten Untersuchung wurden akute Verschlimmerungen von CD abgemildert, jedoch blieben die Patienten Steroid- abhängig und die Krankheits-Invariablität kehrte innerhalb eines Zeitraums einiger Monate wieder.It has been shown to be antibody against the tumoromascrosis factor alpha (TNF-α) in the treatment of CD (29) were used. In this uncontrolled investigation were acute exacerbations were alleviated by CD, but patients remained steroid dependent and the disease invariablity returned within a period of a few months.

Die intemationale Patentanmeldung Nr. WO 95/01997 offenbart die Verwendung von Antikörpern gegen Interleukin-1β zur Behandlung von Interleukin-1 mediatisierten entzündlichen Erkrankungen in Menschen. Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/23865 offenbart die Verwendung von Antikörpern gegen Interleukin-8 für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen, wie z.B. entzündlicher Darm- Erkrankung und bakteriellen Pneumonia.International Patent Application No. WO 95/01997 discloses the use of antibodies to interleukin-1β for the treatment of interleukin-1 mediated inflammatory diseases in humans. International Patent Application No. WO 95/23865 discloses the use of antibodies to Inter leucine-8 for the treatment of inflammatory diseases, such as inflammatory bowel disease and bacterial pneumonia.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Behandlung für IBD zur Verfügung, welches überraschenderweise effektiver ist als existierende Therapien. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zum Screenen nach Substanzen zur Verfügung, welche effektiv sind in ihrer Fähigkeit, den Colitis- induzierenden Effekt von IL-12 zu inhibieren.The The present invention provides a treatment agent for IBD available which surprisingly is more effective than existing therapies. The present invention further provides a method of screening for substances available which are effective in their ability to inhibit the colitis-inducing effect of IL-12.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung eines Antikörpers auf Interleukin-12, effektiv in der Reduzierung des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin-12, zur Verfügung für die Herstellung eines medizinischen Produktes zur Behandlung der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Krankheit.The The present invention provides a use of an antibody Interleukin-12, effective in reducing the colitis inducer Effects of Interleukin-12, available for the preparation of a medical Product used to treat the inflammatory response to an established Colitis in a subject with inflammatory bowel disease.

Auch zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität bei der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis, umfassend das Erhalten eines Tieres mit einer etablierten Colitis, das Verabreichen der Substanz an das Tier und das Assaying des Tieres für einen Effekt auf Interleukin-12, welche in der Reduktion der entzündlichen Antwort resultiert, wobei die Reduktion der entzündlichen Antwort dadurch anzeigt, dass die Interleukin-12 Aktivität inhibiert wird.Also to disposal A method for screening a substance is provided their effectiveness in the reduction of inflammatory Response to established colitis, including getting an animal with established colitis, administering the substance the animal and the assaying of the animal for an effect on interleukin-12, which in the Reduction of inflammatory Response, with the reduction of the inflammatory response thereby indicating that the interleukin-12 activity is inhibited.

Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Screenen nach einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Vorbeugen gegen entzündli che Darm-Erkrankung, umfassend das Verabreichen der Substanz an ein Tier, welches empfänglich ist für Colitis; das Unterziehen des Tieres unter eine Behandlung, welche eine Colitis induzieren wird; das Assaying des Tieres für eine Entwicklung der Colitis; wobei das nicht-Auftreten der Entwicklung einer Colitis die Inhibition des Colitis induzierenden Effekts von Interleukin-12 anzeigt.Of Furthermore, the present invention provides a method for Screen for a substance for its prevention effectiveness against inflammatory surface Intestinal disease, comprising administering the substance to a Animal, which receptive is for colitis; subjecting the animal to a treatment which will induce a colitis; Assaying the animal for development the colitis; the non-appearance of the development of colitis the inhibition of the colitis inducing effect of interleukin-12 displays.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENSHORT DESCRIPTION THE DRAWINGS

1 zeigt die Ergebnisse der histologischen Einstufung von Darmschnitten von Kontroll BALB/c-Mäusen, behandelt mit Ethanol (offene Balken) und von Mäusen, behandelt mit TNBS (gefüllte Balken). Darmproben wurden genommen zu angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung von TNBS oder Ethanol und die Größenordnung der Entzündungs-Veränderungen in den Darmproben wurde analysiert auf HE-angefärbten Darmquerschnitten. Die Daten wurden gepoolt aus drei unabhängigen Experimenten in jeder Gruppe. 1 shows the results of histological classification of intestinal sections from control BALB / c mice treated with ethanol (open bars) and from mice treated with TNBS (solid bars). Intestinal samples were taken at indicated time points after administration of TNBS or ethanol and the magnitude of inflammatory changes in the intestinal samples was analyzed on HE stained colon sections. The data was pooled from three independent experiments in each group.

2 zeigt die Ergebnisse der histologischen Einstufung der Darmschnitte von BALB/c-Mäusen, behandelt mit TNBS und Antikörpern gegen IL-12 (offene Balken) und von Mäusen, behandelt mit TNBS und Rattenkontroll-IgG (ausgefüllte Balken). Darmproben wurden zur angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung von TNBS oder Ethanol genommen und die Größenordnung der Entzündungsveränderungen in den Därmen wurde analysiert auf HE- gefärbten Darmquerschnitten. Die Daten wurden gepoolt von drei unabhängigen Experimenten in jeder Gruppe. 2 Figure 10 shows histological scores from BALB / c mice treated with TNBS and antibodies against IL-12 (open bars) and from mice treated with TNBS and rat IgG control (solid bars). Intestinal samples were taken at the indicated time points after administration of TNBS or ethanol and the magnitude of the inflammatory changes in the intestines was analyzed on HE-stained intestinal sections. Data were pooled from three independent experiments in each group.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMENDESCRIPTION THE PREFERRED EMBODIMENTS

Die vorliegende Erfindung kann leichter verstanden werden per Verweis auf die folgende detaillierte Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen sowie die Beispiele, welche hierin enthalten sind.The The present invention can be understood more easily by reference to the following detailed description of specific embodiments as well as the examples included herein.

Diese Erfindung stellt eine Verwendung eines Antikörpers auf Interleukin-12 effektiv bei der Reduktion des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin-12 zur Herstellung ei nes medizinalen Produkts zur Verfügung zur Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Erkrankung.These Invention effectively makes use of an antibody to interleukin-12 in reducing the colitis-inducing effect of interleukin-12 for the manufacture of a medical product Treatment of the inflammatory Response of established colitis in a subject with inflammatory bowel disease.

Jedes Tier, welches der Colitis ausgesetzt ist, kann durch dieses Verfahren behandelt werden, obwohl Menschen die primären therapeutischen Ziele sind. Wie hier verwendet, bezieht sich eine "etablierte Colitis" auf einen Zustand des Darms, charakterisiert durch einen Zustand der Entzündung, in welchem ein oder mehrere der folgenden histologischen Charakteristika nachweisbar sind: Leukozyten-Infiltration; Verdickung der Darmwand; transmurale Infiltrationen; Verlust der Becherzellen; Ulcerationen; Granulomas; und Fibrose. Klinische Symptome können einschließen, sind jedoch nicht limitiert auf, Diarrhöe, rektalen Prolaps, Gewichtsverlust, Abdominal-Schmerz, Dehydration und Splenomegalie.Any animal exposed to colitis can be treated by this procedure, although humans are the primary therapeutic targets. As used herein, "established colitis" refers to a condition of the intestine characterized by a condition of inflammation in which one or more of the following histological characteristics are detectable: leukocyte infiltration; Thickening of the intestinal wall; transmural infiltrations; Loss of goblet cells; ulcerations; granulomas; and fibrosis. Clinical symptoms may include, but are not limited to, diarrhea, rectal prolapse, weight gain Lust, abdominal pain, dehydration and splenomegaly.

Antikörper gegen IL-12 können aus irgendeiner Quelle sein. Jedoch, um die Immunogenizität der Immunoglobuline selbst zu reduzieren, sind die Antikörper vorzugsweise von menschlichem Ursprung oder sind Antikörper, erzeugt in anderen Spezies und "humanisiert" zur Verabreichung in Menschen, wie dies in Beispiel VI beschrieben wird. Fragmente von Antikörpern, welche IL-12 bindende Aktivität beibehalten, wie auch Fragmente von IL-12, welche IL-12 bindende Aktivität (beispielsweise Homodimer-Formation) aufrechterhalten und die Colitis- induzierenden Effekte von IL-12 reduzieren, sind innerhalb der Bedeutung des Begriffs "Antikörper" eingeschlossen. Solche Antikörper und Fragmente können durch Techniken erzeugt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und auf ihre Spezifität und Aktivität gemäß der Verfahren dargestellt in den hier beigefügten Beispielen gescreent werden. Beispielsweise können allgemeine Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern bei Harlow and Lane (23) gefunden werden.Antibodies against IL-12 can be from any source. However, the immunogenicity of immunoglobulins By themselves, the antibodies are preferably human Origin or are antibodies, produced in other species and "humanized" for administration in humans, as described in Example VI. fragments of antibodies, which IL-12 binding activity as well as fragments of IL-12 which bind IL-12 activity (for example, homodimer formation) and the colitis-inducing effects of IL-12 are included within the meaning of the term "antibody". Such antibodies and fragments can produced by techniques known in the art are, and their specificity and activity according to the method shown in the attached here Examples are screened. For example, general methods for Generating antibodies to be found at Harlow and Lane (23).

In der vorliegenden Erfindung können die Antikörper gegen IL-12 oral oder parental verabreicht werden in einem pharmazeutisch akzeptablen Carrier für menschliche Subjekte. Geeignete Carrier zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf pyrogenfreie Salzlösungen. Zur parenteralen Verabreichung der Antikörper wird eine sterile Lösung oder Suspension in Salzlösung hergestellt, welche Additiva enthält, wie z.B. Ethyloleat oder Isopropylmyristat, und diese kann injiziert werden, beispielsweise in subkutane oder intramuskuläre Gewebe.In of the present invention the antibodies be administered orally or parental to IL-12 in a pharmaceutical acceptable carrier for human subjects. Suitable carriers for use in the present Close invention but are not limited to pyrogen-free salt solutions. For parenteral administration of the antibodies is a sterile solution or Suspension in saline prepared containing additives, e.g. Ethyl oleate or Isopropyl myristate, and these can be injected, for example in subcutaneous or intramuscular Tissue.

Alternativ können die Antikörper mikroverkapselt sein, entweder mit einem natürlichen oder einem synthetischen Polymer, in Mikropartikel von 4–8 μm Durchmesser, welche auf intestinale Lymphoid-Gewebe zielen und eine verzögerte Freisetzung der Antikörper für bis zu vier Wochen (22, 28) erzeugen.alternative can the antibodies be microencapsulated, either natural or synthetic Polymer, in microparticles of 4-8 μm diameter, which target intestinal lymphoid tissues and a delayed release the antibody for until to produce four weeks (22, 28).

Für die Behandlung von Menschen würden Antikörper gegen IL-12 in löslicher Form typischerweise in einer einzelnen Dosis zwischen 10 mg und 20 mg/kg an Körpergewicht verabreicht werden. Alternativ kann man dem Patienten 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht wöchentlich geben, bis die Colitis-Symptome abklingen.For the treatment of people would antibody against IL-12 in soluble Form typically in a single dose between 10 mg and 20 mg / kg of body weight be administered. Alternatively, you can give the patient 10 mg 20 mg / kg of body weight weekly give until the colitis symptoms disappear.

Zur oralen Verabreichung können 500 mg bis 1000 mg P. O. verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung können 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht verabreicht werden, als eine einzelne oder wöchentliche intravenöse Injektion. Jedoch das Alter, Gewicht und der Zustand der meisten Individuen muss beim Bestimmen einer schlussendlichen Dosis berücksichtigt werden. Für die Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 in spezieller Form können 500 mg bis 1000 mg wie beschrieben für verzögerte Freisetzung über einen vier- bis achtwöchigen Zeitraum mikroverkapselt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird realisieren, dass Dosierungen am Besten durch den behandelnden Arzt optimiert werden und Verfahren zum Bestimmen von Dosierungen werden beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (24).to oral administration 500 mg to 1000 mg P.O. be administered. For parenteral administration can 10 mg to 20 mg / kg of body weight administered as a single or weekly intravenous injection. However, the age, weight and condition of most individuals must be considered when determining a final dose become. For the administration of antibodies against IL-12 in special form 500 mg to 1000 mg as described for sustained release over a four-month period. to eight weeks Period be microencapsulated. The person skilled in the art will Realize that dosages are best done by the attending physician be optimized and methods for determining dosages for example, described in Remington's Pharmaceutical Sciences (24).

Geeignete Träger zur oralen Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 schließen eine oder mehrere Substanzen ein, welche auch als geschmacksgebende Wirksubstanzen agieren können, als Gleitmittel, suspendierende Wirksubstanzen oder als Schutzhilfsmittel. Geeignete feste Carrier schließen Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumstearat, Zucker, Stärke, Gelatine, Cellulose, Carboxylpolymethylen oder Cyclodextrane ein. Geeignete flüssige Carrier können Wasser sein, pharmazeutisch akzeptable Öle oder eine Mischung von beiden. Die Flüssigkeit kann auch andere geeignete pharmazeutische Zusätze, wie z.B. Puffer, Konservierungsmittel, geschmacksverstärkende Agenzien, Viskositäts- oder Osmoregulatoren, Stabilisatoren oder suspendierende Agenzien enthalten. Beispiele geeigneter flüssiger Träger schließen Wasser, mit oder ohne verschiedene Additiva, einschließend Carboxypolymethylen als ein pH-reguliertes Gel ein. Die Antikörper können enthalten sein in enterisch gecoateten Kapseln, welche Antikörper in den Darm abgeben, um Magenkollaps zu verhindern.suitable carrier for oral administration of antibodies to IL-12 include or several substances, which are also used as flavoring active substances can act as a lubricant, suspending active substances or as a protective agent. Close suitable solid carriers Calcium phosphate, calcium carbonate, magnesium stearate, sugar, starch, gelatin, Cellulose, carboxyl polymethylene or cyclodextranes. suitable liquid Carrier can Be water, pharmaceutically acceptable oils or a mixture of both. The liquid may also contain other suitable pharmaceutical additives, e.g. Buffer, preservative, flavor-enhancing Agents, Viscosity or osmoregulators, stabilizers or suspending agents contain. Examples of suitable liquid carriers include water, with or without different Additiva, including Carboxypolymethylene as a pH-regulated gel. The antibodies may contain be enteric coated capsules containing antibodies in release the bowel to prevent gastric collapse.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivtät bei der Reduktion des Colitis induzierenden Effekts von IL-12, umfassend das Erhalten eines Tieres mit einer etablierten Colitis; das Verabreichen der Substanz an ein Tier; und das Assaying des Tieres für einen Effekt auf IL-12, welcher in einer Reduktion der entzündlichen Antwort der Colitis resultiert, wobei ein Maß der Reduktion der entzündlichen Antwort vorzugsweise größer als das Maß der Reduktion, resultierend von der Verabreichung von Antikörpern gegen IFN-γ, TNF-α oder anderen Cytokinen, oder von der Verabreichung von Cytokinen selbst, eine effektive Substanz anzeigt. Eine Substanz, welche effektiv ist bei der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis ist eine, welche die histologischen und klinischen Manifestationen reduziert oder zurückbildet, wie dies oben beschrieben wird.In a further embodiment The present invention provides a method for screening a substance with regard to its effectiveness in the reduction of colitis inducing effect of IL-12, comprising obtaining an animal with an established colitis; administering the substance one animal; and assaying the animal for an effect on IL-12, which in a reduction of the inflammatory The result of colitis results, being a measure of the reduction of the inflammatory Answer preferably greater than the measure of Reduction resulting from the administration of antibodies to IFN-γ, TNF-α or other cytokines, or from the administration of cytokines themselves, an effective Indicates substance. A substance that is effective in reducing the inflammatory The answer to established colitis is one which is the histological and reduces or regresses clinical manifestations, as described above.

Die Fähigkeit einer Substanz, den Colitis induzierenden Effekt von IL-12 zu reduzieren, kann, wie oben dargestellt, bestimmt werden durch Auswerten der histologischen und klinischen Manifestationen des Tieres mit Colitis vor und nach Verabreichung der Substanz von Interesse und Quantifizieren des Maßes der Reduktion der Entzündung. Falls das Maß der Reduktion der Entzündungs-Antwort, induziert durch IL-12, gemessen in einem Tier nach Verabreichung der Substanz, größer ist als das Maß der Reduktion der entzündlichen Antwort, induziert durch IL-12, gemessen in einem Tier nach Verabreichung der Antikörper gegen IFN-γ, TNF-α oder andere Cytokine oder durch die Verabreichung von Cytokinen selbst, wird die Substanz als effektiv beim Reduzieren der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis eingestuft.The ability a substance to reduce the colitis-inducing effect of IL-12, can, as shown above, be determined by evaluating the histological and clinical manifestations of the animal with colitis before and after administration of the substance of interest and quantification of measure the reduction of inflammation. If the measure of Reduction of the inflammatory response, induced by IL-12 measured in an animal after administration the substance is bigger as the measure of Reduction of inflammatory Response induced by IL-12 measured in an animal after administration the antibody against IFN-γ, TNF-α or other cytokines or by the administration of cytokines themselves, The substance is considered effective in reducing the inflammatory Rated an established colitis response.

Das Tier, in welchem die Colitis erzeugt wird, kann jegliches Säugetier sein und kann einschließen, ist jedoch nicht limitiert auf Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Katze, Hund, Ziege, Affe und Schimpanse. Die Colitis kann erzeugt werden in einem Tier durch irgendein Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist. Beispielsweise kann die Colitis erzeugt werden durch Einbringen eines Hapten-Reagenzes in den Darm des Tieres in einer effektiven Menge. Das Hapten-Reagenz kann sein, ist jedoch nicht limitiert auf 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure, 2,4-Dinitrochlorobenzen und andere Trinitrophenylamino-Verbindungen.The Animal in which the colitis is produced can be any mammal be and can include is not limited to mouse, rat, guinea pig, hamster, Rabbit, cat, dog, goat, monkey and chimpanzee. The colitis can be generated in an animal by any method that known in the art. For example, the colitis can be generated by introducing a hapten reagent into the intestine of the animal in an effective amount. The hapten reagent may be however, is not limited to 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, 2,4-dinitrochlorobenzene and other trinitrophenylamino compounds.

Um die Effizienz der Anti-IL-12-Behandlung in Menschen mit IBD auszuwerten, können die folgenden Untersuchungen durchgeführt werden. Patienten mit aktiver Entzündung des Darmes und/oder des terminalen Ileums, welche nicht auf die Standardprednisontherapie (parenteral oder oral) angesprungen haben, können für die Kontrolle der IBD ausgewählt werden. Die Wirksubstanzeffizienz kann überwacht werden über Colonoskopie. Patienten können randomisiert auf zwei unterschiedliche Protokolle sein. In einem Protokoll können die Subjekte nach ursprünglicher Steroiddosierung eingestellt bleiben und in dem zweiten Protokoll können die Subjekte in ihrer Steroiddosierung allmählich abgesetzt worden sein, nachdem sie Anti-IL-12-Therapie empfangen haben.Around evaluate the efficacy of anti-IL-12 treatment in people with IBD, can the following investigations are carried out. Patients with active inflammation of the intestine and / or the terminal ileum, which do not affect the Have started standard drug therapy (parenteral or oral), can for the control the IBD selected become. The drug substance efficiency can be monitored via colonoscopy. Patients can be randomized to two different protocols. In one Protocol can the Subjects after original Steroid dosage remain adjusted and in the second protocol can the subjects were gradually deposed in their steroid dosage, after receiving anti-IL-12 therapy.

Die Behandlung kann entweder aus einer einzelnen Dosis von 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht von Antikörpern gegen IL-12 per Infusion über einen zwei Stunden Zeitraum oder einer wöchentlichen Dosierung von 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht an Antikörpern auf IL-12 per Infusion, jedes Mal über eine zwei Stunden-Periode, bis die Symptome der Colitis abklingen, bestehen. Der Blutdruck, Puls und die Temperatur des Subjekts kann vor und in 30 Minuten-Intervallen während der zweistündigen Infusions-Periode überwacht werden. Man kann die Subjekte einer Laborauswertung unterziehen, bestehend aus einer vollständigen Blutzählung (complete blood count, CBC) mit differentieller Blutplättchenzählung, SMA-18-Chemieprofil, Erythrocyten-Sedimentationsrate (ESR) und einem C-reaktiven Proteinassay bei 1) der Zeit der Anti-IL-12 Infusion; 2) 24 Stunden nach Infusion; 3) 72 Stunden nach Infusion; 4) zwei Wochen nach der letzten Infusion; 5) vier Wochen nach der letzten Infusion; 6) sechs Wochen nach der letzten Infusion; und 7) acht Wochen nach der letzten Infusion.The Treatment may either be from a single dose of 10 mg 20 mg / kg of body weight of antibodies against IL-12 via infusion a two-hour period or a weekly dosage of 10 mg to 20 mg / kg of body weight of antibodies on IL-12 by infusion, each time over a two-hour period, persist until the symptoms of colitis subsided. The blood pressure, Pulse and the temperature of the subject can be before and in 30 minute intervals while the two-hour Infusion period to be monitored. You can subject the subjects to a laboratory evaluation, consisting from a complete blood count (complete blood count, CBC) with differential platelet count, SMA-18 chemistry profile, Erythrocyte sedimentation rate (ESR) and a C-reactive protein assay at 1) the time of anti-IL-12 infusion; 2) 24 Hours after infusion; 3) 72 hours after infusion; 4) two weeks after the last infusion; 5) four weeks after the last infusion; 6) six weeks after the last infusion; and 7) eight weeks after the last infusion.

Man kann die Subjekte routinemäßig einer Colonoskopie unter Videoüberwachung unterziehen zur Zeit der Infusion der Anti-IL-12 und wiederum nach zwei, vier, sechs und acht Wochen nach der letzten Infusion.you The subjects can routinely one Colonoscopy under video surveillance undergo at the time of infusion of anti-IL-12 and again after two, four, six and eight weeks after the last infusion.

Des Weiteren können Serum-Proben der Subjekte geassayt werden durch ELISA auf IFN-γ-Spiegel, um die Wirksubstanzeffizienz zu überwachen. Auch Gewebsbiopsie- Proben, erhalten während der Colonoskopie, können kultiviert werden und auf ihre IFN-γ-Spiegel geassayt werden.Of Further can Serum samples of the subjects are assayed by ELISA for IFN-γ levels to monitor the drug substance efficiency. Also tissue biopsy samples, get during the colonoscopy, can and their IFN-γ levels be reassessed.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Verhindern der entzündlichen Darm-Erkrankung, umfassend das Verabreichen der Substanz an ein Tier, welches empfänglich ist für Colitis; das Unterziehen des Tieres unter eine Behandlung, welche Colitis induzieren wird; das Assaying des Tieres auf die Entwicklung einer Colitis; und das Vergleichen der Effektivität der Substanz beim Verhindern der Entwicklung einer Colitis, vorzugsweise mit der Effektivität von Antikörpern gegen Interferongamma oder Tumomekrosisfaktor- alpha bei der Verhinderung der Entwicklung einer Colitis, wobei eine Substanz, die mehr effektiv ist im Verhindern der Entwicklung einer Colitis, als ein Antikörper gegen Interferon-gamma oder Tumornekrosisfaktor- alpha eine effektive Substanz anzeigt.In a further embodiment The present invention provides a method of screening a substance in terms of its effectiveness in preventing the inflammatory Intestinal disease, comprising administering the substance to a Animal, which receptive is for colitis; subjecting the animal to a treatment which Induce colitis; the assaying of the animal on the development of a colitis; and comparing the effectiveness of the substance in preventing the development of a colitis, preferably with the effectiveness of antibodies against Interferon gamma or tumor microsofactor alpha in prevention the development of a colitis, being a substance that is more effective is in preventing the development of colitis, as an antibody against Interferon gamma or tumor necrosis factor alpha is an effective Indicates substance.

Substanzen, welche sich als effektiv beim Verhindern von IBD herausgestellt haben, wie z.B. Antikörper gegen IL-12, können verabreicht werden an ein Subjekt, um die Entwicklung von Colitis, gemäß den Protokollen der hier beschriebenen Verabreichung, zu verhindern.substances which proved effective in preventing IBD have, such as antibody against IL-12, can be administered to a subject for the development of colitis, according to the protocols the administration described herein.

Die vorliegende Erfindung wir spezieller beschrieben in den folgenden Beispielen, welche allein als illustrativ gedacht sind, da verschiedenen Modifikationen und Variationen dort den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein werden.The present invention will be described more specifically in the following examples, which are solely il are illustrative, as various modifications and variations will be apparent to those skilled in the art.

BEISPIELEEXAMPLES

Beispiel 1. Materialien, Antikörper und ZellenExample 1. Materials, antibody and cells

Reagenzien und monoklonale Antikörper. Unkonjugierte und biotinylierte monoklonale Ratten Anti-Maus-IL2 (Klone JES6-1A12/JES6-5H4), IL-4 (BVD4-1D11/BVD6-24G2), IL-10 (JESS-2A5/SXC-1) und IFN-γ (R4-6A2/XMG1,2), Antikörper und rekombinantes Maus-IL-2 (spezifische Aktivität: 2,5 × 108 Biological Response Modifiers Program (BRMP) Einheiten/mg), IL-4 (1 × 107 Einheiten/mg pa CTLL.2,4 Assay), IL-10 (5 × 105 Einheiten/mg) und IFN-γ (1 × 10? Einheiten/ mg) wurden käuflich von Pharmingen bzw. Genzyme Corp, (Cambridge, MA) erworben. Aufgereinigte Hamster Anti-Maus CD3ε-(Klon 145-2C11) und Hamster Anti-Maus CD 28-(Klon 37.51) Antikörper wurden von Pharmingen erhalten.Reagents and monoclonal antibodies. Unconjugated and biotinylated monoclonal rats anti-mouse IL2 (clones JES6-1A12 / JES6-5H4), IL-4 (BVD4-1D11 / BVD6-24G2), IL-10 (JESS-2A5 / SXC-1) and IFN-γ (R4-6A2 / XMG1,2), antibody and recombinant mouse IL-2 (specific activity: 2.5x10 8 Biological Response Modifiers Program (BRMP) units / mg), IL-4 (1 × 10 7 units / mg pa CTLL.2,4 assay), IL-10 (5 x 10 5 units / mg) and IFN-γ (1 x 10? units / mg) were purchased from Pharmingen and Genzyme Corp, (Cambridge, MA) , Purified hamster anti-mouse CD3ε (clone 145-2C11) and hamster anti-mouse CD 28 (clone 37.51) antibodies were obtained from Pharmingen.

Zellisolierung und Aufreinigung von Lamina Propria CD4-T-Zellen (LP-Zellen). LP-Zellen wurden isoliert von frisch erhaltenen Darmproben unter Verwendung einer Modifikation einer Technik, beschrieben von van der Heijden und Stok (17). Nach Entfernung der Peyer Patches wurde der Darm gewaschen in Hanks Balanced Salzlösung-Calcium- und Magnesium- frei (HBSS-CMF), in 0,5 cm Stücke zerteilt und zweimal mit HBSS inkubiert, enthaltend Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) (0,37 mg/ml) und Dithiothreitol (DTT) (145 mg ml) bei 37°C für 15 Min Das Gewebe wurde in RPMI-1640 Medium (Whittaker, Walkersville, MD), enthaltend Collagenase D (400 μl ml) und DNase l (0,1 mg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in einen Schüttel-Inkubator bei 37°C verdaut. LP-Zellen wurden dann geschichtet auf einem 40%–100% Percoll-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und Lymphocyt-angereicherte Populationen wurden aus den Zellen an der 40–100% Grenzfläche isoliert. Angereicherte CD4+ T-Zell-Populationen wurden erhalten durch negative Auswahl unter Verwendung von Maus DC4+ T-Zellisolations-Säulen (ISOCELL®, Pierce Co., Rockford, IL). Die resultierenden Zellen bestanden bei Analyse per Durchfluss-Cytometrie (FACScan; Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) aus mehr als 85% CD4+-Zellen.Cell isolation and purification of lamina propria CD4 T cells (LP cells). LP cells were isolated from freshly obtained intestinal samples using a modification of a technique described by van der Heijden and Stok (17). After removal of the Peyer patches, the intestine was washed in Hanks Balanced Saline-Calcium and Magnesium Free (HBSS-CMF), cut into 0.5 cm pieces and incubated twice with HBSS containing disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (0.37 mg / ml). ml) and dithiothreitol (DTT) (145 mg ml) at 37 ° C for 15 min. Tissue was spiked into RPMI-1640 medium (Whittaker, Walkersville, MD) containing collagenase D (400 μl ml) and DNase I (0.1 mg / ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in a shaker incubator at 37 ° C digested. LP cells were then layered on a 40% -100% Percoll gradient (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and lymphocyte-enriched populations were isolated from the cells at the 40-100% interface. Enriched CD4 + T cell populations were obtained by negative selection using mouse DC4 + T cell isolation columns (ISOCELL ®, Pierce Co., Rockford, IL). The resulting cells, when analyzed by flow cytometry (FACScan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA), consisted of more than 85% CD4 + cells.

Zellkultur von LP-Zellen. Zellkulturen von LP-Zellen wurden durchgeführt in vollständigem Medium, bestehend aus RPMI-1640 Medium, angereichert mit 3 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES Puffer, 10 μg/ml Gentamycin (Whittaker), 100 U/ml jeweils von Penicillin und Streptomycin (Whittaker), 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (2 ME) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) und 10% FCS.cell culture from LP cells. Cell cultures of LP cells were performed in complete medium consisting from RPMI-1640 medium supplemented with 3mM L-glutamine, 10mM HEPES Buffer, 10 μg / ml Gentamycin (Whittaker), 100 U / ml each of penicillin and streptomycin (Whittaker), 0.05mM 2-mercaptoethanol (2MU) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) and 10% FCS.

Isolierung von Milz CD+-T-Zellen. Die Milz wurde in allen Fällen aseptisch entfernt und nachfolgend mit Collagenase (400 U/ml) und DNase 1 (12,5 μg/ml) bei 37°C für 15 Minuten verdaut. Nach Filtrations-Fraktionierung wurde die resultierende Splenocyten-Suspension an roten Blutzellen (RBC) verarmt durch hypotonische Lyse mit Ammoniumchlorid-Tris (ACK) Lysispuffer (B & B Scott, W. Warwick, RI). Zellen gesammelt aus der 70%/90%-Schicht einer Percoll-Gradient-Zentrifugation wurden weiterer negativer Selektion unter Verwendung von Maus CD4+ T-Zellisolations-Säulen unterzogen. Wie jedoch die fluoreszenzaktivierte Zell-Sortier-Analyse (FACS) ausgewertet wurde, enthielt die resultierende Zellpopulation mehr als 25% CD4+ Zellen.insulation of spleen CD + T cells. The spleen was removed aseptically in all cases and subsequently with collagenase (400 U / ml) and DNase 1 (12.5 μg / ml) 37 ° C for 15 minutes digested. After filtration fractionation, the resulting Splenocytes suspension Red blood cells (RBC) depleted by hypotonic lysis with ammonium chloride tris (ACK) Lysis Buffer (B & B Scott, W. Warwick, RI). Cells collected from the 70% / 90% layer Percoll gradient centrifugation became more negative Selection using mouse CD4 + T cell isolation columns. However, as the fluorescence activated cell sorting analysis (FACS) was evaluated, the resulting cell population contained more as 25% CD4 + cells.

Zellkultur von Milz CD4+ T-Zellen. 105 Milz DC4+ T-Zellen wurden in 1 ml an vollständigem Medium kultiviert. Kultur-Überstände wurden nach 48 Stunden entfernt und hinsichtlich Cytokin-Konzentration wie oben beschrieben untersucht.Cell culture of spleen CD4 + T cells. 10 5 spleen DC4 + T cells were cultured in 1 ml of complete medium. Culture supernatants were removed after 48 hours and assayed for cytokine concentration as described above.

Beispiel II. Behandlung von Mäusen mit Anti-IL-12 AntikörpernExample II. Treatment of mice with anti-IL-12 antibodies

Behandlung mit Anti-IL-12 Antikörpern. Die Hybridoma Zelllinie (C17.8), welche neutralisierende Ratten Anti-Maus IL-12 Antikörper produzierte (G. Trinchieri, The Wistar Institute, Philadelphia, PA (20, 21) wurde verwendet, um Ascites-Flüssigkeit in Nacktmäusen gemäß Standardverfahren zu erzeugen und die Antikörper wurden aufgereinigt unter Verwendung von E-Z-SEP-Aufreinigungskits (Middlesex Sciences, Inc, Foxborough, MA). Rattenkontrollen IgG wurde erhalten von Jackson Immuno Research (West Grove, PA). Ein mg entweder von Ratten-Anti-Maus-IL-12 Antikörpern oder Rattenkontroll-IgG wurden intraperitonial in Mäusen verabreicht, welche mit TNBS zu verschiedenen Zeitpunkten vorbehandelt worden waren.treatment with anti-IL-12 antibodies. The hybridoma cell line (C17.8), which neutralized rats Anti-mouse IL-12 antibody (Trinchieri G., The Wistar Institute, Philadelphia, PA (20, 21) was used to remove ascites fluid in nude mice according to standard procedures to produce and the antibodies were purified using E-Z SEP purification kits (Middlesex Sciences, Inc, Foxborough, MA). Rat controls IgG were obtained Jackson Immuno Research (West Grove, PA). One mg either of Rat anti-mouse IL-12 antibodies or rat control IgG were administered intraperitoneally in mice which had been pretreated with TNBS at different times.

Beispiel III. Induktion und Auswertung der ColitisExample III. induction and evaluation of colitis

Induktion von Colitis. Spezifische pathogenfreie 2–4 Monate alte weibliche BALB/ c oder SJL/J Mäuse wurden erhalten vom National Cancer Institute (NCl, Bethesda, MD) und im Gebäude 10A der Tierstallung am National Institutes of Health gehalten. Die Mäuse wurden leicht anästhesiert mit Metofan (Methoxyfluran; Pitman-Moore, Mundelein IL). Ein 3,5 F Katheter wurde in den Dann insertiert, bis die Spitze 4 cm nahe am Anus war. Um Colitis zu induzieren, wurden 0,5 mg des Hapten-Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure (TNBS; Sigma, St. Louis, MO) in 50% Ethanol (um die Darm-Epithel-Barriere zu durchdringen) langsam in das Lumen des Darmes über den Katheter, welcher auf eine 1 ml Spritze passte, verabreicht. Im Kontrollexperimenten empfingen die Mäuse 50% Ethanol allein unter Verwendung der gleichen Technik wie oben beschrieben. Das gesamte Injektions-Volumen war 100 μl in beiden Gruppen, was erlaubte, dass TNBS oder Ethanol den gesamten Darm einschließend Caecum und Appendix erreichte. Die Tiere wurden in vertikaler Position für 30 Sekunden gehalten und kehrten dann in ihre Käfige zurück.Induction of colitis. Specific pathogen-free 2-4 month-old female BALB / c or SJL / J mice were obtained from the National Cancer Institute (NCI, Bethesda, MD) and in Building 10A of the animal housing on National Institutes of Health. Mice were lightly anesthetized with Metofan (methoxyflurane, Pitman-Moore, Mundelein IL). A 3.5 F catheter was inserted into the then until the tip was 4 cm near the anus. To induce colitis, 0.5 mg of the hapten reagent 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS, Sigma, St. Louis, MO) in 50% ethanol (to penetrate the intestinal epithelial barrier) became slow into the lumen of the intestine via the catheter, which fit on a 1 ml syringe. In the control experiments, the mice received 50% ethanol alone using the same technique as described above. The total injection volume was 100 μl in both groups, allowing TNBS or ethanol to reach the entire gut, including cecum and appendix. The animals were held in vertical position for 30 seconds and then returned to their cages.

Skalierung der histologischen Veränderungen. Gewebe wurden entfernt zu verschiedenen Zeitpunkten und in Paraffin eingebettet. Paraffin-Schnitte wurden gemacht und mit Haematoxylin und Eosin angefärbt. Der Grad der Entzündung der mikroskopischen Querschnitte des Darmes wurde semiquantitativ von 0 bis 4 klassifiziert [0 – keine Anzeichen einer Entzündung, der Darm ist nicht zu unterscheiden von demjenigen eines normalen Darms; 1 – sehr geringer Grad an Leucozyten-Infiltration (1–10% des Bereichs, infiltriert mit Leucozyten); 2 – geringer Grad an Leucozyten-Infiltration (11–25% des Bereichs mit Leucozyten infiltriert); 3 – hoher Grad von Leucozyten-Infiltration (26–50% des Bereichs mit Leucozyten infiltriert), hohe Gefäß-Dichte, Ausdickung der Darm- Wand; 4 – transmurale Leucozyten-Infiltration (> 50% des Bereichs infiltriert mit Leucozyten), Verlust von Becher-Zellen, hoher Gefäß-Dichte, Verdickung der Darmwand]. Die Klassifizierung wurde in Blindversuchen durch den gleichen Pathologen durchgeführt.scaling of histological changes. Tissues were removed at various times and in paraffin embedded. Paraffin sections were made and with hematoxylin and eosin stained. Of the Degree of inflammation The microscopic cross sections of the intestine became semiquantitative from 0 to 4 classified [0 - none Signs of inflammation, the gut is indistinguishable from that of a normal one intestine; 1 - very low level of leucocyte infiltration (1-10% of the area, infiltrated with leucocytes); 2 - lower Degree of leucocyte infiltration (11-25% of the leucocyte area infiltrated); 3 - high degree of leucocyte infiltration (26-50% of the area infiltrated with leucocytes), high vascular density, Thickening of the intestinal wall; 4 - transmural Leucocyte infiltration (> 50% of the area infiltrated with leucocytes), loss of beaker cells, high vessel density, Thickening of the intestinal wall]. The classification was in blind trials performed by the same pathologist.

Morphometrische Auswertung der Darmwanddicke. Drei oder mehr Tiere einer jeden Behandlungs-Gruppe wurden zufällig zu verschiedenen Zeitpunkten ausgewählt und Darmproben wurden entfernt und in Paraffin eingebettet. Die Dicke der Darmwand wurde beschrieben für Querschnitte durch Messen des Abstandes der serosalen Oberfläche zur luminalen Oberfläche in 2 mm Intervallen entlang der gesamten Länge eines jeden Schnitts durch ein kalibriertes Okular unter Verwendung eines Olympus Vanox S1 Mikroskops.morphometric Evaluation of the intestinal wall thickness. Three or more animals of each treatment group became coincidental selected at various times and intestinal samples were removed and embedded in paraffin. The thickness of the intestinal wall has been described for cross sections by measuring the distance of the serosal surface to the luminal surface in FIG mm intervals along the entire length of each cut through a calibrated eyepiece using an Olympus Vanox S1 Microscope.

Immunohistochemie. Proben wurden unter optimale Schneide-Temperatur(OCT)-Adaption auf Trockeneis gegeben, und 7 μm Cryo-Schnitte wurden geschnitten gemäß Standardverfahren. Schnitte wurden dann luftgetrocknet und in kaltem Aceton für 2 Min bei Raumtemperatur fixiert. Die Proben wurden rehydratisiert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 15 Min, blockiert mit 5% fötalem Kälberserum (FCS) in PBS für 20 Min und mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD4-Antikörper (1:100 Verdünnung; Pharmingen, San Diego, CA) für 45 Min in einer dunklen feuchten Kammer inkubiert. Die Schnitte wurden dann für 15 Min in PBS gewaschen, montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm analysiert.Immunohistochemistry. Samples were subjected to optimal cutting temperature (OCT) adaptation on dry ice given, and 7 microns Cryo-sections were cut according to standard procedures. slice were then air dried and placed in cold acetone for 2 min fixed at room temperature. The samples were rehydrated in Phosphate-buffered saline (PBS) for 15 min, blocked with 5% fetal calf serum (FCS) in PBS for 20 min and with fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated rat anti-mouse CD4 antibody (1: 100 dilution; Pharmingen, San Diego, CA) for Incubated for 45 min in a dark moist chamber. The cuts were then for Washed, mounted and with a fluorescence microscope for 15 min in PBS at an excitation wavelength analyzed by 490 nm.

Quantifikation von CD4+ T-Lymphozyten wurde durchgeführt mit Cryostatschnitten für zumindest drei Proben für jeden Zeitpunkt und jede Behandlungsgruppe durch Untersuchen von zehn zufällig ausgewählten Hochkraftfeldern (high power fields, HPF). Unter diesen experimentellen Bedingungen (400-fach Vergrößerung) repräsentierte ein HPF 0,25 mm2.Quantification of CD4 + T lymphocytes was performed with cryostat sections for at least three samples for each time point and each treatment group by examining ten randomly selected high power fields (HPFs). Under these experimental conditions (400x magnification), an HPF represented 0.25 mm 2 .

Intrarektale Verabreichung von 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure induziert eine chronische Granulomatos-Colitis in BALB/c und SJL/Mäusen. BALB/c- und SJL/J-Mäuse, welche einer intrarektalen Verabreichung von TNBS in 50% Ethanol ausgesetzt worden waren, entwickelten PanColitis mit schwerer Diarrhöe und rektalem Prolaps zusammen mit einer extensiven Verschmutzungskrankheit. Das Maximum der klinischen Erkrankung trat bei drei Wochen auf und klinische Anzeichen der Colitis ließen nach üblicherweise zwei Monaten nach. Kontrollmäuse, behandelt mit 50% Ethanol allein, zeigten keine Entwicklung einer Verschmutzungskrankheit und schienen gesund zu sein.intrarectal Administration of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid induces a chronic Granulomatous colitis in BALB / c and SJL / mice. BALB / c and SJL / J mice, which exposed to intrarectal administration of TNBS in 50% ethanol PanColitis developed with severe diarrhea and rectal Prolapse along with extensive pollution disease. The Maximum clinical disease occurred at three weeks and clinical Left signs of colitis usually two months after. Control mice, treated with 50% ethanol alone, showed no development of a Pollution disease and seemed to be healthy.

Die Darmproben von TNBS-behandelten BALB/c-Mäusen, entfernt sieben Tage nach Verabreichung von TNBS, zeigten merkliche Hyperemia und Entzündung, wohingegen die Darmproben von Kontroll-Mäusen, behandelt mit 50% Ethanol allein, keine makroskopischen Anzeichen einer Entzündung zeigten. Darüber hinaus zeigten TNBS-behandelte Mäuse Splenomegalie.The Intestinal samples from TNBS-treated BALB / c mice, removed seven days after administration of TNBS, marked hyperemia and inflammation, whereas the intestinal samples from control mice, treated with 50% ethanol alone, showed no macroscopic signs of inflammation. About that In addition, TNBS-treated Mice splenomegaly.

Histologische Analyse während der ersten Tage nach Induktion von Colitis zeigte Infiltrationen von neutrophilen Granulozyten in den Darm. Am Tag 7 wurde eine transmurale Entzündung, welche den gesamten Darm betraf (jedoch nicht den Blinddarm), gefunden. Die Colitis wurde hauptsächlich charakterisiert durch Lymphozyten-Einwachsungen, welche assoziiert waren mit Verdickung der Darmwand, Ulceration, Verlust von Becher-Zellen und dem Vorliegen von Granuloma. Immunohistochemisches Anfärben zeigte, dass am Tag 7 CD4+ T-Zellen erhöht im Darm von TNBS-behandelten Mäusen vorlagen im Vergleich zu Kontrollmäusen. Die Unterschiede in der entzündlichen Aktivität wurden des Weiteren bestätigt durch histologische Klassifikation der Darmschnitte (1). Wie durch morphometrische Analyse des Darms ausgewertet wurde, lagen die Maxima der Darmwanddicke und die Zahl der CD4+ T-Lymphozyten (Tabelle 1) der Erkrankungsintensität üblicherweise zwischen zwei und vier Wochen nach Verabreichung von TNBS. Zu späteren Stadien trat eine Reduktion in der Anzahl der Granulozyten auf, jedoch blieben intramurale Lymphoid-Aggregate bestehen und einsetzende Fibrosis wurde festgestellt. Diese histologischen Anzeichen der Entzündung wurden immer noch zwei Wochen nach TNBS-Behandlung nachgewiesen, traten jedoch nicht in mit Ethanol behandelten Mäusen auf.Histological analysis during the first days after induction of colitis showed infiltration of neutrophilic granulocytes into the intestine. On day 7, a transmural inflammation affecting the entire intestine (but not the cecum) was found. Colitis was mainly characterized by lymphocytic ingrowth associated with thickening of the intestinal wall, ulceration, loss of goblet cells and the presence of granuloma. Immunohistochemical staining showed that on day 7 CD4 + T cells increased in the gut of TNBS-treated mice as compared to control mice. The Differences in inflammatory activity were further confirmed by histological classification of intestinal sections ( 1 ). As evaluated by morphometric analysis of the gut, the intestinal wall thickness maxima and the number of CD4 + T lymphocytes (Table 1) of disease intensity were usually between two and four weeks after administration of TNBS. At later stages there was a reduction in the number of granulocytes, but intramural lymphoid aggregates persisted and onset of fibrosis was noted. These histological signs of inflammation were still detected two weeks after TNBS treatment, but did not occur in ethanol-treated mice.

Histologisch zeigten die Milzproben von TNBS-behandelten Mäusen einen Zuwachs in der Größe der roten Blutzellen und der periarteriolären lymphoiden Schichten am Tag 7, wenn dies mit Milzproben von Kontrollmäusen verglichen wurde. Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortier-Analyse (FACS) von Milz-Lymphozyten förderte eine zweifache Vergrößerung in der Prozentzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen in TNBS-behandelten Mäusen zutage im Vergleich mit Kontroll-Ethanol-behandelten Mäusen und normalen BALB/c-Mäusen, zusammen mit einer Reduktion in den B220+ B-Zellen.histological The spleen samples from TNBS-treated mice showed an increase in the size of the red Blood cells and the periarteriolar lymphoid layers on day 7, when compared with spleen samples from control mice has been. Fluorescence-activated cell sorting analysis (FACS) of spleen lymphocytes promoted a double magnification in percentage of CD4 + and CD8 + T cells in TNBS-treated mice compared with control ethanol-treated mice and normal BALB / c mice, along with a reduction in the B220 + B cells.

Frühverabreichung der Antikörper gegen IL-12 unterdrückt Colitis und beseitigt die Verschmutzungserkrankung in TNBS-behandelten Mäusen. Zur Bestimmung, ob Antikörper gegen IL-12 die Erkrankungs-Aktivitäten beeinträchtigen, wurden die Mäuse fünf und neun Tage nach Induktion der Colitis systemisch mit Anti-IL-12 oder Kontrollratten-IgG behandelt. Wenn die Mäuse mit Anti-IL-12 behandelt wurden, wurde eine signifikante Verbesserung der Verschmutzungskrankheit offensichtlich. Anti-IL-12-behandelte Mäuse wurden aktiver und verloren das Erscheinungsbild des gesträubten Fells im Vergleich mit unbehandelten Mäusen oder Mäusen, denen Kontrollratten-IgG verabreicht worden war. Darüber hinaus erhielten Mäuse, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war, üblicherweise ihr ursprüngliches Körpergewicht zurück, wohingegen Kontroll-IgG-behandelte Mäuse weiter an Gewicht verloren. Schließlich brachte die Brutto-Inspektion des Darms am Tag 12 eine Reduktion der entzündlichen Aktivität in Tieren zutage, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war.early administration the antibody suppressed against IL-12 Colitis and eliminates the pollution disease in TNBS-treated Mice. To determine if antibodies against IL-12 impaired the disease activities, the mice became five and nine Days after induction of colitis treated systemically with anti-IL-12 or control rat IgG. If the mice treated with anti-IL-12, was a significant improvement of the pollution disease obviously. Anti-IL-12 treated mice were more active and lost the appearance of the roughened fur compared with untreated mice or mice, control rat IgG had been administered. Furthermore received mice, who had been given anti-IL-12, usually their original one body weight back, whereas control IgG-treated mice continued to lose weight. After all brought the gross inspection of the intestine on day 12 a reduction in inflammatory activity in animals revealed that anti-IL-12 had been administered.

Histologische Untersuchungen zeigen signifikant weniger entzündliche Zellen in den Darmproben von Anti-IL-12-behandelten Mäusen. In den meisten Fällen klang bei Anti-IL-12-Behandlung die TNBS-induzierte Entzündung vollständig ab und stellte das normale histologische Erscheinungsbild des Darms wieder her. Dies wurde bestätigt durch histologisches Klassifizieren von Darmschnitten. Gepoolte Daten von drei unabhängigen Experimenten zeigten signifikante Reduktion in der entzündlichen Aktivität nach Anti-IL-12-Behandlung (2).Histological studies show significantly less inflammatory cells in the intestinal samples of anti-IL-12 treated mice. In most cases, anti-IL-12 treatment completely abolished TNBS-induced inflammation and restored the normal histological appearance of the gut. This was confirmed by histological classification of intestinal sections. Pooled data from three independent experiments showed significant reduction in inflammatory activity following anti-IL-12 treatment ( 2 ).

Beispiel IV. Cytokin-AssaysExample IV. Cytokine Assays

ELISA. Um Cytokin-Produktion zu messen, werden 24-Well-Platten (Costar, Cambridge, MA) mit 10 μg/ml murinen Anti-CD3ε-Antikörpern in Carbonatpuffer (pH 9,6) über Nacht bei 4°C gecoatet. 105 LP-T-Zellen wurden in 1 ml vollständigem Medium in vorgecoateten oder ungecoateten Wells kultiviert und 1 μg/ml löslichem Anti-CD28 Antikörper wurde zu den Anti-CD3ε gecoateten Wells hinzugegeben. Kultur-Überstände wurden nach 48 Stunden entfernt und auf die Cytokin-Konzentration geassayt. Cytokin-Konzentrationen wurden bestimmt durch spezifischen ELISA, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (Pharmingen) unter Verwendung von Immulon-496-Well-Mikrotiter-Platten (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA). Optische Dichten wurden gemessen auf einem Dynatech MR 5000 ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 490 nm.ELISA. To measure cytokine production, 24-well plates (Costar, Cambridge, MA) are coated with 10 μg / ml murine anti-CD3ε antibodies in carbonate buffer (pH 9.6) overnight at 4 ° C. 10 5 LP-T cells were cultured in 1 ml of complete medium in pre-coated or uncoated wells and 1 μg / ml of soluble anti-CD28 antibody was added to the anti-CD3ε coated wells. Culture supernatants were removed after 48 hours and assayed for cytokine concentration. Cytokine concentrations were determined by specific ELISA according to the manufacturer's recommendations (Pharmingen) using Immulon 496 well microtiter plates (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA). Optical densities were measured on a Dynatech MR 5000 ELISA reader at a wavelength of 490 nm.

Stimulierte LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen sekretieren Th1-Cytokine. Um die Cytokin-Produktion durch Infiltrieren von LP-Zellen in den jeweiligen Darm der TNBS-behandelten Mäuse zu untersuchen, wurde diese Zellpopulation aufgereinigt aus Darm-Gewebsproben 7 Tagen nach der Induktion der Colitis und das Cytokinmuster dieser Zellen wurde verglichen mit demjenigen von LP-Zellen, erhalten aus Darm-Gewebsproben von Kontroll-Ethanol-behandelten Mäusen. Zellen wurden kultiviert für zwei Tage und Kulturüberstände wurden analysiert auf Konzentrationen von Th1 (IL-2, IFN-γ) und Th2 (IL-4, IL-10)-Cytokinen durch spezifischen ELISA. Eine zehnfache Erhöhung in der spontanen IFN-γ-Produktion durch LP-Zellen wurde in TNBS-behandelten Mäusen gefunden. Des Weiteren erzeugten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen, stimuliert mit Anti-CD3 und Anti-CD28 20- bis 50- mal höhere Spiegel an IL-2 und IFN-γ als LP-Zellen von Kontrollmäusen. Ähnlich wurde ein Anstieg in der spontanen (4,5 U vs. 1,8 U) und induzierten (46 U vs. 16,8 U nach Stimulation mit Anti-CD3 und Anti-CD28) IFN-γ-Produktion durch Milz CD4+ T-Zellen in den TNBS-behandelten Tieren verglichen mit den Ethanol-Kontrollgruppen zu diesem Zeitpunkt gefunden.stimulated LP cells from TNBS-treated mice secrete Th1 cytokines. To infiltrate cytokine production was examined by LP cells in the respective intestine of the TNBS-treated mice this cell population purified from intestinal tissue samples 7 days after the induction of colitis and the cytokine pattern of these cells was compared with that of LP cells obtained from intestinal tissue samples of Control ethanol-treated mice. Cells were cultured for two days and culture supernatants were analyzed for concentrations of Th1 (IL-2, IFN-γ) and Th2 (IL-4, IL-10) cytokines by specific ELISA. A tenfold increase in spontaneous IFN-γ production by LP cells was in TNBS-treated mice found. Furthermore, LP cells produced by TNBS-treated mice were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 20 to 50-fold higher levels of IL-2 and IFN-γ than LP cells of control mice. Became similar an increase in the spontaneous (4.5 U vs. 1.8 U) and induced (46 U vs. 16.8 U after stimulation with anti-CD3 and anti-CD28) IFN-γ production by spleen CD4 + T cells in the TNBS-treated animals found with the ethanol control groups at this time.

Im Gegensatz zu diesen oben dargestellten Ergebnissen war die Sekretion von IL-4 unstimulierten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen identisch im Vergleich zu LP-Zellen von Ethanol- behandelten Kontrollmäusen. In stimulierten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen war die durchschnittliche Sekretion von IL-4 reduziert um ungefähr das fünffache im Vergleich mit Ethanol- behandelten Kontrollmäusen. Schließlich war die Sekretion von IL-10 durch stimulierte und unstimulierte LP-Zellen ähnlich in TNBS- und Ethanol- behandelten Mäusen.In contrast to these results presented above, the secretion of IL-4 unstimulated LP cells from TNBS-treated mice was identical compared to LP cells from ethanol-treated Kon troll mice. In stimulated LP cells from TNBS-treated mice, the average secretion of IL-4 was reduced by approximately five-fold compared with ethanol-treated control mice. Finally, secretion of IL-10 by stimulated and unstimulated LP cells was similar in TNBS and ethanol treated mice.

In situ rerverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). In situ RTPCR für IFN-γ mRNA-Expression oder durchgeführt wie zuvor beschrieben (18). Cryoschnitte wurden auf geladenen Glasträgern platziert, so geschnitten, dass sie in 0,5 ml Eppendorf-Tuben passten. Proben wurden fixiert in 10% Formaldehyd über Nacht bei 4°C, dreimal mit PBS gewaschen und viermal in autoklaviertem dH2O für 5 Min. Die Schnitte wurden permeabilisiert mit 2 mg/ml Trypsinogen (Sigma) in 0,01 N HCl für 15 Min bei 25°C, gefolgt von Neutralisation mit Puffer A (0,1 M Tris HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl). Zur DNA-Degradation wurden die Schnitte inkubiert in RQ1 Rnase-freier DNase (8U/100 ml: erhalten von Promega, Madison, WI) in Puffer B, enthaltend 40 mM Tris HCl (pH 7,9), 10 mM NaCl, 6 mM MgCl2 und 0,1 mM CaCl2 bei 37°C für 12 Min und bei 75°C für 10 Min. Als nächstes wurden die Schnitte für 60 Min bei 50°C in einem Perkin Elmer Thermocycler in 100 μl der folgenden Reaktionsmischung inkubiert: 10 mM Tris HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 25 μM dATP, 25 μM dTTP, 25 μMdCTP, 25 μM dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ), 100 nM von jeweils IFN-γ-Primer (Sense: 5'-GACAATCAGGCCATCAGCAACAAC-3' (SEQ ID NO: 1); Antisense-Primer: 5'-TCCTGAGGCTGGATTCCGGCAACA-3' (SEQ ID NO: 2), 10 mM DTT, 75 U RNasin und 400 U M-MLV reverse Transkriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Die Träger wurden fünfmal jeweils mit Natriumcitrat-Puffer gewaschen (3 M NaCl, 0,3 M Na3Citrat, pH 7,0, 2 × SSC) und zweimal in dH2O.In situ reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). In situ RTPCR for IFN-γ mRNA expression or performed as previously described (18). Cryosections were placed on charged glass slides, cut to fit 0.5 ml Eppendorf tubes. Samples were fixed in 10% formaldehyde overnight at 4 ° C, washed three times with PBS, and four times in autoclaved dH 2 O for 5 min. Sections were permeabilized with 2 mg / ml trypsinogen (Sigma) in 0.01 N HCl for 15 Min at 25 ° C, followed by neutralization with buffer A (0.1 M Tris HCl (pH 7.5), 0.1 M NaCl). For DNA degradation, sections were incubated in RQ1 RNase-free DNase (8U / 100 ml: obtained from Promega, Madison, WI) in Buffer B containing 40 mM Tris HCl (pH 7.9), 10 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 and 0.1 mM CaCl 2 at 37 ° C for 12 min and at 75 ° C for 10 min. Next, the sections were incubated for 60 min at 50 ° C in a Perkin Elmer thermocycler in 100 μl of the following reaction mixture: 10 mM Tris HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 25 μM dATP, 25 μM dTTP, 25 μMdCTP, 25 μM dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ), 100 nM of each IFN-γ primer (Sense: 5'-GACAATCAGGCCATCAGCAACAAC-3 '(SEQ ID NO: 1); antisense primers: 5'-TCCTGAGGCTGGATTCCGGCAACA-3' (SEQ ID NO: 2), 10mM DTT, 75 U RNasin, and 400U M-MLV reverse transcriptase ( Gibco BRL, Gaithersburg, MD) The slides were washed five times each with sodium citrate buffer (3M NaCl, 0.3M Na 3 Citrate, pH 7.0, 2x SSC) and twice in dH 2 O.

Das Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren wurde durchgeführt in situ entweder für sense- oder antisense-geprimte cDNA in 100 ml der folgenden Reaktionsmischung: 25 μM von jeweils den Nukleotiden dATP, dCTP, dGTP und 23,7 μM dTTP, 1,25 μM Digoxigenin-11-dUTP; erhalten von Boehringer Mannheim) und 10 nM von IFN-γ Primern. Nach Denaturierung der Proben für 4 Min bei 95°C wurde Thermocycling durchgeführt für fünf Zyklen (94°C für 70 Sek., 62°C für 1 Min, 72°C für 1 Min); die letztendliche Extension wurde für 10 Min bei 72°C durchgeführt. Die Proben wurden dann in SSC-Lösungen gewaschen (2 × SSC, 1 × SSC, 0,5 × SCC; je 5 mal) und Immunodetektion wurde durchgeführt unter Verwendung von DIG-Nukleinsäure-Nachweiskits (Boehringer Mannheim). Schnitte wurden dehydratisiert in hochreinem Ethanol, platziert in Xylen und montiert auf Deckgläschen.The Polymerase chain reaction (PCR) procedure was performed in situ either for Sense or antisense primed cDNA in 100 ml of the following reaction mixture: 25 μM of each nucleotides dATP, dCTP, dGTP and 23.7 μM dTTP, 1.25 μM digoxigenin-11-dUTP; obtained from Boehringer Mannheim) and 10 nM of IFN-γ primers. After denaturation of the samples for 4 min at 95 ° C Thermocycling was carried out for five cycles (94 ° C for 70 sec., 62 ° C for 1 min, 72 ° C for 1 min); the final extension was performed at 72 ° C for 10 min. The Samples were then in SSC solutions washed (2 × SSC, 1 × SSC, 0.5 × SCC; 5 times each) and immunodetection was performed using DIG nucleic acid detection kits (Boehringer Mannheim). Slices were dehydrated in high purity Ethanol, placed in xylene and mounted on coverslips.

Elispot Assay für IFN-γ. 105 LP-Zellen wurden inkubiert für einen Tag in Anti-CD3ε-gecoateten 24 Well-Platten und 1 μg/ml löslicher Anti-CD28-Antikörper wurde hinzu gegeben. Die Zellen wurden inkubiert in 24 Well-Platten, welche gecoatet waren mit Ratten-Anti-Maus-IFN-γ (Pharmingen). Nach 12 Stunden wurden die Platten in PBS/TWEEN® gewaschen und biotinyliertes Ratten-Anti-Maus-IFN-γ (Pharmigen) (2 μg/ ml) wurde hinzu gegeben. Die Platten wurden inkubiert über Nacht bei 4°C. Nach Waschen in PBS/TWEEN® wurde Streptavidin/alkalische Phosphatase (1:1000 Verdünnung, erhalten von Zymed) für 30 Min bei 37°C hinzu gegeben. Die Platten wurden erneut in PBS/TWEEN® gewaschen und das alkalische Phosphatase(AP)-Substrat (Promega, Madison, WT), zusammen mit 1% Agarosegel, wurde zugegeben. Die Farbreaktion ließ man für 24 Std. laufen, bevor die Spots fotografiert wurden.Elispot assay for IFN-γ. 10 5 LP cells were incubated for one day in anti-CD3ε-coated 24-well plates and 1 μg / ml of soluble anti-CD28 antibody was added. Cells were incubated in 24-well plates coated with rat anti-mouse IFN-γ (Pharmingen). After 12 hours, the plates in PBS / TWEEN ® were washed, and biotinylated rat anti-mouse IFN-γ (Pharmingen) (2 ug / ml) was added. The plates were incubated overnight at 4 ° C. After washing in PBS / TWEEN ® streptavidin / alkaline phosphatase (1: 1000 dilution, obtained from Zymed) for 30 min at 37 ° C added. The plates were washed again in PBS / TWEEN ® and the alkaline phosphatase (AP) substrate (Promega, Madison, WT), together with 1% agarose gel, was added. The color reaction was allowed to run for 24 hours before the spots were photographed.

In situ Polymerasekettenreaktions-Untersuchungen zeigen erhöhte IFN-γ mRNA-Expression in den Darmproben von TNBS-behandelten BALB/c-Mäusen. Um zu bestimmen, ob der beobachtete Anstieg in IFN-γ-Produktion auch auf der mRNA-Ebene beobachtet wurde, wurde die mRNA-Expression von IFN-γ im Darm von TNBS-behandelten Mäusen durch in situ-PCR-Untersuchungen ausgewertet. Ethanolkontrollbehandelte Tiere zeigten keine signifikante Expression von IFN-γ mRNA am Tag 7. In den TNBS-behandelten Tieren wurde jedoch eine drastische Hochregulation von IFN-γ mRNA-Expression zum selben Zeitpunkt beobachtet. Hohe Färbe-Intensität wurde speziell in den Subepithel-Gebieten beobachtet.In situ polymerase chain reaction studies show increased IFN-γ mRNA expression in the intestinal samples from TNBS-treated BALB / c mice. To determine if the observed increase in IFN-γ production was also observed at the mRNA level, mRNA expression was of IFN-γ in the gut from TNBS-treated mice evaluated by in situ PCR studies. Ethanol Control Treated Animals showed no significant expression of IFN-γ mRNA at Day 7, however, was drastic in the TNBS-treated animals Up-regulation of IFN-γ mRNA expression observed at the same time. High staining intensity was observed especially in the subepithelial areas.

IFN-γ-produktion durch stimulierte LP-Zellen wird beseitigt in TNBS-behandelten Mäusen, denen Anti-IL-12 verabreicht wird. Eine Analyse der IFN-γ-Produktion durch LP-Zellen in Anti-IL-12-behandelten Tieren brachte ein Abklingen der IFN-γ- Produktion in TNBS-behandelten Mäusen zutage, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war, und zwar im Vergleich mit Ratten-IgG-behandelten Mäusen, was darauf hindeutet, dass die Anti-IL-12-Behandlung agieren kann durch Einflussnahme auf die Th1- ähnliche Antwort von lokalen CD4+ T-Zellen. Darüber hinaus zeigten Elispot-Assays für die IFN-γ-Sekretion durch LP-Zellen eine drastische Reduktion in der durchschnittlichen Zahl an Elispots in den Anti-IL-12-behandelten Gruppen im Vergleich zu den Ratten-Kontroll-IgG-behandelten Gruppen. Die Größe der Elispots war jedoch ähnlich in beiden Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Reduktion in der IFN-γ-Sekretion durch LP-Zellen von Anti-IL-12-behandelten Mäusen hauptsächlich aufgrund der Reduktion in der Anzahl von IFN-γ-sekretierenden Zellen begründet war.IFN-γ-production by stimulated LP cells is eliminated in TNBS-treated mice which Anti-IL-12 is administered. An analysis of IFN-γ production LP cells in anti-IL-12 treated animals faded IFN-γ production in TNBS-treated mice In comparison, anti-IL-12 was administered with rat IgG-treated mice, suggesting that the anti-IL-12 treatment can act by influencing the Th1-like response of local CD4 + T cells. About that in addition, Elispot assays showed for the IFN-γ secretion by LP cells a drastic reduction in the average Number of elis spots in the anti-IL-12 treated groups compared to the rat control IgG treated groups. The size of the Elispots however, it was similar in both groups, suggesting that the reduction in the IFN-γ secretion by LP cells from anti-IL-12 treated mice mainly due to reduction in the number of IFN-γ-secreting Cells established was.

Späte Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 beseitigte die Verschmutzungserkrankung in Mäusen mit TNBS-induzierter Colitis. Um zu bestimmen, ob Anti-IL-12-Behandlung effektiv während später Phasen der Erkrankung sein würde, wenn die Colitis vollständig etabliert war, wurde die Verabreichung von Anti-II-12 oder Kontroll-Ratten-IgG am Tag 20 begonnen und am Tag 24 und 28 wiederholt. Ein signifikanter Anstieg im durchschnittlichen Gewicht der Mäuse wurde nach Anti-IL-12-Behandlung gefunden, jedoch nicht nach Ratten-Kontroll-IgG-Behandlung. Des Weiteren trat ein Abklingen der IFN-γ-Sekretion beobachtbar auf, wenn LP-Zellen von solchen Mäusen mit Anti-CD3 und Anti-CD28 stimuliert wurden, und zwar in denjenigen Mäusen, denen Anti-IL-12 verabreicht wurde, jedoch nicht in denjenigen, denen Ratten-Kontroll-IgG verabreicht wurde.Late administration of antibodies against IL-12 eliminated the fouling disease in mice TNBS-induced colitis. To determine if anti-IL-12 treatment is effective while later Phases of the disease would be if the colitis is complete was established, the administration of anti-II-12 or control rat IgG a day 20 started and repeated on day 24 and 28. A significant increase in the average weight of the mice was after anti-IL-12 treatment found, but not after rat control IgG treatment. Of Furthermore, a decrease in IFN-γ secretion was observable, if LP cells from such mice were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28, in those mice, which anti-IL-12 has been administered, but not in those where rat control IgG was administered.

Beispiel V. Behandlung von Menschen mit Anti-IL-12-AntikörpernExample V. Treatment of people with anti-IL-12 antibodies

Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 an ein menschliches Subjekt mit der Diagnose einer etablierten Colitis. Um den Colitis- induzierenden Effekt von IL-12 in einem menschlichen Subjekt zu inhibieren, können 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht von Antikörpern gegen IL-12 als eine Einzeldosis über einen zweistündigen Zeitraum verabreicht werden oder als wöchentliche Infusionen, verabreicht über einen zweistündigen Zeitraum, bis die Symptome der Colitis, wie z.B. Abdominalschmerz, Diarrhöe, Dehydration oder andere allgemeine Symptome von IBD abklingen. Zur oralen Verabreichung können 500 bis 1000 mg an Antikörpern gegen IL-12 verabreicht werden, P. O. in einer Einzeldosis oder in wöchentlichen Dosen, bis die Symptome der Colitis wie oben beschrieben abklingen.administration of antibodies against IL-12 to a human subject with the diagnosis of an established Colitis. To the colitis-inducing effect of IL-12 in one To inhibit human subject may be 10 mg to 20 mg / kg body weight of antibodies against IL-12 as a single dose over a two-hour period be administered or as weekly Infusions, administered via a two-hour Period until the symptoms of colitis, e.g. abdominal pain, diarrhea, Dehydration or other common symptoms of IBD subside. to oral administration 500 to 1000 mg of antibodies against IL-12, P.O. in a single dose or in weekly Doses until the symptoms of colitis subsided as described above.

Beispiel VI. Humanisierte AntikörperExample VI. humanized antibody

Die Produktion von humansierten Mausantikörpern gegen IL-12. Nagetier- monoklonale oder polyklonale Antikörper können modifiziert werden, gemäß den Protokollen, dargestellt bei Junghans et al. (25), Brown et al. (26) und Kettleborough et al (27). Genauer gesagt können Nagetier-Antikörper modifiziert werden zur menschlichen Verabreichung durch Konstruieren mit Hilfe von rekombinanten DNA-Protokollen, die jedem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, eines chimeren Nagetier- menschlichen Antikörpers bestehend aus Nagetier- variablen Regionen und menschlichen schweren und leichten Ketten-konstanten Regionen. Ein anderer Ansatz des Humanisierens von Nagetier-Antikörpern ist die Verpflanzung von Nagetier komplementär-bestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) von den Nagetier variablen Regionen in menschliche variable Regionen. Unter Verwendung eines dieser Ansätze können Nagetier- Antikörper humanisiert zur Verabreichung an menschliche Subjekte werden.The Production of Humanized Mouse Antibodies to IL-12. Rodent- monoclonal or polyclonal antibodies can be modified according to the protocols, shown by Junghans et al. (25) Brown et al. (26) and Kettleborough et al. (27). More specifically you can Rodent antibody modified for human administration by engineering with the help of recombinant DNA protocols that any professional are known in the art of a chimeric rodent human antibody consisting of rodent variable regions and human heavy and light chain constant regions. Another approach of the Humanizing rodent antibodies the transplantation of rodent complementary-determining regions (complementarity determining regions, CDRs) of the rodent variable regions in human variable regions. Using one of these approaches, rodent Antibodies humanized for administration to human subjects.

Beispiel VII. Verfahren zum Screenen nach Substanzen in einem TiermodellExample VII. Method for screening for substances in an animal model

Screening nach einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität bei der Reduktion der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis. Um zu bestimmen, ob eine Substanz effizient in der Reduktion der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis durch Zurückdrängen des Colitis induzierenden Effekts durch IL-12 ist, kann ein Tiermodell für etablierte Colitis präpariert werden, gemäß dem Protokoll dargestellt im Beispiel III oben. Eine Menge der Substanz von Interesse kann dann dem Tier parenteral in einem Dosier-Plan verabreicht werden, bestehend aus 1 mg in einer Einzeldosis oder einem wöchentlichen Plan von 1 mg zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung der Substanz an das Tier kann die Menge der Reduktion der entzündlichen Antwort gemäß dem Protokollen dargestellt in Beispiel III oben bestimmt werden. Antikörper gegen IFN-γ und Antikörper gegen TFN-α können auch Tieren verabreicht werden, in welchen Colitis etabliert worden ist, in einem Therapie-Plan besteht aus 1 mg in einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Verabreichung von 1 mg zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung des Anti-IFN-γ oder TNF- α kann die Menge der Reduktion der entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß dem Protokoll, dargestellt in Beispiel III oben. Eine Substanz, welche die entzündliche Antwort der Colitis in einem größeren Grad reduziert als das Ausmaß der Reduktion der Entzündung, induziert durch Anti-IFN-γ-oder Anti-TNF-α-Verabreichung, wird als effektive Substanz in Behandlung einer etablierten Colitis betrachtet.screening for a substance in terms of its effectiveness in the Reduction of inflammatory Answer of an established colitis. To determine if a substance efficient in reducing the inflammatory response of an established Colitis by pushing back the Colitis inducing effect by IL-12 is an animal model for established Colitis prepared be, according to the protocol shown in Example III above. A lot of the substance of interest can then be administered to the animal parenterally in a dosing schedule, consisting of 1 mg in a single dose or weekly Plan 1 mg twice a week. At certain times after Administration of the substance to the animal may reduce the amount of reduction the inflammatory Answer according to the protocols shown in Example III above. Antibodies against IFN-γ and antibody against TFN-α can also Be administered to animals in which colitis has been established, in a therapy plan consists of 1 mg in a single dose or a weekly Administration of 1 mg twice a week. At certain times After administration of the anti-IFN-γ or TNF-α, the amount of reduction the inflammatory Be determined according to the protocol, shown in Example III above. A substance which is the inflammatory Response of colitis reduced to a greater degree as the extent of Reduction of inflammation, induced by anti-IFN-γ or Anti-TNF-α administration, is used as an effective substance in treatment of an established colitis considered.

Screening einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Vorbeugen von IBD. Um zu bestimmen, ob eine Substanz effizient in der Vorbeugung von IBD ist, kann die Substanz an ein Tier empfänglich für Colitis verabreicht werden, und das Tier kann dann einer Behandlung unterzogen werden, welche Colitis induzieren wird (beispielsweise durch Behandlung mit einem Hapten-Reagenz, wie in den Beispielen hier beschrieben). Eine Menge der Substanz von Interesse kann an das Tier parenteral in einem Dosierplan verabreicht werden, bestehend aus 1 mg von einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Dosis von 1 mg, zweimal in der Woche. Zu angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung der Substanz an das Tier und Behandlung des Tiers, um Colitis zu induzieren, kann die Entwicklung der entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß den Protokollen dargestellt in Beispiel III oben. Antikörper gegen IFN-γ und Antikörper gegen TFN-α können auch den Tieren verabreicht werden, welche empfänglich gegen Colitis sind, und zwar in einem Dosierplan, bestehend aus 1 mg von einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Verabreichung von 1 mg, zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung der Anti-IFN-γ oder TNF-α und der Behandlung des Tieres, um Colitis zu induzieren, kann die Entwicklung einer entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß dem Protokollen dargestellt in Beispiel III oben. Eine Substanz, die der entzündliche Antwort in einem größeren Ausmaß vorbeugt als der Grad der Prävention der Entzündung, induziert durch Anti-IFN-γ- oder Anti-TNF-α-Verabreichung, wird als effektive Substanz zum Vorbeugen von IBD betrachtet.Screening a substance for its effectiveness in preventing IBD. In order to determine if a substance is efficient in the prevention of IBD, the substance may be administered to an animal susceptible to colitis and the animal may then be subjected to a treatment which will induce colitis (for example by treatment with a hapten reagent as described in the examples herein). An amount of the substance of interest may be administered to the animal parenterally in a dosage regimen consisting of 1 mg of a single dose or a weekly dose of 1 mg, twice a week. At indicated times after administration of the substance to the animal and treatment of the animal to induce colitis, the development of the inflammatory response may be determined, according to the protocol len shown in Example III above. Antibodies to IFN-γ and antibodies to TFN-α can also be administered to the animals susceptible to colitis, in a dosage regimen consisting of 1 mg of a single dose or a weekly administration of 1 mg twice a week. At certain times after administration of the anti-IFN-γ or TNF-α and the treatment of the animal to induce colitis, the development of an inflammatory response can be determined according to the protocols set forth in Example III, supra. A substance which prevents the inflammatory response to a greater extent than the degree of prevention of inflammation induced by anti-IFN-γ or anti-TNF-α administration is considered to be an effective substance for preventing IBD.

Obwohl der vorliegende Prozess unter Verweis auf spezifische Details bestimmter Ausführungsformen davon beschrieben worden war, ist nicht beabsichtigt, das solche Details als Einschränkungen für den Umfang der Erfindung betrachtet werden, außer in dem Maße, als sie in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.Even though the present process with reference to specific details of certain Embodiments thereof It is not intended that such details as restrictions for the Scope of the invention are considered, except in so far as they in the attached claims are included.

Figure 00210001
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Tabelle 1. Auswertung der Darmwanddicke und der Zahl der CD4+ T-Lymphozyten pro Hochkraftfeld (high power field, HPF) in den Darmproben von TNBS- und Ethanol- behandelten BALB/c-Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Behandlung. Die Darmwanddicke wird in μm ausgedrückt ± Standardabweichung. Die Werte der CD4+ T-Lymphozyten, wie dargestellt, werden als positive Zellen pro HPF ± Standardabweichung ausgedrückt.table 1. Evaluation of the intestinal wall thickness and the number of CD4 + T lymphocytes per high power field (HPF) in the intestinal samples of TNBS- and ethanol-treated BALB / c mice at different times after treatment. The intestinal wall thickness is expressed in μm ± standard deviation. The Values of CD4 + T lymphocytes, as shown, are considered positive cells per HPF ± standard deviation expressed.

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SEQUENZPROTOKOLL

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SEQUENCE LISTING
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Claims (11)

Verwendung eines Antikörpers für Interleukin-12 effektiv in der Reduzierung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12 für die Herstellung eines medizinischen Produktes zur Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Kolitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darmerkrankung.Use of an antibody for interleukin-12 effectively in the reduction of the colitis-inducing effect of interleukin-12 for the Preparation of a medical product for the treatment of inflammatory Response of established colitis in a subject with inflammatory Bowel disease. Verwendung von Anspruch 1, worin das Subjekt ein Mensch ist.Use of claim 1, wherein the subject is a Is human. Ein Verfahren zum Screenen einer Substanz effektiv in der Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effekts von Interleukin-12 umfassend: (a) Erhalten eines Tieres, welches etablierte Kolitis hat; (b) Verabreichen der Substanz an das Tier; und (c) Untersuchen des Tieres hinsichtlich der Reduktion der entzündlichen Antwort der Kolitis, wobei eine Reduktion in der entzündlichen Antwort der Kolitis eine effektive Substanz anzeigt.A method for screening a substance effectively in the oppression of the colitis-inducing effect of interleukin-12 comprising: (A) Obtaining an animal having established colitis; (B) Administering the substance to the animal; and (c) Examine of the animal with regard to the reduction of the inflammatory response of colitis, being a reduction in the inflammatory Colitis response indicates an effective substance. Das Verfahren von Anspruch 3, worin das Tier eine etablierte Kolitis aufweist, erzeugt durch das Einbringen einer effektiven Menge eines Haptenreagenzes in den Dickdarm des Tieres.The method of claim 3, wherein the animal is a has established colitis produced by the introduction of a effective amount of a hapten reagent in the colon of the animal. Das Verfahren von Anspruch 4, wobei das Haptenreagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure ist.The method of claim 4, wherein the hapten reagent 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, worin das Tier eine Maus ist.The method of any one of claims 3 to 5, wherein the animal is a mouse. Ein Verfahren zum Screenen einer Substanz, die effektiv im Verhindern der Entwicklung einer Kolitis ist durch Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12, umfassend: (a) Verabreichen der Substanz an ein Tier, das empfänglich für Kolitis ist; (b) Unterziehen des Tieres einer Behandlung, welche Kolitis-induzierend ist; (c) Untersuchen des Tieres hinsichtlich der Entwicklung einer Kolitis, wobei das Fehlen der Entwicklung einer Kolitis die Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12 anzeigt.A method of screening a substance effectively in preventing the development of colitis is by suppressing the Colitis-inducing effect of interleukin-12, comprising: (A) Administering the substance to an animal susceptible to colitis; (b) subject the animal of a treatment which is colitis-inducing; (C) Examination of the animal for the development of colitis, absence of development of colitis suppression of Colitis-inducing Effect of interleukin-12. Das Verfahren von Anspruch 7, worin das Tier eine Maus ist.The method of claim 7, wherein the animal is a Mouse is. Das Verfahren der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Behandlung, welche eine Kolitis induzieren wird, die Einfuhr einer effektiven Menge eines Haptenreagenzes in den Dickdarm des Tieres darstellt.The method of claims 7 or 8, wherein the treatment, which will induce colitis, the importation of an effective Represents amount of a hapten reagent in the colon of the animal. Das Verfahren von Anspruch 9, worin das Haptenreagenz 2,4,6-Trinitrobenzol Sulfonsäure ist.The method of claim 9, wherein the hapten reagent 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid is. Ein Antikörper für Interleukin-12 effektiv in der Reduktion des Kolitis-induzierten Effekts von Interleukin-12 zur Verwendung in der Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Kolitis in einem Subjekt.An antibody for interleukin-12 effective in reducing the colitis-induced effect of interleukin-12 for use in the treatment of the inflammatory response of an established Colitis in a subject.
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