DE69623635T2

DE69623635T2 - Mu-opioidligande: agonisten und antagonisten

Info

Publication number: DE69623635T2
Application number: DE69623635T
Authority: DE
Inventors: T. Dooley; A. Houghten
Original assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Current assignee: Torrey Pines Institute for Molecular Studies
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2003-05-08
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: AU6157696A; AU707245B2; DK0853484T3; WO1996040208A1; EP0853484A4; EP0853484A1; CA2223428A1; DE69623635D1; EP0853484B1; ES2180781T3; ATE223927T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Peptidchemie und spezieller neue Opioidpeptide, die eine Ligandenbindung an einen Opioidrezeptor hemmen können.

HINTERGRUNDINFORMATIONEN

Es gibt mindestens drei bekannte Subtypen von Opioidrezeptoren, my (u), delta (δ) und kappa (κ), an die Morphin, die Enkephaline bzw. die Dynorphine binden. Die drei Rezeptorsubtypen weisen analgetische Eigenschaften auf. Jedoch variieren bei jedem Rezeptortyp die Art des gehemmten Schmerzes und die sekundären Funktionen. Es wird allgemein angenommen, dass der u- Rezeptor derjenige ist, der mit Schmerzlinderung, Atemdepression, Darmmotilität, Antidiurese, einer Immunantwort und Drogen- oder andersartiger körperlicher Abhängigkeit assoziiert ist. Andererseits ist der δ-Rezeptor mit thermischer Analgesie und, in einem geringeren Ausmaß, Atmung und Abhängigkeit assoziiert. Obwohl er mit dysphorischen und psychometrischen Wirkungen assoziiert ist, hat der κ-Rezeptor auch ein geringeres Potential für Abhängigkeit verglichen mit dem u-Rezeptor. Der κ-Rezeptor beeinflusst wirkungsvoll Analgesie in Reaktion auf Schmerzen, einschließlich chemischer Reize. Der κ-Rezeptor induziert auch Diurese und Sedierung. Diese Unterschiede bei den Opioidrezeptorfunktionen ermutigen die Suche nach Arzneimitteln, die Analgesie ohne schädliche Nebenwirkungen erzeugen.
Die Verwendung von synthetischen Peptiden verhalf zu der Charakterisierung dieser Subtypen und zu der Bereitstellung von Analoga, die verwendet werden können, um die Wechselwirkungen von Liganden, die für diese Rezeptorsysteme spezifisch sind, sowohl in in vitro- als auch in vivo-Systemen zu untersuchen.
Bestimmte Opioidverbindungen sind Agonisten (binden an den Rezeptor und erzeugen eine Wirkung), während andere Antagonisten sind (binden an den Rezeptor, erzeugen aber keine Wirkung). Die meisten zuvor bekannten Agonisten und Antagonisten der Opioidrezeptoren sind Analoga der Enkephaline und verwandter Peptide, einschließlich der Dynorphine, der Dermenkephaline und der Casomorphine. Die Verbindungen der Erfindung weisen geringe oder keine Sequenzhomologie zu einem jeglichen von diesen bekannten Opioidpeptiden auf.
Neuere Fortschritte bei Methoden für die Herstellung und das Screenen von großen Zahlen von individuellen Peptiden haben zu der Identifizierung von zahlreichen Peptiden geführt, die in allen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Forschung in Hinblick auf die Wechselwirkung eines Liganden für den Opiatrezeptor, nützlich sind.
Die PCT-Veröffentlichung WO95/22557 beschreibt verschiedene Peptide, die an den my-Opioidrezeptor binden, einschließlich H-Tyr-(D-Nle)-Phe-Trp-NH&sub2;, H-Tyr-(D-Nle)-Phe-(2'-Nap)-NH&sub2;, H- Tyr-(D-Nle)-Trp-(2'-Nap)-NH&sub2; und und H-Tyr-(D-Nle)-Trp-Trp-NH&sub2;.
Sowohl Rezeptor-spezifische Agonisten als auch Antagonisten werden als pharmakologische Werkzeuge und als therapeutische Mittel benötigt. Jedoch ist sogar bei diesen Fortschritten die Grundlagenforschung und Arzneimittelentdeckung durch die Verfügbarkeit der erforderlichen großen Anzahl von verschiedenen Opiatagonisten und -antagonisten, die benötigt werden, um die Beziehung zwischen einem Ligand für einen speziellen Opiatrezeptor-Subtyp sicherzustellen, eingeschränkt gewesen. Folglich besteht ein Bedarf für große Zahlen von individuellen Verbindungen für eine Verwendung in der biomedizinischen Forschung, einschließlich jenen für die Untersuchung von Opiat-Ligand- Rezeptor-Wechselwirkungen. Es besteht ebenso ein Bedarf an Opioidpeptiden, die therapeutischen Wert haben. Diese Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und stellt ebenso damit in Zusammenhang stehende Vorteile bereit.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt neue Opioidpeptide bereit. Diese Opioidpeptide haben die allgemeinen Strukturen Ac-Phe-Arg-Trp-Trp- Tyr-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 1); Ac-Arg-Trp-Ile-Gly-Trp-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 2); Trp-Trp-Pro-Lys/Arg-Hisz-Xaaz-NH&sub2; (SEQ ID NO. 222); Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 5); (D)Ile-(D)Met- (D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Glyn-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 6); und (D)Ile- (D)Met-(D)Thr-(D)Trp-Gly-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 7). Innerhalb von jeder obigen Gattung wird Xaa durch eine Aminosäure ersetzt. Die Erfindung betrifft auch ein Opioidpeptid mit der allgemeinen Struktur Tyr-A1-B2-C3-NH&sub2; (SEQ ID NO. 214), worin A1 (D)Nve oder (D)Nle ist, B2 Gly, Phe oder Trp ist und C3 Trp oder Nap ist. Von der Erfindung umfasst werden auch Opioidverbindungen der allgemeinen Struktur MexHyN-Tyr-Tyr-Phem-Pron-NH&sub2; (SEQ ID NO. 221), die Peptide sind, die durch Permethylierung, Perallylierung, Perethylierung, Perbenzylierung oder Pernaphthylierung modifiziert sind und die durch Reduktion weiter modifiziert sein können.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die Verbindungen der SEQ ID NOS. 162 bis 167.
Fig. 2 gibt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die durch die SEQ ID NOS. 168 bis 173 identifizierten Verbindungen an.
Fig. 3 zeigt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die Verbindungen entsprechend den SEQ ID NOS. 174 bis 179.
Fig. 4 zeigt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die Verbindungen der SEQ ID NOS. 180 bis 185.
Fig. 5 gibt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die Verbindungen entsprechend den SEQ ID NOS. 186 bis 191 an.
Fig. 6 zeigt die zweidimensionalen chemischen Strukturen der Verbindungen entsprechend den SEQ ID NOS. 192 bis 197.
Fig. 7 zeigt die zweidimensionalen chemischen Strukturen für die Verbindungen der SEQ ID NOS. 198 bis 203.
Da die in den Figuren angegebenen chemischen Strukturen zweidimensional sind, entsprechen Peptide der SEQ ID NOS. 208 bis 213, die mindestens eine Aminosäure in der (D)-Konfiguration aufweisen, der Struktur von SEQ ID NO. 162 von Fig. 1.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt neue Opioidpeptide bereit, die in der Lage sind, die Bindung des u-selektiven Opioidpeptids [³H]-[D- Ala²,MePhe&sup4;,Gly-ol&sup5;]enkephalin zu hemmen. In einer Ausführungsform haben die Peptide die allgemeine Struktur Ac-Phe- Arg-Trp-Trp-Tyr-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 1), worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren ist.
In einer anderen Ausführungsform sind die neuen Peptide jene, die von der Formel Ac-Arg-Trp-Ile-Gly-Trp-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 2) umfasst werden, wobei Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann.
In noch anderen Ausführungsformen der Erfindung haben die Peptide die Struktur Trp-Trp-Pro-Lys/Arg-Hisz-Xaaz-NH&sub2; (SEQ ID NO. 222), worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann und z 0 oder 1 ist, mit der Maßgabe, dass, wenn Xaa vorhanden ist, His anwesend ist. Mehr bevorzugt haben die Peptide die Struktur Trp-Trp-Pro-Lys-His- Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 3), worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann, oder Trp-Trp- Pro-Lys/Arg-NH&sub2; (SEQ ID NO. 4). In den obigen Formeln bedeutet "Lys/Arg", dass an jener Position entweder Lysin oder Arginin substituiert werden kann.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt Peptide bereit, die die Struktur Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 5) haben, worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann.
Die Erfindung stellt auch Peptide bereit, die unter die Strukturformel (D)Ile-(D)Met-(D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Glyn-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 6) fallen, worin Xaa Gly oder die D-Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist und n 0 oder 1 ist. Peptide dieser Formel können Hexapeptide sein, wenn Gly fehlt (n 0 ist), und Heptapeptide sein, wenn Gly vorhanden ist (n 1 ist).
Eine andere Ausführungsform, die ebenfalls D-Aminosäuren umfasst, sind jene Peptide mit der Formel (D)Ile-(D)Met-(D)Thr- (D)Trp-Gly-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 7), worin Xaa Gly oder die D- Form einer natürlich vorkommenden Aminosäuren ist.
Die Erfindung stellt auch Opioidpeptide mit der allgemeinen Struktur Tyr-A1-B2-C3-NH&sub2; bereit, worin A1 (D)Nve ist, B2 Gly, Phe oder Trp ist und C3 Trp oder Nap ist; oder worin A1 (D)Nle ist, B2 Gly ist und C3 Trp oder Nap ist.
Von der Erfindung werden auch Opioidverbindungen umfasst, die Peptid-Mimetika mit der allgemeinen Struktur MexHyN-Tyr-Tyr- Phem-Pron-NH&sub2; (SEQ ID NO. 221) sind, worin x und y 0, 1 oder 2 sind, mit der Maßgabe, dass x und y zusammen genommen niemals größer als 2 ist und m und n 0 oder 1 sind, mit der Maßgabe, dass, wenn Pro vorhanden ist, Phe anwesend ist. Peptide, die unter diese Formel fallen, sind an den Stickstoffatomen des Peptidrückgrats oder der Peptidhauptkette durch Permethylierung, Perallylierung, Perethylierung, Perbenzylierung und/oder Pernaphthylierung modifiziert. Eine derartige Modifizierung an den verschiedenen Stickstoffatomen innerhalb der Hauptkette kann identisch oder unterschiedlich sein. Beispiele dafür, wo die Modifizierungen unterschiedlich sind, umfassen Peptide, die den SEQ ID NOs. 201 bis 206, die in der nachstehenden Tabelle 9 angegeben sind, entsprechen. Die Peptide können durch Reduktion weiter modifiziert sein, wie nachfolgend detaillierter beschrieben wird. Eine oder mehrere der Aminosäuren kann bzw. können entweder in der (L)- oder der (D)-Konfiguration vorliegen, wie beispielsweise mit den Verbindungen, die den SEQ ID NOs. 207 bis 213 entsprechen, exemplifiziert wird.
Die folgenden Standardabkürzungen werden hier verwendet, um Aminosäurereste zu identifizieren.
Die Aminosäuren werden durch diese allgemein bekannten Drei- und Ein-Buchstaben-Codes, wie oben angegeben, bezeichnet und (D) bezeichnet eine Aminosäure, die die "D"-Konfiguration aufweist im Gegensatz zu den natürlich vorkommenden L-Aminosäuren. Sofern nicht anders angegeben, würde sich für einen Fachmann verstehen, dass, wo keine spezielle Konfiguration angegeben ist, die Aminosäure eine (L)-Aminosäure ist. Das α-Kohlenstoffatom von Gly ist nicht asymmetrisch, da es zwei Wasserstoffatome aufweist. Dementsprechend tritt Gly nicht als D- oder L-Isomer auf und es wird dementsprechend nicht angegeben, dass es die eine oder andere Konfiguration hat.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren" eine beliebige der Folgenden: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val. Wie hier verwendet, bedeutet die Ausdrucksweise "die D-Form einer natürlich vorkommenden. Aminosäure" das D-Isomer einer beliebigen dieser natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Ausnähme von Gly, das, wie oben diskutiert, nicht als D- oder L-Isomere vorkommt.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet würde wissen, dass eine oder mehrere der Aminosäuren innerhalb der beispielhaft aufgeführten Peptide modifiziert oder substituiert sein kann bzw. können, wie beispielsweise durch eine konservative Aminosäuresubstitution von einer oder mehreren der speziellen Aminosäuren, die in den beispielhaft aufgeführten Peptiden gezeigt sind. Eine Änderung in Form einer konservativen Aminosäuresubstitution kann beispielsweise den Austausch einer sauren Aminosäure gegen eine andere saure Aminosäure, einer hydrophoben Aminosäure gegen eine andere hydrophobe Aminosäure oder andersartige konservative Substitutionen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich der Verwendung von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren, wie Nle für Leu oder Ornithin (Orn) oder homoArginin (homoArg) für Arg, umfassen.
Zusätzlich zu den obigen Typen von Modifizierungen oder Substitutionen kann auch eine Nachahmungs- oder Mimetikverbindung von einer oder mehreren Aminosäuren, außerdem bekannt als Peptidmimetikum oder Peptidomimetikum, verwendet werden. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Mimetikverbindung" eine Aminosäure oder ein Aminosäureanalog, das die gleiche oder eine ähnliche funktionelle Charakteristik wie eine Aminosäure hat. So kann beispielsweise ein (D)-Argininanalog ein Mimetikum von (D)-Arginin sein, wenn das Analog eine Seitenkette mit einer positiven Ladung bei physiologischem pH enthält, wie diese für die reaktive Guinidiniumseitenkettengruppe von Arginin charakteristisch ist. Ein Peptidmimetikum oder Peptidomimetikum ist ein organisches Molekül, das ähnliche pharmakophore Peptidkettengruppen, wie sie in dem entsprechenden Peptid vorhanden sind, bewahrt.
Die Substitution von Aminosäuren durch nicht natürlich vorkommende Aminosäuren und Peptidomimetika, wie oben beschrieben, kann die Gesamtaktivität oder Eigenschaften eines individuellen Peptids basierend auf den Modifizierungen an den Seitenkettenfunktionalitäten verstärken. Diese Arten von Veränderungen an den speziell exemplifizierten Peptiden können beispielsweise die Stabilität des Peptids gegenüber einem enzymatischen Abbau erhöhen oder die biologische Aktivität verstärken.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung der obigen Formeln die Peptide dieser Erfindung leicht synthetisieren. Standardverfahren zur Herstellung von synthetischen Peptiden sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Die neuen Opioidpeptide können unter Verwendung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS)-Methode von Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964)) oder von Modifizierungen der SPPS synthetisiert werden oder die Peptide können unter Verwendung von in Lösung erfolgenden Standardverfahren, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind (siehe beispielsweise Bodanzsky, M., Principles of Peptide Synthesis, 2. durchgesehene Aufl. (Springer- Verlag, 1988 und 1993) synthetisiert werden. Alternativ können simultan erfolgende Mehrfachpeptidsynthese (SMPS)-Techniken, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind, verwendet werden. Durch die Merrifield-Methode hergestellte Peptide können unter Verwendung einer automatisierten Peptidsynthetisiervorrichtung, wie des Applied Biosystems 431A-01 Peptide Synthesizer (Mountain View, CA) oder unter Verwendung der manuellen Peptidsynthesetechnik, die von Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 5131 (1985), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben worden ist, synthetisiert werden.
Peptide können unter Verwendung von Aminosäuren oder Aminosäureanaloga, deren aktive Gruppen, wie erforderlich, unter Verwendung beispielsweise einer tert.-Butyldicarbonat (t-BOC)- Gruppe oder einer Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)-Gruppe geschützt sind, synthetisiert werden. Aminosäuren und Aminosäureanaloga können kommerziell erworben werden (Sigma Chemical Co.; Advanced Chemtec) oder unter Verwendung von Methoden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, synthetisiert werden. Unter Anwendung der Festphasenmethode synthetisierte Peptide können an Harze, einschließlich 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA), 4- (Oxymethyl)phenylacetamidomethyl- und 4-(Hydroxymethyl)phenoxymethylphenoxymethyl-copoly(styrol-1% Divinylbenzol) (Wang- Harz), die allesamt kommerziell erhältlich sind, oder an p- Nitrobenzophenonoxim-Polymer (Oxim-Harz), das synthetisiert werden kann, wie von De Grado und Kaiser beschrieben, J. Org. Chem. 47: 3258 (1982), gebunden sein.
In den exemplifizierten Peptiden bezeichnet "Ac" eine Acetylgruppe an dem Aminoterminus und "NH&sub2;" eine Amidgruppe an dem Carboxyterminus. Peptide können manipuliert werden, während sie beispielsweise noch an einem Harz angeheftet sind, um N- terminal modifizierte Verbindungen, wie ein acetyliertes Peptid, zu erhalten, oder können von dem Harz unter Verwendung von Fluorwasserstoff oder einem äquivalenten Spaltreagens entfernt und dann modifiziert werden. Synthetisierte Verbindungen, die die C-terminale Carboxygruppe enthalten (Wang-Harz) können nach Abspaltung von dem Harz oder, in einigen Fällen, vor der in Lösungsphase erfolgenden Synthese modifiziert werden. Verfahren zur Modifizierung des N-Terminus oder C-Terminus, wie Methoden zur Acetylierung des N-Terminus oder Methoden zur Amidierung des C-Terminus, sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt.
Zusätzliche Nomenklatur, die bei den exemplifizierten Peptiden verwendet wird, umfasst und bedeutet das Folgende: "Pm", permethyliert; "Pa", perallyliert; "Pe", perethyliert; "Pb", perbenzyliert; "Pn", pernaphthyliert. Die Methylierung, Allylierung, Ethylierung, Benzylierung und Naphthylierung in den jeweiligen Peptiden erfolgt an jedem der Stickstoffatome in dem Peptidrückgrat, wie in den Fig. 1 bis 7 gezeigt. Die Modifizierung des Amidrückgrats durch Permethylierung und ähnliches ergibt Peptidomimetika mit diversen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die sich von den Peptiden, ausgehend von welchen sie erhalten wurden, unterscheiden, wie erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau und erhöhte biologische Aktivität. Verschiedene Methoden für die Permethylierung und ähnliches sind beschrieben worden, einschließlich Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11138 (1994); Hakomori, S., J. Biochem., 55: 205 (1964); Challis und Challis, The Chemistry of Amides, S. 731 ff. (1970).
Die Reduktion der Peptidamide ist eine andere Maßnahme für die chemische Umwandlung von Peptiden, welche die Stabilität erhöht und die Aktivität verstärken kann. Bei den exemplifizierten Peptiden bedeutet die Verwendung von "red", dass die Carbonyle des Amid-Peptidrückgrats zu Aminen reduziert sind, wie beispielsweise in den Fig. 1 bis 7 und spezieller beispielsweise in Fig. 1, Nummer 162 gezeigt. Es steht eine Anzahl von Reagenzien für die Reduktion von Amiden zu Aminen zur Verfügung und diese sind dafür wohlbekannt, wie jene, die in Wann et al., JOC, 45: 257 (1981) und Raucher et al., Tett. Let., 21: 14061 (1980) offenbart werden. Diboran hat den Vorteil, dass Trimethylborat, das einzige Nebenprodukt bei der Aufarbeitung der Reaktionsmischung, flüchtig ist und dementsprechend durch Verdampfen leicht entfernt wird. Die Verwendung eines Überschusses von Diboran in unter Rückfluss kochendem Tetrahydrofuran erlaubt, einfache aliphatische und aromatische Amide schnell und oftmals quantitativ in ihre entsprechenden Amine zu reduzieren.
Ein neu synthetisiertes Peptid kann gereinigt werden, indem eine Methode, wie Umkehrphasenhochochleistungsflüsigkeigkeitschromatographie (RP-HPLC) oder andere Trennverfahren, die auf der Größe oder Ladung des Peptids beruhen, verwendet werden. Darüber hinaus kann das gereinigte Peptid unter Verwendung von diesen und anderen wohlbekannten Verfahren, wie Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie, charakterisiert werden.
Nach der Herstellung können die Peptide hinsichtlich Rezeptorbindungsaktivität unter Verwendung des Radiorezeptorassays (Beispiele I und II) oder anderer Assays, die nachfolgend erläutert werden, einschließlich des Adenylylcyclaseassays (Beispiel III) oder des Meerschweinchen-Ileum-Assays (Beispiel IV) oder des Maus-Vas deferens-Assays (Beispiel IV) untersucht werden. Zusätzlich ist der Warmwasser-Mäuseschwanz-Zuckungs- Assay ein in vivo-Tiermodell, das für das Testen von Peptiden der Erfindung nützlich ist. Der Schwanz-Zuckungs-Assay wird beispielsweise in Dooley et. al., Science, 266: 2019-2022 (1994) und Jiang et al., J. Pharmascol. Exp. Ther., 262: 526 (1992) beschrieben.
Da die Peptide der Erfindung an den u-Rezeptor binden, können sie in in vitro-Assays verwendet werden, um die Opiatrezeptor- Subtypen zu studieren. Beispielsweise können bei einem Probenrezeptor von unbekannter Art oder Herkunft die Peptide, nachdem sie mit einem detektierbaren Marker, wie einem radioaktiven Isotop, markiert worden sind, mit der Rezeptorprobe unter Bedingungen, die das Binden an einen bestimmten Rezeptor-Subtyp spezifisch begünstigen, in Kontakt gebracht werden. Rezeptor ohne Bindung und ungebundenes Peptid können entfernt werden, beispielsweise durch Waschen mit einer Kochsalzlösung, und gebundener Rezeptor kann dann unter Verwendung von Methoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, detektiert werden. Dementsprechend sind die Peptide der Erfindung in vitro für die Diagnose von relevanten Opioidrezeptor- Subtypen und insbesondere des u-Typs im Gehirn und anderen Gewebeproben nützlich.
Zusätzlich zu deren Nützlichkeit in in vitro-Screeningverfahren sind die Peptide auch in vivo nützlich. Die Opioidpeptide können beispielsweise in vivo diagnostisch verwendet werden, um Opioidrezeptor-Subtypen zu lokalisieren. Die Peptide sind auch als Arzneimittel nützlich, um Pathologien zu behandeln, die mit anderen Verbindungen, die mit dem Opioidrezeptorsystem wechselwirken, assoziiert sind. Dementsprechend können die Peptide der Erfindung in Arzneimitteln für die Behandlung von Pathologien, die mit dem u-Rezeptor assoziiert sind, und als Analgetika verwendet werden. Man kann sich vorstellen, dass diese Peptide für therapeutische Zwecke verwendet werden können, um die peripheren Wirkungen eines zentral wirkenden Schmerzmittels zu blockieren. Beispielsweise ist Morphin ein zentral wirkendes Schmerzmittel. Jedoch hat Morphin eine Anzahl von schädlichen Wirkungen auf Ebene der Peripherie, die für die angestrebten analgetischen Wirkungen nicht erforderlich sind, wie Verstopfung und Pruritus (Juckreiz). Obwohl bekannt ist, dass die vielen Peptide die Blut-Hirn-Schranke nicht leicht durchqueren und dementsprechend keine zentrale Wirkung entfalten, können die vorliegenden Peptide wertvoll sein, um die Peripheriewirkungen von Morphin, wie Verstopfung und Pruritus, zu blockieren.
Die beanspruchten neuen Peptide können in pharmazeutische Zusammensetzungen eingebracht werden. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen wässrige Lösungen, wie physiologisch gepufferte Kochsalzlösung, oder andere Puffer oder Lösemittel oder Vehikel, wie Glykole, Glycerol, Öle, wie Olivenöl, oder injizierbare organische Ester. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger kann physiologisch verträgliche Verbindungen enthalten, die beispielsweise wirken, um das Opioidpeptid zu stabilisieren oder die Absorption des Peptids zu erhöhen. Solche physiologisch verträglichen Verbindungen umfassen beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine von niedrigem Molekulargewicht oder andere Stabilisatoren oder Exzipientien. Ein Fachmann auf diesem Gebiet würde wissen, dass die Wahl eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, einschließlich einer physiologisch verträglichen Verbindung, beispielsweise von der Verabreichungsroute und von den besonderen physikalisch-chemischen Eigenschaften des speziellen Opioidpeptids abhängt.
Verfahren zur Verabreichung eines Arzneimittels sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und umfassen eine orale, intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine Verabreichung kann kontinuierlich oder mit Unterbrechungen erfolgen und wird je nach Patient variieren und hängt von der Behandlungsart und Wirkkraft des verwendeten Peptids ab.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.

BEISPIEL I

Identifizierung von my-selektiven Opioidpeptiden durch einen Radiorezeptorassay

Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung von individuellen Peptiden, die entweder in einer synthetischen kombinatorischen Bibliotheksmischung enthalten sind oder separat hergestellt worden sind, als Inhibitoren des u-selektiven Opioidpeptids [³H]-[D-Ala²,MePhe&sup4;,Gly-Ol&sup5;-enkephalin([³H]-DAMGO). Es wurde durch einen Radiorezeptorassay festgestellt, dass die individuellen Peptide in der Lage waren, [³H]-DAMGO zu hemmen.
Synthetische kombinatorische Bibliotheken (SCLs), die aus Mischungen von mehreren Zehn Millionen verschiedener Peptide gebildet werden, können verwendet werden, um schnell individuelle aktive Verbindungen zu identifizieren. Da die Bibliotheken in Lösung sind (d. h. nicht an ein Körnchen, einen Stift, einen Phagen, Glas u.s.w. angeheftet sind), können sie praktisch in einem jeglichen Assaysystem gescreent werden.
Mit Ausnahme der permethylierten und reduzierten Peptide wurden alle Opioidpeptide anfänglich innerhalb von SCLs hergestellt und waren darin enthalten. Einige SCLs waren vollständig aus L-Aminosäuren zusammengesetzt, eine von diesen enthielt eine N-terminale Acetylgruppierung, während andere SCLs primär aus D-Aminosäuren zusammengesetzt waren, wie durch die nachfolgend angegebenen Peptidstrukturen detaillierter erläutert wird. Die Bibliotheken wurden in Verbindung mit einem iterativen Selektionsprozess verwendet, um individuelle Peptide zu identifizieren, die in der Lage waren, tritiummarkiertes DAMGO in dem Radiorezeptorassay zu hemmen.
Wie nachfolgend detailliert erläutert, wurden die Bibliotheken in einer einzigen Konzentration (0,08 mg/ml) in einem Radiorezeptorassay unter Verwendung von Rattenhirnhomogenisaten und [³H]-DAMGO als radioaktiver Ligand gescreent. Für Mischungen in der Bibliothek, die die Bindung von [³H]-DAMGO signifikant hemmten, wurden IC&sub5;&sub0;-Werte bestimmt.

Für den my-Rezeptor selektive Radiorezeptorassays

In flüssigem Stickstoff eingefrorene Ratten- und Meerschweinchengehirne wurden von Harlan Bioproducts for Science (Indianapolis, IN) erhalten. Gefrorene Gehirne wurden aufgetaut, die Cerebella entfernt und das verbleibende Gewebe gewogen. Jedes Gehirn wurde individuell in 40 ml Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,4, 4ºC) homogenisiert und 10 min bei 4ºC zentrifugiert (39000 · g) (Modell J2-HC; Beckman Instruments, Fullerton, CA). Die Pellets wurden in frischem Tris-HCl-Puffer resuspendiert und 40 min bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Suspensionen zentrifugiert, wie oben, die resultierenden Pellets in 100 Volumen Tris-Puffer resuspendiert und die Suspensionen vereinigt. Membransuspensionen wurden hergestellt und am selben Tag verwendet. Der Proteingehalt der rohen Homogenisate reichte von 0,15-0,2 mg/ml, wie unter Verwendung der von Bradford (Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976)) beschriebenen Methode bestimmt wurde.
Bindungsassays wurden in Polypropylenröhrchen ausgeführt. Jedes Röhrchen enthielt 0,5 ml Membransuspension, 3 nM des u- selektiven Opioidpeptids [³H]-DAMGO (spezifische Aktivität 36 Cl/mmol), 0,08 mg/ml Peptidmischung und Tris-HCl-Puffer in einem Gesamtvolumen von 0,65 ml. Assayröhrchen wurden 60 min bei 25ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Filtration durch GF- B-Filter (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) beendet. Die Filter wurden nachfolgend mit 6 ml Tris-HCl-Puffer bei 4ºC gewaschen. Gebundene Radioaktivität wurde mittels eines Beta-Platten- "Liquid Scintillation Counter"-Geräts (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gezählt und in Zählimpulsen ("counts") pro Minute (cpm) ausgedrückt. Inter- und Intra-Assay-Variationsstandardkurven wurden bestimmt durch Inkubation von [³H]-DAMGO in Gegenwart von 0,13-3900 nM unmarkiertem DAMGO. Kompetitive Inhibitionsassays wurden ausgeführt, wie oben, unter Verwendung von Reihenverdünnungen der Peptidmischungen. Dann wurden IC&sub5;&sub0;-Werte unter Verwendung der Software GRAPHPAD (ISI, San Diego, CA) berechnet. IC&sub5;&sub0;-Werte von weniger als 1000 nM zeigen hochgradig aktive Opioidpeptide, die an den N-Rezeptor binden, an, wobei besonders aktive Verbindungen IC&sub5;&sub0;-Werte von 100 nM oder weniger haben und die aktivsten Verbindungen mit Werten von weniger als 10 nM.
Es wurden Opioidpeptide identifiziert, die die allgemeine Struktur Ac-Phe-Arg-Trp-Trp-Tyr-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 1) haben, worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren ist. IC&sub5;&sub0;-Werte dieser Peptide sind in Tabelle 1 angegeben.
Ausgehend von dem Screening der acetylierten SCL wurden auch Peptide der allgemeinen Formel Ac-Arg-Trp-Ile-Gly-Trp-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 2), worin Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren ist, identifiziert. Tabelle 2 gibt die jeweiligen IC&sub5;&sub0;-Werte für jedes der zwanzig Peptide mit dieser Formel an.
Das Screenen einer nicht-acetylierten Bibliothek mit ausschließlich L-Aminosäuren enthüllte, dass Peptide der Formel Trp-Trp-Pro-Lys-His-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 3) den u-selektiven radioaktiven Ligand hemmten. Wieder kann Xaa eine beliebige der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren sein, wie in Tabelle 3 zusammen mit deren jeweiligen IC&sub5;&sub0;-Werten gezeigt. Zusätzlich wurden zwei kürzere Analoga, Trp-Trp-Pro-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO. 68) und Trp-Trp-Pro-Arg-NH&sub2; (SEQ ID NO. 69) identifiziert, deren IC&sub5;&sub0;-Werte ebenfalls in Tabelle 3 angegeben sind.
Ausgehend von einer nicht-acetylierten L-Aminosäure-SCL wurden auch Peptide der Formel Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 5) identifiziert. Die IC&sub5;&sub0;-Werte für jedes der Peptide dieser Formel sind in Tabelle 4 angegeben.
Peptide der allgemeinen Formel (D)Ile-(D)Met-(D)Ser-(D)Trp- (D)Trp-Glyn-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 6) waren ebenfalls Inhibitoren der [³H]-DAMGO-Bindung. IC&sub5;&sub0; für die Hexapeptide (n = 0) der Formel (D)Ile-(D)Met-(D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 215) und für die Heptapeptide (n = 1) der Formel (D)Ile- (D)Met-(D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Gly-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 216), worin Xaa Gly oder die D-Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sind in den Tabellen 5 bzw. 6 angegeben.
Tabelle 7 gibt die IC&sub5;&sub0;-Werte der als Inhibitoren identifizierten Opioidpeptide an, die unter die allgemeine Formel (D)Ile- (D)Met-(D)-Thr-(D)-Trp-Gly-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 7) fallen, worin Xaa Gly oder die D-Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist.
Ausgehend von einer synthetischen kombinatorischen Bibliothek zum Positionsscanning (PS-SCL) werden die Peptide der Tabelle 8 identifiziert, die die generischen Formel Tyr-A1-B2-C3-NH&sub2; (SEQ ID NO. 8) haben, worin A1 (D)Nve oder (D)Nle ist, B2 Gly, Phe oder Trp ist und C3 Trp oder Nap ist. IC&sub5;&sub0;-Werte für jedes der Peptide in dem u-selektiven Radiorezeptorassay sind nachfolgend angegeben.

Synthese von mit Tyr-Tyr, Tyr-Tyr-Phe und Tyr-Tyr-Phe-Pro (SEQ ID NO. 217) verwandten Verbindungen

Spezielle Verbindungen, die mit den Di-, Tri- und Tetrapeptiden Tyr-Tyr, Tyr-Tyr-Phe bzw. Tyr-Tyr-Phe-Pro (SEQ ID NO. 217) verwandt sind und von der Formel MexHyN-Tyr-Tyr-Phem-Pron-NH&sub2; (SEQ ID NO. 221) umfasst werden, wurden synthetisiert und ihre Rezeptorbindung untersucht. Das geschützte Tetrapeptid-Harz YYFP-MBHA (SEQ ID NO. 217) und das Tripeptid-Harz YYF-MBHA wurden permethyliert, perethyliert, perallyliert, perbenzyliert und pernaphtbyliert in ihrer Trityl-geschützten Form, um nach der Entfernung der Trityl-Schutzgruppen die freien N-terminalen Aminogruppen zu erhalten. Darüberhinaus wurden diese Peptidharze vor einer Permethylierung und Perallylierung auch durch reduktive Alkylierung modifiziert.
Die reduktive Alkylierung wurde ausgeführt unter Verwendung der Dimethoxydityl-geschützten Peptidharze, um das monomethylierte N-terminale Amin zu erhalten, und des freien Amins, um das dimethylierte N-terminale Amin zu erhalten. Eine Reihe dieser zwanzig Peptide (einschließlich einer nicht-alkylierten Peptidsequenz als Kontrolle) wurde von dem Harz nach der Peralkylierung abgespalten - eine Reihe wurde nach der Peralkylierung reduziert. Einzelheiten zur Synthese sind nachfolgend für das repräsentative Beispiel Pm and red {MeHN-YYF-NH&sub2;} angegeben.
Es wurden die folgenden Materialien verwendet. Aminosäurederivate wurden von Bachem California (Torrance, CA) erworben. p- Methylbenzhydrylaminharz (MBHA), 1% DVB, 100-200 mesh, 0,9 mÄqu./g Substitution, wurde von Peninsula Laboratories, INC (Belmont, CA) erhalten. Wasserfreies THF, wasserfreies DMSO und Lithiumtert.-butoxid als eine 1 M Lösung in THF wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) erworben. Andere Lösemittel wurden von Fisher (Fiar Lawn, NJ) erhalten.
Das als Peptidausgangsmaterial dienende geschützte Peptidharz Trt-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-Phe-MBHA wurde synthetisiert unter Verwendung von Standard-BOC-Chemie und simultan erfolgender Mehrfachpeptidsynthese beginnend mit 100 mg MBHA-Harz (0,09 mmol Aminogruppen), die in einem Polypropylenmaschenpaket enthalten waren.
Triphenylmethylchlorid (Tritylchlorid, TrtCl) wurde, wie folgt, angekoppelt. Das Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)- Phe-MBHA-Harz (0,09 mmol primäre Aminogruppen) wurde mit DCM (1 · 1 min · 5 ml), 5% DIEA/DCM (3 · 2 min · 5 ml) und DCM (2 · 1 min · 5 ml) gewaschen. 5,84 ml DMF/DCM (9 : 1) und 0,455 ml DIEA (2,61 mmol) wurden dem Peptidharz zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 125,45 mg TrtCl (0,45 mmol). Die Reaktionsmischung wurde 6 h geschüttelt. Das Peptidharz wurde mit DCM (1 · 1 min · 5 ml), 5% DIEA/DCM (1 · 1 min · 5 ml) und/DCM (1 · 1 min · 5 ml) gewaschen. Die Kopplung wurde 2 h unter Verwendung von 9 ml DCM als Lösemittel und denselben Mengen DIEA und TrtCl, wie sie für die erste Kopplung verwendet worden waren, wiederholt. Das Peptidharz wurde mit DMF (2 · 1 min · 5 ml), 5% DIEA/DCM (1 · 2 min · 5 ml), DCM (3 · 1 min · 5 ml) und Me-OH (1 · 1 min · 5 ml) gewaschen. Eine kleine Probe von Peptidharz wurde hinsichtlich der Vollständigkeit der Kopplung unter Verwendung des Bromphenolblautests (Krchnak et al., Collect. Czech, Chem. Commun. 53: 2542-2548 (1988)) untersucht.
Das harzgebundene geschützte Peptid wurde, wie folgt, peralkyliert. Alle Manipulationen wurden unter Stickstoffatmosphäre und streng wasserfreien Bedingungen ausgeführt. Das Peptidharz wurde über Nacht bei 50 mTorr getrocknet. 10,8 ml 0,5 M Lithiumtert.-butoxid in THF (5,4 mmol) wurden dem Trt-Tyr (2,6-di- Cl-Bzl)-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-Phe-MBHA-Harzpaket (0,09 mmol Peptid, 0,27 mmol Amidgruppen) zugesetzt und bei Raumtemperatur 15 min geschüttelt. Die überschüssige Basenlösung wurde unter Verwendung eines Stickstoffüberdruckflüssigkeitshebers entfernt. Es wurden 10,8 ml DMSO und 1,008 ml Iodmethan (16,2 mmol) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 2 h geschüttelt. Die Alkylierungslösung wurde durch Stickstoffüberdruckflüssigkeitshebertransfer entfernt und die gesamte Prozedur zweimal wiederholt.
Das Harzpaket wurde mit DMF (3 · 1 min · 5 ml), IPA (2 · 1 min · 5 ml), DCM (3 · 1 min · 5 ml) und MeOH (1 · 1 min · 5 ml) gewaschen.
Die Trityl-Gruppe wurde, wie folgt, entschützt. Das Peptidharz wurde mit DCM (1 · 1 min · t ml) gewaschen und dann mit 2% TFA in DCM (1 · 2 min · 5 ml und 1 · 30 min · 5 ml) behandelt, gefolgt von den 1-minütigen Waschschritten DCM (1 · 5 ml), IPA (2 · 5 ml) und DCM (2 · 5 ml)
Eine reduktive Methylierung von 4,4'-Dimethoxydityl (Dod)- geschützten unmodifizierten oder permethylierten Peptiden kann erfolgen gemäß den Vorgehensweisen von Kaljuste und Unden, Int. J. Peptide Protein Res. 42: 118-124 (1993). Das Koppeln von 4,4'-Dimethoxyditylchlorid (DodCl) wurde ausgeführt, wie folgt. Das Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-(NMe)-Tyr(2,5-di-Cl-Bzl)-(NMe)- Phe-(NMe)-MBHA-Harzpaket (0,09 mmol primäres Amin) wurde mit DCM (1 · 1 min · 5 ml), 5% DIEA/DCM (3 · 2 min · 5 ml) und DCM (2 · 1 min · t ml) gewaschen. 22,5 ml DCM und 0,455 ml DIEA (2,61 mmol) wurden dem Harzpaket zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 118,17 mg DodCl (0,45 mmol). Die Mischung wurde 90 min geschüttelt. Das Harzpaket wurde mit DMF (2 · 1 min · 5 ml), 5% DIEA/DCM (1 · 2 min. · 5 ml) und DCM (3 · 1 min · 5 ml) gewaschen. Eine Probe des Harzes wurde hinsichtlich der Vollständigkeit der Kopplung unter Verwendung des Bromphenolblautests untersucht.
Eine Formaldehydlösung wurde hergestellt, indem 10 ml Formaldehyd (37 gew.-%-ige Lösung in Wasser), 90 ml DMF und 30 g wasserfreies Magnesiumsulfat gemischt wurden. Die Lösung wurde 24 h geschüttelt, zentrifugiert und dann der Überstand für die reduktive Methylierung verwendet.
Für die reduktive Methylierung wurden 10,8 ml Formaldehydlösung zu dem Dod-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-(NMe)-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)- (NMe)-Phe-(NMe)-MBHA-Harzpaket (0,09 mmol Peptid) zugesetzt und 5 min geschüttelt. Die Lösung wurde abgegossen. Es wurden zusätzliche 10,8 ml Formaldehydlösung mit 0,108 ml Essigsäure zugesetzt und geschüttelt. Nach 5 min wurden 108 mg Natriumcyanborhydrid zugesetzt und die Mischung 1 h geschüttelt. Das Harzpaket wurde mit DMF (2 · 1 min · 5 ml), IPA (2 · 1 min · 5 ml), DCM (3 · 1 min · 5 ml) und MeOH (1 · 1 min · 5 ml) gewaschen.
Die Dod-Schutzgruppe wurde entfernt durch Waschen des Harzpakets mit DCM (1 · 1 min · 5 ml), gefolgt von einer Behandlung mit 55% TRA in DCM (1 · 5 min · 5 ml und 1 · 30 min · 5 ml), gefolgt von den 1-minütigen. Waschschritten DCM (1 · 5 ml, IPA (2 · 5 ml) und DCM (2 · 1 min).
Eine Reduktion erfolgte, wie folgt. In ein 50 ml-Glasrohr (mit Teflon verkleidete Kappe) wurden das Dod-(NMe)-Tyr(2,6-di-Cl- Bzl)-(NMe)-Tyr(2,6-di-Cl-Bzl)-(Nme)-Phe-(NMe)-MBHA-Harzpaket und 310 mg Borsäure (5,014 mmol) zugegeben. Unter Stickstoffatmosphäre wurde 0,5 ml Trimethylborat (0,0042 mmol) zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 15 ml 1 M Boran-Tetrahydrofuran-Komplex (15 mmol). Nach dem Ende der Wasserstoffentwicklung wurde das Rohr dicht verschlossen und 100 h in einen Ofen mit kontrollierter Temperatur bei 65ºC gestellt. Die Rohre wurden dann entfernt, auf Raumtemperatur abgekühlt und es wurden 2 ml Methanol zugegeben, um überschüssiges Reduktionsmittel zu quenchen. Das Harzpaket wurde mit THF (1 · 1 min · 10 ml) und MeOH (4 · 1 min · 10 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzpakets wurde es mit 15 ml Piperidin bedeckt und 18 h bei 65ºC erwärmt. Das Harzpaket wurde mit DMF (2 · 1 min · 5 ml), DCM (2 · 1 min · 5 ml), MeOH (1 · 1 min · 5 ml), DMF (2 · 1 min · 5 ml), DCM (2 · 1 min · 5 ml) und MeOH (1 · 1 min · 5 ml) gewaschen.
Peptid wurde von dem festen Träger durch Folgendes freigesetzt. Das Harzpaket wurde 9 h bei 0ºC mit Fluorwasserstoff (5 ml mit 0,35 ml Anisol, das als Radikalfänger zugesetzt wurde) unter Verwendung einer Spaltapparatur mit einer Mehrzahl von Gefäßen gespalten (Houghten et al., Int. J. Pept. Protein Res., 27: 673-678 (1936)). Das resultierende Polyamin wurde unter Verwendung von 50% wässrigem Acetonitril (3 · 5 ml) nach Beschallen extrahiert. Die Lösung wurde lyophilisiert, zwei weitere Male in 50% wässrigem Acetonitril aufgenommen und lyophilisiert, was das Rohprodukt 2 ergab.
Tabelle 9 gibt die IC&sub5;&sub0;-Werte der synthetisierten Opioidverbindungen an, die unter die allgemeine Formel MexHyN-Tyr-Tyr-Phem- Pron-NH&sub2; (SEQ ID NO. 221) fallen.

Beispiel II

My-Rezeptorspezfität von Opioidpeptiden

Dieses Beispiel demonstriert die Spezifität der neuen Opioidpeptide für die u-Rezeptoren verglichen mit den δ- und κ-Opiatrezeptoren.
Es wurden individuelle Peptide synthetisiert und die Aktivität dieser Peptide in dem hinsichtlich der u-Rezeptoren selektiven Radiorezeptorassay aus Beispiel I wurde mit Radiorezeptorassays verglichen, die hinsichtlich der δ- und κ-Rezeptoren selektiv waren, wie nachfolgend detailliert erläutert.
Individuelle Peptide wurden unter Verwendung der simultan erfolgenden Mehrfachpeptidsynthese (SMPS) synthetisiert und ihre Identitäten durch massenspektrometrische Analyse an einem MALDI-Instrument von Kratos Analytical (Ramsey, NJ) bestätigt. Peptide wurden durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer präparativen Waters Milliprep 300 HPLC-Anlage (Milford, MA), modifiziert mit einem präparativen Autosampler und Foxy-Fraktionensammler des Typs Gilson Modell 232 (Gilson Medical Electronics, Middleton, WI), gereinigt. Reine Fraktionen (unter Anwendung von analytischer HPLC bestimmt) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Hinsichtlich δ-Rezeptoren selektive Radiorezeptorassays wurden ausgeführt unter Verwendung von Rattenhirnhomogenisaten, wie oben, und [³H]-Naltrindol (0,5 nM, spezifische Aktivität 34,7 Ci/mmol) als radioaktiver Ligand in Tris-Puffer, enthaltend 100 uM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 5 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), pH 7,4. Proben wurden 2,5 h inkubiert. Standardkurven wurden unter Verwendung von 0,10- 3200 nM [³H]-D-Pen&sub2;,Pen&sub5;]-enkephalin ([³H]-DPDPE) erstellt.
Hinsichtlich κ-Rezeptoren selektive Assays wurden ausgeführt unter Verwendung von [³H]-U69,593 (3 nM, spezifische Aktivität 62 Ci/mmol) als radioaktiver Ligand und Gewebehomogenisaten, die aus Meerschweinchenhirnen (Cortex und Cerebellum) hergestellt worden waren, unter Verwendung von Tris-Puffer, enthaltend 100 uM PMSF, 5 mM MgCl&sub2; und 1 mg/ml BSA, pH 7,4. Probenröhrchen wurden 2,5 h inkubiert. Standardkurven wurden unter Verwendung von 0,05-6300 nM Naloxon erstellt.
Tritiummarkierte Liganden, [³H]-DAMGO, [³H]-DPDPE und [³H]-[D- Ser²,Leu&sup5;,Thr&sup6;]enkephalin ([³H]-DSLET), "Abuse (NIDA) repository", wie von Multiple Peptide Systems (San Diego, CA) hergestellt, [³H]-U69,593 von Amersham (Arlington Heights, IL) und [³H]-Naltrindol von DuPont NEN Research Products (Los Angeles, CA). Die durchschnittliche Standardabweichung für IC&sub5;&sub0;-Werte betrug ± 20%.
Die obigen Vergleichsdaten, die in Tabelle 10 angegeben sind, zeigen die Selektivität der neuen Opioidpeptide hinsichtlich der u-Rezeptoren gegenüber den δ- und κ-Opiatrezeptoren.

BEISPIEL III

My-Rezeptor-Agonisten- oder -Antagonistenaktivität anhand eines Adenylylcyclaseassays

Bestimmte opioide Verbindungen sind Agonisten (binden an den Rezeptor und erzeugen eine Wirkung), während andere Antagonisten sind (binden an den Rezeptor, erzeugen aber keine Wirkung). Dieses Beispiel verwendet den Adenylylcyclaseassay, um zu zeigen, dass bestimmte der neuen Opioidpeptide Agonisten des u-Rezeptors sind, während andere Antagonisten des u- Rezeptors sind.
Es wurde ein Adenylylcyclaseassay unter Verwendung von menschlichen SH-SY5Y-Neuroblastomzelllinienmembranen verwendet, um die Opioidagonisten- oder -antagonisteneigenschaften von individuellen Peptiden schnell zu bestimmen. Ein Opioidagonist hemmt Adenylylcyclaseaktivität, was zu verringerten Konzentrationen an cyclischem AMP führt.

Adenylylcyclaseassay

Die menschliche SH-SY5Y-Neuroblastomzelllinie (Biedler et al., Cancer Research, 38: 3751-3757 (1978)) wurde in RPMI 1640- Medium, gepuffert mit 12,5 mM HEPES, pH 7,2, und das 300 ug/ml L-Glutamin, 100 ug/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 60 gM 2-Ethanolamin und 10% mit Eisen ergänztes Rinderkälberserum enthielt, in 5% CO&sub2; bei 37ºC kultiviert. Zellen wurden in Medium, das 10 um Retinsäure enthielt, sechs Tage vor dem Ernten kultiviert, um die Zellen zu differenzieren, wie zuvor beschrieben (Ya und Sadfe, J. Pharmacol. Exp. Ther., 245: 350-355 (1988)).
Zellmembranen wurden für eine Verwendung in den Adenylylcyclaseassays präpariert, wie zuvor beschrieben (Law et al., Mol. Pharmacol., 23: 26-35 (1983)). Nach der anfänglichen Zentrifugation bei 200 · g für 15 min bei 4ºC wurden die Zellen in Sucrosepuffer (0,32 M Sucrose, 40 mM HEPES, 2 mM EDTA, pH 7,6) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut bei 200 · g zentrifugiert, dann in Sucrosepuffer mittels fünf kurzen Läufen ("strokes") eines Dounce Homogenizer (Wheaton Instruments, Millville, NJ) homogenisiert. Die Membranen wurden bei 22000 · g 20 min bei 4ºC zentrifugiert, dann in Sucrosepuffer resuspendiert. Die Proteinkonzentration wurde durch die Methode von Bradford (Bradford, a.a.O.) unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt. SH-SY5Y-Membranen mit einer Proteinkonzentration von 1-4 mg/ml wurden bei -80ºC gelagert.
SH-SY5Y-Membranen wurden in einem Endvolumen von 100 ul 40 mM HEPES, pH 7,7, enthaltend 15 Einheiten Creatinphosphokinase, 20 mM Phosphocreatin, 1 mM 1,10-o-Phenanthrolin, 60 uM Isobutylmethylxanthin (IBMX), 50 uM ATP, 50 uM GTP, 3 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl, inkubiert. Jeder der getesteten Agonisten und Antagonisten war in Endkonzentrationen von 100 uM bzw. 500 uM enthalten. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 36 ug Membranprotein initiiert. Nach 15 min bei 30ºC wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 ul kalter 4,5%-iger Perchlorsäure gestoppt. Die Proben wurden durch die Zugabe von 40 ul kaltem 30%-igem Kaliumbicarbonat neutralisiert. Schließlich wurden die Membranen bei 12000 · g 4 min bei 4ºC in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die in 100 ul des Überstands vorhandene Menge an cyclischem AMP, die dem durch 15 ug Membranprotein produzierten cyclischen AMP äquivalent ist, wurde unter Verwendung eines cyclisches AMP-Kits (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) bestimmt. Diese Vorgehensweise, die ein cyclisches AMP bindendes Protein in einem kompetitiven Proteinbindungsassay verwendet, basiert auf der Methode von Tovey et al. (Clin. Chim. Acts, 56: 221-234) und wurde mit der folgenden Modifizierung verwendet: cyclisches [³H]-AMP (spezifische Aktivität 31,4 Ci/mmol), erhalten von Amersham (Arlington Heights, IL), wurde anstelle des cyclischen [³H]-AMPs, das in dem Assaykit enthalten war, verwendet. Cyclisches [³H]-AMP, 0,9 uCi, wurde zu 6 ml H&sub2;O hinzugesetzt und 100 ul des verdünnten cyclischen [³H]-AMP wurden den Assayröhrchen zugesetzt. Die endgültigen Überstände wurden in 10 ml Ecolite (+ )-Szintillationsflüssigkeit (ICN Pharmaceuticals, Covina, CA) gezählt.
Eine Verringerung der Konzentrationen an cyclischem AMP auf weniger als 70% der die Referenzwerte darstellenden Konzentrationen an cyclischem AMP wurde als Anzeichen für eine Opioidagonistenwirkung angesehen mit der Maßgabe, dass die Hemmung des cyclischen AMP durch den Opioidantagonisten Naloxon blockiert wurde. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse des Adenylylcyclaseassays und gibt an, welche der getesteten Peptide u- Rezeptor-Agonisten und welche u-Rezeptor-Antagonisten sind.

BEISPIEL IV

My-Rezeptor-Agonisten- oder -Antagonistenaktivität anhand von Meerschweinchen-Ileum- und Maus-Vas deferens-Assays

Dieses Beispiel zeigt anhand von Meerschweinchen-Ileum- und Maus-Vas deferens-Assays, dass bestimmte der neuen Opioidpeptide Agonisten des Rezeptors sind, während andere Antagonisten sind.

Meerschweinchen-Ileum-Assay

Der Meerschweinchen-Ileum (GPI)-Bioassay wurde ausgeführt, um zu bestimmen, ob ein Peptid ein Opioidagonist ist (an Rezeptor bindet und ein intrazelluläres Signal initiiert) oder ein Opioidantagonist ist (an Rezeptor bindet, aber kein intrazelluläres Signal initiiert). Stiche Informationen können ausgehend von dem oben beschriebenen Radiorezeptorbindungsassay nicht bestimmt werden.
Der GPI-Assay (Kosterlitz et al., Br. J. Pharam. 39: 398-418 (1970)) ist einer der am verbreitetsten verwendeten Assays zur Bestimmung von Opioidaktivitäten in vitro. Der Assay beruht auf der Fähigkeit von Opioidagonisten, elektrisch stimulierte Kontraktionen in Geweben zu hemmen. GPI ist kein "sauberer" Assay insofern, als das Ileumpräparat sowohl u- als auch κ- Rezeptoren enthält. Jedoch können u-Rezeptor-vermittelte Effekte im GPI von κ-Rezeptor-vermittelten Effekten unterschieden werden, indem Ke-Werte für Naloxon als Antagonist bestimmt werden (u-Effekte: Ke ~ 1-3 nM); κ-Effekte: Ke ~ 20-30 nM) oder indem spezifische u- oder κ-Antagonisten verwendet werden.
Die Meerschweinchen wurden durch Dekapitation getötet. Das Ileum wurde entfernt und Längsmuskel-Plexus myentericus- Präparate wurden in Krebs-Lösung (NaCl 118 mM, KCl 4,75 mM, NaH&sub2;PO&sub4; 1 mM, NaHCO&sub3; 25 mM, MgSO&sub4; 1,2 mM, Glucose 11 mM und CaCl&sub2; 2,5 mM) gelegt. Die Lösung wurde mit 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; begast und bei 37ºC gehalten. Das Gewebe wurde unter einer Endspannung von 1 g in einem 10 ml-Organbad aufgehängt und 1 h stabilisiert. Es erfolgte eine elektrische Stimulierung über eine gerade Platinelektrode, 0,4 ms-Pulse von supramaximaler Spannung, abgegeben mit einer Rate von 0,1 Hz. Isometrische Kontraktionen wurden über Dehnungsmesserkraftaufnehmer gemessen und auf Bandschreibern aufgezeichnet.

Maus-Vas deferens-Assay

Der Maus-Vas deferens (MVD)-Bioassay wurde ebenfalls verwendet, um zu bestimmen, ob ein Peptid ein Opioidagonist oder ein Opioidantagonist ist. Wieder sind solche Informationen ausgehend von den Radiorezeptorbindungsassayergebnissen nicht verfügbar.
Der MVD-Assay (Henderson et al., Br. J. Pharma. 12: 119-127 (1957)) ist ein anderer der am verbreitetsten verwendeten Assays für die Bestimmung von Opioidaktivitäten in vitro. Dieser Assay beruht wie der GPI-Assay auf der Fähigkeit von Opioidagonisten, elektrisch stimulierte Kontraktionen in Geweben zu hemmen. Der MVD-Assay ist ebenfalls nicht "sauber", indem, zusätzlich zu dem vorherrschenden δ-Rezeptor, auch die u- und κ- Rezeptoren vorhanden sind. Jedoch erlaubt die Verwendung eines spezifischen δ-Antagonisten, wie H-Tyr-Tic-Phe-Phe-NH&sub2; (SEQ ID NO. 223) (TIPP) eine Beurteilung, ob ein in dem MVD-Assay beobachteter Agonisteneffekt tatsächlich δ-Rezeptor-vermittelt ist oder nicht.
Vasa deferentia von der Maus wurden präpariert und in Krebs- Lösung gelegt. Die Reaktionen des Längsmuskels würden unter einer Grundspannung von 0,5 g aufgezeichnet und durch Pulse von 1 Millisekunde Lauer angeregt.
Bei allen Bioassays wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit einer Referenzverbindung (z. B. [D-Ala²,Leu&sup5;]enkephalinamid oder U50,488) bei jedem Präparat verwendet. Dies ist wichtig, da IC&sub5;&sub0;-Werte einer gegebenen Verbindung von einem Präparat zu einem anderen beträchtlich variieren können. Wirkkräfte von neuen Verbindungen, die getestet werden sollen, werden bezogen auf jene der Referenzverbindung bestimmt und deren IC&sub5;&sub0;-Werte werden basierend auf einem durchschnittlichen IC&sub5;&sub0;-Wert, der für die Referenzverbindung durch Ausführen von vielen Bestimmungen mit einer großen Anzahl von Präparaten erhalten worden ist, normalisiert. In Fällen, wo Peptide hinsichtlich eines enzymatischen Abbaus empfindlich sein könnten, werden Wirkkräfte in Gegenwart einer Mischung von Peptidaseinhibitoren (1-Leucylleucin, 2 mM; Bestatin, 10-30 uM; Thiorphan, 0,3 uM; Captopril, 10 uM) bestimmt, wie von McKnight et al., Eur. J. Pharm. 86: 339-402 (1983), empfohlen. Ke-Werte für Naloxon oder andere Antagonisten werden ausgehend von dem Verhältnis von IC&sub5;&sub0;-Werten (DR), die mit dem untersuchten Peptid in Gegenwart und Abwesenheit einer festgelegten Konzentration des Antagonisten erhalten werden, unter Verwendung der Formel Ke = a/(DR- 1) ("a" = festgelegte Konzentration) bestimmt. Eine logarithmische Dosis-Wirkungs-Kurve wird mit [Leu&sup5;]enkephalin für jedes Ileum- und Vas deferens-Präparat erstellt und es wird der IC&sub5;&sub0;- Wert bestimmt. Ke-Werte für Antagonisten werden ausgehend von dem Verhältnis von IC&sub5;&sub0;-Werten, die mit [Leu&sup5;]enkephalin in Gegenwart und Abwesenheit einer festgelegten Antagonistenkonzentration erhalten werden, bestimmt.
Eine logarithmische Dosis-Wirkungs-Kurve wurde mit [Leu&sup5;]enkephalin für jedes Ileum- und Vas deferens-Präparat erstellt und es wurde der IC&sub5;&sub0;-Wert, bestimmt. Ke-Werte für Antagonisten wurden ausgehend von dem Verhältnis von IC&sub5;&sub0;-Werten, die mit [Leu&sup5;]enkephalin in Gegenwart und Abwesenheit einer festgelegten Naloxon-Antagonistenkonzentration erhalten worden waren, bestimmt (Kosterlitz und Watt, Br. J. Pharamcol., 33: 266-276 (1968)).
Tabelle 12 gibt die Ergebnisse von zwei Peptiden, WWPKHN-NH&sub2; (SEQ ID NO. 49) und WWPKHK-NH&sub2; (SEQ ID NO. 50), die in den GPI- und MVP-Assays getestet worden sind, an. Es wurde gezeigt, dass diese Peptide in beiden Assays Agonisten waren. Ihre Wirkkräfte waren in dem GPI-Assay ähnlich zu jener von Leucinenkephalin (YGGFL-OH) (SEQ ID NO. 218). Die Agonisteneffekte von WWPKHN-NH&sub2; (SEQ ID NO. 49) und WWPKHK-NH&sub2; (SEQ ID NO. 50) in dem GPI-Assay wurden durch Naloxon mit Ke-Werten von 1,27 ± 0,16 nM bzw. 2,97 ± 0,43 nM antagonisiert, was anzeigt, dass sie u-Rezeptor-vermittelt waren. Obwohl die IC&sub5;&sub0;-Werte in dem MVD-Assay viel niedriger waren als jene des GPI-Assays, zeigt der MVD-Assay, wie oben diskutiert, hauptsächlich Reaktivität gegenüber Verbindungen, die auf die δ-Rezeptoren wirken. Aktivität in dem MVD-Assay wurde durch TIPP, einen hochgradig δ- selektiven Antagonisten, nicht antagonisiert. Sie wurde jedoch durch Naloxon antacronisiert, das präferentiell u-Rezeptor- vermittelte Effekte: antagonisiert, und dementsprechend wird die in dem MVD-Assay beobachtete Aktivität durch die in dem Gewebe vorhandenen u-Rezeptoren vermittelt. Die in diesen Assays beobachtete Aktivität zeigt, dass die vorliegenden Peptide potentielle analgetische Aktivität in vivo haben.
In Tabelle 13 werden zusätzliche individuelle Peptide angegeben, von denen gezeigt worden ist, dass sie Agonisten- oder Antagonistenaktivität entweder anhand des Adenylylcyclaseassays oder des GPI-Assays aufweisen.
Die Erfindung ist unter Bezugnahme auf die oben angegebenen Beispiele beschrieben worden und wird in den folgenden Ansprüchen dargelegt.

Claims

1. Peptid, das die Struktur

Ac-Phe-Arg-Trp-Trp-Tyr-Xaa-NH&sub2;

(SEQ ID NO. 1) aufweist, worin Xaa eine natürlich vorkommende Aminosäure ist.

2. Peptid, das die Struktur

Ac-Arg-Trp-Ile-Gly-Trp-Xaa-NH&sub2;

(SEQ ID NO. 2) aufweist, worin Xaa eine natürlich vorkommende Aminosäure ist.

3. Peptid, das die Struktur

Trp-Trp-Pro-Lys/Arg-Hisz-Xaaz-NH&sub2; (SEQ ID NO. 222),

aufweist, worin z 0 oder 1 ist; und

worin Xaa eine natürlich vorkommende Aminosäure ist, mit der Maßgabe, daß, wenn Xaa vorhanden ist, His anwesend ist.

4. Peptid nach Anspruch 3, das die Struktur

Trp-Trp-Pro-Lys-His-Xaa-NH&sub2; (SEQ ID NO. 3),

worin Xaa eine natürlich vorkommende Aminosäure ist.

5. Peptid nach Anspruch 3, das die Struktur

Trp-Trp-Pro-Lys/Arg-NH&sub2; (SEQ ID NO. 4)

aufweist.

6. Peptid, das die Struktur

Tyr-Pro-Phe-Gly-Phe-Xaa-NH&sub2;

(SEQ ID NO. 5) aufweist, worin Xaa eine natürlich vorkommende Aminosäure ist.

7. Peptid, das die Struktur

(D) Ile-(D)Met-(D)Ser-(D)Trp-(D)Trp-Glyn-Xaa-NH&sub2;

(SEQ ID NO. 6) aufweist, worin n 0 oder 1 ist und wobei Xaa Gly oder die D-Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist.

8. Peptid, das die Struktur

(D)Ile-(D)Met-(D)Thr-(D)Trp-Gly-Xaa-NH&sub2;

(SEQ ID NO. 7) aufweist, worin Xaa Gly oder die D-Form einer natürlich vorkommenden Aminosäure ist.

9. Peptid, das die Struktur

Tyr-A1-B2-C3-NH&sub2; (SEQ ID NO. 214)

aufweist,

worin A1 (D)Nve ist;

B2 Gly, Phe oder Trp ist; und

C3 Trp oder Nap ist.

10. Verbindung der Struktur: MexHyN-Tyr-Tyr-Phem-Pron-NH&sub2; (SEQ ID NO. 221), worin x 0, 1 oder 2 ist und y 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß x und y zusammen niemals größer als 2 ist; m und n 0 oder 1 sind, mit der Maßgabe, daß, wenn Pro anwesend ist (n ist 1), Phe anwesend ist (m ist 1); und worin jedes der Stickstoffatome im Peptidrückgrat zwischen den jeweiligen Aminosäuren modifiziert ist, wobei diese Modifikation ferner aus der Gruppe bestehend aus permethyliert (Pm), perallyliert (Pa), perethyliert (Pe), perbenzyliert (Pb) und pernaphthyliert (Pn) ausgewählt ist.

11. Verbindung nach Anspruch 10, bei der die zweite Position Tyr in der L-Konfiguration vorliegt.

12. Verbindung der Struktur MexHyN-Tyr-Tyr-Phe-NH&sub2;, worin x 0, 1 oder 2 ist und y 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß x und y zusammen niemals größer als 2 ist, und worin jedes der Stickstoffatome in dem Peptidrückgrat zwischen den jeweiligen Aminosäuren modifiziert ist, worin diese Modifikation ferner aus der Gruppe bestehend aus permethyliert (Pm), perallyliert (Pa), perethyliert (Pe), perbenzyliert (Pb) und pernaphthyliert (Pn) ausgewählt ist.

13. Verbindung der Struktur MexHyN-Tyr-Tyr-NH&sub2;, worin x 0, 1 oder 2 ist und y 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß x und y zusammen niemals größer als 2 ist, und worin jedes der Stickstoffatome in dem Peptidrückgrat zwischen den jeweiligen Aminosäuren modifiziert ist, wobei diese Modifikation ferner aus der Gruppe bestehend aus permethyliert (Pm), perallyliert (Pa), perethyliert (Pe), perbenzyliert (Pb) und pernaphthyliert (Pn) ausgewählt ist.

14. Verbindung wie in irgendeinem der Ansprüche 10 bis einschließlich 13, bei der alle Carbonyle des Amid-Peptidrückgrats reduziert sind.

15. Verbindung wie in irgendeinem der Ansprüche 10 bis einschließlich 14, bei der mindestens eine Aminsosäure in der (D)-Konfiguraticm vorliegt.

16. Verbindung wie in irgendeinem der Ansprüche 10 bis einschließlich 15, bei der diese Modifikation eines jeden Stickstoffatoms im Peptidrückgrat eine identische Modifikation ist.

17. Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe besteh end aus:

wobei "red" bedeutet, daß die Carbonyle des Amid-Peptidrückgrats zu Aminen reduziert sind.

18. Peptid, das die Struktur

Tyr-A1-B2-C3-NH&sub2;

aufweist, bei der A1 (D) Nle ist;

B2 Gly ist; und

C3 Trp oder Nap ist.