DE69312309T2 - Verdichtungsprüfung zur bewertung einer therapie für eine atmungskrankheit - Google Patents
Verdichtungsprüfung zur bewertung einer therapie für eine atmungskrankheitInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay, der die Kompaktion von Sputumproben von Säugetieren mißt, die an Erkrankungen der Atmungsorgane, die mit Absonderungen von infizierten Atemwegen einhergehen, leiden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kompaktionsassay, der die Wirksamkeit eines Heilmittels bei der Verbesserung der Lungenfunktion eines Patienten, der an einer Krankheit der Atmungsorgane leidet, mißt.
- Die vorliegende Erfindung betrifft im speziellen einen Kompaktionsassay, der die therapeutische Wirksamkeit von DNase bei einer Population von Patienten vorhersagt.
- Lungensekrete sind komplexe nicht-homogene Materialien, die ein viskoses hydrophiles Gel bilden. Diese Sekrete spielen eine wichtige Rolle bei der normalen Funktion der Atemwege. Erkrankungen der Atmungsorgane, die mit infizierten Atemwegssekreten einhergehen, wie cystische Fibrose (CF), Bronchitis und Lungenentzündung, sind durch eitrige Sekrete gekennzeichnet, die die Hauptverantwortung für die mit der Erkrankung der Atmungsorgane verbundenen Atmungsfunktionsstörung tragen.
- Die Viskosität nicht-infizierter Lungensekrete wird Schleimglykoproteinen zugeschrieben, während die Viskosität infizierter oder eitriger Lungensekrete Schleimproteinen und DNA (Shak et al., PNAS 87:9188-9192 [1990]) sowie Glykoproteinen, DNA, Proteinen, Lipiden und Kationen (Yeates, DB, "The Lung: Scientific Foundations", Hrsg. Crystal et al., Verleger Raven Press, S.197-203 [1991]) zugeschrieben wird.
- Cystische Fibrose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch einen Defekt im Sekretionsepithel, das am elektrogenen Chloridtransport beteiligt ist, gekennzeichnet ist und es handelt sich dabei um die häufigste tödliche genetische Erkrankung bei Kaukasiern, wo sie bei etwa 1 von 2.500 Lebendgeburten vorkommt (Boat et al., "The Metabolic Basis of Inherited Disease" Hrsg. Scriver et al., Verleger McGraw Hill, S.2649-2860 [1989]). Funktionsstörungen des Sekretionsepithels führen zu mehreren Anomalien, einschließlich verringerter Sekretion des Pankreasenzyms, schlechter Absorption im Magendarmtrakt und übermäßiger Sekretion von Bronchialschleim (Kerem et al., "New England Journal of Medicine" 323:1517-1522 [1990]). Diese übermäßigen Bronchialsekrete sorgen für eine Umgebung, die chronische Lungeninfektionen durch opportunistische Pathogene, wie z.B. Pseudomonas aeruginosa, begünstigt (George, RH "Arch Dis Child" 62: 438-439 [1987]). Eine große Zahl Entzündungsleukozyten dringt in diese Infektionsstellen ein und wird nach einer kurzen Zeit lysiert, wodurch ihre nukleare Desoxyribonukleinsäure (DNA) in den Bronchialschleim freigesetzt wird. Extrem eitrige Sekrete, bei denen gezeigt worden ist, daß sie bis zu 15 mg/ml DNA enthalten (Matthews et al., "Am Rev Respir Dis" 88.199- 204 [1963]) werden zu dick, als daß sie der DF-Patient Ioswerden könnte, was zu Atemnot und progressiver Lungenzerstörung führt (Welsh et al., "J.Ciin.Invest." 80:1523- 1526 [1987]).
- Lungenentzündung ist durch Entzündung des Lungenparenchyms gekennzeichnet. Die meisten Fälle von Lungenentzündung sind auf Infektionen durch Bakterien oder Viren zurückzuführen, einige auf das Einatmen von Chemikalien oder Traumen an der Brustwand, und eine kleine Minderheit auf Rickettsien, Pilze und Hefen. Die Entzündung kann lobär, segmentär oder lobulär verbreitet sein. Ein klinisches Symptom für Lungenentzündung ist das Vorhandensein eitriger Sekrete in den Atemwegen.
- Bronchitis ist durch Entzündung der Schleimhautmembran der Luftröhrenäste gekennzeichnet. Es gibt viele Formen von Bronchitis, darunter chronische Bronchitis, hämorrhagische Bronchitis, fibrinöse Bronchitis (Bronchitis plastica), Kapillarbronchitis und asthmatische Bronchitis. Chronische Bronchitis ist ein Zustand des Bronchialbaums, der durch Husten, übermäßige Schleimäbsonderung und Sputumauswurf über einen langen Zeitraum in Verbindung mit erhöhter Anfälligkeit für Bronchialinfektion gekennzeichnet ist. Eine Erhöhung der Viskosität eitriger Sekrete steht bei Patienten mit chronischer Bronchitis in Verbindung mit Schwierigkeiten beim Aushusten (Dulfano et al., "Am.Rev.Respir.Dis." 104:88-98 [1971]).
- In der Vergangenheit sind verschiedene Versuche unternommen worden, die viskoelastische Beschaffenheit eitriger Tracheobronchialsekrete bei Säugetieren zu verringeren, die an Erkrankungen der Atmungsorgane leiden, die mit Sekretion bei den infizierten Atemwegen verbunden sind, in der Hoffnung, daß der Patient das Material besser ausscheiden kann. Therapien wie das Inhalieren von Wasser (Rosenbluth et al., "Archives of Disease in Childhood" 49: S.606-610 [1974]) und die Verwendung von schleimlösenden Mitteln wie n-Acetylcystein (Mucomyst) sind nicht erfolgreich gewesen.
- Es ist gezeigt worden, daß Rinderpankreas-DNase I (Dornase) bei der Behandlung von Lungenentzündung wirksam ist (Clifton, et al., "Cancer" (14):414-420 [1961]), aber seine Verwendung erwies sich als ungünstig, weil bei Menschen bei Verwendung dieser Rinderproteins Reizungen auftraten (Shak et al., "PNAS" 87:9188 [1990]). Vor kurzem berichteten Hubbard et al., "NEJM" 326:812-815 [1992]) und Aitken et al., ("JAMA" Band 267, S.1947-1951 [1992]), dass menschliche DNase DNA mit hohem Molekulargewicht in eitrigen Sekrten in den Atemwegen spaltet, wodurch die Viskoelastizität der eitrigen Sekrete verringert und die Lungenfunktion verbessert wird. Menschliche DNase ist auch bei der Behandlung chronischer Bronchitis, Bronchiectase, Sinusinfektionen und anderen Erkrankungen der Atmungsorgane indiziert worden (WO90/07572, veröffentlicht am 12. Juli 1990).
- Andere Therapeutika, wie z.B. Antineutrophilelastase-Mittel und Sekretionsleukoproteaseinhibitor sind möglicherweise vielversprechende neue Therapien zur Behandlung von CF (Mulherin et al., "Dig.Dis." 10(1) S.29-37 [1992]). Die Antibiotikatherapie ist für die Behandlung chronischer Atemwegsinfektionen, die mit CF und anderen Erkrankungen der Atmungsorgane in Verbindung stehen, indiziert (Mulherin et al., "Ir.J.Med.Sci." 160(6), S.173-175 [1991]) und de Montalembert et al., "Ann. Pediatric." 38(8) S.523-528 [1991]). Brust-Physiotherapie ist als mechanischer Ansatz für infektionshemmende Therapie bei cystischer Fibrose (Zach et al., "Infection" 15(5) S.381-384 [1987]) sowie Asthma, chronischer Bronchitis und Bronchiectase (Eid et al., "Respir.Care" 36(4), S.270-282 (1991)] ebenfalls indiziert worden.
- DNase ist eine Phosphodiesterase, die zur Hydrolyse von Polydesoxyribonukleinsäure fähig ist. Sie bewirkt umfassend und nichtspezifisch, daß DNA abgebaut wird, und unterscheidet sich in dieser Hinsicht von den relativ begrenzt wirkenden und sequenzspezifischen Restriktionsendonukleasen. DNase I weist ein pH-Optimum nahe der Neutralität sowie einen obligatorischen Bedarf an zweiwertigen Kationen auf und erzeugt bei der Hydrolyse von DNA 5'-Phosphatnukleotide. DNase II weist ein saures pH-Optimum auf, kann durch zweiwertige Kationen aktiviert wrden und erzeugt bei der Hydrolyse von DNA 3'-Phosphatnukleotide. Es sind viele Molekularformen von DNase I und DNase II bekannt.
- DNase hat eine Anzahl bekannter Anwendungsgebiete und ist für therapeutische Zwecke eingesetzt worden. Seine wichtigste therapeutische Verwendung war bisher die Reduktion der viskoelastischen Eigenschaften infizierter Atemwegssekrete bei Erkrankungen der Atmungsorgane, wie cystischer Fibrose, Lungenentzündung und Bronchitis, wodurch das Freimachen der Atemwege und eine Verbesserung der Lungenfunktion unterstützt wird.
- Rinder-DNase A, B, C und D wurde schon 1973 gereinigt und vollständig sequenziert. Rinderpankreas-DNase wurde unter dem Markennamen Dornavac (Merck) verkauft und bei der Behandlung von Patienten verwendet, die an Lungenentzündung und CF leiden. Dieses Produkt wurde vom Markt genommen, nachdem Kliniker schwerwiegende Komplikationen durch seine Verwendung festgestellt hatten (Raskin, "Am.Rev.Respir.Dis." 98:597-598 [1968]).
- Menschliche DNase I wurde von Shak et al., oben, kloniert und exprimiert, die berichteten, daß katalytische Mengen rekombinanter menschlicher DNase (rhDNase) die Viskosität von eitrigem Sputum von cystischer Fibrose stark verringert, und es von einem nichtfließenden viskosen Gel in eine fließende Flüssigkeit umwandelt, wodurch das Ausscheiden von Sputum verbessert wird. Hubbard et al., oben, und Aiken et al., "JAMA" 267:1947-1951 [1992]) berichteten von einer verbesserten Lungenfunktion bei CF-Patienten nach der Behandlung mit rhDNase in Aerosolform.
- Atemwegssekrete, wie z.B. Schleim, spielen eine wichtige Rolle bei der normalen Funktion der Atemwege. Diese Atemwegssekrete schützen die Atemwege gegen Mikroorganismen und andere Fremdkörper in der Luft, indem sie für einen kontinuierlichen Fluß oder Transport von Sekreten unter der Treibkraft des Flimmerepithels sorgen. Dieser Transport unterstützt das Ausscheiden der Teilchen und Mikroorganismen, die im die Atemwege auskleidenden Schleim eingeschlossen sind. Die viskoelastischen Geleigenschaften von normalem Schleim sind kritisch für den wirksamen Schleimtransport durch die Zilien (Yeates et al., oben).
- Es ist gezeigt worden, daß Patienten, die an einer Erkrankung der Atmungsorgane leiden, die durch infizierte Atemwegssekrete gekennzeichnet ist, übermäßige Mengen an eitrigen Sekreten mit anormalen viskoelastischen Eigenschaften ausscheiden. Je nach der Art der Erkrankung der Atmungsorgane, der Schwere und der Dauer gibt es eine Veränderlichkeit der Viskoelastizität des infizierten Sputums, wodurch das Behandlungsschema nicht vorhersehbar ist.
- King et al. ("Rheology" 24:589-597 [1987]) zeigen eine umgekehrte Beziehung zwischen der Viskoelastizität und dem Ziliartransport; je größer die Viskoelastizität ist, desto geringer ist der Transport durch die Zilien. Beeinträchtigter Transport durch die Zilien kann zur Verlegung der Atemwege in den Lungen durch infizierte Sekrete führen, was Atemnot verursacht und in manchen Fällen zu Atemausfall und Tod führen kann.
- Forscher haben erfolglos versucht, eine Korrelation zwischen der in vitro- und der in vivo-Beurteilung der rheologischen Eigenschaften von Sputum zu finden. Reid et al., ("Rheology-Relation to the Composition of Sputum", Scandinavian Journal of Respiratory Diseases, Verleger: Munksgaard International Publishers, Band 103, Erg., S.27-35 [1974]) behaupten, daß die in vitro-Beurteilung der Scherraten von Sputum nicht verwendet werden kann, um die rheologischen Eigenschaften von Sputum in vivo zu beurteilen. Rosenblut et al. ("Archives of Disease in Childhood" 49:606 [1974)) zeigen, daß obwohl eine Erhöhung des Wassergehalts von CF-Sputum in vitro die Viskosität verringert, eine Nebeltherapie weder die Sputumviskosität noch das Sputumvolumen bei CF-Patienten beeinflußte.
- Es kann schwierig sein, relevante rheologische Messungen des Sputum von Patienten mit Erkrankung der Atmungsorgane durch ein einziges rheologisches Verfahren zu erhalten. Tatsächlich sind die Ergebnisse einer Technik aufgrund der der Viskoelastizität von Patientensputumproben eigenen Veränderlichkeit und der nichtnewtonschen Eigenschaften von Sputum, da die Viskositäts- und Elastizitätswerte vom Analyseverfahren abhängen, selten mit den durch andere Techniken erhaltenen vergleichbar.
- Es sind verschiedene Arten von Geräten verwendet worden, um die rheologischen Eigenschaften von Schleim zu untersuchen, einschließlich des dynamischen Viskosimeters mit Konus und Platte, des Kapillarrheometers, des Mikrorheometers mit oszillierender Magnetkugel und des magnetischen Rheometers. Diese Geräte messen die mit Viskosität und Elastizität in Verbindung stehenden dynamischen Werte.
- Das dynamische Viskosimeter mit Konus und Platte ist eines der am wenigsten destruktiven dieser Verfahren kann kann gleichzeitig Informationen über Viskosität und Elastizität einer Probe liefern; dieses Verfahren erfordert jedoch die Verwendung relativ großer Sputumvolumina. Das Kapillarrheometer unterliegt, obwohl es kleine Probenvolumina erfordert, mehreren Einschränkungen, einschließlich Problemen bei der Handhabung der Probe. Das Magnetmikrorheomter arbeitet bei Materialien, die in hohem Maße heterogen sind, wie Sputum, nicht zufriedenstellend, weil die Bewegung der Teilchen oft unterbrochen wird, wenn es sich um einen Bereich mit höherer Viskosität handelt.
- Yeates et al., oben, warnen, daß Vergleiche rheologischer Werte, die von verschiedenen Geräten stammen, vorsichtig erfolgen müssen, weil diese von der Anwendung anderer rheologischer Prinzipien abhängig sind.
- Viele Verfahren, die angewandt werden, um rheologische Messungen zu erzielen, sind destruktiv und ändern die physikalische Beschaffenheit des Sputums während der Lagerung oder Sammlung von Daten unwiderruflich. Das gilt für das Einfrieren und die Verwendung von Vorrichtungen wie dem statischen Rheometer mit Konus und Platte, die häufig für Viskositätsbestimmungen verwendet werden. Viele Geräte, wie das dynamische Rheometer mit Konus und Platte, sind sehr teuer und erfordern einen geschulten Techniker zur Bedienung des Instruments und zur Interpretation der resultierenden Daten.
- Bis zur vorliegenden Erfindung gab es keinen einfachen, gültigen oder rheologischen in vitro-Assay zur Beurteilung der Wirksamkeit eines Therapeutikums zur Verbesserung der Lungenfunktion bei einem Patienten mit einer Erkrankung der Atmungsorgane. Bis zur vorliegenden Erfindung gab es keinen einfachen, gültigen oder normierten rheologischen in vitro-Assay zur Messung der Schwere einer Erkrankung der Atmungsorgane als Funktion der Viskoelastizität. Bis zur vorliegenden Erfindung gab es kein Verfahren zur Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von rhDNase- Behandlung bei Säugetierpatienten mit einer Krankheit der Atmungsorgane.
- Die US-A-3.914.985 offenbart eine Zentrifugenvorrichtung und ein Verfahren zum Ernten, Kompaktieren und Messen von Teilchenmaterial, insbesondere Zellmaterial, in Körperfluiden wie Blut. Nach dem Zentrifugieren wird das kompaktierte Teilchenmaterial Volumetrischen Messungen unterzogen.
- Der Kompaktionsassay gemäß vorliegender Erfindung basiert auf der Änderung der Sputumverdichtbarkeit in einem Zentrifugalfeld nach einer in vitro-DNase-Behandlung von Sputum. Das Ausmaß der Sputumverdichtbarkeit, wie durch Zentrifugalpelletgröße gemessen, steht mit dem Gehalt an DNA mit großem Molekulargewicht in Zusammenhang. Je größer die Menge an DNA mit großem Molekulargewicht in einer Sputumprobe ist, desto größer ist der Widerstand gegen Verdichtung. DNase bewirkt die Hydrolyse der in eitrigem Sputum vorhandenen DNA mit großem Molekulargewicht, wodurch die Verdichtbarkeit durch Zentrifugieren einer in vitro mit DNase behandelten Probe erhöht wird. Je größer die Zunahme der Verdichtbarkeit einer in vitro mit DNase behandelten Sputumprobe bei einem Patienten ist, desto größer ist die festgestellte Verbesserung der Lungenfunktion des Patienten bei in vivo-rhDNase- Behandlung.
- Es besteht Bedarf an einem einfachen und raschen normierten Assay zur Bewertung der Fähigkeit eines Therapeutikums zur Verbesserung der Lungenfunktion bei einer Patientenpopulation. Dieser Bedarf besteht bei jeder Patientenpopulation mit einer Erkrankung der Atmungsorgane, die durch infizierte Atemwegssekrete gekennzeichnet ist.
- In vielen Fällen wäre es wünschenswert, den Grad der Erkrankung der Atmungsorgane bei einem Säugetier zu bewerten, um wirksame Dosierungschemata von Therapeutika zu ermitteln, die bei der Behandlung der Erkrankung der Atemwege nützlich sind. Besonders wünschenwert wäre ein rascher und einfacher in vitro-Assay, der die Wirksamkeit von in vivo-DNase-Therapie bei einer Patientenpopulation vorhersagt, die DNase-Therapie benötigt.
- Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen raschen und einfachen normierten Assay bereitzustellen, mit dem die Wirksamkeit eines Therapeutikums bei der Verbesserung der Lungenfunktion in einer Patientenpopulation beurteilt werden kann.
- Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen raschen und einfachen in vitro- Assay bereitzustellen, um die Schwere der Erkrankung der Atmungsorgane bei einem Säugetierpatienten zu bestimmen, um wirksame Dosierungsschemata von Therapeutika zu ermitteln, die bei der Behandlung der Erkrankung der Atmungsorgane nützlich sind. Ein damit im Zusammenhang stehendes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen in vitro-Assay bereitzustellen, der die Wirksamkeit von DNase-Therapie in einer Patientenpopulation vorhersagt, die DNase-Therapie benötigt.
- Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten klar sein.
- Die vorliegende Erfindung basiert auf dem unerwarteten Versuchsergebnis, daß in vitro- Messungen der Viskoelastizität, die beim Kompaktionsassay erhalten werden, den Grad der Erkrankung der Atmungsorgane eines Säugetiers anzeigen und die in vivo Wirksamkeit von Therapeutika vorhersagen, die bei der Behandlung der Erkrankung der Atemwege zur Verbesserung der Lungenfunktion nützlich sind.
- Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden erreicht, indem ein Verfahren zum Messen der Kompaktion einer Sputumprobe von einem Säugetierpatienten mit Erkrankung der Atmungsorgane, die mit infizierten Atemwegssekreten in Verbindung steht, bereitgestellt wird, welches Verfahren das Entnehmen einer Sputumprobe vom Säugetierpatienten, das Zentrifugieren der Sputumprobe, bis diese in eine Überstand und eine Pelletphase fraktioniert ist, und das Messen des Pellets umfaßt.
- Bei einer Ausführungsform stammt die Sputumprobe von einem Säugetierpatienten mit cystischer Fibrose. Bei einer weiteren Ausführungsform stammt die Sputumprobe von einem Säugetierpatienten mit Bronchitis.
- Bei wieder einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen der Kompaktion einer in vitro mit einem Therapeutikum behandelten Säugetierpatienten-Sputumprobe bereit, welches Verfahren das Abnehmen einer Sputumprobe vom Säugetierpatienten, das Zugeben von Therapeutikum zur Sputumprobe, das Zentrifugieren der Sputumprobe bis zur Fraktionierung in eine Überstand- und eine Pelletphase, und das Messen des Pellets umfaßt.
- Bei einer Ausführungsform ist das Therapeutikum menschliche DNase. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Therapeutikum ein Antibiotikum, das bei der Behandlung von Erkrankungen der Atmungsorgane nützlich ist.
- Bei wieder einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen der Kompaktion einer mit DNase behandelten Sputumprobe von einem Säugetierpatienten, der DNase-Therapie benötigt, bereitgestellt, welches Verfahren das Abnehmen einer Sputumprobe vom Säugetierpatienten, das Zugeben von DNase zur Sputumprobe, das Zentrifugieren der mit DNase behandelten Sputumprobe bis zur Fraktionierung in eine Überstand- und eine Pelletphase, und das Messen des Pellets umfaßt.
- Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist die DNase menschliche DNase in einer Konzentration von zumindest 1 µg DNase/ml Sputum.
- Fig. 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von DNase (SEQUENZ. ID Nr.1).
- Fig. 2 ist eine Agarosegelelektrophoreseuntersuchung der DNA-Größe innerhalb von Sputumproben. Sputumproben wurden entweder durch Behandlung mit Verdünnungsmittel (Minus-Spalten) oder rhDNase (Plus-Spalten) hergestellt, und einer Elektrophorese in einem 0,5% Agarosegel unterzogen.
- Fig. 3 zeigt Pellethöhen in Prozent für die 6 im Kompaktionsassay erhaltenen CF- Sputumproben nach der Zugabe von Verdünnungsmittel (graue Balken) oder rhDNase (volle schwarze Balken).
- Fig. 4 zeigt durch das dynamische Viskosimeter mit Konus und Platte gemessene Viskositäts- und Elastizitätswerte als Funktion der Belastung für eine representative Sputumprobe.
- Fig. 5 zeigt die physikalischen Eigenschaften 6 eitriger Proben.
- Fig. 6 zeigt das Ausmaß an DNA, das nach der Zugabe von Verdünnungsmittel oder rhDNase in der Pellet- und der Überstandfraktion von 6 Proben detektiert wurde.
- Fig. 7 zeigt eine Dosis-Reaktions-Kurve für die rhDNase-Wirkung einer CF- Sputumprobe. Eitriges CF-Sputum wird mit zunehmenden Konzentrationen an rhDNase behandelt und mit dem Kompaktionsassay bewertet. Die rhDNase-Konzentrationen wurden für das Sputumvolumen plus Enzymzugabe berechnet.
- Fig. 8 zeigt die Beziehung zwischen Kompaktionsassayergebnissen und gemessener Elastizität. Die Elastizität wurde mit einem dynamischen Viskosimeter mit Konus und Platte bei 20% Belastung gemessen, wie beschrieben. Der Pelletprozentsatz (aus Kompaktionsassayergebnissen) wurde für die 6 in dieser Untersuchung vollständig charakterisierten Proben sowie für vier andere eitrige CF-Sputumproben in Beziehung gesetzt. Die Datenpunkte stellen sowohl mit Verdünnungsmittel behandelte (volle Symbole) als auch mit rhDNase behandelte (leere Symbole) Proben dar.
- Die Verwendung des Begriffs "Kompaktion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Verformungswiderstand einer Sputumprobe beim Zentrifugieren und ist direkt von der Viskoelastizität der Probe abhängig. Je größer die Viskoelastizität der Probe ist, desto geringer ist die Verdichtbarkeit der Probe beim Zentrifugieren, wie dies durch die Zentrifugalpelletgröße gemessen wurde. Kompaktionsassayergebnisse sind im klinischen Zusammenhang nützlich, um den Grad der Erkrankung der Atmungswege als Funktion der Sputumviskoelastizität zu beurteilen und die Wirksamkeit von Therapeutika bei der Verbesserung der Lungenfunktion bei Säugetierpatienten mit Erkrankungen der Atmungswege zu bewerten.
- Die therapeutische Wirksamkeit von DNase bei der Verbesserung der Lungenfunktion eines Säugetierpatienten, der DNase-Therapie benötigt, kann durch Bestimmen der Kompaktierbarkeit der Säugetierpatienten-Sputumprobe nach der in vitro-Behandlung mit DNase vorhergesagt werden. Wenn die Zentrifugalpelletgröße nach der in vitro- DNase-Behandlung abnimmt, wird vorhergesagt, daß die Behandlung des Säugetierpatienten mit menschlicher DNase die Lungenfunktion verbessert. Die Reduktion der Pelletgröße nach der DNase-Behandlung ist auf die Hydrolyse langkettiger DNA zu kürzeren Ketten zurückzuführen. Die darauffolgende Freisetzung der kurzkettigen DNA in den Überstand führt zu erhöhter Pelletkompaktion und erhöhtem Überstandvolumen. Diese Wirkung kann quantifiziert und als Indikator fiir das Ausmaß der Viskoelastizitätsänderung nach der in vivo-rhDNase-Behandlung verwendet werden. Für jene Patienten, die DNase-Behandlung brauchen, wird vorhergesagt; daß diese auf die DNase-Therapie ansprechen, wenn die in vitro-rhDNase-Behandlung die Kompaktion der Sputumprobe des Patienten erhöht.
- Die Zentrifugation einer unbehandelten Sputumprobe von einem Säugetierpatienten, der DNase-Behandlung benötigt, ergibt eine Probe mit einer DNA-Konzentration, die im Zentrifugalpellet größer ist als im verbleibenden Überstand. Wegen des dehydrierten Zustandes des Sputum des Säugetierpatienten, der DNase-Therapie benötigt, entsteht durch Zentrifugieren mit 10.000 x g allein nicht immer eine Überstandphase. Es ist oft notwendig, der Sputumprobe ein Verdünnungsmittel zuzugeben, um eine Zentrifugalfraktionierung der Probe in zwei Phasen zu erzielen, und die zugegebene Menge an Verdünnungsmittel sollte bei allen getesteten Proben gleich sein. Wenn eine Verdrängerpipette zum Messen der zu testenden Sputumprobe verwendet wird, wird der Sputumprobe vorzugsweise Verdünnungsmittel in einem Volumen, das 50% des gemessenen Probenvolumens entspricht, zugegeben, um ein zumindest 20%iges Überstandvolumen nach dem Zentrifugieren zu gewährleisten. Wenn die Sputumprobe gravimetrisch gemessen wird, wird der Sputumprobe Verdünnungsmittel vorzugsweise in einem Volumen zugegeben, das 50% des genauen Sputumgewichts entspricht, sodaß beim Zentrifugieren zumindest 20% Überstandvolumen entstehen. Wenn beispielsweise das genaue Sputumvolumen, wie mit einer Verdrängerpipette gemessen, 100 µl beträgt, ist typischerweise die Zugabe von 50 µl Verdünner erforderlich, um zumindest 20% Überstandvolumen beim Zentrifugieren zu ergeben, oder wenn das exakte Sputumprobengewicht beispielsweise 100 mg beträgt, ist typischerweise die Zugabe von 50 µl Verdünner erforderlich, um beim Zentrifugieren zumindest 20% Überstandvolumen zu gewährleisten. Typischerweise wird eine Mettler-Analysewaage verwendet, um das Sputumprobengewicht zu messen. Wenn zum Messen des Sputumprobenvolumens nicht eine Verdrängerpipette verwendet wird, ist aufgrund des Vorhandenseins von Luftblasen ünd Schleimpropfen in der Sputumprobe, die die Volumsmessungen beeinflussen können, die Zugabe von Verdünnungsmittelvolumen auf Basis des Sputumprobengewichts notwendig. Nach der Zugabe von Verdünnungsmittel oder DNase und darauffolgendem Zentrifugieren ist der resultierende Überstand weder elastisch noch viskos, aber das verbleibende Pellet ist ziemlich fest oder elastisch. Die verbleibende Pelletphase enthält die Komponenten, die zur Elastizität des Gesamtsputums beitragen.
- DNase ist als Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Fig. 1 definiert, gemeinsam mit Aminosäuresequenzvarianten davon, die die qualitative enzymatische Aktivität von DNase beibehalten. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "DNase" verschiedentlich auf alle Formen menschlicher oder nichtmenschlicher Tier-DNase, die in akzeptierten DNase-Assays als biologisch aktiv bekannt sind, wie z.B. ELISA, RIA, Hydrolyse von ³²P-markierter DNA oder PAGE-Elektrophorese, wie in der am 12 Juli 1990 veröffentlichten WO90/07572 beschrieben, oder Agarplatten DNase-Assay (Smith et al., "Applied Microbiology" 18:991[1969)), und soll DNase in einer reifen, Pro- oder Met-Form umfassen, gleichgültig, ob sie aus natürlicher Quelle erhalten, chemisch synthetisiert oder durch Verfahren mit rekombinanter DNA-Technologie erzeugt ist.
- Eine vollständige Beschreibung der Herstellung rekombinanter menschlicher DNase (rhDNase) einschließlich ihrer cDNA und Aminosäuresequenzen und Expression wird in Shak et al., "PNAS" 87:9 188-9192 [1990)) und der WO90/07572 gezeigt. Nichtmenschliche Tier-DNase, einschließlich Rinder-, Schwein- und Schaf-DNase, ist beispielsweise in Liao et al., ("J.Biol.Chem." 248:1489 [1973]); Salnikow et al., ("J.Biol.Chem." 248:1499 [1973]); Liao et al. ("J.Biol.Chem." 249:2354 [1973]); Paudel et al. ("J.Biol.Chem." 261:16006 [1986]); und Paudel et al. ("J.Biol.Chem." 261:1601 2[1986]) geoffenbart
- Der Begriff DNase umfaßt verschiedentlich glykosylierte Formen und andere Varianten und Derivate solcher DNasen, gleichgültig, ob nach dem Stand der Technik bekannt oder in der Zukunft verfügbar. Beispiele für solche Varianten sind Allele und die Produkte stellengerichteter Mutagenese, bei denen Reste gelöscht, eingefügt und/oder substituiert sind. Vorzugsweise sind die Varianten bei Menschen nicht immunogen. Varianten können über größere enzymatische Aktivität oder verbesserte Löslichkeit verfügen oder von Wirtszellen in höheren Mengen exprimiert werden.
- DNA, die für menschliche DNase kodiert, wird durch in vitro-Verfahren synthetisiert oder leicht von menschlichen Pankreas-cDNA-Bibliotheken erhalten, wie in Shak et al., oben, beschrieben. Die Expression von rhDNase wird in Shak et al., oben und der WO90/07572 beschrieben.
- Menschliche DNase wird gemeinsam mit erforderlichen Kofaktoren in therapeutische Formulierungen eingebracht und wird gegebenenfalls auf die gleiche Weise verabreicht, wie das bei Tier-DNase, wie z.B. Rinderpankreas-DNase der Fall war. Die bevorzugte Formulierung für menschliche DNase ist eine gepufferte oder nicht gepufferte Lösung, und es handelt sich dabei vorzugsweise um eine isotonische Salzlösung, wie z.B. 150 mM Natriumchlorid, die 1,0 mM Kalzium bei pH 7 enthält. Die Natriumchloridkonzentration kann im Bereich von 75 mM bis 250 mM liegen. Die Kalziumkonzentration kann im Bereich von 0,01 bis 0,05 mM liegen, und andere zweiwertige Kationen, die DNase stabilisieren, können enthalten sein oder anstelle von Kalzium verwendet werden. Der pH-Wert kann im Bereich von 5,5 - 9,0 liegen, und es können auch Puffer eingesetzt werden, die mit dem enthaltenen zweiwertigen Kation kompatibel sind. Diese Lösungen sind besonders an die Verwendung von im Handel erhältlichen Zerstäubern anpaßbar, wie z.B. Düsenzerstäubern und Ultraschallzerstäubern, die zur Verabreichung nützlich sind, beispielsweise direkt in die Atemwege oder Lungen eines Patienten, der an einer Krankheit der Atmungsorgane leidet, die mit infizierten Atemwegsekreten einhergeht. Die Formulierung kann lyophilisiertes Pulver sein, das auch Kalzium enthält.
- Für die Verabreichung sind im Handel erhältliche Zerstäuber für flüssige Formulierungen, einschließlich Düsenzerstäuber und Ultraschallzerstäuber, nützlich. Flüssige Formulierungen können direkt zerstäubt und lyophilisiertes Pulver kann nach der Rekonstruktion zerstäubt werden. Alternativ dazu kann DNase unter Verwendung einer Fluorkohlenstoffformulierung und eines Meßdosisinhalators als Aerosol verabreicht oder als lyophilisiertes und gemahlenes Pulver inhaliert werden.
- Gereinigte DNase wird zur enzymatischen Änderung der Viskoelastizität von Sputum eingesetzt. Menschliche DNase ist besonders nützlich zur Behandlung von Patienten mit Lungenerkrankung, die anormale, viskose oder verdickte eitrige Sekrete bei Zuständen wie akuter oder chronischer Bronchopulmonarerkrankung (infektiöse Lungenentzündung, Bronchitis oder Tracheobronchitis, Brochioectrasis, Mukoviszidose, Asthma, TB oder Pilzinfektionen), Atelectase aufgrund von Tracheal- oder Bronchialimpaktion und Tracheotomiekomplikationen aufweisen. Für derartige Therapien wird eine Lösung oder ein feinzerteiltes Trockenpräparat menschlicher DNase auf herkömmliche Weise, z.B. durch Aerosolisierung einer DNase-Lösung, in die Bronchien eingebracht.
- Die chemische Wirkung der in vitro-rhDNase-Behandlung von Sputumproben kann unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese nach dem Verfahren von Shak et al., oben und der WO90/07572 verfiziert werden.
- DNase kann auch gemeinsam mit anderen pharmakologischen Mitteln verabreicht werden, die verwendet werden, um die oben angeführten Zustände zu behandeln, wie Antibiotika, Bronchodilatoren, entzündungshemmende Mittel und schleimlösende Mittel, z.B. n-Acetylcystein.
- Säugetierpatienten, die DNase-Therapie benötigen, sind jene Patienten, die an einer Erkrankung der Atmungsorgane leiden, die durch infizierte Atemwegssekrete gekennzeichnet ist.
- Die therapeutisch wirksame DNase-Menge, die bei der Behandlung von Menschen verwendet wird, die an einer mit infizierten Atemwegsekreten einhergehenden Erkrankung der Atmungsorgane leiden, ist eine Dosis von etwa 1 µg bis etwa 100 mg menschliche DNase pro kg Körpergewicht des Patienten, verabreicht mit pharmazeutischen Zusammensetzungen wie hierin beschrieben. Die therapeutisch wirksame Menge menschlicher DNase hängt beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Demgemäß ist es notwendig, daß der Therapeut die Dosis einstellt und den Verabreichungsweg wie erforderlich modifiziert, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen.
- Bei einer Anzahl von Erkrankungen der Atmungsorgane nimmt der Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Gehalt von Sputum mit dem Eitergrad zu (Picot et al., "Thorax" 33:235-242 [1978]). Das gilt besonders bei CF, wo hohe Infektionsgrade mit erhöhten Mengen an Sputum-DNA einhergehen (Carswell et al., "Eur. J. Respir. Dis." 65: 53-57 [1984]). Die Eigenschaften von DNA, die von Sputumproben von Patienten mit einer Erkrankung der Atmungsorgane erhalten wird, unterliegen einer Veränderlichkeit.
- DNA beeinflußt die Viskoelastizität von Sputum durch die Interaktion mit anderen Sputumkomponenten, einschließlich Schleimglykoproteinen.
- Die DNA, die im Sputum von Patienten mit einer Erkrankung der Atmungsorgane vorhanden ist, stammt entweder von infizierenden Organismen oder von den eigenen Zellen des Patienten (Lethem et al., "Eur.Respir.J." 3:19-23 [1990]). Wenn die Wirtszellen den Hauptbeitrag zur Gesamtsputum-DNA liefern, spiegelt sich das im Gehalt an Leukozyten und Epithelzellen wider, die aufgrund der Entzündung vorhanden sind. Lethem et al., oben, berichten, daß die DNA, die gemeinsam mit Mukusglykoproteinen gereinigt wird, menschlichen Ursprung hat, was darauf hinweist, daß die von der Infektion herrührenden Entzündungsvorgänge und nicht die Infektion selbst die Quelle der DNA in CF-Sputum sind.
- Das Vorhandensein von eitrigen Sekreten der Atmungsorgane von Patienten mit Erkrankungen der Atmungsorgane stellt ein hervorragendes Wachstumsmedium für Mikroorganismen dar, und Lungeninfektionen sind trotz normaler Wirtsverteidigungsmechanismen häufig. Für diese Infektionen ist die Verwendung von Antibiotika indiziert.
- Die drei häufigsten bakteriellen Pathogene, die vom Sputum von CF-Patienten isoliert werden, sind Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Hemophilus influenzae. Proteus- und Klebsiella-Spezies werden viel weniger häufig beobachtet. Es wird angenommen, daß das Vorhandensein dieser Bakterien für einige der destruktiven Änderungen in den Lungen von CF-Patienten verantwortlich ist.
- Bei CF ist auch chronische Sinusitis festzustellen und kann das Ergebnis der Verlegung der Nebenhöhlengänge sein, was das Ablaufen verhindert und nicht mit der zugrundenliegenden Lungenerkrankung in Verbindung steht. Zu den in diesen Fällen von Sinusitis allgemein isolierten Bakterien gehören P.aeruginosa, H.influenzae, Streptococci und Anaerobes.
- Obwohl die Verwendung von Antibiotika bei CF sowohl kontroversiell als auch mit Schwierigkeiten verbunden ist (In "Pharmacotherapy: a Pathophysiologic Approach", Hrsg: DiPiro und Talbert et al., Verleger Elsevier New York, S.836-843 [1989]), behandeln die meisten Kliniker Lungeninfektionen in Verbindung mit CF mit Antibiotika. Die spezifische Therapie richtet sich auf erwiesene oder wahrscheinliche Pathogene, wie z.B. Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus und umfaßt üblicherweise ein Aminoglykosid und ein Penicillin mit erweitertem Spektrum. Die vollständige Entfernung des Pathogens ist zwar ein praktischer Endpunkt der Antibiotikatherapie, aber die totale Entfernung von Pseudomonas aeruginosa ist selten und nicht dauerhaft. Daher ist ein praktischer Endpunkt der Verwendung von Antibiotika die Rückkehr zum klinischen S0tatus vor der Verschlimmerung des klinischen Zustands oder des Lungenfunktionsstatus.
- Ein weiteres Problem bei der Antibiotikaverwendung bei CF ist die geänderte pharmakokinetische Disposition einiger Antibiotika bei den meisten CF-Patienten. Viele CF-Patienten weisen eine erhöhte Gesamtkörperclearance für viele Antibiotika auf, und daher können höhere Dosen dieser Mittel notwendig sein, um therapeutische Konzentrationen herzustellen. Unglücklicherweise sind diese Änderungen der Pharmakokinetik weder einheitlich noch vorhersehbar. Erhöhungen der Dosis sollten mit gewisser Vorsicht erfolgen, und ihnen sote eine weitere Bestimmung der Serumkonzentrationen folgen.
- Es gibt zwar Kontroversen im Zusammenhang mit der Verwendung von Antibiotika bei chronischer Bronchitis (In "Pharmacotherapy: a Pathopysiologic Approach", Hrsg.: DiPiro und Talbert et al., Verleger Elsevier New York, S.1092-1095 [1989]), aber die am häufigsten für die Behandlung chronischer Bronchitis gewählten Antibiotika (Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Trimethoprimsulfamethoxazol) weisen in vitro-Aktivität gegen die häufigen Sputumisolate H.influenzae, S.pneumoniae und M.pneumoniae auf.
- Zur Behandlung von Lungenentzündung stehen zahlreiche Antibiotika zur Verfügung. Sobad (ein) verursachende(s) Pathogen(e) identifiziert worden ist/sind, kann ein Antibiotikaschema gegen das/die spezielle(n) identifizierte(n) Pathogen(e) gerichtet werden. Zu Antibiotika, die für die Behandlung von Lungenentzündung nützlich sind, gehören unter anderem Erythromycin, Ampicillin, Penicillin, halbsynthetisches Penicillin, Tetracyclin, Cefuroxim, Cephalosporin, Clindamycin, Aminoglycosid und Ticarcillin. Eine vollständige Aufstellung antimikrobieller Mittel zur spezifisch gerichteten Therapie ist in "The Medical Letter Handbook of Antimicrobial Therapy" (In "Pharmacotherapy: a Pathophysiologic Approach", Hrsg. DiPiro und Talbert et al., Verleger Elsevier New York, S.1100-1105 [1989]) zu finden.
- Der Begriff "Rheologie" und grammatikalische Abwandlungen davon, wie hierin verwendet, beziehen sich auf die Verformungs- und Fließeigenschaften einer Substanz. Bei einer viskoelastischen Substanz, wie Sputum, basieren die Fließeigenschaften auf der Viskosität und Elastizität.
- Es sind mehrere Arten von Rheometern verwendet worden, um die rheologischen Eigenschaften von Schleim zu untersuchen. Rotationsrheometer haben entweder einen Koaxialzylinder (Davis "Rheological Examination of Sputum and Saliva and the Effects of Drugs", in: Gabelnick HL, Litt M. (Hrsg.): "Rheology of Biological Systems", Springfield, II: Charles C.Thomas pub. S.158-193 [1973]), einen Konus und Platte (Mitchell-Heggs "Physical Properties of Microliter Quantities of Normal Mucus", in: Elstein und Parke (Hrsg.): "Mucus in Health and Disease. Advances in Experimental Medicine and Biology", Band 89. New York: Plenum Press, S.203-215 [1977]), oder ein Parallelscheiben-Sensorsystem (Puchelle Biorheology 21:265-272 [1984]). Diese Rheometer können mit einer konstanten Rotationsgeschwindigkeit oder in einem Oszillationsmodus verwendet werden. Diese Rheometer erfordern die Verwendung von Scherbeanspruchungen, die das 200-1.000fache der für Zillen geschätzten ausmachen. Diese hohen Scherraten lassen sich fast nicht mit in vivo-Bedingungen in Korrelation bringen.
- Beim Rheometer mit Konus und Platte wird das zu testende Fluid zwischen dem Konus und der Platte angeordnet. Eine dieser beiden Auflageplatten wird gedreht, wodurch eine als Scherrate bekannte Scherkraft ausgeübt wird. Je größer die Viskosität der Flüssigkeit, desto mehr Spannung entsteht darin und wird zu den oberen Auflageplatten geleitet und als Scherspannung gemessen. Die Viskosität wird dann als Verhältnis zwischen Scherspannung und Scherrate brechnet. Die prozentuelle Beanspruchung stellt die Oszillationsamplitude in Abstandseinheiten zwischen dem Konus und der Platte dar. Daher ist die Oszillationsamplitude umso geringer und wird die Sputumprobe umso weniger geschädigt, je geringer die prozentuelle Beanspruchung ist.
- Es sind magnetische Rheometer entwickelt worden, bei denen ferromagnetische Teilchen in Mikrometergröße verwendet wurden, die geringe Beanspruchung herbeiführen können, in etwa das 10-50fache der für Zilien geschätzten. Es besteht zwar eine bessere in vivo-Korrelation der mit dem Magnetrheometer erhaltenen Daten als der mit dem Rotationsrheometer erhaltenen, aber das Magnetrheometer ist experimentell komplex und eignet sich nicht für Routinetests. Außerdem erfordert die mathematische Analyse von Daten vom Magnetrheometer die Verwendung eines Digitalcomputers, was für die klinische Routineverwendung nicht geeignet ist.
- Kapillarrheometer sind verwendet worden, um die physiologische Fluidviskosität und Elastizität für kleine Proben zu messen. Die Viskosität wird gemessen, indem die Fluidströmungsrate als Reaktion auf einen bekannten Druckabfall ermittelt wird. Die erhaltbare Scherbelastung wird ermittelt, wenn dieser Differentialdruck auf zurückgeführt wird. Die Beanspruchungen, die ausgeübt werden, um bei diesen Instrumenten Fluidströmung in Kapillaren zu bewirken, machen etwa das 10.000fache jener aus, die geschätzterweise durch die Zilien erzeugt werden, und korrelieren daher nicht mit in vivo-Bedingungen (Yeates et al., oben).
- Das mechanische Freimachen der Atemwege erfolgt durch das Mukoziliartransportsystem, dessen Funktion hauptsächlich von der Wechselwirkung von zwei Hauptelementen abhängt: den Zilien, die dem Motorelement des Systems entsprechen, und dem Schleim, der das Transportelement darstellt. Sekrete werden durch die Aktivität der Zilien die Auskleidungsmembranen der Atemwegsdurchgänge entlang vorangetrieben. Der Schleim besteht aus einem zweischichtigen System: die untere nicht klebrige Schicht, die auch als Periziliar bezeichnet wird, und die obere viskoelastische Gelschicht. Puchelle ("Biorheology" 21:265-272 [1984]) berichtet, daß die Schleimtransportrate durch die Zillen mit steigender Viskosität der Periziliarschicht sinkt. Die erhöhte Viskosität und Elastizität von Atemwegsschleim bei Patienten, die an einer durch infektiöse Ausscheidungen der Atemwege gekennzeichneten Erkrankung der Atmungsorgane leiden, macht es für diese schwierig, ihre Atemwege von den Sekreten freizumachen, was zu Pulmonalinsuffizienz und Lungeninfektion beiträgt und zum Tod führen kann.
- Viskosität, die Fähigkeit eines Materials, Widerstand gegen Verformung zu leisten, ist die wichtigste Eigenschaft, die das Fließverhalten eines Fluids beeinflußt. Viskosität ist jene Eigenschaft eines Fluids oder Semifluids, das es ihm ermöglicht, ein Ausmaß an Scherspannung zu entwickeln und beizubehalten, das von der Strömungsgeschwindigkeit abhängt und der Strömung dann kontinuierlichen Widerstand entgegenzusetzen.
- Das Newtonsche Viskositätsgesetzt besagt, daß diese Kraft pro Flächeneinheit proportional zum Geschwindigkeitsgradienten zwischen den Schichten ist. Daher gilt τ = µY worin τ = Scherspannung, µ = Viskosität und Y = Scherrate. Fluide, die diesem Verhalten folgen, werden als Newtonsche Fluide beschrieben.
- Nicht-Newtonsche Fluide gehorchem dem Newtonschen Viskositätsgesetz nicht, sodaß die Viskosität von der Scherrate abhängt. Die Viskosität nimmt mit steigender Scherkraft ab. Die Scherung ist die Bewegung einer Schicht relativ zu jener einer benachbarten Schicht. Sputum ist ein Beispiel für ein Nicht-Newtonsches Fluid. Wenn eine Scherspannung auf Sputum ausgeübt wird, verhält es sich als Gel und verformt sich in etwa im Verhältnis zur ausgeübten Belastung. Die Scherbeanspruchung ist das Verhältnis zwischen der Distanz, um die sich die Oberfläche bewegt, verglichen mit der Tiefe der Sputumschicht, und sie ist daher dimensionslos. Elastizität bezieht sich auf die Fähigkeit von Sputum, Energie zu speichern oder gegen Verformung Widerstand zu leisten, wenn es Scherkräften ausgesetzt ist. Jene Fluids, die bei sehr geringer ausgeübter Spannung deutlich verformt werden, die aber dennoch zu ihrer ursprünglichen Gestalt zurückkehren, werden als hochelastisch bezeichnet. Sputumproben vor der rhDNase-Behandlung weisen mehr Elastizität als Viskosität auf, obwohl die Unterschiede nach der rhDNase-Behandlung im wesentlichen geringer sind. Die Elastizität wird durch die rhDNase-Behandlung stärker beeinflußt als die Viskosität, obwohl beide sich verringern. Die Elastizität ist nicht von der Gesamt-DNA- Konzentration abhängig. Es besteht jedoch eine Beziehung zwischen der Menge an DNA mit hohem Molekulargewicht und der gemessenen Elastizität.
- Die Eigenschaft der Viskoelastizität bezieht sich auf die verknüpifen Eigenschaften der Viskosität und der Elastizität, wie sie physiologische Fluide, einschließlich Sputum, aufweisen. Lethem et al. ("Eur.Respir.J." 3:19-23 [1990]) haben gezeigt, daß die CF- Sputum-Viskoelastizität nach exogener DNA-Zugabe zunimmt, und Picot et al., oben, zeigen, daß sich die Viskoelastizität von Sputum als vom Gesamt-DNA-Gehalt unabhängig herausstellte, aber mit der in vitro-Zugabe von nicht hydrolysierter langkettiger Kalbsthymus-DNA stark zunahm.
- Das prozentuelle Trockengewicht von Sputum ist ein Maß für den Prozentsatz an Feststoffen, die nach dem 2stündigen Trocknen der Sputumprobe bei 160ºC vorliegen. Das prozentuelle Trockengewicht wurde als 100 minus dem prozentuellen Gewichtsverlust nach dem Trocknen berechnet.
- Der Begriff "Sputum", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Auswurfmaterial aus Speichel und Abscheidungen von den Atemwegen. Sputum ist ein nicht-Newtonsches hochkomplexes Material, das über eine ausgeprägte gelartige Struktur verfügt. Sputum, das eitrig ist, weist erhöhte Viskoelastizität auf, die sowohl den Schleimglykoproteinen als auch der DNA zugeschrieben wird und ist durch die flüssigen Entzündungsprodukte, wie beispielsweise Leukozyten und die Bruchstücke abgestorbener Zellen, gekenn zeichnet. Die rheologischen Eigenschaften von eitrigem Sputum weisen ihnen eigene Unterschiede auf.
- Zum Sammeln von Sputum zur Verwendung beim Assay gemäß vorliegender Erfindung schlagen Byrne et al., ("Laboratory Tests: Implications for Nursing Care" 2. Auflg., Hrsg. Byrne et al., Verleger Addison-Wesley Kalifornien [1986]) vor, daß der Patient das durch mehrmaliges heftiges Husten hervorgebrachte Material in einem Behälter mit einem Deckel sammelt. Alternativ dazu kann Sputum unter Verwendung eines Bronchoscops gesammelt werden, wie in Kim et al., ("Bull.Europ.Physiopath.Resp." 18:915-926 [1982]) beschrieben.
- Zentrifugen werden verwendet, um Feststoffe von Flüssigkeiten oder eine Flüssigkeit von einer anderen zu isolieren. Zentrifugen werden auch verwendet, um das Absetzen einer leichten Phase von einer schweren Phase zu bewirken oder um suspendierte Feststoffe durch Vergrößerung der Schwerkraft zu filtrieren.
- Zentrifugen sind dazu konstruiert, das Prinzip auszunutzen, daß auf ein Objekt, das in einem fixen Radialabstand um einen Mittelpunkt rotiert, eine Kraft wirkt. Obwohl die Geschwindigkeit des Objektes konstant ist, ändert sich seine Richtung ständig, und eine Zentripetalkraft wirkt zum Rotationsmittelpunkt hin darauf ein.
- Zentrifugen bestehen im allgemeinen aus einem Rotor oder Behälter, in dem die Zentrifugalkraft auf ihre Komponenten ausgeübt wird, einem System zum Antreiben und Rotieren des Behälters um seine Achse, einem Rahmen zum Stützen des Systems und einer Umhüllung, um darin den Rotor zu enthalten und um die getrennten Produkte in einem diskreten Zustand zu halten.
- Bei industriellen Zentrifugen beträgt die Zentrifugalbeschleunigung ein Vielfaches der Gravitationsbeschleunigung. Die Zentrifugalkraft variiert mit der Rotationsgeschwindigkeit und mit dem Radialabstand vom Rotationsmittelpunkt.
- Gemäß vorliegender Erfindung betrug die minimale in vitro-rhDNase-Konzentration, die im Kompaktionsassay Aktivität zeigt, 1 µg rhDNase/ml Sputum. Unter Verwendung einer der üblichen rhDNase-Dosierungsformen, 0,25 mg/ml, und unter der Annahme, daß 0,5 ml der Formulierung tatsächlich an die Lungen abgegeben wird und daß das Sputumvolumen, über dem die rhDNase-Konzentration abgelagert wird, 100 ml beträgt, kann geschätzt werden, daß die Endkonzentration von rhDNase in vivo 1,25 µg/ml beträgt.
- Klinische Studien, bei denen 1 und 4 mg/ml rhDNase-Lösungen eingesetzt wurden, führt zu einer erhöhten Lungenfunktion bei CF-Patienten (Aitken et al., oben, und Hubbard et al., oben). Nach dem Inhalieren von 10 mg rhDNase lagen die rhDNase- Konzentration in Sputum, das eine Stunde nach dem Inhalieren abgenommen wurde, typischerweise im Bereich von 1-20 µg/ml. Das stimmt mit den in vitro-Daten überein und weist darauf hin, daß die rhDNase-Konzentration in der Formulierung ausreicht, um die Sputum-Viskoelastizität wirksam zu verringern. rhDNase-Konzentrationen über dem minimalen Schwellenwert werden vorgezogen, um Schwankungen der Sputum- Eigenschaften und Aerosolablagerung zu ermöglichen.
- Die Verwendung des Begriffs litherapeutikumtl, wie hierin verwendet, bezieht sich auf jene Mittel, die bei der Behandlung von Erkrankungen der Atmungsorgane, die mit infizierten Atemwegssekreten einhergehen, wirksam sind, und umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf Antibiotika, DNase, schleimlösende Mittel, Antineutrophilelastasemittel und Sekretionsleukoproteaseinhibitor.
- Weitere Details der Erfindung werden im folgenden nicht-einschränkenden Beispiel veranschaulicht.
- Dieses Beispiel zeigt, daß die in vitro-DNase-Behandlung von eitrigem Sputum von Patienten, die an einer durch infizierte Atemwegssekretion gekennzeichneten Erkrankung der Atmungsorgane leiden, die in den Proben vorhandene langkettige DNA hydrolysiert, wodurch die Viskosität des Sputum verringert wird. Dieses Beispiel zeigt, daß die Ergebnisse des Kompaktionsassay gemäß vorliegender Erfindung mit rheologischen Messungen, die vom Rheometer mit Platte und Konus erhalten wurden, korrelieren.
- Eitrige Sputumproben, die von in stationärer Behandlung befindlichen rhDNas-naiven CF-Patienten erhalten wurden, wurden zur DNA-Bewertung und rheologischen Analyse in Aliquante geteilt. Die Aliquanten fiir den Gesamt-DNA-Gehalt und die Länge wurden bis zur Analyse eingeforen, und jene für rheologische Messungen wurden bis zum Testen (innerhalb von 24 h nach der Abnahme) eingekühlt. Das Sputum-Trockengewicht wurde nach 2stündigem Trocknen bei 160ºC grav metrisch ermittelt. Das prozentuelle Trockengewicht wurde als 100 minus dem prozentuellen Gewichtsverlust nach dem Trocknen berechnet. Das Gen für DNase I wurde bei Genentech, Inc. kloniert und exprimiert, wie in Shak et al., oben, [1990] beschrieben. Die exprimierte rhDNase wurde als 4 mg/ml-Lösung in 1 mM CaCl&sub2; und 150 mM NaCl mit pH 7,4 verwendet. Bei Vergleichszugaben mit der Bezeichnung "Verdünnungsmittel" und Verdünnungen mit 4 mg/ml rhDNase wurde die gleiche Salzlösung ohne rhDNase verwendet.
- Der Sputumproben-DNA-Gehalt wurde mit einer Modifikation des von Kissane und Robins ("J.Biol.Chem." 233:184-188 [1958) entwickelten Diaminobenzoesäure(DABA)- Assays ermittelt, der die Gesamt-DNA-Konzentration unabhängig von der Länge quantifiziert. Zuvor eingefrorene Sputumaliquote wurden mit Verdünnungsmittel (25 mM HEPES, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 4 mM CaCl&sub2;, 4 mM MgCl&sub2;, 0,05% Polysorbat 20 und 0,01 % Thimerosal bei pH 7,5) auf das Zehnfache verdünnt und bei 60ºC 1 h lang inkubiert. Verdünnte Proben (50 pl) wurden in Mikrotiterplattennäpfe pipettiert, und 50 µl einer 20% igen 3,5-Diaminobenzoesäurehydrochlorid(DABA)- Lösung wurden zugegeben, woraufhin die Platten dicht verschlossen wurden. Nach einstündiger Inkubation bei 60ºC wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 µl 5M HCl unterbrochen. Ein Cytofluor (Millipore Corp.)-Mikrotiterplattenfluorometer (mit 390 nm Anregungs- und 530 nm-Emissionsfilter) wurde verwendet, um die Platten abzulesen. Lachshoden-DNA (Sigma) wurde verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen. Sputum-DNA-Konzentrationen von 0,125 bis 8 mg/ml waren meßbar. Der Variationskoeffizient für den Assay wurde mit ≤ 6% ermittelt.
- Die Länge der DNA in Sputum-Proben wurde qualitativ durch Agarosegelelektrophorese ermittelt, wie von Shak et al., oben, beschrieben. Die Wirkung des Einfrierens auf die Sputum-DNA-Länge wurde durch die Elektrophorese von Proben mit und ohe einen Gefrierzyklus bei -70ºC untersucht. Die Proben wurden in einem Puffer, der 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% SDS, 100 µg/ml Proteinase K (Sigma), 50 mM Tris, pH 8,0, enthielt, auf das Vierfache verdünnt und 3 h lang unter gelegentlichem Mischen bei 37ºC inkubiert. Die Proben wurden dann einer Elektrophorese in 0,5% Agarosegelen unterzogen und nach Standardverfahren (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2.Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press" [1989]) mit Ethidiumbromid gefärbt. Ein 1 Kb-DNA-Marker mit 12 Hauptbanden zwischen 500 bp und 12 Kb (Gibco/BRL 5615SA) wurde als Molekulargewichtsstandard verwendet.
- Rheologische Sputummessungen wurden bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines Rheometrics Fluid Rheometer (RFR-7800, Rheometrics Inc. Piscataway, NJ) mit einem 0,02 Radian, 25 mm Radius Konus-und-Platten-Gerät durchgeführt. Etwa 0,8 ml Sputum wurde auf einer Platte mit 25 µl Verdünnungsmittel angeordnet oder das Sputum mit rhDNase überschichtet. Der Konus wurde auf die Probe gesenkt, während sich die Bodenplatte langsam mit 5 UpM drehte, um die Probe langsam über den Spalt zwischen Konus und Platte zu verteilen. Trocknen des Probenrandes wurde durch Pipettieren von 0,1 Poise-Silikonöl (Dow Chemical) auf den freiliegenden Rand des Konus verhindert. Das Drehen der Platte wurde für 5 min unterbrochen, um das Entspannen der Probe zuzulassen. Jedes Präparat wurde mit einer Deformationsrate von 10 Radian/s getestet und die prozentuelle Belastung in Steigerungen um 10% von 100/bis 200% variiert. Die prozentuelle Belastung ist als das Hundertfache der Distanz der Scherbewegung dividiert durch den Raum zwischen dem Konus und der Platte des Viskometers defineirt. Dert zweite Belastungwert, 20% Belastung, wurde für die Vergleiche zwischen Proben und Behandlungen verwendet, weil es sich dabei um die geringstmögliche Belastung für präzise Messung handelt. Das Starten des Instruments umfaßt häufig den ersten Datenpunkt, und höhere Belastungen können die Netzwerkstrukturen schädigen (Ferry, "J.Viscoelastic Properties of Polymers", 3. Aufl. Hrsg. John Wiley and Sons, Inc, New York, S.245- [1980]), was zu Artefakten und irreproduzierbaren Daten führt.
- Etwa 100 µl Sputum wurden mit einer Verdrängerpipette (Gilson Microman ausgestattet mit einem Schaft aus rostfreiem Stahl und einem Kunststoffkolben) in ein gewogenes Eppendorf-Mikrozentrifugen röhrchen übertragen. Entweder rhDNase oder Vergleichsverdünnungsmittel wurden als Volumen, das 50% des exakten Sputum- Probengewichts entspricht, zugegeben. Die Eppendorf-Röhrchen wurden 15 s lang heftig gevortext und dann 15 min lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Aliquote des behandelten Sputum wurden in Kimax-51, 1,5-1,8x90 mm Schmelzpunktkapillarröhrchen (Kimble Products) eingebracht, wobei 50 µl-Drummond-Glaskapillarröhrchen (Microcaps) verwendet wurden. Die beladenen Röhren wurden 20 min lang mit 12.000 UpM in einer Biofuge A-Mikrozentrifuge (Heraeus Sepatech GmbH) zentrifugiert, die mit einem horizontalen Rotorkopf vom Hematokrittyp ausgerüstet war (Heraeus Sepatech), und die Überstand/Pellet-Grenzfläche daraufhin hinsichtlich ihrer Auflösung untersucht. Gelegentlich dauerte es bei manchen Proben bis zu weitere 20 min, um die Überstand-Pellet-Grenzfläche klar aufzulösen. In diesen Fällen wurden alle auf den Rotor geladenen Proben für eine längere Dauer zentrifugiert. Die Gesamthöhe des in die Kapillarröhrchen eingebrachten Materials und die Pellethöhe wurden in mm gemessen. Der Pelletprozentsatz wurde als Höhe des Pellets dividiert durch die Höhe des eingebrachten Gesamtmaterials, multipliziert mit 100, berechnet.
- Die als Funktion der Belastung mit dem dynamischen Viskosimeter mit Konus und Platte gemessenen Viskositäts- und Elastizitätswerte für eine repräsentative Sputumprobe werden in Fig. 4 gezeigt. Obwohl die Behandlung mit rhDNase die gemssenen Viskositätswerte über den getesteten Belastungsbereich veringerte, wurde die Elastizität stärker beeinflußt. Unter Verwendung der Elastizität als drastischeres rheologisches Kriterium für die rhDNase-Wirkungen von CF-Sputum wurden mehrere physikalische Eigenschaften von 6 eitrigen Proben bewertet und in Fig. 5 dargestellt. Die Gesamt- DNA-Konzentrationen, das durchschnittliche prozentuelle Trockengewicht, das Ansprechen auf rhDNase-Behandlung, bewertet durch dynamische Rheometrie mit Konus und Platte, und das Kompaktionsassay zeigten, daß alle 6 Proben einen beträchtlichen DNA-Gehalt aufweisen, aber unterschiedlich auf rhDNase-Behandlung ansprechen. In Übereinstimmung mit vorhergehenden Untersuchungen, Rosenbluth et al., oben, korrelliert das prozentuelle Trockengewicht der Sputumprobe weder mit der anfänglichen Elastizität noch der anfänglichen Viskosität.
- Das in Fig. 2 gezeigte Agarosegel zeigt, daß vor der rhDNase-Behandlung alle 6 Proben variable Mengen sehr großer DNA aufweisen. Ein Teil der DNA war zu groß, um in das Gel einzudringen, und wurde an der Aufgabestelle zurückgehalten. Kleinere DNA- Fragmente (die von etwa 500 bp bis mehr als 12 Kb variieren) konnten aufgelöst werden. Alle 6 Sputumproben zeigten nach der 20minütigen Inkubation bei 25ºC mit 36 µM rhDNase vollständige Hydrolyse (weniger als 500 bp).
- Die Gesamt-DNA wurde nach der Zugabe von Verdünnungsmittel und Zentrifugation im Kompaktionsassay in der Pelletfraktion in einem viel größeren Ausmaß detektiert als im Überstand dieser rhDNase-naiven Proben, wie in Fig. 6 gezeigt. Das Verhältnis der DNA-Verteilung zwischen Pellet und Überstand dieser rhDNase-naiven Proben zeigte einen weiten Bereich. Die Proben 4 und 6 hatten die größte Fraktion im Pellet, und das korrelierte mit der Agarosegelelektrophoreseuntersuchung (Fig. 2), was darauf hinweist, daß ebendiese zwei Proben den größten Prozentsatz an DNA mit großem Molekulargewicht aufweisen. Probe 3 hatte das nächstgrößte Peliet/Überstand-DNA- Verhältnis (Fig. 6) und qualitativ die nächsthöchste Menge an großer DNA (Fig. 2). Die Proben 1, 2 und 5 hatten die geringsten Pellet/Überstand-DNA-Verhältnisse und DNA mit offensichtlich kleinerer Größe.
- Nach der rhDNase-Behandlung zeigten alle 6 Proben eine Umverteilung der Gesamt- DNA vom Pellet zum Überstand nach der Kompaktion (Fig. 6). Diese Beobachtung stimmt mit den Agarosegeldaten (Fig. 2) überein, was eine drastische Reduktion der DNA-Größe für jede dieser Proben zeigt.
- Die prozentuellen Pellethöhen für die 6 CF-Sputumproben, die im Kompaktionsassay nach der Zugabe von entweder Verdünnungsmittel oder rhDNase erhalten wurden, werden in Fig. 3 gezeigt. Diese Daten (sowie Daten von anderen CF-Sputumproben) können mit Elastizitätsmessungen in Korrelation gebracht werden, die durch das dynamische Rheometer mit Konus und Platte (Fig. 8) erhalten wurden. Gemeinsam weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß der Kompaktionsassay ein nützlicher Indikator für die rhDNase-Wirkung auf eitriges CF-Sputum ist. Der Kompaktionsassay wurde verwendet, um eine Dosis-Reaktions-Kurve für die rhDNase-Wirkung auf eine CF- Sputumprobe (Fig. 7) zu erhalten. Diese Daten weisen darauf hin, daß rhDNase unter 0,1 µg/ml minimal wirksam und über 1 µg/ml im CF-Sputum maximal wirksam ist.
- Die obigen Ausführungen beziehen sich zwar auf besonders bevorzugte Ausführungsformen, es versteht sich jedoch, daß verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können.
- (i) ANMELDER: Genentech. Inc.
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Kompaktionsassay zur Beurteilung der Therapie von Erkrankungen der Atmungsorgane
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
- (iv) ANSCHRIFT:
- (A) NAME: Genentech. Inc.
- (B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
- (C) ORT: South San Francisco
- (D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
- (E) STAAT: USA
- (F) POSTLEITZAHL: 94080
- (v) COMPUTERLESBARE FORM:
- (A) MEDIUM TYPE: 5,25 Inch, 260 Kb Floppy Disk
- (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patin (Genentech)
- (vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
- (A) ANMELDUNGSNUMMER:
- (B) EINREICHDATUM:
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (vii) DATEN FRÜHERER ANMELDUNG(EN):
- (A) ANMELDUNGSNUMMER:
- (B) EINREICHDATUM:
- (viii) VERTRETER:
- (A) NAME: Johnston, Sean A.
- (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 35.910
- (C) DOCKET NUMBER: 792C1
- (ix) TELEKOMMUNIKATIONSNUMMERN:
- (A) TELEPHON: 415/225-3562
- (B) TELEFAX: 415/952-9881
- (C) TELEX: 910/371-7168
- (A) LÄNGE. 1039 Basen
- (B) TYP: Nukleinsäure
- (C) EINSTRANGIG/MEHRSTRANGIG: einstrangig
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.1:
Claims (22)
1. Verfahren zur Messung der Kompaktion einer Sputumprobe von einem
Säugetierpatienten, der an einer Erkrankung der Atmungsorgane leidet, die mit infizierten
Atemwegssekreten einhergeht, umfassend das Abnehmen einer Sputumprobe vom
Säugetierpatienten, das Zentrifugieren der Sputumprobe, bis sie in eine Überstand- und eine
Pelletphase fraktioniert ist, und das Messen des Pellets.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Sputumprobe vor dem Zentrifugieren
Verdünnungsmittel zugegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Verdünnungsmittel Wasser ist, das in einem
Volumen, das 50% des Gewichts des Sputums entspricht, zugegeben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Sputum des Säugetierpatienten von einem
Patienten mit cystischer Fibrose stammt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Sputum des Säugetierpatienten von einem
Patienten mit Lungenentzündung stammt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Sputum des Säugetierpatienten von einem
Patienten mit Bronchitis stammt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Sputum des Säugetierpatienten von einem
Patienten mit Nebenhöhleninfektion stammt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Säugetierpatient mit einem Therapeutikum
behandelt worden ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Säugetierpatient mit DNase behandelt worden
ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Säugetierpatient mit Brustphysiotherapie
behandelt worden ist.
11. Verfahren zur Messung der Kompaktion einer in vitro mit einem Therapeutikum
behandelten Säugetierpatienten-Sputumprobe, umfassend das Abnehmen einer
Sputumprobe vom Säugetierpatienten, das Zugeben von Therapeutikum zur Sputumprobe, das
Zentrifugieren der Sputumprobe, bis sie in eine Überstand und eine Pelletphase
fraktioniert worden ist, und das Messen des Pellets.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Säugetierpatienten-Sputum von einem
Patienten mit einer Erkrankung der Atmungsorgane, die mit infizierten
Atemwegssekreten einhergeht, stammt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Erkrankung der Atmungsorgane cystische
Fibrose ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Erkrankung der Atmungsorgane Bronchitis
ist.
15. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Erkrankung der Atmungsorgane
Lungenentzündung ist.
16. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Therapeutikum rhDNase ist.
17. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Therapeutikum ein Antibiotikum ist, das bei
der Behandlung einer Erkrankung der Atmungsorgane nützlich ist.
18. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Therapeutikum in einem Volumen, das
50% des Probengewichts des Sputums entspricht, zugegeben wird.
19. Verfahren zur Bestimmung der Kompaktion einer mit DNase behandelten
Sputumprobe von einem Säugetierpatienten, der DNase-Therapie benötigt, umfassend
das Abnehmen der Sputumprobe vom Säugetierpatienten, das Zugeben von DNase zur
Sputumprobe, das Zentrifugieren des mit DNase behandelten Sputum, bis es in eine
Überstand- und eine Pelletphase fraktion iert ist, und das Messen des Pellets.
20. Verfahren nach Anspruch 19, worin der Säugetierpatient ein Mensch ist und die
DNase rekombinante menschliche DNase I (rhDNase I) ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19, worin die rekombinante menschliche DNase I in einer
Konzentration von zumindest 1 µg rhDNase l/ml Sputum vorliegt.
22. Verfahren nach Anspruch 19, worin die DNase in einem Volumen, das 50% des
Gewichts des Sputums entspricht, zugegeben wird.
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Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US3914985A (en) * | 1974-03-29 | 1975-10-28 | American Hospital Supply Corp | Centrifuging device and method |
| US4072045A (en) * | 1976-09-10 | 1978-02-07 | Ovutime, Inc. | Viscometer for indicating rheological properties of fluids having high and low viscosity components |
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Also Published As
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