DE69303822T2

DE69303822T2 - Herpes simplex virus 1 ul13-genprodukt: verfahren

Info

Publication number: DE69303822T2
Application number: DE69303822T
Authority: DE
Inventors: Frances Purves; Bernard Roizman
Original assignee: Arch Development Corp
Current assignee: Arch Development Corp
Priority date: 1992-08-18
Filing date: 1993-08-12
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: DE69303822D1; US5334498A; WO1994004920A1; JPH08500185A; ATE140793T1; AU5005293A; US20020015944A1; EP0656113B1; EP0656113A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Genprodukts eines Herpes simplex-Virus-UL13-Gens in einem Test zum Screening von Substanzen auf ihre anti-Herpes simplex-Virus-Aktivität.
Das Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1)-Genom kodiert für mindestens 76 Gene (McGeoch et al., 1985; Chou et al., 1986; McGeoch et al., 1988; Liu et al., 1991; Barker et al., 1992). Da drei der Gene innerhalb von Wiederholungsseguenzen enthalten sind, kodiert das Genom für mindestens 73 Polypeptide. Die 76 Gene umfassen mehrere Gruppen mit der Bezeichnung α, β und γ, deren Expression in koordinierter Weise und in sequentieller Anordnung in der Art einer Kaskade reguliert wird (Honess et al., 1974). Für die letzten beiden Dekaden wurden im vorliegenden Laboratorium die Mechanismen untersucht, nach denen HSV-1 die Expression und Funktion seiner Gene reguliert. Im Verlauf dieser Untersuchungen wiesen wir nach, daß (i) die Initiation der Transkription von viralen Genen durch eine strukturelle Komponente des Virions induziert wird (Post et al., 1981; Batterson et al., 1983), daß (ii) regulatorische Proteine, die durch dieses Verfahren induziert werden, phosphoryliert sind (Pereira et al., 1977; Marsden et al., 1978) und daß (iii) die Bindung dieser Proteine an DNA durch Phosphorylierung beeinflußt wird (Wilcox et al., 1980). Da von Protein-kinasen (PK) bekannt ist, daß sie die Funktion von regulatorischen Proteinen beeinflussen, versuchten wir, die Substrate von viralen PKS zu identifizieren und ihre Funktion aufzuklären.
Sowohl HSV-1-US3- als auch UL13-Genprodukte enthalten Motive, die bekannten Protein-kinasen gemeinsam sind (Mogeoch et al., 1985; McGeoch et al., 1988; McGeoch et al., 1986; Smith et al., 1989). Ein endgültiger Beweis der US3-PK-Aktivität ergab sich aus den Beobachtungen, daß (i) die neue Enzymaktivität, die in mit Wildtyp-Virus infizierten Zellen nachgewiesen wurde, bei nicht-infizierten Zellen und Zellen, die mit einer Mutante, aus der das US3-Gen deletiert worden war, infiziert waren, fehlte (Purves et al., 1986; Frame et al., 1987) und daß (ii) ein Antikörper, der gegen ein synthetisches US3-Oligopeptid mit 8 C-terminalen Aminosäuren gebildet worden war, mit gereinigten Präparaten des Enzyms reagierte (Frame et al., 1967). Kürzlich zeigten wir, daß es sich beim wichtigsten Ziel von US3-PK um ein essentielles, nicht-glycosyliertes Membranprotein handelt, das durch ein stark konserviertes Herpes-Virus-Gen, UL34, kodiert wird (Purves et al., 1991; Purves et al., 1992). In Abwesenheit von US3 assoziiert das nicht-phosphorylierte UL34-Protein mit mehreren phosphorylierten Proteinen, was in mit Wildtyp-Virus infizierten Zellen nicht nachweisbar ist. Gleichzeitig wurde gezeigt, daß das US11-Protein als Antiterminator der Transkription von UL34 wirken kann, da sich (i) erhebliche Mengen einer gekürzten UL34-mRNA in mit einem US11&supmin;-Virus infizierten Zellen anreichern und da (ii) das US11-Protein an UL34-mRNA unmittelbar in 5'-Stellung zur Kürzungsstelle bindet (Roller et al., 1991). Obgleich die Funktionen des UL34-Proteins unbekannt bleiben, spricht die Regulierung seiner Synthese und Expression, die von den Aktivitäten des US11- und US3-Proteins abgeleitet ist, für seine Rolle beim Reproduktionszyklus des Virus. Sehr wenig ist bekannt, über die Zielstellen von UL13-PK. Um die Rolle von UL13 bei der Prozessierung des UL34-Proteins zu untersuchen, konstruierten wir virale Mutanten mit einem Mangel entweder am UL13-Gen oder mit einem Mangel sowohl am UL13- als auch am US3-Gen. Wir stellen fest, daß ein Substrat von UL13-PK das Produkt des regulatonschen Gens, α22, ist.
Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz in bezug auf ihr anti-Herpes simplex-Virus-Wirkungsvermägen, umfassend folgende Stufen:
(a) Herstellen eines Modellsystems für die Phosphorylierung eines Substrats des Herpes simplex-Virus- UL13-Genprodukts;
(b) Auswählen einer Substanz, für die eine anti-Herpes simplex-Virus- Aktivität angenommen wird; und
(c) Testen der Fähigkeit dieser Substanz, die Phosphorylierung des Substrats und somit die anti-Herpes simplex-Virus-Aktivität in diesem Modelisystem zu modulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einem in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Substrat um Protein 0 von mit Herpes simplex-Virus infizierten Zellen, um Protein 22 von mit Herpes sirnplex-Virus infizierten Zellen, um Herpes simplex-Virus-US11-Genprodukt, um Herpes simplex-Virus-UL26-Genprodukt, um Herpes simplex-Virus- UL26. 5-Genprodukt oder um Herpes simplex-Virus-UL47-Genprodukt.
Ein Modeilsystem zur Phosphorylierung eines derartigen Substrats enthält vorzugsweise eine wirksame katalytische Menge eines Herpes simplex- Virus-UL13 -Genprodukts.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein derartiges Modellsystem hergestellt, indem man ein Gemisch durch Umsetzung einer wirksamen katalytischen Menge von Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt mit einer wirksamen Menge eines Substrats bildet, dessen Phosphorylierung durch das Herpes simplex-Virus UL13-Genprodukt in einem flüssigen Medium mit einem Gehalt an einem Phosphatdonor katalysiert wird.
Nachstehend wird die der Beschreibung beigefügte Zeichnung näher erläutert.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der DNA-Sequenzanordnungen des HSV-1-Genoms von Deletionsmutanten. Die obere Zeile zeigt das Genom von HSV-1 (F)Δ305, von dem etwa 500 bp des Thymidin-kinase (tk)-Gens deletiert worden sind (Post et al., 1961). Die Rechtecke stellen die invertierten Wiederholungen dar, die die besonderen Sequenzen (dünne Linien) der langen und kurzen Komponenten flankieren. Die Position des tk-Gens ist markiert (TK) . Zeile 1: Relevante Restriktionsenzymstellen, die in den in Zeile 4 gezeigten UL12-14-Genen vorhanden sind. Zeilen 2 und 3: Die EcoRV-P- bzw. BglII-O-Fragmente. Zeile 5: Das 561 Aminosäuren-UL13 Gen mit Protein-kinase-Motiven zwischen den BstEII- und HindIII-Spaltungsstellen, deren Position durch das schraffierte Rechteck dargestellt ist. Zeile 6: Das UL13-Gen von R7350- und R7354-Viren. In diese Rekombinanten wurde ein α27-tk-chimäres Gen von pRB3968 in die BstEII-Stelle des 2691-bp-EcoRV-P-Fragments, das in die Smai-Stelle von pGEM3z in PRB6 geklont war, inseriert. Das erhaltene Plasmid pRB4435 wurde mit intakten R7040- oder HSV-1(F)Δ305-DNAs in Kaninchen-Hautzellen kotransfektiert und tk&spplus;-Nachkommenviren wurden in 143TK&supmin;-Zellen gemäß den Angaben von Post et al., 1981, selektiert und als R70 bzw. R7354 bezeichnet (Tabelle 1). Der rekombinante Virus R7350 weist auch die Deletion im US3- Gen auf, die früher beschrieben wurde (Longnecker et al., 1987) und in Zeile 12 dargestellt ist. Zeile 7: Schematische Darstellung der Sequenzen, ausgehend von der HindIII-Stelle (Aminosäure 155) zur BstEII-Stelle (Aminosäure 412), deletiert aus dem UL13-Gen. Zeile 8: Die DNA-Anordnung der rekombinanten Viren R7352, R7357 und R7358, bei denen die UL13-Sequenzen, die durch die Insertion aufgebrochen oder die deletiert worden waren, durch Marker-Rescue mit dem Msci-Kpni-Fragment wiederhergestellt worden waren. Somit wurde das 2223 bp-Kpni-Msci-Fragment von pRB4004 mit dem HSV-1-BglII-O ausgeschnitten und in die EcoRV-Stelle von PGEMSZ unter Bildung des Plasmids pRB4437 geklont. Die pRB4437-DNA wurde mit HindIII und BstEII gespalten, mit T4-Polymerase stumpfendig gemacht und unter Bildung von pRB4439 religiert. Rekombinante R7351 und R7355 wurden durch Kotransfektion von R7350- oder R7054-viraler DNA mit dem Plasrnid pRB4439 unter anschließender Selektion der tk -Nachkommen gemäß den Angaben von Post et al., 1981, konstruiert. Die Entfernung des HINDIII-BstEII-Fragments deletierte 45% der UL13-Codons (Aminosäuren 155 bis 412 unter Einschluß der vorhergesagten konservierten PK-Motive) . Die Rekombinanten R7352, R7357 und R7358 wurden durch Marker-Rescue von rekombinanten Viren R7351, R7350 bzw. R7354 konstruiert. Das Plasmid pRB4437 wurde mit intakten viralen DNAs kotransfektiert, und die Nachkommen wurden auf tk&supmin; selektiert (R7357 und R7358) . Die Nachkommen der einzelnen Plaques wurden auf die Anwesenheit eines intakten 5,2 kbp-BglII-O-Fragments geprüft. Zeile 9: Bereiche der entsprechenden BamHI-Fragmente, die die Gene US1 (α22) , US2, US3 (PK), US4 (Glycoprotein G) und US5, die in Zeile 10 dargestellt sind, enthalten. Zeile 11: Das 481 Aminosäuren-US3-Gen mit konservierten Protein-kinase-Motiven, die durch das schraffierte Rechteck wiedergegeben sind. Zeile 12: Schematische Darstellung der US3-Sequenzen von der PstI-Stelle bei Aminosäure 69 zur BamHI-Stelle bei Aminosäure 357, deletiert aus R7040-, R7041-, R7350- und R7351-Viren. Zeile 13: Darstellung der Region von R7306, in der die deletierten US3-PK-Sequenzen von R7041 durch Marker-Rescue wiederhergestellt worden sind.
Fig. 2 zeigt autoradiographische Abbildungen von BglII-Verdauungsprodukten von rekombinanten viralen DNAs. Virale DNAs wurden aus NaI-Gradienten gemäß früheren Angaben (Walboomers et al., 1976) hergestellt, mit BglII verdaut, elektrophoretisch an 0,8% Agarosegelen aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Membranen übertragen und mit radioaktiv markiertem pRB4004, das das HSV-1(F)-BglII-O-Fragment enthielt, hybridisiert. Die Bande mit der Bezeichnung 5,2 kbp stellt das Wildtyp-BglII-O-Fragment dar, das in den rekombinanten Viren HSV-1(F)Δ305 und R7040 (ΔUS3) vorhanden ist. Die 6,7 kb-Bande stellt das BglII-O-Fragment mit einem Gehalt an dem α27-tk-Gen im UL13-Gen in rekombinanten Viren R7350 (ΔUS3, UL13i) und R7354 (UL13i) dar. Die 4,4 kb-Banden, die in den rekombinanten Viren R7351 (ΔUS3, ΔUL13) und R7355 (ΔUL13) nachgewiesen wurden, stellen das BglII-O-Fragment dieser Viren mit einer 773 bp-Deletion im ΔUL13-Gen dar.
Fig. 3 zeigt autoradiographische und photographische Aufnahmen von elektrophoretisch getrennten Phosphoproteinen aus infizierten HEp-2-Zellkernen: Das Feld A zeigt das ³²P-markierte Phosphoproteinprofil von Kernextrakten von infizierten Hep-2-Zellen, die elektrophoretisch in denaturierenden 8,5% Acrylamidgelen getrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit monoklonalem Antikörper (Q1) gegen alkalische Exonudease umgesetzt worden waren, wie in Feld B gezeigt ist. Der Pfeil gibt die mit ICP18 bezeichnete 85 000 Mr-alkalische Exonudease an. Die blasse, rascher wandernde Spezies, die mit dem Antikörper reagiert, wurde vorher als Abbauprodukt von alkalischer Exonudease identifiziert. Zur Herstellung von Kernextrakten wurden infizierte, markierte HEp-2-Zellmonolayers mit PBS-A gewaschen, durch Schaben in PBS-A gebracht und durch Zentrifugieren pelletisiert. Die Zellen wurden mit PBS-A mit einem Gehalt an 0,5% NP40 aufgebrochen, und die Kerne wurden durch Zentrifugation pelletisiert, mit PBS-A mit einem Gehalt an 0,1% NP40 gewaschen, 30 Minuten bei 4ºC in einem Puffer (SO mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,42 M NaCl, 25% Glycerin, 10% Saccharose, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP40, 0,1 M KCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) extrahiert, durch Zentrifugation geklärt und bei -70ºC gelagert. Die Verfahren zur elektrophoretischen Trennung in denaturierenden 8,5% oder 10% Polyacrylamidgelen, zur elektrischen Übertragung auf Nitrocellulose und zur Färbung mit für HSV-1(F)-Proteine spezifischen Antikörpern und/oder zur Autoradiographie entsprechen den früheren Angaben (Purves et al., 1991; Purves et al., 1992).
Fig. 4 zeigt autoradiographische Abbildungen von elektrophoretisch ³²P- und ³&sup5;S-markierten Lysaten von infizierten BHK-Zellen. Die Verfahren zur Infektion, radioaktiven Markierung und Herstellung der Zellysate entsprechen den früheren Angaben (Purves et al., 1991; Purves et al., 1992). Feld A: Autoradiogramm von ³²P-markierten Proteinen, getrennt in denaturierenden Gelen mit einem Gehalt an 10% Acrylamid. Die geschlossenen Kreise zeigen die erhöhten Mengen des 70 kd-Phosphoproteins, das in Lysaten von mit den UL13i- oder ΔUL13-Viren infizierten BHK-Zellen beobachtet wurde. Die Buchstaben a-d geben die vier neuen Phosphoproteine an, die in mit ΔUS3-Viren infizierten Zellen vorhanden sind. Das ausgefüllte Quadrat zeigt die Position des UL34-Proteins. Die Molekulargewichtsstandards sind angegeben. Feld B: Autoradiogramm von mit ³&sup5;S-Methionin markierten Proteinen, getrennt auf die vorstehend beschriebene Weise. Die Positionen von bekannten ICPs sind angegeben.
Fig. 5 zeigt photographische und autoradiographische Aufnahmen von elektrophoretisch getrennten, mit³²P-markierten und mit ³&sup5;S-Methionin markierten Lysaten von infizierten Zellen. Feld A: Photographie von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung in 8,5% denaturierenden Acrylamidgelen, Übertragung auf Nitrocellulose und zunächst Umsetzung mit polyklonalem R77-Antiserum mit Spezifität für ICP22 und anschließend mit monoklonalem Antikörper H1117 gegen ICP27 als eine Kontrolle für gleiche Infektivität. Die fünf Formen des ICP22-Proteins sind in den Bahnen 2 und 20 angegeben. Die Position von ICP27 ist durch den einzelnen Pfeil in Feld A angegeben. Das Feld B zeigt das entsprechende Autoradiogramm. Bei den Bahnen 1-12 handelt es sich um getrennte infizierte Zellproteine nach Markierung mit ³²P Bei den Bahnen 13-20 handelt es sich um getrennte infizierte Zellproteine nach Markierung mit ³&sup5;S-Methionin. Bekannte ICPs sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Ein Mr-67 000-Marker ist enthalten.
Fig. 6 zeigt autoradiographische und photographische Aufnahmen von ³²P-markierten Kernextrakten von infizierten HEp-2-Zellen. Feld A: Autoradiogramm von ³²P-markierten Kernextraktproteinen nach Trennung in denaturierenden Gelen mit einem Gehalt an 8,5% Acrylamid. Feld B: Photographie des entsprechenden Gels von Feld A nach Übertragung auf Nitrocellulose und Umsetzung mit polyklonalem Antiserum R77 gegen ICP22. Feld C: Die Bahnen 16-22 stellen eine geringere Exposition der gleichen HEp-2- Kernextrakte von ³²P-markierten Proteinen nach Infektion mit den angegebenen Viren, wie in Feld A gezeigt, dar. Die Präparation von markiertem Kernextrakt ist in der Anmerkung zu Fig. 3 beschrieben. Kernextraktproteine wurden in einem 8,5% Polyacrylamidgel getrennt. Die Bahnen 23-27 zeigen HEp-2-Kernextrakte, die mit γ³²P-ATP in Gegenwart von 1 M NaCl in vitro markiert worden sind. Die fünf Formen von ICP22 sind mit den Ziffern 1-5 bezeichnet. Die Positionen von ICP18 (alkalische Exonudease: Mr 85 000), ICP25 (αTIF, Mr 65 000) , ICP27 (Mr 63 000) und von UL34 (M&sub3; 30 000)-Protein, dargestellt durch das Quadrat, sind angegeben. Die Buchstaben U, T, S, R und Q in Feld C kennzeichnen das Phosphoprotein von Kernextrakten von infizierten HEp-2-Zellen nach in vitro-Markierung mit γ³²P- ATP. Etwa 2 µg Kernextrakt wurden in 50 µl Kinase-Puffer mit einem Gehalt an 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 0,1% NP40, SO mM KCl, 20 mM MgCl&sub2;, 30 mM MgAc, 1 mM Dithiothreit und 5 µCi γ³²P-ATP suspendiert und 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Denaturierung mit Natriumdodecylsulfat beendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz in bezug auf ihr anti-Herpes simplex-Virus-Wirkungsvermögen bereit. Ein derartiges Verfahren umfaßt folgende Stufen:
(a) Herstellen eines Modellsystems für die Phosphorylierung eines Substrats des Herpes simplex-Virus UL13-Genprodukts;
(b) Auswählen einer Substanz, für die eine anti-Herpes simplex-Virus- Aktivität angenommen wird; und
(c) Testen der Fähigkeit dieser Substanz, die Phosphorylierung des Substrats und somit die anti-Herpes simplex-Virus-Aktivität in diesem Modellsystem zu modulieren.
Das Expressionsprodukt von Herpes simplex-Virus-Gen UL13 katalysiert die Übertragung eines Phosphatrestes von einem Phosphatdonor auf ein Substrat. Dies bedeutet, daß das UL13-Genprodukt als Protein-kinase wirkt.
Zu Substraten für die UL13-Genprodukt-Protein-kinase gehören eine Anzahl von Proteinen, die in mit Herpes simplex-Virus infizierten Zellen auftreten, sowie Proteinprodukte einer speziellen Herpes simplex-Genexpression. Beispielhafte und bevorzugte infizierte Zellprotein (ICP)-Substrate werden mit ICP0 und ICP22 bezeichnet. ICP22 ist ein Genprodukt des Herpes simplex-Virus-Regulatorgens α22. ICP22 wird hier auch als α22-Protein bezeichnet.
Beispielhafte und bevorzugte Genprodukt-Substrate sind die Genprodukte von Herpes simplex-Virus-US11-Gen, Herpes simplex-Virus-UL26-Gen, Herpes simplex-Virus-UL26.5-Gen oder Herpes simplex-Virus-UL47-Gen.
Das Herpes simplex-Virus UL26-Genprodukt wirkt als ein Protease-Enzym. Vom Herpes simplex-Virus-UL26.5-Genprodukt wird angenommen, daß es ein Substrat für diese Protease darstellt. Das Herpes simplex-Virus US11- Genprodukt wirkt als antiterminierendes Mittel für die Transkription des UL34-Gens.
Zumindest einige der Substrate der UL13-Genprodukt-Kinase-Aktivität spielen eine Rolle bei der viralen Replikation und treten spät bei der viralen Infektion auf. Wo eine Infektion mit einem Virus mit einem Mangel an der UL13-Genproduktexpression erfolgt, wird die virale Replikation gehemmt. Diese Substratmoleküle sind verändert (ICP22, das UL47-Genprodukt) oder in ihrer Menge erheblich verringert (die US11-, UL26-, UL26.5-Genprodukte).
Gemäß diesen Beobachtungen umfaßt ein Modellsystem zur Untersuchung der Phosphorylierung der UL13-Genproduktsubstrate vorzugsweise eine wirksame katalytische Menge von Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein derartiges Modellsystem hergestellt, indem man ein Gemisch durch Umsetzung einer wirksamen katalytischen Menge von Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt mit einer wirksamen Menge eines Substrats umsetzt, dessen Phosphorylierung durch das Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt in einem flüssigen Medium mit einem Gehalt an einem Phosphatdonor katalysiert wird.
Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt wird vorzugsweise aus Zellen oder Organismen, die mit dem Virus infiziert sind, erhalten. Mittel zur Isolierung und Reinigung von Produkten der viralen Genexpression in infizierten Zellen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ein geeignetes Substrat zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich ebenfalls aus infizierten Zellen erhalten.
Die nachstehenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen die Beschreibung und die Ansprüche in keiner Weise beschränken.

Beispiel 1

Das Herpes simplex-Virus 1-UL13-Gen kodiert für die posttranslationale Prozessierung, die mit der Phosphorylierung des regulatorischen Proteins α22 assoziiert ist.

Materialien und Methoden

Zellen und Viren

Sämtliche Zellinien wurden von ATCC bezogen. Die Ableitung der in dieser Untersuchung verwendeten Viren entspricht den Angaben in Tabelle 1.

Tabelle 1 Phänotyp und Genotyp van in dieser Untersuchung verwendeten HSV-1- Mutanten

aΔ:Das Gen enthält eine Deletion; i: durch Insertion von a27-tk-Gen mutagenisiertes Gen; R: Wildtypsequenzen in der Mutante wiederhergestellt.

Ergebnisse

Das UL13-Gen ist in der Zellkultur nicht-essentiell.

Die Konstruktionen und Genotypen der rekombinanten Viren R7350, R7351, R7354 und R7355 (Einzelheiten in Fig. 1 und in der Erklärung hierzu) entsprechen den früheren Angaben (Post et al., 1981) und beinhalten die Selektion von rekombinanten Viren mit einem Gehalt an einem chimären α27-tk-Gen, das im oder in der Nähe des Zielgens inseriert ist, gefolgt von einer Selektion der Rekombinante, aus der sowohl das tk-Gen als auch die Zielsequenzen deletiert sind. Die Verifizierung der Struktur der gentechnisch bearbeiteten Viren erfolgte durch Southern-Analyse (E. M. Southern, 1975), dargestellt in Fig. 2. Um sich gegen die Einführung von zufälligen Mutationen zu schützen, schlossen die Tests mit (R) bezeichnete Viren ein, bei denen die deletierten Sequenzen durch Marker-Rescue mit einem kleinen Fragment wiederhergestellt wurden. Sämtliche vier rekombinanten Viren replizierten auf Kaninchenhaut, 143 TK&supmin;-, HEp-2-, Veround BHK-Zellen. Während der Konstruktion der rekombinanten Viren wurde jedoch festgestellt, daß Viren mit einer Deletion des UL13-Gens (ΔUL13) weniger Plaques ergaben, die auch eine geringere Größe als die des Wildtyp-Virus aufwiesen, eine Eigenschaft, die sie mit Mutanten im UL12-Gen, das für alkalische Exonudease kodiert, gemeinsam haben (Weller et al., 1990). Diese Eigenschaften sind nicht auf eine Deletion oder auf eine Verringerung der Menge des UL12-Genprodukts zurückzuführen, da UL13&supmin;-Mutanten Mengen an alkalischer Exonudease bildeten, die mit den Mengen von Wildtyp-Viren vergleichbar waren (Fig. 3). Die Behinderung des Wachstums und der Plaquebildung war auf die Deletion oder Inaktivierung des UL13- Gens zurückzuführen, da der Wildtyp-pHänotyp durch Marker-Rescue des Gens wieder hergestellt wurde. Wir ziehen den Schluß, daß das UL13-Gen entweder in Zellkultur in Gegenwart oder in Abwesenheit des US3-Gens nicht essentiell ist, daß aber die virale Replikation in signifikanter Weise bei einigen Zellinien in Abwesenheit des UL13-Proteins beeinträchtigt werden kann.

Die neuen Phosphoproteine, die in mit den ΔUS3-Viren infizierten Zellen vorhanden sind, sind nicht vom UL13-Genprodukt abhängig.

Von den vier Phosphoproteinen (in Fig. 4 mit a-d bezeichnet) wurde anderweitig (Purves et al., 1992) gezeigt, daß sie in ³²P-markierten Lysaten von BHK-Zellen, die mit rekombinanten Viren, in denen entweder das US3-Gen deletiert worden war oder die ortsspezifische Mutationen in der PK-Zielstelle des UL34-Proteins enthielten, infiziert waren, vorhanden waren und mit UL34-Protein assoziiert waren. Um festzustellen, ob diese Proteine durch UL13 phosphoryliert werden, jedoch nur wenn das UL34-Protein zum Abschalten von UL13 inkompetent ist, untersuchten wir die Phosphoproteine in Zellen, die mit einfachen Mutanten (ΔUL13) oder doppelten Mutanten (ΔUL11, ΔUS3) infiziert waren. Wie in Fig. 4, Bahnen 3, 5 und 6 dargestellt ist, war die Tetrade (a, b, c und d) von neuen Phosphoproteinen in mit sämtlichen ΔUS3-Viren infizierten Zellen vorhanden, unabhängig davon, ob das UL13-Gen vorhanden, deletiert (ΔUL13) oder durch Insertion aufgebrochen war (UL13i) Diese Ergebnisse stützen nicht die Hypothese, daß das UL13-Genprodukt an der Assozuerung der neuen Phosphoproteine mit der unphosphorylierten Form des UL34-Proteins beteiligt ist.

Eine Disruption oder Deletion des UL13-offenen Leserasters verändert die posttranslationale Modifikation des α22-Proteins in vivo.

Wie in Fig. 4, Feld A gezeigt, enthielten Lysate von BHK-Zellen, die mit ΔUL13- oder UL13i-Viren infiziert waren, eine bedeutende ³²P-markierte Bande, die mit einem scheinbaren Mr-Wert von 70 000 wanderte (angegeben durch den geschlossenen Kreis) . Das Auftreten dieser Bande korrelierte nicht mit Deletionen im US3-Gen. Weitere Untersuchungen der Lysate von BHK-Zellen (Fig. 5, Feld B, Spuren 1-12) oder von Kernextrakten von HEp-2-Zellen (Fig. 6, Feld A, Bahnen 1-8) ergaben fünf Phosphoprotein-Spezies im Mr-Bereich von 70 000 bis 82 000 (identifiziert in Fig. 5, Bahn 2 und Fig. 6, Bahn 2, mit den Nummern 1-5), deren Abwesenheit, Anwesenheit und Menge in konsistenter Weise mit dem Zustand des UL13-Gens korrelierte. Speziell trat in Zellysaten oder Kernextrakten von Zellen, die mit ΔUL13- oder UL13i-Rekombinanten infiziert waren, das Mr 70 000-Phosphoprotein (Nr. 5) entweder in hyperphosphorylierter Form auf oder es war in erhöhten Mengen vorhanden, während die höheren Mr-Phosphoproteine (Nr. 1-3) offensichtlich entweder abwesend oder hypophosphoryliert waren (Fig. 5, Feld B, Bahnen 5-8; Fig. 6, Feld A, Bahnen 5-8). Da eine Wiederherstellung der UL13-Sequenzen den Wildtyp-pHänotyp sowohl in BHK-Zellen (Fig. 5, Feld B, Spuren 9-11) als auch in HEp-2-Zellen (Daten nicht dargestellt) wiederherstellten, spiegelte der beobachtete phänotyp den UL13-Genotyp wider.
Um festzustellen, ob die mit den Ziffern 1-5 bezeichneten phosphorylierten Proteine bekannten viralen Phosphoproteinen entsprechen, wurden elektrophoretisch aufgetrennte Lysate von infizierten Zellen elektrisch auf eine Nitrocellulosefolie übertragen und mit Antikörpern gegen ICP27 (H1117), αTIF (LP1), ICP22 (R77) und alkalische Exonudease (Q1) umgesetzt (Ackermann et al., 1984; Ackermann et al., 1985; Banks et al., 1985). Die Ergebnisse (Fig. 5, Feld A und Fig. 6, Feld B) zeigen, daß die Phosphoproteine 1-5 zusammen mit posttranslational modifizierten Formen von ICP22 wandern. Ein schlüssiger Beweis der Identität dieser Proteine beruht auf der Abwesenheit dieser Banden in mit R325 infizierten Zellen (Fig. 5, Felder A und B, Spur 12), einem rekombinanten Virus, aus dem ein Bereich des α22-Gens deletiert worden war (Post et al., 1981). Als eine Kontrolle für gleiche Infektivität wurde auch das gleiche Immunoblot (Fig. 5, Feld A) mit monoklonalem Antikörper gegen ICP27 umgesetzt. In mit UL13&supmin;-Virus infizierten BHK-Zellen (Fig. 5, Feld A, Spuren s-e, 15-16), war der Großteil des ICP22 als ein Mr-70 000-Protein (Nr. 5) vorhanden, und nur ein geringer Anteil wanderte zusammen mit der Bande Nr. 4. Ein ähnliches Muster ergibt sich in Kernextrakten von mit UL13&supmin;-Viren infizierten HEp-2-Zellen (Fig. 6, Feld B, vgl. Spuren 9-11 mit 12-15), mit der Ausnahme, daß Spuren der Spezies mit höherem Molekulargewicht (Nr. 2 und 3) vorhanden waren. Wir ziehen den Schluß, daß das UL13-Genprodukt die posttranslationale Prozessierung, die mit einer Phosphorylierung von ICP22 assoziiert ist, zu der Spezies mit scheinbar höherem Molekulargewicht (Banden Nr. 1-4) vermittelt.

Die Phosphoprotein-Profile von Kernextrakten, die aus HEp-2-Zellen, die mit den in vitro mit γ³²P-ATP markierten UL13-Deletionsviren infiziert waren, erhalten worden waren, unterschieden sich in signifikanter Weise von solchen, die in vivo mit ³²Pi-markiert worden waren.

Kernextrakte von mit HSV-1(F) infizierten Zellen, die in vitro mit γ³²P-ATP in Gegenwart von 1 M NaCl markiert worden waren, zeigten fünf markierte Banden, die als U, T, S, R und Q bezeichnet wurden (Fig. 6, Feld C, Bahn 24). Da die Phosphoproteine U, T, 5 und R in mit ΔUS3-Viren infizierten Zellen abwesend waren (Fig. 6, Feld c, Bahnen 25-26), handelt es sich hierbei um Proteine, deren Phosphorylierung entweder direkt oder indirekt durch US3-PK vermittelt wird. Es ist wahrscheinlich, daß es sich bei den Phosphoproteinen S und R um US3-PK selbst handelt, die ein Dublett bildet und für eine Autophosphorylierung bekannt ist. Phosphoprotein U wurde aufgrund seiner Reaktivität mit dem monoklonalen Q1-Antikörper als die alkalische Exonudease identifiziert. Phosphoprotein T wird derzeit untersucht. Phosphoprotein Q, das einen scheinbaren Mr-Wert von 57 000 hat, ist jedoch nur in Zellen vorhanden, die mit Viren infiziert sind, die für ein intaktes UL13-Gen kodieren.
In einer neueren Arbeit (cunningham et al., 1992) wurde eine Kinase- Aktivität identifiziert, die in den Kernen von infizierten Zellen vorhanden ist und ein Mr-57 000-Protein phosphoryliert. Die Aktivität befindet sich zwischen den UL9- und UL15-Genen und ist mit anti-UL13-Antiseren immunopräzipitierbar. Die Autoren wiesen darauf hin, daß es sich bei dem beobachteten Ereignis um eine UL13-Autophosphorylierung handeln könnte. Diese Interpretation stimmt mit unseren Ergebnissen überein, jedoch wurde nicht ermittelt, ob es sich bei der tatsächlichen Kinase-Aktivität um UL13 selbst handelt.
Das UL13-Protein ist wie US3-PK für die HSV-1-Replikation in Zellkultur nicht-essentiell, obgleich die viralen Ausbeuten offensichtlich verringert sind. Die vorhergesagte Sequenz des UL13-Proteins enthält Aminosäuremotive, die für die katalytischen Domänen von eukaryontischen PKs charakteristisch sind, und möglicherweise bakterielle Phosphotransferasen (Smith et al., 1989; Chee et al., 1989). Aufgrund von Analogie mit US3-PK (Purves et al., 1986; Purves et al., 1987; Purves et al., Eur. J. Biochem. 1987) erfordert die Bestimmung der enzymatischen Aktivität Untersuchungen an gereinigtem Protein. Während es sich bei US3-PK vorwiegend um eine zytoplasmatische Kinase handelt (Purves et al., 1986), läßt sich das UL13-Protein leicht im Kern nachweisen (cunningham et al., 1992). Während es sich beim Hauptsubstrat von US3-PK um das UL34-Membranprotein handelt (Purves et al., 1992), stellt ICP22 das vorwiegende Ziel von UL13 dar. Während ferner US3 nur bei den α-Herpes-Viren konserviert wird (McGeoch et al., 1986; Baer et al., 1984; Davison et al., 1986), wird das UL13-Gen bei sämtlichen drei Herpes-Virus-Unterfamilien (Varicella zoster (Davison et al., 1986), humaner Cytomegalovirus (Chee et al., 1989), humaner Herpes-Virus 6 (Lawrence et al., 1990) und Epstein-Barr-Virus (Baer et al., 1984) konserviert.
Die Mr-70 000-Spezies (Nr. 5) von ICP22 und Spurenmengen von Spezies mit höherem Molekulargewicht (Nr. 2-4) überwiegen in Extrakten von Zellen, die mit UL13&supmin;-Viren infiziert sind. Die stufenweise Zunahme des Molekulargewichts bei den fünf ICP22-Unterspezies stimmt mit aufeinanderfolgenden Phosphorylierungen des Proteins überein (ist aber kein Anzeichen hierfür) und scheint für den Zelltyn spezifisch zu sein. Die Phosphorylierung der Mr-70 000-Spezies (Nr. 5) ist vom UL13-Protein unabhängig. Die anschließende Phosphorylierung von ICP22 kann eine direkte Phosphorylierung durch das UL13-Protein oder durch ein anderes infiziertes Zell-PK nach Aktivierung mit dem UL13-Genprodukt darstellen. Wir stellen fest, daß für ICP22 45 Aminosäurereste von Serin und 28 Reste von Threonin vorhergesagt werden. Der Großteil dieser Reste wird von Clustern von sauren Aminosäuren flankiert, insbesondere am N-Terminus zwischen den Aminosäuren 38 und 118 und am C-Terminus zwischen den Aminosäuren 296 und 385. Die Kern-PK-Aktivität, die von cunningham et al. beschrieben wird (cunningham et al., 1992) und die das UL13-Protein phosphoryliert, weist ebenfalls eine Präferenz für saure Zielstellen des in ICP22 vorhandenen Typs auf.
Eine Beteiligung von ICP22 bei der trans-Aktivierung von viralen Genen und als Protein bei der Erweiterung des Wirtsbereichs von HSV-1 in Zellkultur wurde angenommen (Sears et al., 1985). In nicht-permissiven Zellen (z. B. Kaninchenhaut-, Hamster- und Ratten-Zellinien) war die späte Proteinsynthese stark vermindert. ICP22 scheint eine regulatorische Funktion auszuüben, die bei einigen Zellinien durch zelluläre Proteine vervollständigt wird. Da ICP22 sich unter den ersten viralen Proteinen, die nach der Infektion gebildet werden, findet, ist es denkbar, daß das UL13-Protein ICP22 im späten Infektionsstadium modifiziert und dabei dessen Funktion verändert. In dieser Hinsicht kann das UL13-Gen zur Regulierung der späten Genexpression über ICP22 dienen. Es ist bemerkenswert, daß ein UL13&supmin;-Virus ein beeinträchtigtes Wachstum auf Kaninchen-Hautzellen aufwies und daß in mit UL13&supmin;-Virus infizierten BHK-Zellen ICP22 weniger umfassend prozessiert wurde als in infizierten HEp-2-Zellen. Die Bedeutung der Modifikationen von ICP22 wird derzeit untersucht.
Weitere Analysen der Proteinprofile von mit UL13-Deletionsviren infizierten Zellen ergaben, daß die Konzentrationen von spezifischen späten viralen Proteinen mengenmäßig drastisch verringert sind, im Vergleich zu den Konzentrationen, die bei Zellen beobachtet wurden, die entweder mit Wildtyp-Virus oder mit Virus, bei dem das UL13-Gen repariert worden war, infiziert waren. Zu den Proteinen, die verringert werden, gehören die Produkte von US11, UL26 (Protease) und UL26.5 (Protease-Substrat) und drei weitere virale Proteine, von denen zwei möglicherweise den durch die UL47- und UL49-Gene kodierten Integument-Proteinen entsprechen. Die Liste von beeinflußten viralen Proteinen kann nicht als umfassend angesehen werden, da zahlreiche weitere Protein-Konzentrationen bisher noch nicht näher untersucht wurden. Es ist bemerkenswert, daß nicht alle späten viralen Proteine in mit dem UL13&supmin;-Virus infizierten Zellen in reduziertem Umfang auftreten. Speziell reichem sich αTIF- und Glycoprotein C-Proteine in den mit UL13-Deletionsviren infizierten Zellen bis zu Wildtyp Konzentrationen an, was zeigt, daß das modifizierte ICP22 möglicherweise nur auf bestimmte virale Gene abzielt.
Gleichermaßen wichtig ist, daß späte Gene offensichtlich nicht die einzige kinetische Klasse darstellen, die von der durch UL13-vermittelten Phosphorylierung von ICP22 beeinflußt wird. Während sich beispielsweise zwei α-Genprodukte, ICP4 und ICP27, in Zellen, die entweder mit den ICP22-Deletionsviren oder den UL13-Deletionsviren infiziert sind, auf Wildtyp-Konzentrationen anreichern, sind die Mengen des weiteren α-Genprodukts ICP0 bei beiden signifikant verringert. Diese Beobachtung ist von besonderer Bedeutung, da ICP0 eine kritische Rolle in verschiedenen Aspekten des viralen Lebenszyklus zu spielen scheint. Zahlreiche Untersuchungen nehmen hierfür eine Rolle als promiskuöser Transaktivator der viralen Genexpression während der lytischen Replikation an. Rekombinante Viren, in denen das α0-Gen deletiert worden ist, zeigen eine beeinträchtigte Reaktivierung von der Latenz.
Um festzustellen, ob die verringerte Anreicherung von Proteinen in Zellen, die mit den ICP22- und den UL13-Deletionsviren infiziert sind, auf verringerte Konzentrationen von mRNA in infizierten Zellen zurückzuführen waren, wurden die Konzentrationen von mRNA, die für zwei der betroffenen Proteine kodieren, nämlich ICP0 und US11, durch Northern-Blotanalyse gemessen. Die ICP0- und US11-mRNA-Spiegel waren beide in Zellen, die mit den mutanten Viren infiziert waren, klar verringert, was entweder auf verringerte Transkriptionsraten dieser Gene oder eine verminderte Stabilität dieser rnrnas in Abwesenheit der UL13-induzierten Modifikation von ICP22 hinweist.

Druckschriften

Die folgenden Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
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Claims

1. Verfahren zur Identifizierung einer Substanz in bezug auf ihre anti-Herpes simplex-Virus-Aktivität, umfassend folgende Stufen:

(a) Bilden eines Gemisches aus einer wirksamen katalytischen Menge eines Herpes-Virus-Unterfamilie-Homologen eines Herpes simplex-Virus- UL13-Genprodukts und einer wirksamen Menge eines Substrats, dessen Phosphorylierung durch das Genprodukt in einem flüssigen Medium mit einem Gehalt an einem Phosphat-Donor katalysiert wird;

(b) Auswählen einer Substanz, für die eine anti-Herpes simplex-Virus- Aktivität angenommen wird; und

(c) Testen der Fähigkeit dieser Substanz, die Phosphorylierung des Substrats und somit die anti-Herpes simplex-Virus-Aktivität im Gemisch von Stufe (a) zu modulieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Herpes-Virus- Famihe-Homologen um das Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukt handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Herpes-Virus- Famihe-Homologen um das Varicella-zoster-Homologe des Herpes simplex- Virus-UL13-Genprodukts handelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Herpes-Virus- Famihe-Homologen um das humane Zytomegalovirus-Homologe des Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukts handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Herpes-Virus- Famihe-Homologen um das humane Herpes-Virus 6-Homologe des Herpes simplex-Virus-UL13-Genprodukts handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Herpes-Virus- Famihe-Homologen um das Epstein-Barr-Virus-Homologe des Herpes simplex- Virus-UL13-Genprodukts handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Testen auf die Fähigkeit dieser Substanz zur Hemmung der Phosphorylierung das Testen der Fähigkeit dieser Substanz zur Hemmung der Bindung des Substrats an das Genprodukt beinhaltet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Testen auf die Fähigkeit dieser Substanz zur Hemmung der Phosphorylierung das Testen der Phosphorylierung beinhaltet.