DE69016783T2 - Omega carboxy alcohol oxidase. - Google Patents
Omega carboxy alcohol oxidase.Info
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine ω-Carboxylalkoholoxidase, ihre Herstellung, ein Verfahren zum Nachweis eines aliphatischen Alkohols oder eines aliphatischen Aldehyds oder eines ω-Carbonsäurederivats davon und auf ein Verfahren zur Herstellung einer Carbonsäure.The invention relates to an ω-carboxyl alcohol oxidase, its preparation, a method for detecting an aliphatic alcohol or an aliphatic aldehyde or a ω-carboxylic acid derivative thereof and a method for producing a carboxylic acid.
Eine bekannte Oxidase, die Substratspezifität für eine aliphatische Säure hat, ist Alkoholoxidase (EC. 1.1.3.13), die die folgende Reaktion zur Bildung eines Aldehyds katalysiert:A known oxidase that has substrate specificity for an aliphatic acid is alcohol oxidase (EC. 1.1.3.13), which catalyzes the following reaction to form an aldehyde:
R"-CH&sub2;OH + O&sub2; -- ) R'''-CHO + H&sub2;O&sub2;R"-CH₂OH + O₂ -- ) R'''-CHO + H₂O₂
Alkoholoxidasen aus Basidiomycet [Biochim. Biophys. Acta, 151: 330-342 (1968), Biochem. BioDhys. Res. Commun., 20 : 630-634 (1965)], H. polymorpha, eine Hefe, die in Methanol gewachsen ist, und Kloeckera sp. [Agr. Biol. Chem., 36: 2297-2306 (1972), Eur. J. Biochem., 36: 250-256 (1973), ibid., 64: 341- 350 (1976, Agr. Biol. Chem., 36: 68-75 (1972)] sind bekannt. Alkoholoxidase aus Basidiomycet hat Substrat-(R'''-CH&sub2;OH)- Spezifität für einen C&sub2;&submin;&sub4; geradkettigen primären Alkohol, einen Allylalkohol oder 2-Propion-1-ol; die von H. Polymorpha hat Substratspezifität für einen C&sub1;&submin;&sub4; geradkettigen primären Alkohol, 2-Propen-1-ol oder 2-Buten-1-ol; und die von Kloeckera sp. hat Substratspezifität für einen C&sub1;&submin;&sub4; geradkettigen primären Alkohol, 2-Propen-1-ol, 2-Buten-1-ol oder Allylalkohol.Alcohol oxidases from Basidiomycete [Biochim. Biophys. Acta, 151: 330-342 (1968), Biochem. BioDhys. Res. Commun., 20 : 630-634 (1965)], H. polymorpha, a yeast grown in methanol, and Kloeckera sp. [Agr. Biol. Chem., 36: 2297-2306 (1972), Eur. J. Biochem., 36: 250-256 (1973), ibid., 64: 341- 350 (1976, Agr. Biol. Chem., 36: 68-75 (1972)] are known. Alcohol oxidase from Basidiomycete has substrate (R'''-CH2OH)- specificity for a C2-4 straight-chain primary alcohol, an allyl alcohol or 2-propion-1-ol; that from H. polymorpha has substrate specificity for a C1-4 straight-chain primary alcohol, 2-propen-1-ol or 2-buten-1-ol; and that of Kloeckera sp. has substrate specificity for a C1-4 straight-chain primary alcohol, 2-propen-1-ol, 2-buten-1-ol or allyl alcohol.
Daher bilden Alkoholoxidasen aus diesen Quellen Aldehyde und haben Substratspezifität in bezug auf zumindest geradkettige primäre Alkohole, für niedrige aliphatische Alkohole, die weniger als vier Kohlenstoffatome haben.Therefore, alcohol oxidases form aldehydes from these sources and have substrate specificity towards at least straight-chain primary alcohols, for lower aliphatic alcohols having less than four carbon atoms.
Enzyme, die Substratspezifität für Glycerol, z.B. Glyceroldehydrogenase oder Glycerol-2-dehydrogenase (EC. 1.1.1.6, EC. 1.1.1.72, EC. 1.1.1.156) und Glyceroloxidase haben, sind bekannt. Diese Enzyme oxidieren Glycerol und bilden Dihydroaceton oder Glycerolaldehyd. Sie katalysieren nicht eine Reaktion, die ein Carbonsäurederivat bildet.Enzymes that have substrate specificity for glycerol, e.g. glycerol dehydrogenase or glycerol-2-dehydrogenase (EC. 1.1.1.6, EC. 1.1.1.72, EC. 1.1.1.156) and glycerol oxidase, are known. These enzymes oxidize glycerol and form dihydroacetone or glyceraldehyde. They do not catalyze a reaction that forms a carboxylic acid derivative.
Eine Oxidase, die Substratspezifität für eine Fettsäure aufweist, die eine Hydroxygruppe am ω-Carboxylalkohol hat, die dieses Substrat oxidiert, um eine zweibasige Säure zu bilden, ist auch bekannt. Diese kann aus tierischem Gewebe [Biochim. Biophys. Acta, 46 : 45-50 (1961) und pflanzlichem Gewebe [Methods in Enzymology, 71 : 411-420, (1981)] erhalten werden. Diese Enzyme benötigen ein essentielles Coenzym NAD oder NADP.An oxidase that has substrate specificity for a fatty acid having a hydroxy group on the ω-carboxyl alcohol, which oxidizes this substrate to form a dibasic acid, is also known. This can be obtained from animal tissue [Biochim. Biophys. Acta, 46 : 45-50 (1961) and plant tissue [Methods in Enzymology, 71 : 411-420, (1981)]. These enzymes require an essential coenzyme NAD or NADP.
DD-A-239 005 offenbart Alkoholoxidasen. Dieses Dokument weist daraufhin, daß die Oxidasen mit Ethanol als Substrat reagieren.DD-A-239 005 discloses alcohol oxidases. This document indicates that the oxidases react with ethanol as a substrate.
Dementsprechend haben bekannte Alkoholoxidasen Substratspezifitäten für niedrige Alkohole mit weniger als vier Kohlenstoffatomen, zumindest in bezug auf geradkettige aliphatische primäre oder sekundäre Alkohole, auf Glycerol oder auf eine ω-Hydroxycarbonsäure mit Coenzym NAD oder NADP. Ein Enzym, das kein Coenzym benötigt, hat keine Substratspezifität für einen geradkettigen primären Alkohol mit zwei oder weniger Kohlenstoffatomen und das Sauerstoff benötigt, um Wasserstoffperoxid zu erzeugen, ist nicht bekannt.Accordingly, known alcohol oxidases have substrate specificities for lower alcohols with fewer than four carbon atoms, at least with respect to straight-chain aliphatic primary or secondary alcohols, to glycerol or to a ω-hydroxycarboxylic acid with coenzyme NAD or NADP. An enzyme that does not require a coenzyme, has no substrate specificity for a straight-chain primary alcohol with two or fewer carbon atoms and that requires oxygen to generate hydrogen peroxide is not known.
Wir haben gefunden, daß der Streptomyces-Stamm AC 8205 FERM BP-2491, der aus einer Erdprobe aus einem Feld in Sumotoshi, Hyogo-ken, Japan isoliert wurde, ein ω-Carboxyalkoholoxidase- Enzym bildet. Wir haben dieses Enzym isoliert und gereinigt und ein Verfahren für die Herstellung von einer Carbonsäure, das dieses Enzym verwendet, zur Verfügung gestellt.We have found that Streptomyces strain AC 8205 FERM BP-2491 isolated from a soil sample from a field in Sumotoshi, Hyogo-ken, Japan, produces a ω-carboxyalcohol oxidase enzyme. We have isolated and purified this enzyme and provided a process for the production of a carboxylic acid using this enzyme.
Dieses Enzym ist im Hinblick auf seine Enzymwirkung, Substratspezifität und Verwendung von einem Coenzym neu. Es ist als ω-Carboxylalkoholoxidase bestimmt worden.This enzyme is new in terms of its enzyme activity, substrate specificity and use of a coenzyme. It has been identified as ω-carboxyl alcohol oxidase.
Die taxonomischen Eigenschaften vom Streptomyces-Stamm AC 8205 sind folgende:The taxonomic characteristics of Streptomyces strain AC 8205 are as follows:
Morphologische Beobachtungen mittels optischer und elektronischer Mikroskopie, nachdem sie auf einem anorganischem Salz-Stärke Agarmedium, Glycerol-Asparagin Agarmedium oder Pilzextrakt-Malzextrakt Agarmedium bei 30ºC 14 Tage lang kultiviert wurden, sind wie folgtMorphological observations by optical and electronic microscopy after being cultured on an inorganic salt-starch agar medium, glycerol-asparagine agar medium or mushroom extract-malt extract agar medium at 30ºC for 14 days are as follows
Das Substratmyzel ist gekrümmt oder gerade, mit Ästen gewachsen, 0,3 - 0,5 µm im Durchmesser und bildet keine Fragmentierung.The substrate mycelium is curved or straight, with branches, 0.3 - 0.5 µm in diameter and does not form fragmentation.
Das Luftmyzel, das auf dem Substratmyzel gewachsen ist, ist mit einer gekrümmten oder geraden langen Hauptachse und kurzen Ästen ausgebildet, die abwechselnd oder sich gegenüberliegend, 0,4 - 0,6 µm im Durchmesser, ausgebildet sind. Die Spitzen der Äste sind lose Spiralen mit 2 bis 4 Windungen und ungefähr 10- 20 Kettensporen.The aerial mycelium grown on the substrate mycelium is formed with a curved or straight long main axis and short branches that are alternate or opposite each other, 0.4 - 0.6 µm in diameter. The tips of the branches are loose spirals with 2 to 4 turns and about 10-20 chain spores.
Die Sporen sind oval und von 0, 6 - 0,8 x 0,8 - 1,0 µm Größe mit stachligen Oberflächen.The spores are oval and 0.6 - 0.8 x 0.8 - 1.0 µm in size with spiny surfaces.
Keine Sporangien, motilen Sporen, Verticillien und Sklerotia werden gebildet.No sporangia, motile spores, verticillia and sclerotia are formed.
LL-Typ Diaminopimelinsäure wird gefunden und kein Mesotyp wird gemäß dem Verfahren von Staneck et al. [Appl. Microbiol., 28 226-231 (1974)] nachgewiesen.LL-type diaminopimelic acid is found and no mesotype is detected according to the method of Staneck et al. [Appl. Microbiol., 28 226-231 (1974)].
Beobachtungen auf verschiedenen Medien, die bei 30ºC 20 Tage lang kultiviert wurden, werden in Tabelle 1 gezeigt.Observations on different media cultured at 30ºC for 20 days are shown in Table 1.
Farbangaben werden, unter zu Rate ziehen von "Color Harmony Manual", 4. Auflage, 1958 (Container Corp. of America) gemacht. Tabelle 1 Agarmedium Wachstum Farbe des Substratmyceriums Luftmycerium Lösliches Pigment Saccharosenitrat Glukoseasparagin Glycerolasparagin Anorganische Salze-Starke Tyrosin hafermehl Hefeextract-Malzextract Nährstoff Bennets Emersons gut schwach mäßig bambusfarben bis farblos teilweise dunkelbraun nelkenbraun braun bis kamelfarben leicht elfenbeinfarben weiß beige bis silbergrau spurenweise naturfarben bis austernweiß keines braun, geringfügig gebildetColor specifications are made using the "Color Harmony Manual," 4th edition, 1958 (Container Corp. of America). Table 1 Agar medium Growth Colour of substrate mycerium Aerial mycerium Soluble pigment Sucrose nitrate Glucose asparagine Glycerol asparagine Inorganic salts-starch Tyrosine oat flour Yeast extract-malt extract Nutrient Bennets Emersons good weak moderate bamboo to colourless partly dark brown clove brown brown to camel light ivory white beige to silver grey traces natural to oyster white none brown, slightly formed
1) Wachstumstemperatur: 20 - 40ºC (optimal: 30 - 37ºC)1) Growth temperature: 20 - 40ºC (optimal: 30 - 37ºC)
2) Gelatineverflüssigung: Positiv2) Gelatin liquefaction: Positive
3) Stärkehydrolyse: Positiv3) Starch hydrolysis: Positive
4) Magermilch: Peptonisierung: Positiv4) Skimmed milk: Peptonization: Positive
Coagulation: PositivCoagulation: Positive
5) Melaninpigmentbildung:5) Melanin pigment formation:
Tyrosinagar: NegativTyrosine agar: Negative
Pepton-Hefe Extrakt-Eisenagar: NegativPeptone yeast extract iron agar: Negative
6) Verwendung von Kohlenstoff-Quellen:6) Use of carbon sources:
Positiv: L-Arabinose, D-Fructose, D-Glukose, Inositol, D- Mannitol, Rhamnose und D-Xylose.Positive: L-arabinose, D-fructose, D-glucose, inositol, D-mannitol, rhamnose and D-xylose.
Negative: Raffinose und Saccharose.Negative: raffinose and sucrose.
Wie oben ausgeführt, hat der AC 8205 Stamm die taxonomischen Eigenschaften, daß er ein Luftmyzel ausbildet, das Kettensporen mit Spiralen auf der Spitze des Substratmyzels ausbildet und keine Flagellantensporen oder Sporangien ausbildet. Er wird somit als zur Gattung, Streptomyces gehörend identifiziert. Auf diesen Stamm wird als Streptomyces sp. AC 8205 bezug genommen und er wurde am 28 Juni 1989 im Fermentation Institut, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2491 hinterlegt.As stated above, the AC 8205 strain has the taxonomic characteristics of forming an aerial mycelium that forms chain spores with spirals on the tip of the substrate mycelium and does not form flagellant spores or sporangia. It is thus identified as belonging to the genus Streptomyces. This strain is referred to as Streptomyces sp. AC 8205 and was deposited on June 28, 1989 in the Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan under the accession number FERM BP-2491.
Die Erfindung stellt eine ω-Carboxylalkoholoxidase mit mindestens den folgenden biochemischen Eigenschaften zur Verfügung:The invention provides an ω-carboxyl alcohol oxidase having at least the following biochemical properties:
1) Enzymwirkung: Katalysiert zumindest die folgenden Reaktionen a) und b)1) Enzyme action: Catalyses at least the following reactions a) and b)
a) R-CH&sub2;OH + O&sub2; -- > R-CHO + H&sub2;O&sub2;a) R-CH2OH + O2 -> R-CHO + H2O2
b) R-CHO + O&sub2; + H&sub2;O -- > R-COOH + H&sub2;O&sub2;b) R-CHO + O2 + H₂O --> R-COOH + H₂O₂
wobei R-CH&sub2;OH ein aliphatischer Alkohol mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder ein ω-Carbonsäurederivat dieses Alkohols darstellt, R-CHO ein korrespondierender aliphatischer Aldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat davon ist und R-COOH eine dazu korrespondierende Verbindung ist;where R-CH₂OH is an aliphatic alcohol with the exception of methanol and ethanol or an ω-carboxylic acid derivative thereof alcohol, R-CHO is a corresponding aliphatic aldehyde or a ω-carboxylic acid derivative thereof, and R-COOH is a corresponding compound thereto;
2) Substratspezifität: Zumindest Substratspezifität für HO&sub2;C- (CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-OH und H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub5;-OH und keine Substratspezifität für Methanol, Ethanol und Glycerol; und2) Substrate specificity: At least substrate specificity for HO₂C- (CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₉-OH, H₃C-(CH₂)₃-OH, H₃C-(CH₂)₇-OH and H₃C-(CH₂)₅-OH and no substrate specificity for methanol, ethanol and glycerol; and
3) Verwendung eines Coenzyms: Kein Verwendung von NAD und NADP.3) Use of a coenzyme: No use of NAD and NADP.
Die ω-Carboxylalkoholoxidase kann folgende biochemischen Eigenschaften haben:The ω-carboxyl alcohol oxidase can have the following biochemical properties:
- Molekulargewicht: 66000 ± 6000 (Gelfiltrationsmethode mit einer Superose-12-Säule),- Molecular weight: 66000 ± 6000 (gel filtration method with a Superose 12 column),
- optimaler pH-Wert: 7,5 ± 0,5- optimal pH value: 7.5 ± 0.5
-stabiler pH-Bereich: 6 bis 9-stable pH range: 6 to 9
-Wärmestabilität: Stabil bei 45ºC (bei pH 7,5; 10 Minuten).-Heat stability: Stable at 45ºC (at pH 7.5; 10 minutes).
Gegenstand der vorliegende Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer ω-Carboxylalkoholoxidase, wie oben definiert, das die Kultivierung dieser ω-Carboxylalkoholoxidase, die zur Gattung Streptomyces gehört, in einem Medium umfaßt und das Erhalten dieser ω-Carboxylalkoholoxidase daraus.The present invention also relates to a process for producing an ω-carboxyl alcohol oxidase as defined above, which comprises culturing said ω-carboxyl alcohol oxidase belonging to the genus Streptomyces, in a medium and obtaining said ω-carboxyl alcohol oxidase therefrom.
Der Mikroorganismus Streptomyces sp. AC 8205 ist lediglich veranschaulichend für Mikroorganismen, die die erfindungsgemäße ω-Carboxylalkoholoxidase herstellen. Andere (ω-Carboxylalkoholoxidase herstellende Mikroorganismen, die zur Gattung Streptomyces gehören, können verwendet werden. Mikroorganismenstämme werden leicht natürlich oder künstlich mutiert und daher können diese Mutanten, die die Fähigkeit haben eine ω-Carboxylalkoholoxidase in einer isolierbaren Menge herzustellen, erfindungsgemäß verwendet werden. Des weiteren sind auch Stämme, die durch RNS-Rekombinationstechnik für diese Enzymherstellung verbessert worden sind, in die Erfindung eingeschlossen.The microorganism Streptomyces sp. AC 8205 is merely illustrative of microorganisms producing the ω-carboxyl alcohol oxidase of the present invention. Other (ω-carboxyl alcohol oxidase producing microorganisms belonging to the genus Streptomyces may be used. Microorganism strains are easily mutated naturally or artificially and therefore these mutants having the ability to produce ω-carboxyl alcohol oxidase in an isolable amount can be used in the present invention. Furthermore, strains improved by recombinant RNA technology for this enzyme production are also included in the invention.
In den anhängenden Zeichnungen bedeutet:In the attached drawings:
Fig. 1 ist ein Diagramm der Erzeugung und des Verbrauchs des Aldhyds;Fig. 1 is a diagram of the production and consumption of aldehyde;
Fig. 2 ist ein Diagramm des bestmöglichen pH-Werts;Fig. 2 is a diagram of the best possible pH value;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das den stabilen pH-Bereich zeigt;Fig. 3 is a graph showing the stable pH range;
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Wärmestabilität zeigt; undFig. 4 is a graph showing the thermal stability; and
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Standardkurve der 12- Hydroxydodecansäure zeigt.Fig. 5 is a graph showing the standard curve of 12-hydroxydodecanoic acid.
Eine Ausführungsform des Verfahrens für die Herstellung von ω-Carboxylalkoholoxidase mittels dieses Enzym herstellenden Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces gehört, ist wie folgt:An embodiment of the process for producing ω-carboxyl alcohol oxidase by means of a microorganism belonging to the genus Streptomyces producing this enzyme is as follows:
Ein ω-Carboxylalkoholoxidase herstellender Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces gehört, wird auf übliche Weise in einem Nährmedium für Antibiotika- oder Enzymherstellung kultiviert. Es können feste oder flüssige Kulturen verwendet werden.A ω-carboxyl alcohol oxidase-producing microorganism belonging to the genus Streptomyces is cultured in a conventional manner in a nutrient medium for antibiotic or enzyme production. Solid or liquid cultures can be used.
Nährstoffquellen für Mikroorganismen sind übliche Medien für die Mikroorganismus-Kultivierung. Als Stickstoffquellen, als assimilierbare Stickstoffquellen, können, zum Beispiel Cornsteep-Lösung, Sojabohnen-Pulver, Pepton, verschiedene Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen, als assimilierbare Kohlenstoffquellen, können, zum Beispiel Saccharose, Glukose, Melassen oder Glycerol verwendet werden. Des weiteren können gegebenfalls anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat verwendet werden.Nutrient sources for microorganisms are common media for the cultivation of microorganisms. Nitrogen sources, as assimilable nitrogen sources, can be used, for example, cornsteep solution, soybean powder, peptone, various meat extracts, yeast extracts, ammonium sulfate or ammonium chloride. Carbon sources, as assimilable carbon sources, can be used, for example, sucrose, glucose, molasses or glycerol. In addition, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, potassium phosphate or potassium dihydrogen phosphate can be used if necessary.
Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb des Bereichs, der geeignet ist für die ω-Carboxylalkoholoxidase-Herstellung und dem Mikroorganismenwachstum variiert werden. Sie beträgt gewöhnlich 20 bis 40ºC.The cultivation temperature can be varied within the range suitable for ω-carboxyl alcohol oxidase production and microorganism growth. It is usually 20 to 40ºC.
Die Kultivierungszeit kann gemäß den Bedingungen variiert werden. Sie beträgt gewöhnlich 50 bis 100 Stunden. Die Kultivierung sollte natürlich zum Zeitpunkt der größten Enzymproduktion beendet werden.The cultivation time can be varied according to the conditions. It is usually 50 to 100 hours. Of course, the cultivation should be stopped at the time of the greatest enzyme production.
Die ω-Carboxylalkoholoxidase ist ein Endoenzym und in den Zellen eingeschloßen.The ω-carboxyl alcohol oxidase is an endoenzyme and is enclosed in the cells.
Die ω-Carboxylalkoholoxidase kann isoliert werden, indem die kultivierten Zellen von der kultivierten Nährlösung abgetrennt werden, indem die naßen Zellen in einer Pufferlösung, wie Phosphatpuffer oder Tris-HCl-Puffer suspendiert werden und wird mittels einer French-Presse, einer Ultraschallbehandlung, einer Mühlenbehandlung oder einer Lysozymbehandlung behandelt, um eine Rohlösung der ω-Carboxylalkoholoxidase zu erhalten. Die Lösung wird des weiteren mittels bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren für Proteine und Enzyme behandelt, um gereinigte ω-Carboxylalkoholoxidase zu erhalten. Zum Beispiel wird die Enzymlösung mit Protaminsulfat behandelt, um Nukleinsäuren zu entfernen und sie wird einer Ausfällung aus einem organischen Lösungsmittel unterworfen, indem ein organisches Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Ethanol oder Isopropanol hinzugefügt wird oder einer Aussalzung unterworfen, indem Ammoniumsulfat hinzugefügt wird und einer Chromatographie, indem Ionenaustauscher, wie Diethylaminoethylzellulose oder Diethylaminoethylsepharose verwendet werden oder einer Gelfiltrationschromatographie unterworfen, indem Dextrangel oder Polyacrylamidgel verwendet werden. Ein gereinigtes Enzympulver kann erhalten werden, indem die obigen Arbeitsweisen kombiniert werden und indem schließlich die Enzymlösung, unter der Zugabe von einem oder mehreren Stabilisatoren, wie BSA, Gelatine, Aminosäure, Saccharose, Glycerol oder Ethylenglycol, lyophilisiert wird.The ω-carboxyl alcohol oxidase can be isolated by separating the cultured cells from the cultured broth, suspending the wet cells in a buffer solution such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer, and treating by a French press, ultrasonic treatment, milling treatment or lysozyme treatment to obtain a crude solution of the ω-carboxyl alcohol oxidase. The solution is further treated by known isolation and purification methods for proteins and enzymes to obtain purified ω-carboxyl alcohol oxidase. For example, the enzyme solution is treated with protamine sulfate to remove nucleic acids and subjected to precipitation from an organic solvent by adding an organic solvent such as acetone, methanol, ethanol or isopropanol, or subjected to salting out by adding ammonium sulfate and chromatography by using ion exchangers such as diethylaminoethylcellulose or diethylaminoethylsepharose, or subjected to gel filtration chromatography by using dextran gel or polyacrylamide gel. A purified enzyme powder can be obtained by combining the above procedures and finally lyophilizing the enzyme solution with the addition of one or more stabilizers such as BSA, gelatin, amino acid, sucrose, glycerol or ethylene glycol.
Beispiele für ein Assäyverfahren und biochemische Eigenschaften von einer erfindungsgemäßen ω-Carboxylalkoholoxidase sind wie folgt:Examples of an assay method and biochemical properties of a ω-carboxyl alcohol oxidase according to the invention are as follows:
0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 0,20 ml0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) 0.20 ml
10 mM 12-Hydroxydodecansäure 0,05 ml10 mM 12-hydroxydodecanoic acid 0.05 ml
1% Triton X-100 0,05 ml1% Triton X-100 0.05ml
0,2% Phenol 0,05 ml0.2% Phenol 0.05ml
0, 3% 4-Aminoantipyrin 0,05 ml0.3% 4-aminoantipyrine 0.05 ml
Peroxidase (50 Einheiten/ml) 0,05 mlPeroxidase (50 units/ml) 0.05 ml
Wasser 0,05 mlWater 0.05 ml
Eine Enzymlösung (25 µl) wird zu der obigen Mischung (0,5 ml) hinzugefügt, bei 37ºC für exakt 10 Minuten inkubiert und Natriumdodecylsulfat (SDS) (0,5 ml) werden dazu hinzugefügt. Die Absorbanz wird bei 545 nm gemessen. Eine Einheit (eine einzige Einheit) des Enzyms wird über die Aktivität, die 1 umol Wasserstoffperoxid pro Minute erzeugt, definiert.An enzyme solution (25 µl) is added to the above mixture (0.5 ml), incubated at 37ºC for exactly 10 minutes and sodium dodecyl sulfate (SDS) (0.5 ml) is added to it. The absorbance is measured at 545 nm. One unit (a single unit) of the enzyme is defined by the activity that produces 1 µmol of hydrogen peroxide per minute.
(1) Schwankungen in der Aldehydmenge werden mittels des folgenden Verfahrens gemessen:(1) Variations in the amount of aldehyde are measured using the following procedure:
Gereinigtes Enzym (0,3 Einheiten) wird zu der Reaktionsrnischung (0,5 ml), die aus 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) (0,2 ml), 10 mM 12-Hydroxydodecansäure (0,01 ml), Katalase (Rinderleber, 20 Einheiten) und gereinigtem Wasser (0,29 ml) besteht, hinzugefügt und die Mischung wird bei 37ºC inkubiert. 12% Trichloressigsäure (0,5 ml) werden nach 5, 10, 20 und 40 Minuten hinzugefügt und dann werden 0,1% 2,4-Dinitrophenylhydrazin (2N-HCl) dazu hinzugefügt. Die Mischung wird später mit 3000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird bei 100ºC 5 Minuten lang gekocht, gekühlt, 1,2 N NaOH (3 ml) werden hinzugefügt, gut vermischt und dann wird die Absorbanz bei 440 nm gemessen.Purified enzyme (0.3 units) is added to the reaction mixture (0.5 ml) consisting of 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) (0.2 ml), 10 mM 12-hydroxydodecanoic acid (0.01 ml), catalase (bovine liver, 20 units) and purified water (0.29 ml) and the mixture is incubated at 37ºC. 12% trichloroacetic acid (0.5 ml) is added after 5, 10, 20 and 40 minutes and then 0.1% 2,4-dinitrophenylhydrazine (2N-HCl) is added to it. The mixture is later centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The supernatant is boiled at 100ºC for 5 minutes, cooled, 1.2 N NaOH (3 ml) is added, mixed well and then the absorbance is measured at 440 nm.
Das Ergebnis wird in Fig. 1 gezeigt, in welcher die Erzeugung vom Aldehyd und die Menge der Aldehydabnahme gemäß dem Fortschritt der Reaktion festgehalten wird.The result is shown in Fig. 1, in which the production of aldehyde and the amount of aldehyde removal according to the progress of the reaction are recorded.
(2) Wie aus Fig. 5 berechnet, werden zwei Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol Substrat erzeugt.(2) As calculated from Fig. 5, two moles of hydrogen peroxide are produced from one mole of substrate.
Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Enzym zumindest die obigen Reaktionen a) oder b) katalysiert.This shows that the enzyme according to the invention catalyzes at least the above reactions a) or b).
Beispiele für aliphatische Alkohole, mit Ausnahme von Methanol und Ethanol, sind aliphatische Alkohole mit mehr als drei Kohlenstoffatomen.Examples of aliphatic alcohols, with the exception of methanol and ethanol, are aliphatic alcohols with more than three carbon atoms.
Die Substratspezifität eines Enzyms wird in Tabelle 2 gezeigt. Das Enzym hat zumindest Substratspezifität für HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;- OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-OH und H&sub3;C- (CH&sub2;)&sub5;-OH und keine Substratspezifität für Methanol, Ethanol und Glycerol.The substrate specificity of an enzyme is shown in Table 2. The enzyme has at least substrate specificity for HO₂C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₉-OH, H₃C-(CH₂)₉-OH, H₃C-(CH₂)₇-OH, and H₃C- (CH₂)₅-OH and no substrate specificity for methanol, ethanol and glycerol.
Assayverfahren: In dem Assayverfahren, das oben in (1) veranschaulicht wurde, wird 12-Hydroxydodecansäure durch die Substrate in Tabelle 2 ersetzt. Tabelle 2 Substrat Relative Aktivität (%) glycerolAssay procedure: In the assay procedure illustrated in (1) above, 12-hydroxydodecanoic acid is replaced by the substrates in Table 2. Table 2 Substrate Relative Activity (%) glycerol
Wie in Tabelle 2 gezeigt, können Substrate für das erfindungsgemäße Enzym gesättigte oder ungesättigte aliphatische Alkohole mit mehr als drei Kohlenstoffatomen sein. Falls ein ω-Carboxylalkohol wie HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH und HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-OH verwendet wird, werden die Aldehyde HO&sub2;C- (CH&sub2;)&sub1;&sub1;-CHO oder HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-CHO und die Dicarbonsäuren HO&sub2;C- (CH&sub2;)&sub1;&sub1;-CO&sub2;H und HO&sub2;C- (CH&sub2;)&sub1;&sub5;-CO&sub2;H gebildet.As shown in Table 2, substrates for the enzyme of the invention can be saturated or unsaturated aliphatic alcohols having more than three carbon atoms. If an ω-carboxyl alcohol such as HO₂C-(CH₂)₁₁-OH and HO₂C-(CH₂)₁₅-OH is used, the aldehydes HO₂C- (CH₂)₁₁-CHO or HO₂C-(CH₂)₁₅-CHO and the dicarboxylic acids HO₂C- (CH₂)₁₁-CO₂H and HO₂C-(CH₂)₁₅-CO₂H are formed.
Keine Verwendung von NAD und NADP wird bei dem folgenden Assayverfahren beobachtet:No use of NAD and NADP is observed in the following assay procedure:
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 0,5 ml0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) 0.5 ml
10 mM NAD oder NADP 0,2 ml10 mM NAD or NADP 0.2 ml
10 mM 12-Hydroxydodecansäure 0,2 ml10 mM 12-hydroxydodecanoic acid 0.2 ml
1% Triton X-100 0,2 ml1% Triton X-100 0.2ml
Wasser 0,05 mlWater 0.05 ml
Eine Enzymeinheit wird zu der obigen Reaktionsmischung (2,0 ml) hinzugefügt und die Absorbanz wird bei 340 nm und 37ºC kontinuierlich gemessen.One unit of enzyme is added to the above reaction mixture (2.0 mL) and the absorbance is measured continuously at 340 nm and 37ºC.
Das Ergebnis wird in Tabelle 3 gezeigt. Es wird kein Anstieg der Absorption beobachtet. Das Enzym benötigt kein NAD oder NADP. Tabelle 3 ZeitThe result is shown in Table 3. No increase in absorption is observed. The enzyme does not require NAD or NADP. Table 3 Time
Ungefähr 66000 (66000 ± 6000), gemessen mittels Gelfiltration unter Verwendung einer Superose 12 Säule.Approximately 66000 (66000 ± 6000) as measured by gel filtration using a Superose 12 column.
Der beste pH-Wert wird gemäß der oben beschriebenen Assaymethode gemessen, indem die gleiche Reaktionsmischung, außer, daß der pH-Wert verändert wird, verwendet wird.The best pH is measured according to the assay method described above using the same reaction mixture except that the pH is changed.
Die Ergebnisse werden in Fig. 2. gezeigt. In Fig. 2:The results are shown in Fig. 2. In Fig. 2:
: MES-Puffer : Tris-HCl-Puffer Δ : Glycin-NaOH-Puffer.: MES buffer : Tris-HCl buffer Δ : Glycine-NaOH buffer.
Der stabile pH-Bereich des Enzyms in verschiedenen Pufferlösungen wird gemessen, indem das Enzym in 10 mM Puffer gelöst wird, auf 37ºC 60 Minuten lang erwärmt wird und sofort abgekühlt wird und die verbleibende Aktivität bei jedem pH gemessen wird.The stable pH range of the enzyme in different buffer solutions is measured by dissolving the enzyme in 10 mM buffer, heating to 37ºC for 60 minutes, immediately cooling, and measuring the remaining activity at each pH.
Das Ergebnis wird in Fig.3 gezeigt, in welcher:The result is shown in Fig.3, in which:
O : MES-Puffer : Tris-HCl-Puffer A : Glycin-NaOH-Puffer.O : MES buffer : Tris-HCl buffer A : Glycine-NaOH buffer.
Das in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöste Enzym wird bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten lang inkubiert und sofort abgekühlt. Die verbleibenden Aktivitäten werden gemessen.The enzyme dissolved in 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) is incubated at different temperatures for 10 minutes and immediately cooled. The remaining activities are measured.
Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt.The results are shown in Fig. 4.
Die Wirkung des Detergent und der Metallionen, die in Tabelle 4 veranschaulicht werden, werden in dieser Tabelle gezeigt.The effect of the detergent and the metal ions illustrated in Table 4 are shown in this table.
Diese Reagensien zeigen keine Wirkung auf dem Enzym. Die Aktivitäten des Enzyms werden gemessen, indem jedes Detergent und Metallion hinzugefügt wird. Tabelle 4 Reagens Konzentration Relative Aktivität (%) Triton X-100 Deoxycholat CholatThese reagents have no effect on the enzyme. The activities of the enzyme are measured by adding each detergent and metal ion. Table 4 Reagent Concentration Relative Activity (%) Triton X-100 Deoxycholate Cholate
(isoelektrische Fokussierung erfolgt unter Verwendung eines Trägerampholyts)(isoelectric focusing is carried out using a carrier ampholyte)
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Bestimmung von aliphatischem Alkohol, aliphatischem Aldehyd oder von den ω-Carbonsäurederivaten der Formeln R'-CH&sub2;OH oder R'-CHO, worin R'-CH&sub2;OH ein aliphatischer Alkohol ist mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Alkohol und R'-CHO ist ein korrespondierender aliphatischer Aldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat davon, in einer Probe, mit einer, wie oben definierten, ω-Carboxylalkoholoxidase und der quatitativen Bestimmung der Menge an verbrauchter oder erzeugter Komponente.The invention also relates to a method for determining aliphatic alcohol, aliphatic aldehyde or the ω-carboxylic acid derivatives of the formulas R'-CH₂OH or R'-CHO, in which R'-CH₂OH is an aliphatic alcohol with the exception of methanol and ethanol or a ω-carboxylic acid derivative of this alcohol and R'-CHO is a corresponding aliphatic aldehyde or a ω-carboxylic acid derivative thereof, in a sample, with a ω-carboxyl alcohol oxidase as defined above and the quantitative determination of the amount of component consumed or produced.
Die ω-Carboxylalkoholoxidase, die in dem obigen Verfahren verwendet wird, ist nicht beschränkt, so weit sie die oben gezeigten biochemischen Eigemschaften hat. Das bevorzugte Enzym ist die ω-Carboxylalkoholoxidase, die von Streptomyces sp. AC 8205 hergestellt wird.The ω-carboxyl alcohol oxidase used in the above method is not limited as long as it has the biochemical properties shown above. The preferred enzyme is the ω-carboxyl alcohol oxidase produced by Streptomyces sp. AC 8205.
R'-CH&sub2;OH in einer Probe ist ein aliphatischer Alkohol mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Alkohol. Zum Beispiel kann es ein langkettiger Alkohol sein, der drei oder mehr Kohlenstoffatome aufweist, wie HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub8;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub3;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub3;-OH und H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub2;-OH. Unter diesen sind HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C- (CH&sub2;)&sub7;-OH und H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub5;-OH bevorzugt.R'-CH₂OH in a sample is an aliphatic alcohol other than methanol and ethanol or a ω-carboxylic acid derivative of this alcohol. For example, it may be a long chain alcohol having three or more carbon atoms such as HO₂C-(CH₂)₁₁-OH, HO₂C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₈-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₅-OH, H₃C-(CH₂)₃-OH and H₃C-(CH₂)₅-OH. Among these, HO₂C-(CH₂)₁₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₉-OH, H₃C-(CH₂)₇-OH are preferred.
R'-CHO in einer Probe kann ein aliphatischer Aldehyd mit Ausnahme von Formaldehyd und Acetaldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Aldehyd sein, zum Beispiel die korrespondierende Aldehydverbindung des obigen aliphatischen Alkohols oder ein ω-Carbonsäurederivat davon sein.R'-CHO in a sample may be an aliphatic aldehyde except formaldehyde and acetaldehyde or a ω-carboxylic acid derivative of this aldehyde, for example, the corresponding aldehyde compound of the above aliphatic alcohol or a ω-carboxylic acid derivative thereof.
Die Konzentration von R'-CH&sub2;OH oder R'-CHO in einer Probe beträgt gewöhnlich 0,01 bis 0,05 mM. Sie kann verdünnt oder einer Vorbehandlung unterworfen werden. Die Reaktiontemperatur beträgt im allgemeinen ungefähr 0 bis 40ºC. Die Menge an ω-Carboxylalkoholoxidase, die verwendet wird, beträgt ungefähr 1 bis 10 Einheiten.The concentration of R'-CH2OH or R'-CHO in a sample is usually 0.01 to 0.05 mM. It may be diluted or subjected to pretreatment. The reaction temperature is generally about 0 to 40°C. The amount of ω-carboxyl alcohol oxidase used is about 1 to 10 units.
Eine Komponente, die in der Reaktion verbraucht wird, ist eine Substratkomponente, Sauerstoff oder Wasser. Eine erzeugte Komponente kann R'-CHO, R'-COOH oder H&sub2;O&sub2; sein. Für den Fall, daß R'-CH&sub2;OH ein aliphatischer Alkohol mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder eine ω-Carbonsäure eines aliphatischen Alkohols mit Ausnahme von Methanol und Ethanol ist, kann eine Komponente, d.h. Sauerstoff, R'-CHO, R'-COOH oder H&sub2;O&sub2; in dem Assaysystem gemessen werden.A component consumed in the reaction is a substrate component, oxygen or water. A component produced may be R'-CHO, R'-COOH or H2O2. In the case that R'-CH2OH is an aliphatic alcohol other than methanol and ethanol or an ω-carboxylic acid of an aliphatic alcohol other than methanol and ethanol, a component, i.e., oxygen, R'-CHO, R'-COOH or H2O2 can be measured in the assay system.
Für den Fall, daß R'-CHO ein aliphatischer Aldehyd mit Ausnahme von Formaldehyd und Acetaldehyd oder das korrespondierende ω-Carbonsäurederivat dieses aliphatischen Aldehyds ist, können Sauerstoff, R'-COOH oder H&sub2;O&sub2; in dem Assaysystem gemessen werden.In case R'-CHO is an aliphatic aldehyde except formaldehyde and acetaldehyde or the corresponding ω-carboxylic acid derivative of this aliphatic aldehyde, oxygen, R'-COOH or H₂O₂ can be measured in the assay system.
Bei einem Assay kann jedes geeignete Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann für den Fall, das erzeugtes H&sub2;O&sub2; gemessen wird, das Peroxidaseverfahren angewendet werden. Ein bekanntes Chromogen, ein färbendes Reagens, ein luminiszierendes Reagans oder fluoreszierendes Reagens werden mit erzeugtem H&sub2;O&sub2; in der Gegenwart von Peroxidase reagiert und die Absorbanz des Reaktionsgemisches wird gemessen.Any suitable method may be used in an assay. For example, in the case of H₂O₂ generated is measured, the peroxidase method can be used. A known chromogen, a coloring reagent, a luminescent reagent or a fluorescent reagent is reacted with generated H₂O₂ in the presence of peroxidase and the absorbance of the reaction mixture is measured.
R'-CH&sub2;OH oder R'-CHO kann eine Komponente in der Probe, wie sie ist, sein oder kann eine Komponente sein, die von einem aliphatischen Ester mittels der Einwirkung einer Esterase oder Lipase erzeugt wird.R'-CH2OH or R'-CHO may be a component in the sample as it is or may be a component produced from an aliphatic ester by the action of an esterase or lipase.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Verfahren für die Herstellung von Carbonsäure, welches bei in Kontakt bringen in Wasser, umfaßt:The invention further relates to a process for the production of carboxylic acid, which, when brought into contact with water, comprises:
1) Eine ω-Carboxylalkoholoxidas, wie oben definiert und1) A ω-carboxyl alcohol oxidase as defined above and
2) R"-CH&sub2;OH oder R"-CHO, worin R"-CH&sub2;OH ein aliphatischer Alkohol mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Alkohol ist und R"-CHO ein korrespondierender aliphatischer Aldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat davon ist, wobei dieser Alkohol oder Aldehyd ein Substrat von dieser ω-Carboxylalkoholoxidase ist und ein Substrat, das eine Carbonsäure in der Gegenwart von Sauerstoff produzieren kann, ist.2) R"-CH2OH or R"-CHO, wherein R"-CH2OH is an aliphatic alcohol other than methanol and ethanol or a ω-carboxylic acid derivative of said alcohol and R"-CHO is a corresponding aliphatic aldehyde or a ω-carboxylic acid derivative thereof, said alcohol or aldehyde being a substrate of said ω-carboxylic alcohol oxidase and being a substrate capable of producing a carboxylic acid in the presence of oxygen.
Die ω-Carboxylalkoholoxidase, die in dem Verfahren für die Herstellung von Carbonsäure verwendet wird, ist nicht beschränkt, so weit sie die oben gezeigten biochemischen Eigenschaften hat. Ein bevorzugtes Enzym ist die ω-Carboxylalkoholoxidase, die von Streptomyces sp. AC 8205 erzeugt wird.The ω-carboxyl alcohol oxidase used in the process for producing carboxylic acid is not limited as long as it has the biochemical properties shown above. A preferred enzyme is the ω-carboxyl alcohol oxidase produced by Streptomyces sp. AC 8205.
Das Substrat R"-CH&sub2;OH ist ein aliphatischer Alkohol mit Ausnahme von Methanol und Ethanol oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Alkohol. Zum Beispiel kann er eine lange Kette von drei oder mehr Kohlenstoffatomen haben, wie HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-CH=CH-(CH&sub2;)&sub8;- OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub3;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C- (CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub5;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub3;-OH und H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub2;-OH. Unter diesen sind HO&sub2;C-(CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C- (CH&sub2;)&sub1;&sub1;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub9;-OH, H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub7;-OH und H&sub3;C-(CH&sub2;)&sub5;-OH bevorzugt. Das Substrat R''-CHO kann ein aliphatischer Aldehyd mit Ausnahme von Formaldehyd und Acetaldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat von diesem Aldehyd sein, zum Beispiel eine korrespondierende Aldehydverbindung des obigen aliphatischen Alkohols oder sein ω-Carbonsäurederivat.The substrate R"-CH₂OH is an aliphatic alcohol other than methanol and ethanol or an ω-carboxylic acid derivative of this alcohol. For example, it may have a long chain of three or more carbon atoms, such as HO₂C-(CH₂)₁₁-OH, HO₂C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₇₃-CH=CH-(CH₂)₈-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C-(CH₂)₁₅-OH, H₃C- (CH₂)₉-OH, H₃C-(CH₂)₇-OH, H₃C-(CH₂)₅-OH, H₃C-(CH₂)₅-OH and H₃C-(CH₂)₅-OH. Among these, HO₂C-(CH₂)₁₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₁₁-OH, H₃C-(CH₂)₅-OH, H₃C-(CH₂)₅-OH are preferred. The substrate R''-CHO may be an aliphatic aldehyde other than formaldehyde and acetaldehyde or an ω-carboxylic acid derivative of this aldehyde, for example a corresponding aldehyde compound of the above aliphatic alcohol or its ω-carboxylic acid derivative.
Die Konzentration davon beträgt bei der Herstellung, zum Beispiel 10 bis 500µM.The concentration during production is, for example, 10 to 500µM.
Das wässrige Medium ist nicht beschränkt. Es ist ein Medium, das Wasser enthält und keine nachteiligen Effekte auf die Enzymreaktion hat. Beispiele sind Wasser oder eine Pufferlösung und ein Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel. Beispiel für organische Lösungsmittel sind Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol oder Aceton oder Gemische davon. Bevorzugte Beispiele sind wäßriges Methanol, wäßriges Ethanol, wäßriges Aceton oder Chloroform.The aqueous medium is not limited. It is a medium that contains water and has no adverse effects on the enzyme reaction. Examples are water or a buffer solution and a solvent mixture of water and an organic solvent. Examples of organic solvents are methanol, ethanol, propanol or butanol or acetone or mixtures thereof. Preferred examples are aqueous methanol, aqueous ethanol, aqueous acetone or chloroform.
Sauerstoff kann bereitgestellt werden, indem sprudelndes Sauerstoffgas, oder falls die Menge an Substrat gering ist, kann in einem wäßrigen Medium gelöster Sauerstoff für die Reaktion verwendet werden.Oxygen can be provided by bubbling oxygen gas, or if the amount of substrate is small, oxygen dissolved in an aqueous medium can be used for the reaction.
Bei der Herstellung von Carbonsäure, kann die erfindungsgemäße ω-Carboxylalkoholoxidase als immobilisiertes Enzym auf einem Träger hergestellt werden.In the production of carboxylic acid, the ω-carboxyl alcohol oxidase according to the invention can be produced as an immobilized enzyme on a carrier.
Die Immobilisation kann mittels eines bekannten Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel ein Träger bindendes Verfahren (binden mit einem unlöslichen Träger über eine kovalente Bindung, eine Ionenbindung oder eine Adsorption), ein Vernetzungsverfahren oder ein Einbettungsverfahren (Polymergel vom Gittertyp, Mikrokapseln oder Hohlfasern) oder eine Kombination davon. Ein bevorzugtes Verfahren ist ein kovalentes Bindungsverfahren oder ein Adsorptionsverfahren.The immobilization can be carried out by a known method, for example, a carrier-binding method (binding with an insoluble carrier via a covalent bond, an ionic bond or an adsorption), a cross-linking method or an embedding method (lattice-type polymer gel, microcapsules or hollow fibers) or a combination thereof. A preferred method is a covalent bonding method or an adsorption method.
Beispiele für Träger sind ein natürliches Polymer, synthetische Polymere und anorganisches Material, wie Zellulose, Agarose, Dextran, Chitin, Kollagen, Tannin, Fibrin, Albumin, Kasein, Carrageenan, Aminosäurepolymere, Polystyrol, Polystyrol mit einer Sulfonatgruppe, Polystyrol mit einer Carboxylgruppe, Polystyrol mit einer Aminogruppe, ein Copolymer eines substituierten oder unsubstituierten Styrolderivatmonomers und Methylstryrol, Ethylstyrol, Chlorstyrol, Ethylen, Propylen, Acrylsäure, Acrylsäuremethylester, Akrylsäureethylester, Methacrylsäure, Methacrylsäuremethylester, Methacrylsäureethylester, Acrylonitril, Acrylamid, Maleinsäure, Fumarsäure, Butadien, Chloropren, Isopren, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinylacetat, Vinyltoluol oder Divinylbenzol, Polyvinyltoluol, Polyester, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyacrylonitril, aminiertes Polyacrylonitril, Polyvinylpyrrolidon, Polyacetatvinylacrylat und Vinylchloridacrylat-Copolymer.Examples of carriers are a natural polymer, synthetic polymers and inorganic material such as cellulose, agarose, dextran, chitin, collagen, tannin, fibrin, albumin, casein, carrageenan, amino acid polymers, polystyrene, polystyrene having a sulfonate group, polystyrene having a carboxyl group, polystyrene having an amino group, a copolymer of a substituted or unsubstituted styrene derivative monomer and methylstyrene, ethylstyrene, chlorostyrene, ethylene, propylene, acrylic acid, methyl acrylate, ethyl acrylate, methacrylic acid, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, acrylonitrile, acrylamide, maleic acid, fumaric acid, butadiene, chloroprene, isoprene, vinyl chloride, vinylidene chloride, vinyl acetate, vinyltoluene or Divinylbenzene, polyvinyltoluene, polyester, polyacrylate, polymethacrylate, polyacrylonitrile, aminated polyacrylonitrile, polyvinylpyrrolidone, polyacetate vinyl acrylate and vinyl chloride acrylate copolymer.
Beispiele von Vernetzungsreagenzien sind Glutaraldehyd, Hexamethylendiisocyanat, Toluoldiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Dialdehydstärke, Dimethyladipidat, Dimethylsulbelimidat und Dimethyl-3,3'-dithio-bis-propionimidat.Examples of cross-linking reagents are glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, toluene diisocyanate, xylene diisocyanate, dialdehyde starch, dimethyl adipidate, dimethyl sulbelimidate and dimethyl-3,3'-dithio-bis-propionimidate.
Die Trägeroberfläche kann vorher mit Hydrazin, Thionylchlorid, Carbodiimid, Phosgen, Ethylenchloroformiat oder Bromcyanid aktiviert werden.The carrier surface can be activated beforehand with hydrazine, thionyl chloride, carbodiimide, phosgene, ethylene chloroformate or bromocyanide.
Die Gestalt des Trägers kann gemäß der Art der Arbeitsweise ausgewählt werden. Er kann ein Pellet-, ein Körnchen-, ein Film-, ein Blatt-, ein Faser- oder ein Geltypträger sein.The shape of the carrier can be selected according to the type of operation. It can be a pellet, granule, film, sheet, fiber or gel type carrier.
Die Reaktionstemperatur ist eine Temperatur, die nicht das Enzym denaturiert, zum Beispiel ungefähr 10 bis 40ºC. Die Reaktionszeit kann gemäß den Bedingungen, wie der verwendeten Enzymmenge, ausgewählt werden. Sie kann nachgewiesen werden, indem das Reaktionsverfahren unter Verwendung von TLC überprüft wird.The reaction temperature is a temperature that does not denature the enzyme, for example, about 10 to 40ºC. The reaction time can be selected according to the conditions such as the amount of enzyme used. It can be detected by checking the reaction procedure using TLC.
Die Enzymaktivität, die in der Reaktion verwendet wird, beträgt im allgemeinen 1 bis 10 Einheiten.The enzyme activity used in the reaction is generally 1 to 10 units.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren Streptomyces sp Ac 8205 FERM BP-2491 oder eine Variante oder Mutante davon, die in der Lage ist eine ω-Carboxylalkoholoxidase, wie oben definiert, herzustellen.The invention further relates to Streptomyces sp Ac 8205 FERM BP-2491 or a variant or mutant thereof which is capable of producing an ω-carboxyl alcohol oxidase as defined above.
Eine ω-Zweibasigesäure, die als Ausgangsmaterial für Kunststoffe und Schmiermittel nützlich ist, kann aus dem Substrat, wie einem ω-Carbonsäurederivat eines aliphatischen Aldehyds, hergestellt werden. Das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren ist vorteilhaft, verglichen mit chemischen Verfahren.An ω-dibasic acid useful as a raw material for plastics and lubricants can be prepared from the substrate such as an ω-carboxylic acid derivative of an aliphatic aldehyde. The enzymatic process of the present invention is advantageous compared with chemical processes.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen weiter die Erfindung.The following examples further illustrate the invention.
Ein wäßriges Medium (pH 7,0; 20 l) enthaltend Pepton 1%, Fischfleischextrakt 1%, Fruktose 2%, NaCl 0,3%, KH&sub2;PO&sub4; 0,3%, MgSO&sub4; 0,3% und Antischaumreagens Disform BC-51Y 0,2% wurde bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Eine Impfkultur (200 ml) von Streptomyces sp. AC 8205 FERM BP-2491, die vorher in dem selben Medium kultiviert worden ist, wurde in dem obigen Medium geimpft und bei 28ºC 55 Stunden lang eingetaucht, unter aseptischer Durchlüftung von 20 l/min und 300 U/min Rühren, kultiviert (0,01 Einheiten/ml).An aqueous medium (pH 7.0; 20 L) containing peptone 1%, fish meat extract 1%, fructose 2%, NaCl 0.3%, KH₂PO₄ 0.3%, MgSO₄ 0.3% and antifoam reagent Disform BC-51Y 0.2% was sterilized at 120 ºC for 20 minutes. A seed culture (200 ml) of Streptomyces sp. AC 8205 FERM BP-2491 previously cultured in the same medium was inoculated in the above medium and immersed at 28 ºC for 55 hours under aseptic aeration of 20 L/min and 300 rpm stirring (0.01 units/ml).
Die kultivierte Nährlösung (17 l) wurde zentrifugal bei 5000 U/min 10 Minuten lang aufgetrennt und die erhaltenen Zellen wurden in 10 mM Phophatpuffer (pH 7,0; 8 l) suspendiert, der 0,1% Triton X-100 und 1 mg/ml Lysozym enthält, sodann wurde bei 37ºC 2 Stunden lang autolysiert. Das Gemisch wurde bei 5000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um eine Rohenzymextraktlösung (7,8 l) zu erhalten. Aceton (zweifaches Volumen) wurde dazu hinzugefügt und das Präzipitat wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), der 20% Ammoniumsulfat enthält, gelöst.The cultured broth (17 L) was centrifugally separated at 5000 rpm for 10 minutes, and the resulting cells were suspended in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0; 8 L) containing 0.1% Triton X-100 and 1 mg/ml lysozyme, followed by autolysis at 37°C for 2 hours. The mixture was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to obtain a crude enzyme extract solution (7.8 L). Acetone (twice volume) was added thereto, and the precipitate was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 20% ammonium sulfate.
Unlösliches Material wurde mittels Zentrifugierens bei 12000 U/min 10 Minuten lang entfernt. Eine Octyl-Sepharose CL-6B Säule (2,6 x 10 cm) wurde mit der überstehende Lösung (490 ml) beschickt, um das Enzym zu adsorbieren. Des weiteren wurde die Säule einer Elution mit 15% Ammoniumsulfatlösung (300 ml) und 10% Ammoniumsulfatlösung (300 ml) unterworfen und die aktiven Fraktionen, die gemäß des Assayverfahrens gemessen wurden, d.h. die Fraktionen (300 ml), die mittels 10% Ammoniumsulfat eluiert wurden, wurden gesammelt und in einem Zelluloseacetatrohr gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5; 5 l) bei 4ºC 15 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wurde lyophilisiert, um gereinigte ω-Carboxylalkoholoxidase (155 mg, 0,3 Einheiten/min) zu erhalten.Insoluble material was removed by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes. The supernatant solution (490 ml) was charged to an Octyl-Sepharose CL-6B column (2.6 x 10 cm) to adsorb the enzyme. Further, the column was subjected to elution with 15% ammonium sulfate solution (300 ml) and 10% ammonium sulfate solution (300 ml), and the active fractions measured according to the assay procedure, i.e., the fractions (300 ml) eluted with 10% ammonium sulfate, were collected and dialyzed in a cellulose acetate tube against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5; 5 L) at 4°C for 15 hours. The dialysate was lyophilized to obtain purified ω-carboxyl alcohol oxidase (155 mg, 0.3 units/min).
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,5 ml0.2 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) 0.5 ml
0,3 % 4-Aminoantipyrin 0,3 ml0.3% 4-aminoantipyrine 0.3 ml
0,2% Phenol 0,3 ml0.2% Phenol 0.3ml
Peroxidase (45 Einheiten/ml) 0,2 mlPeroxidase (45 units/ml) 0.2 ml
ω-Carboxylalkoholoxidase (5 Einheiten/ml) 0,1 mlω-Carboxyl alcohol oxidase (5 units/ml) 0.1 ml
Wasser 0,6 mlWater 0.6 ml
12-Hydroxydodecansäure (20 µl) wurde zu dem obigen Reaktionsgemisch hinzugefügt, bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert und dann wurde die Absorbanz bei 500 nm gemessen.12-Hydroxydodecanoic acid (20 µl) was added to the above reaction mixture, incubated at 37ºC for 10 minutes, and then the absorbance was measured at 500 nm.
Die Ergebnisse werden in Figur 5 gezeigt. Eine gute Standardkurve wird erhalten.The results are shown in Figure 5. A good standard curve is obtained.
Das in Beispiel 1 hergestellte Enzym wurde in 0,2 M PIPES-NaOH Puffer (pH 7,3; 0,5 ml) gelöst. Diese Enzymlösung (2 Einheiten) und Katalse (Rinderleber, 5 Einheiten) wurde zu der in Aceton (10 ml) gelösten 12-Hydroxydodecansäure (100 mg) hinzugefügt und bei 28ºC 18 Stunden reagieren gelassen.The enzyme prepared in Example 1 was dissolved in 0.2 M PIPES-NaOH buffer (pH 7.3; 0.5 ml). This enzyme solution (2 units) and catalse (beef liver, 5 units) were added to the 12-hydroxydodecanoic acid (100 mg) dissolved in acetone (10 ml) and allowed to react at 28°C for 18 hours.
Das getrocknete Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform-Methanol (2:1) (5 ml) und Wasser (2 ml) gemischt. Die Chloroformschicht wurde getrocknet, um die zweibasige Säure, 1,12- Dodecandicarbonsäure (75 mg) zu erhalten.The dried reaction mixture was mixed with chloroform-methanol (2:1) (5 mL) and water (2 mL). The chloroform layer was dried to give the dibasic acid, 1,12-dodecanedicarboxylic acid (75 mg).
TLC:Rf = ungefähr 0,8 [Kieselsäuregel 60 Platte, Entwickler: Chloroform-Methanol-Aceton (80:20:5), Detektion: 0,03% Methylrot-95% Ethanollösung]TLC:Rf = approximately 0.8 [Silica gel 60 plate, Developer: chloroform-methanol-acetone (80:20:5), Detection: 0.03% methyl red-95% ethanol solution]
Beispiel 3 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Acetonlösung von 12-Hydroxydodecansäure durch 16- Hydroxyhexadecansäure (100 mg), die in Chloroform (10 ml) gelöst worden war, ersetzt wurde und die Rektionszeit 15 Stunden beträgt, um 1,16-Hexadecandicarbonsäure zu erhalten (72 mg).Example 3 was repeated except that the acetone solution of 12-hydroxydodecanoic acid was replaced by 16-hydroxyhexadecanoic acid (100 mg) dissolved in chloroform (10 ml) and the reaction time was 15 hours to obtain 1,16-hexadecanedicarboxylic acid (72 mg).
Herstellung einer Carbonsäure unter Verwendung von immobilisiertem Enzym:Preparation of a carboxylic acid using immobilized enzyme:
Aminierte Polyacrylnitrilfasern (2,0 g Feuchtgutmasse) wurden mit 25% Glutaraldehyd bei 0ºC 1 Stunde lang behandelt, mit einem Glasfilter gefiltert und mit gereinigtem Wasser gewaschen (200 ml).Aminated polyacrylonitrile fibers (2.0 g wet weight) were treated with 25% glutaraldehyde at 0ºC for 1 hour, filtered with a glass filter and washed with purified water (200 ml).
Das Enzym (25 ml, 30 Einheiten) wurde in 1M Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, mit den Fasern in Kontakt gebracht, bei 30ºC 30 Minuten lang gerührt, mit einem Glasfilter gefiltert und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (50 ml) gewaschen, um das immobilisierte Enzym (2,1 g) zu erhalten.The enzyme (25 ml, 30 units) was dissolved in 1M phosphate buffer (pH 7.0), contacted with the fibers, stirred at 30ºC for 30 min, filtered with a glass filter and washed with 10 mM Tris-HCl buffer (50 ml) to obtain the immobilized enzyme (2.1 g).
Immobilisierungsverhältnis: 73%Immobilization ratio: 73%
Geäußerte Aktivität : 67%Expressed activity : 67%
Immobilisiertes Enzym (200 mg), wie oben in (1) erhalten, wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 4 verwendet. Zweibasige 1,16-Hexadecandicarbonsäure (80 mg) wurde hergestellt.Immobilized enzyme (200 mg) as obtained in (1) above was used under the same conditions as in Example 4. 1,16-hexadecanedicarboxylic dibasic acid (80 mg) was prepared.
Die Erfindung stellt ein neues Enzym, ω-Carboxylalkoholoxidase, zur Verfügung. Dieses Enzym ist nützlich für die Analyse und Bestimmung verschiedener Alkohole und als Enzym-Diagnostikum. Des weiteren kann eine Carbonsäure unter Verwendung des Enzyms aus Alkohol oder Aldehyd hergestellt werden. Insbesondere kann eine zweibasige Säure aus ω-Carbonsäuren von aliphatischen Alkoholen oder Aldehyden hergestellt werden. Unter den zweibasigen Säuren, wird eine C&sub6;&submin;&sub1;&sub5; zweibasige Säure als Ausgangsstoff verwendet, zum Beispiel als Monomer für Kunststoffpolymere, synthetische Fasern, wie Nylon, Frostschutzmittel-Weichmacher (antifreeze plasticizer) oder Schmiermittel. Beispiele sind Brassilsäure und Pentadecandisäure, bei welchen, wenn das erstgenannte verestert wird, ein Polyester hergestellt wird und wenn es aminiert wird, ein Polyamide hergestellt wird. Diese können für synthetische Kunststoffe, synthetische Schmierstoffe, Weichmacher oder Parfüme verwendet werden. Das letztgenannte wird als Ausgangsstoff für das Neutralparfüm Cyclopentadecanon verwendet. Dieses Stoffe sind schwierig mit niedrigen Kosten mittels chemischer Synthesen herzustellen und folglich stellt die vorliegende Erfindung nützliche Herstellungsverfahren zur Verfügung.The invention provides a novel enzyme, ω-carboxyl alcohol oxidase. This enzyme is useful for the analysis and determination of various alcohols and as an enzyme diagnostic. Furthermore, a carboxylic acid can be prepared from alcohol or aldehyde using the enzyme. In particular, a dibasic acid can be prepared from ω-carboxylic acids of aliphatic alcohols or aldehydes. Among the dibasic acids, a C6-15 dibasic acid is used as a raw material, for example, as a monomer for plastic polymers, synthetic fibers such as nylon, antifreeze plasticizers or lubricants. Examples are brassilic acid and pentadecanedioic acid, in which when the former is esterified, a polyester is prepared and when it is aminated, a polyamide is prepared. These can be used for synthetic plastics, synthetic lubricants, plasticizers or perfumes. The latter is used as a starting material for the neutral perfume cyclopentadecanone. These substances are difficult to produce at low cost by chemical synthesis and therefore The present invention provides useful manufacturing processes.
Des weiteren kann das erfindungsgemäße Assayverfahren für einen aliphatischen Alkohol und einen aliphatischen Aldehyd oder ein ω-Carbonsäurederivat davon quantitativ und genau durchgeführt werden. Da ein ω-Carbonsäurederivat eines aliphatischen Alkohols ein Zwischenprodukt für eine ω-hydroxylierte Fettsäure ist, ist das erfindungsgemäße Assayverfahren nützlich für ein Zwischenstoffwechselprodukt einer Fettsäure und für das Screening nach dem Enzym im Metabolismus der Fettsäure.Furthermore, the assay method of the present invention can be quantitatively and accurately carried out for an aliphatic alcohol and an aliphatic aldehyde or a ω-carboxylic acid derivative thereof. Since a ω-carboxylic acid derivative of an aliphatic alcohol is an intermediate for a ω-hydroxylated fatty acid, the assay method of the present invention is useful for an intermediate metabolite of a fatty acid and for screening for the enzyme in the metabolism of the fatty acid.
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