DE69001026T2 - Attenuierte viren. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft die Konstruktion von Vakzinen gegen Rhino- und Enteroviren, insbesondere Polioviren, durch Einführen von definierten Mutationen in deren Genome. Diese Mutationen schwächen die Virulenz der Wildtyp-Viren. Ferner können sie auch das präsente "Leben" der abgeschwächten Vakzin-Virusstämme schwächen, wodurch die Wahrscheinlichkeit, daß sie wieder virulent werden, geringer wird.
• Derzeit sind die einzigen routinemäßig eingesetzten Vakzine gegen Entero- und Rhinovirus- Infektionen solche gegen Poliomyelitis. Unter diesen haben die von Sabin in den 50iger Jahren (1950) entwickelten geschwächten Lebend-Vakzine überall in der Welt größte Verwendung gefunden. Es wurden von jedem der drei Poliovirus-Serotypen (P1, P2 und P3) abgeleitete Vakzinstämme erzeugt und zwar durch solanges Passagieren der Wildtyp-Viren durch Zellkulturen und ganze Tiere, bis geschwächte Stämme vorlagen. Diese geschwächten Viren sind gegenüber den ursprünglichen Wildtyp-Stämmen substantiell weniger fähig, beim Menschen Poliomyelitis zu verursachen. Sie werden oral verabreicht und replizieren sich im Darm, so daß eine schützende Immunantwort induziert wird.
• Diese Vakzine gelten im zwar allgemeinen als sicher, dennoch ist mit deren Einsatz bei den Geimpften ein geringes Lähmungsrisiko verbunden. Am häufigsten tritt dies bei den Serotypen Typ- 2 und Typ-3 auf, selten, wenn überhaupt, bei Typ-1. Es besteht daher das Bedürfnis, die Typ-2 und Typ-3-Vakzine so zu verbessern, daß sie in bezug auf die Sicherheit vergleichbar zum hervorragenden Typ-1-Stamm werden. Ferner besteht ein Bedürfnis nach Vakzinen gegen andere Rhino- und Enteroviren, bspw. gegen Echo-, Coxsackie- und Hepatitis-A-Viren.
• Die Sabin-Vakzin-Stämme wurden im wesentlichen durch empirische Verfahren entwickelt. Die genetische Ursache für deren Abschwächung wurde aber nicht recht verstanden. In den letzten Jahren konnten die Forscher jedoch bei den Untersuchungen, durch welchen Mechanismus die Neurovirulenz dieser Vakzinstämme vermindert wird, eine ganze Zahl von molekular-biologischen Techniken einsetzen. Der größte Teil der Arbeit konzentrierte sich hierbei auf die Serotypen 1 und 3. Die vollständigen Nucleotidsequenzen dieser beiden Stämme wurden mit denen der neurovirulenten Mutterstämme verglichen.
• Im Fall des Poliovirus-Typ1 unterscheidet sich der Vakzin- vom Mutterstamm an 47 Stellen im 7441 Basen großen Genom [Nomoto et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79, 5793-5797]. Dies sind alle einfache Punktmutationen und 21 davon verursachen Aminosäureänderungen bei viral kodierten Proteinen. Obwohl man bei einigen Punktmutationen annimmt, daß sie zum geschwächten Phänotyp des Impfstammes beitragen, direkt gezeigt und bewiesen wurde es für die ATG Mutation an Position 480 der nicht-kodierenden 5'-Genomregion, wobei die Mutation eine merkliche Schwächung des Virus bewirkt [Nomoto et al. (1987) UCLA Symp. Mol. Cell Biol., New Series, Bd. 54, 437-452 (Hrsg.: M.A. Brinton und R.R.Rueckert) New York: Alan R.Liss.Inc.].
• Analoge Untersuchungen an Poliovirus-Typ3 offenbarten, daß im 7432 Basen großen Genom zwischen dem Vakzin- und seinem Mutterstamm nur ein 10 Nucleotide umfassender Sequenzunterschied besteht (Stanway et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81, 1539-1543). Nur drei davon veranlassen Aminosäuresubstitutionen bei den viral kodierten Proteinen. Die Konstruktion von definierten Rekombinanten zwischen dem Vakzin- und seinem Mutterstamm erlaubte die Identifizierung der zum geschwächten Phänotyp beitragenden Mutationen. Eine davon befindet sich an Position-2034 und verursacht im Virusprotein VP3 den Austausch eines Serins durch Phenylalanin.
• Die andere interessante Mutationen ist CTU an Position-472 in der nicht-kodierenden 5'- Region des Genoms. Bei der letzteren Mutation wurde beobachtet, daß das Virus bei der Replikation im menschlichen Darm rasch wieder zum Wildtyp-C zurückkehrt [Evans et al. (1985) Nature 314, 548- 550]. Diese Reversion ist mit einer Zunahme der Neurovirulenz verbunden. Ferner wurde gezeigt, daß ein C an der Position-472 für das rekombinante Maus/Mensch-Poliovirus im Maushirn wichtig ist [LaMonica et al. (1986) J. Virol. 57, 515-525]. Wir konnten jüngst beobachten, daß analog bei Poliovirus-Typ2 an Position 481 A zu G wird und zwar bei der Replikation des Typ2-Vakzins im Darm der Geimpften. Und Minor & Dunn [(1988) J. gen. Virol. 69, 1091-1096] analysierten die Sequenzen in der nicht-kodierenden 5'-Region der Sabin-Vakzin-Poliovirusstämme: Dadurch sollten die Mutationen bestimmt werden, welche die Fähigkeit des Virus, sich im menschlichen Darm zu replizieren, beeinflussen.
• Die in der EP-A-0323900 beschriebenen geschwächten Rhino- und Enteroviren - insbesondere die 25 Polioviren - besitzen eine Attenuatmutation an einer Position, die entweder die Position- 479 und/oder die Position-482 des Poliovirus-Typ3 (Leon-Stamm) ist oder ihr entspricht. Diese geschwächten Viren können auch eine Mutation an Position-472 aufweisen.
• Wir haben die Mutationen an mehreren Stellen untersucht; diese Stellen liegen im Bereich der Nucleotide 470 bis 540 der nicht-kodierenden 5'-Region des Wildtyp-Poliovirus-Typ3, Leon- Stamm. Wir haben gefunden, daß Polioviren mit einer Einzelmutation im Bereich der Position-471 geschwächt wurden. Hingegen war eine Einzelmutation an Position-480 nicht abschwächend. Multiple Mutationen#-in dieser Region waren manchmal lethal.
• Diese Befunde können auf alle Polioviren extrapoliert werden. Sie können insbesondere auch auf die anderen Entero- und Rhinoviren übertragen werden: Mutationen an einer Position, die der Position-471 entspricht, führen auch bei anderen Entero- und Rhinoviren zu einer möglichen Abschwächung. Alle Entero- und Rhinoviren besitzen bzgl. der Genom-RNA einen hohen Grad an Homologie. Bei den anderen Entero- und Rhinovirusstämmen kann man die Position, die der Position-471 (die Numerierung erfolgt nach der o.g. Veröffentlichung von Stanway et al.) des Poliovirus-Typ3 (Leon-Stamm) entspricht, so bestimmen, daß man die Sequenzen der Genom-RNA von den Stämmen aneinanderlegt.
• Die Erfindung betrifft somit abgeschwächte Entero- und Rhinoviren mit einer Attenuatmutation an einer Position, die im Genom des Poliovirus-Typ3, Leon-Stamm, die Position- 471 einnimmt - oder einer entsprechenden Position -, wobei in diesem Genom sich die Positionszahlen so ergeben, daß die Anfangs- und die Endposition der folgenden Nucleotidsequenz AUCCUAACCAUGGAG als Position-470 bzw. Position-484 gesetzt werden.
• Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf Polioviren anwendbar. Das abgeschwächte Poliovirus kann ein Poliovirus vom Typ1, Typ2 oder Typ3 sein. Die Typen 2 und 3 sind bevorzugt. Bei den Typen 1 und 2 entspricht Position-468 der Position-471 von Poliovirus-Typ3.
• Wir haben insbesondere herausgefunden, daß eine UTA-Mutation an Position-471 des Poliovirus-Typ3-(Leon-Stamm)-Genoms zu einer Abschwächung führt. Abgeschwächte Polioviren des Typs 1 oder 2 können auch eine Attentuatmutation an Position-468 - üblicherweise eine UTA- Mutation - enthalten.
• Das abgeschwächte Virus gemäß der Erfindung wird durch ein Verfahren hergestellt, das umfaßt: (i) Einführen der angestrebten Mutation durch punktgesteuerte Mutagenese in einem subklonierten Bereich - der die zur Mutation vorgesehene Position enthält - der cDNA eines Entero- oder Rhinovirus; (ii) Wiedereinführung des so geänderten Bereichs in die Gesamt-DNA, welcher der Bereich entnommen worden ist, und (iii) Herstellen eines aktiven Virus aus der resultierenden DNA.
• Mutationen können in Entero- oder Rhinoviren, z.B. in Wildtyp-Virus- oder Vakzinvirusstämmen, eingeführt werden durch punktgesteuerte Mutagenese der genomischen RNA. Dies erfolgt so, daß man zunächst die entsprechende Region einer infektiösen Genom-DNA-Kopie aus irgendeinem der Virusstämme, bspw. eines Vakzinstammes oder seines Mutterstammes, in einen einzelstängigen Bakteriophagen, wie M13, subkloniert. Der Virusstamm kann ein neurovirulenter Stamm sein, bevorzugt sind aber Vakzinstämme. Das Poliovirus kann bspw. der Sabin-Typ3-Leon- oder der Mahoney- Typ1-Stamm sein. Die angestrebte Mutation wird dann in die subklonierte cDNA eingeführt und zwar durch die Technik der oligonucleotid-gesteuerten Mutagenese.
• Nach dem Einführen der Mutation werden dann die modifizierten subklonierten cDNAs wieder in die Gesamt-cDNA, der sie entstammen, eingebracht und - zur Überprüfung der Virulenz in Maus - im weiteren in eine cDNA von einem Maus-Poliovirus-Derivat, das in Mäusen eine poliomyelitisartige Krankheit hervorruft (LaMonica et al, 1986). Das Lebend-Virus wird aus der mutierten DNA voller Länge gewonnen, indem man mit Hilfe eines T7-Promoters die positiv gerichtete RNA durch in-vitro- Transkription herstellt [Van der Werf et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 2330-2334]. Die gewonnene RNA kann mittels Standardverfahren in die Gewebekulturen eingebracht werden [Koch (1973) Curr. Top Microbiol. Immun. 61, 89-138]. Nach 4 bis 6 Tagen Inkubation kann dann das Virus aus dem Überstand der Gewebekultur gewonnen werden. Der Neurovirulenzgrad des modifizierten Virus kann dann in Maus mit Hilfe eines Standard-LD50-Tests mit dem des unmodifizierten Virus verglichen werden (LaMonica et al, 1986) oder auch mit dem von der WHO gebilligten Affentest zur Vakzinsicherheit [WHO Tech. Rep. Ser. (1983) 687, 107-175].
• Die abgeschwächten Viren können als Vakzine verwendet werden. Sie können somit als pharmazeutische Zubereitungen formuliert werden und diese pharmazeutisch akzeptable Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Es kann jedes herkömmliche Trägermaterial oder Verdünnungsmittel verwendet werden. So werden z.Z. eingesetzte abgeschwächte Lebend-Poliovirus-Stämme in einer 1 molaren MgCl&sub2;-Lösung stabilisiert und als eine Mischung der drei Serotypen verabreicht.
• Die abgeschwächten Viren können daher bei menschlichen Patienten zur Verhinderung von Infektionen, durch Entero- oder Rhinoviren verursachte, verwendet werden. Hierzu können sie oral verabreicht werden, bspw. als Nasenspray, oder parenteral, z.B. durch eine subcutane oder intramuskuläre Injektion. Es kann eine Dosis verabreicht werden entsprechend der Menge eines herkömmlich Lebend-Virus-Impfstoffs. Im Fall von Poliovirus beträgt sie bspw. für einen Sabin-Vakzinstamm bis zu 10&sup6; TCID&sub5;&sub0;. Das nachstehende Beispiel soll die Erfindung veranschaulichen:
BEISPIEL DNA-Konstruktionen
• Ein synthetischer T7-Polymerase-Promotor wurde in den EcoRI/Hind3-Linker von pBR322 kloniert; es wurde pBRT7 erhalten. Der Linker besaß 5' zur Hind3-Stelle eine Stu1-Stelle. Das Produkt besaß zwischen dem T7-Polymerase-Promotor und der Stu1-Stelle folgende Sequenz: TTC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG CCT.
• Dadurch konnten Sequenzen mit dem T7-Promotor ligiert werden und es waren nur zwei zusätzliche G an das 5'-Ende des RNA-Transkripts hinzuzufügen. Das äußere 5'-Ende von pOLIO- LEON (Stanway et al., 1984), das einen Poly-G-Schwanz aufweist und aufgrund des cDNA- Klonierungsverfahren eine Pst1-Stelle besitzt, wurde durch einen Linker folgender Sequenz ersetzt: TAT GAC GCG TGC GGC CGC AAG CTT TAA AAC&sub7;... (nicht-kodierende 5'-Polioregion) ... GGTAC&sub7;&sub0;.
• Das 5'-Ende wurde somit von einer Hind3-Stelle begrenzt, hingegen gingen die Pst1-Stelle und der Poly-G-Schwanz verloren. Die Kpn1-Stelle - an Position-70 in Leon - wurde als 3'-Ende des Linkers verwendet. Mit Hilfe dieser Konstruktion wurde das 5'-Ende von pOLIO-LEON von der Hind3- zur BamH1-Stelle (674) in pBRT7 kloniert; dies ergab pBRT75'L. Die nicht-kodierende 5'-Region wurde unter die Kontrolle des T7-Promotors gebracht. Hierzu wurde pBRT75'L mit Stu1 und Hind3 verdaut, dann die Hind3-Stelle mit Mung-Bean-Nuclease glatt gemacht und religiert; dies ergab p1-5 MBN. Die Sequenz zwischen dem T7-Promotor und dem 5'-Poliovirus las sich dann wie folgt: TTCGAAATTAATACGACTCACTATAGGTTAAAAC-.
• Die Sst1-Stelle am 3'-Ende der Hybrid-Poliovirus-Typ3-(Leon/Typ2)-Startsequenz in pVN23 [Racaniello & Meriam (1986) Virol., 155, 498-507] wurde entfernt und zwar durch partiellen Verdau mit Sst1, Auffüllen mit T4-Polymerase und Religieren. Die Poliovirus-Sequenzen von diesem Plasmid wurden dann - nach Verdau beider Plasmide mit Mlu1 und Sal1 - in p1-5 MBN kloniert; es wurde pT7SFP erhalten. Das infektiöse Virus wurde durch Linearisieren von pT7SFP mit Sal1 gewonnen. Die Synthese einer RNA voller Länge erfolgte mit T7-Polymerase, und die Transfektion der RNA in Hela-Zellen wurde mit dem DEAE-Dextran-Verfahren durchgeführt (Van der Werf et al., 1986).
• Das Template (die DNA-Vorlage) für die in-vitro-Mutagenese wurde so hergestellt, daß man die nicht-kodierende 5'-Region von Poliovirus-Typ3, Leon, aus pVN23 (LaMonica et al., 1986) in das M13-Derivat von mICE [Epernon (1986) Nucl. Acids Res., 14, 2830) subklonierte, wobei die Hind3- und die Sst1-Stelle benutzt wurden. Die Mutationen wurden dann in dieses subklonierte DNA-Fragment eingeführt durch Einsatz der Technik der oligonucleotid-gesteuerten Mutagenese [Zoller & Smith (1982) Nucl. Acids Res. 10, 6487-6500]. Die chemisch synthetisierten DNA-Oligonucleotide, die zur Einführung der erfindungsgemäßen Attenuat-Mutation verwendeten, sind unten in Tabelle 1 gezeigt: TABELLE 1 Mutante Oligonucleotid
• Die Mutanten wurden so hergestellt, daß man die Oligonucleotide an das klonierte Einzelstrang-DNA-Fragment des M13-Phagenderivats hybridisierte. Diese Oligonucleotide waren zur Zielregion komplementär, ausgenommen an der zu mutierenden Position, wo sie eine zur angestrebten Mutation komplementäre Base enthielten. Die zusammenhybridisierten M13- und Oligonucleotid- DNA wurden dann in einer Reaktionsmischung inkubiert, die die DNA-Vorläufer sowie die Enzyme DNA-Polymerase und DNA-Ligase enthielt. Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC wurde die geschlossene zirkuläre DNA durch Agarosegel-Elektrophorese aus der Mischung isoliert. Diese DNA wurde dann zur Transformation von E.coli mutS oder mutL (denen die DNA-Fehlpaarungsreparatur fehlte) verwendet und diese dann auf einen E.coli-JM101-Rasen ausplattiert.
• Die M13-Plaques, die sich in diesem E.coli-Rasen entwickelten, wurden gepickt, die Phagen vermehrt und einzelsträngige M13-DNA isoliert. Die DNAs wurden dann nach der Methode von Sanger sequenziert und die mit der gewünschten Mutation identifiziert. Von jenen wurden größere Mengen an doppelsträngiger DNA, replikative Form, hergestellt, und das Mlu1-Sst1-Fragment, welches das Basenpaar-471 der infektiösen Poliovirus-cDNA mit der Mutation enthielt, gewonnen.
• Das mutierte cDNA-Fragment wurde dann wieder in pT7SFP eingeführt. Von der mutierten cDNA voller Länge wurde das Lebend-Virus gewonnen, indem zunächst ab dem T7-Promoter in-vitro ein RNA-Transkript positiver Richtung (Van der Werf et al, 1986) hergestellt wurde. Dieses wurde dann mit Standardverfahren (Koch) in Gewebekultur-Hela-Zellen eingebracht. Nach 4 bis 6 Tagen Inkubation trat ein cytopathischer Effekt auf, und das Virus konnte aus dem Überstand gewonnen werden.
• Das gewonnene Virus wurde plague-gereinigt und in Hela-Zellen vermehrt. Diese Virusausgangsmenge wurde zur Herstellung von RNA verwendet und daraus - durch Nucleotidsequenzierung über Primerextension (Evans et al., 1984) - die Sequenz der Virusmutante verifiziert. Ein Teil der Ausgangsmenge wurde auch verwendet, um mit den vorstehend beschriebenen Verfahren die Neurovirulenz zu bestimmen.
• Die Sequenzen von Base 470 bis 484 der Genom-RNA des Poliovirus-Typ3, Leon-Stamm, und die von diesen Mutanten abgeleiteten Stämme, einschließlich der Mutante 26, sind nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. Die Mutationen sind durch kleine Buchstaben dargestellt. Ferner ist die Lebensfähigkeit der Stämme beschrieben: "+" steht für lebensfähig, "-" für das Gegenteil. Von den lebensfähigen Stämmen waren der Leon-Mutterstamm und die Mutante 14 virulent. Die Mutante 26 war geschwächt. Der LD&sub5;&sub0;-Wert für die Mutante 14 betrug 10¹ pfu, und für Mutante 26 war er 10&sup5;-10&sup6; pfu. TABELLE 2 Mutante Sequenz (470-484) Lebensfähigkeit

Claims (9)

1. Abgeschwächtes Entero- oder Rhinovirus mit einer Attenuatmutation an mindestens einer - oder einer damit entsprechenden - Position, die im Genom des Poliovirus-Typ3, Leon- Stamm, die Position-471 einnimmt, wobei in diesem Genom sich die Positionszahlen so ergeben, daß die Anfangs- und die Endposition der folgenden Nucleotidsequenz AUCCUAACCAUGGAG als Position-470 bzw. -484 gesetzt werden.

2. Abgeschwächtes Virus nach Anspruch 1, das ein Poliovirus ist.

3. Abgeschwächtes Virus nach Anspruch 2, das ein Poliovirus-Typ1 ist.

4. Abgeschwächtes Virus nach Anspruch 2, das ein Poliovirus-Typ2 ist.

5. Abgeschwächtes Virus nach Anspruch 2, das ein Poliovirus-Typ3 ist.

6. Abgeschwächtes Virus nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Base an Position-471 oder einer entsprechenden Position ein Adenin ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten Entero- oder Rhinovirus gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:

(i) Einführen der angestrebten Mutation durch punktgerichtete Mutagenese in einem subklonierten Bereich - der die zur Mutation vorgesehene Position enthält - der cDNA eines Entero- oder Rhinovirus;

(ii) Wiedereinführung des so geänderten Bereichs in die Gesamt-DNA, welcher der Bereich entnommen worden ist, und

(iii) Herstellen eines aktiven Virus aus der resultierenden DNA.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch akzeptables Träger- oder Verdünnungsmittel sowie ein abgeschwächtes Virus gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt.

9. Abgeschwächtes Virus nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 als Mittel zum Impfen eines Patienten gegen Entero- oder Rhinovirus.