DE68927930T2 - PRODUCTION OF FREEZED GOODS OR OTHER PRODUCTS - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung steht im Zusammenhang mit der Produktion von gefrorenen Lebensmitteln, insbesondere von Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten.The present invention is related to the production of frozen foods, in particular foodstuffs and other biological products.
Um zufriedenstellendes Einfrieren von Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten zu gewärleisten, mußten diese Produkte bisher weit unter den Temperaturen eingefroren werden, bei denen solche Produkte normalerweise eingefroren werden, um "super-cooling" zu vermeiden. "Super-cooling" kann sowohl innerhalb der Zellenfeuchtigkeit als auch außerhalb der Zellenfeuchtigkeit vorkommen, die in Nahrungsmitteln vorliegt, was ein zufriedenstellendes Einfrieren des Produkts verhindert. Obwohl die Wahrscheinlichkeit des "super-cooling" von Menge zu Menge sehr verschieden sein kann, hat das Risiko des "super-cooling" jedoch dazu geführt, daß ein Einfrieren in Kühlanlagen bei Temperaturen bis -40 C geschieht, um solche Risiken zu vermeiden. Außerdem werden Nahrungsmittel und andere biologische Produkte eine außergewöhnliche lange Zeit bei diesen tiefen Temperaturen gehalten, um Probleme, die im Zusammenhang mit "super-cooling" entstehen, vermieden werden. Die Bedingungen, die nötig sind, um sehr niedrige Temperaturen auf eine lange Zeit zu gewährleisten, haben nicht nur sehr hohe Energiekosten zufolge, sondern ein anderes Problem, das eine Folge des "super-cooling" ist; die Tendenz dazu, daß die Eiskristalle in den Nährmitteln sehr groß werden, wobei sie die organoleptische und strukturelle Eigenschaften der eingefrorenen Lebensmittel vermindern. In ähnlicher Weise kann der Verlust des Auftautropfens (normalerweise wird daran die Qualität des gefrorenen Produktes gemeßen) sich vergrößern falls im eingefrorenen Zustand "super-cooling" vorkommt. Das konventionelle Verfahren war bisher, durch die Beeinflußung des schnellen Einfrierens der Produkte die Formierung von Eiskristallen, die eine Folge des "super-cooling" sind, zu verhindern. Als Alternative werden auch Zusatzstoffe benutzt wie z.B. Emulgiermittel in Speiseeis oder "cryoprotectants" wie z.B. Glycerol oder Zucker in anderen Produkten. Diese Vorgänge erfordern jedoch eine Abkühlung auf sehr tiefe Temperaturen, die wiederum hohe Energiekosten zufolge haben.To ensure satisfactory freezing of food and other biological products, these products have had to be frozen well below the temperatures at which such products are normally frozen in order to avoid super-cooling. Super-cooling can occur both within the cell moisture and outside the cell moisture present in food, preventing satisfactory freezing of the product. Although the probability of super-cooling can vary greatly from batch to batch, the risk of super-cooling has led to freezing in refrigeration systems at temperatures as low as -40 C in order to avoid such risks. In addition, food and other biological products are kept at these low temperatures for an exceptionally long time in order to avoid problems associated with super-cooling. The conditions required to ensure very low temperatures for a long time not only result in very high energy costs, but also in another problem which is a consequence of super-cooling; the tendency for the ice crystals in the food to become very large, reducing the organoleptic and structural properties of the frozen food. Similarly, the loss of the thawing drop (which is usually the reason for the quality of the frozen product) measured) increase if super-cooling occurs in the frozen state. The conventional method has so far been to prevent the formation of ice crystals, which are a consequence of super-cooling, by influencing the rapid freezing of the products. As an alternative, additives are also used, such as emulsifiers in ice cream or cryoprotectants such as glycerol or sugar in other products. However, these processes require cooling to very low temperatures, which in turn results in high energy costs.
Die Folgen bestimmter aktiver eiskeimbildende Wirkstoffe, die von verschiedenen Bakterien bei der Abspaltung der Eiskristalle produziert werden, haben kürzlich besonders ihrer Fähigkeit wegen, künstlichen Schnee für Skipisten erzeugen zu können und ihrer Rolle wegen, die sie bei Frostschaden spielen, das wißenschaftliche Intereße erregt. Insbesondere wurde in weiten Kreisen von den Eis-abspaltenden Eigenschaften von Pseudomonas syringae berichtet. (Siehe z.B. Maki et. al. Applied Microbiology, September 1974, S. 456.) In den letzten Jahren sind diese Eigenschaften mit besonderer Betonung der Rolle von Pseudomonas syringae oder einem daraus gewonnen Protein, das Frostschäden an wachsenden Pflanzen verursacht, untersucht worden. (Siehe z. B. Lindow, Plant Disease, March 1983, S. 327). Die Frage der Bewilligung von Experimenten in der offenen Umwelt, die Mutanten von Pseudomonas syringae beinhalten, die derart mutiert wurden, daß das Eis-abspaltende Gen eliminiert wurde, erregten bemerkenswertes Aufsehen in der Preße. In der Hoffhung, die Population der Eis- abspaltenden Pseudomonas syringae zu reduzieren, sollen diese Mutanten mit den natürlich auf Pflanzen vorkommenden Pseudomonas syringae konkurrieren. (Siehe z.B. Lindow, et al. Phytopathology, Bd. 76, Nr. 10, S. 1069 Auszug 95, 1986).The effects of certain active ice nucleating agents produced by various bacteria during the decomposition of ice crystals have recently attracted scientific interest, particularly because of their ability to produce artificial snow for ski slopes and their role in frost damage. In particular, the ice-nucleating properties of Pseudomonas syringae have been widely reported. (See, e.g., Maki et al. Applied Microbiology, September 1974, p. 456.) In recent years, these properties have been studied with particular emphasis on the role of Pseudomonas syringae or a protein derived from it in causing frost damage to growing plants. (See, e.g., Lindow, Plant Disease, March 1983, p. 327). The question of permitting experiments in the open environment involving mutants of Pseudomonas syringae that have been mutated in such a way that the ice-secreting gene has been eliminated has attracted considerable attention in the press. In the hope of reducing the population of ice-secreting Pseudomonas syringae, these mutants are intended to compete with the Pseudomonas syringae that occur naturally on plants. (See, e.g., Lindow, et al. Phytopathology, Vol. 76, No. 10, p. 1069, excerpt 95, 1986).
Von ähnlichen Eis-abspeltenden Eigenschaften wurde bei einigen anderen Mikroorganismen berichtet, einschließlich Erwinia herbolica (Siehe z.B. Lindow, et. al. Phytopathology, Bd. 73, S. 1097-1106, 1983) und Kozloff, et. al. 3. Bacteriology, Jan. 1983, S. 222-231), Pseudomonas flucrescens (Siehe z.B. Phelps, et. al. J. Bacteriology, Aug. 1986, S. 496-502) und Corotto et. al. (EMBO Journal, Bd. 5, S. 231-236, 1986) und Xanthomonas Campestris (Derie and Schaail, Phytopathology, Bd. 76, Nr. 10, S. 1117, 1986, Pseudomonas viridflava (Paulin, et al. Proc 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Bd. 2 INRA Beaucoaze France, 1978, Bd. 2, S. 725-731 und Anderson and Ashworth, Plant Physiol, Bd. 80, S. 956-960, 1986).Similar ice-sloughing properties have been reported in several other microorganisms, including Erwinia herbolica (See, e.g., Lindow, et. al. Phytopathology, Vol. 73, pp. 1097-1106, 1983) and Kozloff, et. al. 3. Bacteriology, Jan. 1983, pp. 222-231), Pseudomonas flucrescens (See, e.g., Phelps, et. al. J. Bacteriology, Aug. 1986, pp. 496-502) and Corotto et. al. (EMBO Journal, vol. 5, pp. 231-236, 1986) and Xanthomonas campestris (Derie and Schaail, Phytopathology, vol. 76, no. 10, p. 1117, 1986, Pseudomonas viridflava (Paulin, et al. Proc 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, vol. 2 INRA Beaucoaze France, 1978, vol. 2, pp. 725-731 and Anderson and Ashworth, Plant Physiol, vol. 80, pp. 956-960, 1986).
Es wurde von einer Anzahl der Untersuchungen dieser bestimmten Gene oder von ihnen produzierten Proteinen, die für die Eis-Abspaltung verantwortlich sind, berichtet. Green und Warner beschreiben z.B. in einem Brief an Nature 317, S. 645, 1985 die Bestimmung der Sequenz der Eis-Abspaltung von Pseudomonas syringae, die sie inaZ nannten. Sie bemerkten, daß dieser Vorgang mehrere Wiederholungen einer Sequenzwiederholung mit der Übereinstimmungswiederholung mit der Konsenswiederholung mit der folgenden Sequenz aulweist:A number of studies of these particular genes or proteins produced by them that are responsible for ice secretion have been reported. For example, Green and Warner, in a letter to Nature 317, p. 645, 1985, describe the determination of the ice secretion sequence of Pseudomonas syringae, which they named inaZ. They noted that this process involves multiple repetitions of a sequence repeat with the consensus repeat with the following sequence:
GCCGGTTATGGCAGCACGCTGACC, in der das Gen eine Gesamtgröße von 4458 besitzt. Desweiteren wollten sie herausfinden, ob die Tilgung von Fragmenten von inaZ die Fähigkeit des Gens affizieren würde, ein Eis-abspaltendes Protein zu produzieren, indem sie solche modifizierten Gene in E Coli einsetzten. Es stellte sich heraus, daß im Falle einer Tilgung, die keine Rahmenveränderung zur Folge hatte, in einigen Fallen die Eis-abspaltenden Eigenschaften beibehalten werden könnten.GCCGGTTATGGCAGCACGCTGACC, in which the gene has a total size of 4458. Furthermore, they wanted to find out whether deletion of fragments of inaZ would affect the ability of the gene to produce an ice-separating protein by inserting such modified genes into E. coli. It turned out that in the case of deletion that did not result in a frame change, in some cases the ice-separating properties could be retained.
Corotti, et al. beschreiben im The EMBO Journal 5, S. 231-236 (1986) ein DNA- Fragment von 75 kb, das aus Pseudomonas fluorescens gewonnen wurde, das dazu in der Lage ist, E Coli Eis-abspaltende Eigenschaften zu verleihen. Sie nannten ihr Gen inaW. Sie untersuchten auch die Aktivität von inaW-Mutanten und stellten fest, daß deren Einfügung in eine bestimmte 3,9 kb Sequenz besonderen Eintluß auf die Aktivität des Gens hatte. Sie schloßen daraus, daß das Produkt des Gens, vorausgesetzt, daß es sich um ein Gen mit ca. 180 kd Molekulargewicht handele, notwendig sei, um E Coli einen Eis-abspaltenden Phänotyp (INA+) zu verleihen.Corotti, et al., in The EMBO Journal 5, pp. 231-236 (1986), described a 75 kb DNA fragment obtained from Pseudomonas fluorescens that was capable of conferring ice-releasing properties to E. coli. They named their gene inaW. They also studied the activity of inaW mutants and found that their insertion into a specific 3.9 kb sequence had a particular influence on the activity of the gene. They concluded that the product of the gene, provided it was a gene with a molecular weight of about 180 kd, was necessary to confer an ice-releasing phenotype (INA+) to E. coli.
Kozloff, et al. vermuten in J Bacteriology 153, S. 222-231 (1983), daß die Eis- abspaltende Aktivität von Pseudomonas syringae und E herbicola von der Präsenz von spaltenden Stellen an ihren Zellwänden herrührt. Ihre Resultate zeigen, daß Pseudomonas syringae wahrscheinlich 4-8 Stellen pro Zelle besitzen und E herbolica 2 Stellen pro Zelle.Kozloff, et al., in J Bacteriology 153, pp. 222-231 (1983), suggest that the ice-separating activity of Pseudomonas syringae and E herbicola is due to the presence of cleavage sites on their cell walls. Their results indicate that Pseudomonas syringae probably has 4-8 sites per cell and E herbolica 2 sites per cell.
Kozloff, et al. schlagen in Science 226, S. 845-846 (1984) vor, daß sowohl ein Lipid Phosphatidylinositol an Eis-abspaltenden Stellen präsent ist, als auch ein Protein, oder Pseudomonas syringae underwiniaherbicola. Die gegenwärtige Forschung bezweifelt diese These allerdings.Kozloff, et al., in Science 226, pp. 845-846 (1984), propose that both a lipid, phosphatidylinositol, and a protein, or Pseudomonas syringae underwiniaherbicola, are present at ice-separating sites. However, current research casts doubt on this hypothesis.
Wobler, et al. berichten in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 7256-7260 (1986) von der Isolierung eines Eis-abspaltenden Proteins aus E. coli, welches mit Hilfe eines aus Pseudomonas syringae gewonnenen inaZ -Gen-enthaltenden Plasmids transformiert wurde. Das Protein (p153) hat ein offensichtliches Molekulargewicht von 153 kd. Der Aminosauregehalt des p153 entspricht ziemlich genau dem erwarteten Gehalt des Produkts aus inaZ und die Anfangßequenz des p153 (Met-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Val- Leu-) ensprach genau der kodierten Sequenz des inaZ-Gens. Sie berichteten desweiteren, daß ein auf ähnliche Weise gewonnenes p180 Protein, - unter Benutzung des aus Pseudomonas syringae gewonnenen inaW-Gens - offensichtlich ähnliche Sequenzen und Strukturen wie das unter Benutzung von inaZ gewonnene p153, aufwies. Sie schlugen vor, daß der Phänotyp INA+ von solchen Proteinen sowohl auf Pseudomonas syringae als auch auf Pseudomonas fluorescens übertragen wird und daß diese Proteine auch in Abwesenheit der Phospholipide, die von Kozloff als notwendig angegeben worden waren, als Schablone für die Eis-Abspaltung dienen.Wobler, et al., reported in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 7256-7260 (1986) the isolation of an ice-releasing protein from E. coli transformed using an inaZ gene-containing plasmid obtained from Pseudomonas syringae. The protein (p153) has an apparent molecular weight of 153 kd. The amino acid content of p153 corresponds almost exactly to the expected content of the product from inaZ and the initial sequence of p153 (Met-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Val- Leu-) corresponded exactly to the encoded sequence of the inaZ gene. They further reported that that a similarly derived p180 protein, using the inaW gene from Pseudomonas syringae, had apparently similar sequences and structures to p153 derived using inaZ. They suggested that the INA+ phenotype of such proteins is conferred on both Pseudomonas syringae and Pseudomonas fluorescens and that these proteins serve as a template for ice cleavage even in the absence of the phospholipids suggested by Kozloff as necessary.
Im Biophysical Journal 49, S. 293a (1986) berichten Wolber und Warner, daß im aus Pseudomonas syringae gewonnenen Eis-abspaltenden Protein sich die Mehrzahl der aus untereinander verbundenen 8, 16 und 48 Aminosäuren bestehenden Sequenz widerholt. Die sekündäre Struktur ist offensichtlich eine scharf s-Blatt Struktur für sich wiederholende Sequenzen, per 48 Aminosäureeinheiten 5-6 mal durchbrochen. Es ist anzunehmen, daß das Protein sich in eine regelmäßige Struktur faltet, -aufgebaut auf der 48 Aminosäurewiederholung - und daß diese Struktur waßerbindende Seitenketten aufweist, die das Eisgitter nachahmen.In Biophysical Journal 49, p. 293a (1986), Wolber and Warner report that in the ice-separating protein obtained from Pseudomonas syringae, the majority of the sequence consisting of interconnected 8, 16 and 48 amino acids is repeated. The secondary structure is evidently a sharp s-sheet structure for repeating sequences, broken 5-6 times per 48 amino acid unit. It is assumed that the protein folds into a regular structure, built on the 48 amino acid repeat, and that this structure has water-binding side chains that mimic the ice lattice.
Phelps, et al. weisen in J. Bacteriology 167, S. 496 (1986) auf die Proteinnatur des von Erwinia herbicola gewonnenen Eis-abspaltenden Materials hin, berichten deweiteren, daß zellfreie Eis-abspaltende Agenten aus Resten der äußeren Membrane gewonnen werden könnten, und daß solche Agenten Waßerabspaltung bei Temperaturen von -2 bis -10ºC einleiten könnten. Makino berichtet in Ann Phytopath Soc. Japan 1348, S. 452-457 (1982), daß eine Eis-abspaltende Tätigkeit in Pseudomonas marginalis geftinden worden war, aber in einem geringeren Ausmaß als in Pseudomonas syringae.Phelps, et al., in J. Bacteriology 167, p. 496 (1986), point out the protein nature of the ice-secreting material obtained from Erwinia herbicola, and report that cell-free ice-secreting agents could be obtained from remnants of the outer membrane, and that such agents could induce water secretion at temperatures of -2 to -10ºC. Makino, in Ann Phytopath Soc. Japan 1348, pp. 452-457 (1982), reports that ice-secreting activity was found in Pseudomonas marginalis, but to a lesser extent than in Pseudomonas syringae.
Außer in den oben bereits angesprochenen Studien von Eis-abspaltenden Baekterien, wurden Eis-Apspaltungs-Studien unternommen, deren biogenetischer Ursprung in anderen Organismen liegt. Duman und Horwath überprufen in Arm. Rev. Physiol. 45, S. 261-70 (1983) daher die Rolle der Eis-abspaltenden Proteine im Hemolymph bestimmter Käfer durch die Übertragung von Frosttoleranz auf die Käfer indem sie "super-cooling" verhindern und das Gefrieren von extrazellulären Flüßigkeiten bei ziemlich hohen Temperaturen sicherstellen und damit das Risiko der intrazellulären Gefrierens veningern. Solche Proteine sollen in Vespula (die 3-6 Eis-abspaltende Proteine besitzen) und Dendroides (welche 1-2 Eis-abspaltende Proteine besitzen) vorkommen. Die Charakteristik des Eis-abspaltenden Proteins, das von Vespula maculala produziert wird, wurde von Dumas, et al. in J. Comparative Physiology B 154, S. 79-83 (1984) untersucht.In addition to the studies of ice-secreting bacteria mentioned above, ice-secreting studies have been undertaken whose biogenetic origin lies in other organisms. Duman and Horwath in Arm. Rev. Physiol. 45, pp. 261-70 (1983) therefore review the role of ice-secreting proteins in the hemolymph of certain beetles in conferring frost tolerance on the beetles by preventing "super-cooling" and ensuring the freezing of extracellular fluids at fairly high temperatures, thus reducing the risk of intracellular freezing. Such proteins are said to be present in Vespula (which possess 3-6 ice-secreting proteins) and Dendroides (which possess 1-2 ice-secreting proteins). The characteristics of the ice-separating protein produced by Vespula maculala was studied by Dumas, et al. in J. Comparative Physiology B 154, pp. 79-83 (1984).
Von Fall und Schnell in J. Marine Research Bd.43, S. 257-265 (1985) wurde berichtet, daß Eis-abspaltende Agenten auch von Heterocapsia niei (ein Meeres-Dino- Geißeltierchen) produziert werden.It was reported by Fall and Schnell in J. Marine Research vol. 43, pp. 257-265 (1985) that ice-separating agents are also produced by Heterocapsia niei (a marine dino-flagellate).
Alle oben zitierten Artikel sind im vorliegenden Paper belegt.All articles cited above are documented in this paper.
Der Gebrauch von Bakterien, die bei bestimmten proteinhaltigen Nahrungsmitteln den strukturierenden Phänotyp INA+ (Erwinia ananas) enthalten, wurde von Arai und Watenabe in Agricultural and Biological Chemistry 50, S. 169-175 (1986) vorgeschlagen. Sie fügten Zellen zu Waßerausbreitungen oder Hydrogelen von Proteinen und Polysacchariden hinzu, um Waßermaßen bei Temperaturen zwischen -5 und 0 C in gerichtete Eiskristalle zu verwandeln, um anisotropisch strukturierte Produkte zu formen. Derartige Produkte wurden produziert unter Zuhilfenahme von rohem Eiweiß, Rinderblut, Sojabohnenquark, Dickmilch, Waßeraußtößen oder Pasten isolierter Proteine von Sojabohnen, Hydrogel oder Agar, Dickmittelpaste und Hydrogele von Glucomannan und Kalziummannan. Derartige Produkte werden in Anwesenheit der Bakterienzellen langsam in einem Luftbad auf -5ºC abgekühlt. Die gefrorenen Produkte wurden, bevor sie sich setzen könnten, bei einer Temperatur von -30ºC luftdicht eingefroren, indem sie bedampft wurden, um eine flockenartige Oberflachenstruktur zu erhalten.The use of bacteria containing the structuring phenotype INA+ (Erwinia ananas) in certain protein foods was proposed by Arai and Watenabe in Agricultural and Biological Chemistry 50, pp. 169-175 (1986). They added cells to water spreads or hydrogels of proteins and polysaccharides to transform water masses into oriented ice crystals at temperatures between -5 and 0 C to form anisotropically structured products. Such products were produced using raw egg whites, bovine blood, soybean curd, sour milk, water exudates or pastes of isolated proteins from Soybeans, hydrogel or agar, thickening paste and hydrogels of glucomannan and calcium mannan. Such products are slowly cooled in an air bath to -5ºC in the presence of the bacterial cells. The frozen products were hermetically frozen at a temperature of -30ºC before they could set by steaming them to obtain a flake-like surface structure.
Der hier gebrauchte Terminus Eiskeimbildende Phänotyp (INA+) bedeutet die Kapazität der Einleitung von Abspaltung von super-gekühltem Waßer bei einer Temperatur von über -20ºC. Laut Makino (Ann Phytopath Soc. Japan Bd. 48, S. 452- 457 (1982)) hat P syringae beispielsweise eine Abspaltungstemperatur von -2.9C.The term ice nucleating phenotype (INA+) used here means the capacity of initiating secretion from super-chilled water at a temperature above -20ºC. According to Makino (Ann Phytopath Soc. Japan vol. 48, pp. 452-457 (1982)), for example, P syringae has a secretion temperature of -2.9C.
Der hier gebrauchte Terminus "nicht-toxischer Mikroorganismus" bezieht sich auf Mikroorganismen, die keinen gegenteiligen Effekt auf Menschen haben, wenn diejenigen Mengen eingenommen werden, die vom Gebrauch solcher Mikroorganismen in der Zuhilfenahme bei der Eis-Abspaltung zu erwarten sind.The term "non-toxic microorganism" as used here refers to microorganisms that have no adverse effect on humans when ingested in amounts expected from the use of such microorganisms in aid in ice breakdown.
Ein Anspruch der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel für das Einfrieren von Nährstoffen und anderen biologischen Produkten zu sein, die zu Konservierungszwecken gefroren werden, was den Energieverbrauch reduzieren würde. Den genannten Nährmitteln und biologischen Produkten wird ein nicht-toxischer Mikroorganismus mit Phänotyp INA+ oder ein davon abgeleiteter Eiskeimbildende Agent beigefügt oder ein funktionsäquivalenter Agent, um ein effektives Einfrieren ohne "super-cooling" zu erreichen.A claim of the present invention is to be a means for freezing nutrients and other biological products that are frozen for preservation purposes, which would reduce energy consumption. A non-toxic microorganism with phenotype INA+ or an ice nucleating agent derived therefrom or a functionally equivalent agent is added to said nutrients and biological products in order to achieve effective freezing without "super-cooling".
Es wird heute angenommen, daß es beim Einfrieren von Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten wünschenswert ist, die Zeit zu verringern, in der die einzufrierenden Proben bei 0 bis -5ºC gehalten werden, da dies eine Temperatur ist, bei der viele schädliche Enzyme besonders aktiv sind. Es ist außerdem ein Vorteil der vorliegenden Untersuchung, die Gleichmäßigkeit der Einfrierzeiten beim Einfrieren von Nährmitteln und anderen biologischen Produkten zu erhöhen, um das Risiko einer langen Außetzung dieser Temperaturen zu verringern.It is now believed that when freezing food and other biological products, it is desirable to reduce the time the samples to be frozen are kept at 0 to -5ºC, since this is a temperature at which many harmful enzymes are particularly active. It is also an advantage of the present study to increase the uniformity of freezing times when freezing food and other biological products in order to reduce the risk of long exposure to these temperatures.
Es ist desweiteren ein Anspruch der vorliegenden Erfindung, ein Mittel lür die Verbeßerung der Qualität gefrorener Lebensmittel, wie z.B. Fisch oder Fleischfillets zu sein, indem "super-cooling" zu einem Grad vermieden werden soll, daß intra-zelluläres Gefrieren innerhalb des Muskelgewebes solcher Nahrungsmittel stattfindet.It is further a claim of the present invention to be a means for improving the quality of frozen foods, such as fish or meat fillets, by avoiding "super-cooling" to such an extent that intra-cellular freezing takes place within the muscle tissue of such foods.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, daß sie die Stabilität des gefrorenen Produkts bei der Kältlagerung verbeßern kann, in der Temperaturschwankungen eine Verschlechterung der Produktqualität zur Folge hatten. Damit würde die Lagerzeit solcher Produkte verlängert werden und Kühihauser könnten bei höheren Temperaturen operieren.Another advantage of the present invention is that it can improve the stability of the frozen product during cold storage, where temperature fluctuations have resulted in deterioration of the product quality. This would extend the storage time of such products and allow refrigerators to operate at higher temperatures.
Genauso bietet die vorliegende Erfindung - bestehend einerseits aus der Hinzugabe eines nicht-toxischen Mikroorganismus mit Phänotyp INA+ oder eines vom erwähnten Mikroorganismus gewonnenen Eis-abspaltenden Agenten oder eines in der Funktion äquivalenten Agenten des Mikroorganismus und bestehend andererseits in der Temperaturreduktion des erwähnten festen Nahrungsmittels oder eines anderen biologischen Produkts - erstens ein Mittel zum Tiefkühlen von festen Nährstoffen und anderen biologischen Produkten, um deßen Einfrieren zu beeinflußen.Likewise, the present invention - consisting on the one hand of adding a non-toxic microorganism with phenotype INA+ or an ice-separating agent obtained from said microorganism or a functionally equivalent agent of the microorganism and consisting on the other hand of reducing the temperature of said solid food or other biological product - offers firstly a means of deep-freezing solid nutrients and other biological products in order to influence their freezing.
Zweitens bietet die vorliegende Erfindung - bestehend aus einerseits aus der Hinzugabe eines nicht-toxischen Mikroorganismus mit INA+ Phänotyp oder eines vom erwähnten Mikroorganismus gewonnenen Eis-abspaltenden Agenten oder eines in der Funktion äquivalenten Agenten des Mikroorganismus und andererseits in der Temperaturreduktion des erwähnten festen Nahrungsmittels oder eines anderen biologischen Produkts - die Möglichkeit, gefrorene Nahrungsmittel oder biologische Produkte bei atmosphärischem Druck und auch später, besagte Nahrungsmittel oder biologische Produkte tiefgekühlt zu lagern, ohne daß weitere Prozeßchritte ausgetührt weiden.Secondly, the present invention - consisting on the one hand of adding a non-toxic microorganism with INA+ phenotype or an ice-releasing agent obtained from the mentioned microorganism or a functionally equivalent agent of the microorganism and on the other hand of reducing the temperature of the mentioned solid food or other biological product - offers the possibility of storing frozen food or biological products at atmospheric pressure and also later storing said food or biological products in a deep-frozen state without carrying out further process steps.
Ich möchte mich nicht an irgendeine bestimmte Theorie gebunden tühlen und glaube daher, daß der vom Mikroorganismus mit Phänotyp INA+ produzierte Eis-abspaltende Agent wahrscheinlich ein Protein ist.I do not wish to be bound by any particular theory and therefore believe that the ice-separating agent produced by the microorganism with phenotype INA+ is probably a protein.
Ziffer 1 ist eine Darstellung einer idealisierten Einfrierkurve auf die erklärend hingewiesen werden wird.Number 1 is a representation of an idealized freezing curve, which will be explained in more detail.
Ziffer 2 zeigt die Einfrierkurven für unbehandelten Fischmuskel und Fischmuskelbehandlung gemaß der vorliegenden Erfindung.Figure 2 shows the freezing curves for untreated fish muscle and fish muscle treatment according to the present invention.
In die Kategorie nicht-toxische Mikroorganismen mit Phänotyp INA+ gehören natürliche Bakterien mit solchen Eigenschaften wie zum Beispiel Erwinia anans, Erwinia herbicola, Pseudomonas syringae und Pseudomonas fluorescens. Dies schließt auch andere nicht-toxische Bakterien ein, die natürlich in Nährmitteln vorkommen, wie zum Beispiel Spezien von Lactobacillus wie z.B. Lactobacillus bulgaricus und Lactobacillus acidophilus und Streptococcus wie z. B. Streptococcus lactus und Streptococcus thermophilus, die von Plasmiden mit inaZ oder inaw Genen verwandelt wurden, die wiederum aus Pseudomonas syringae oder Pseudomonas fluorescens oder aus einem Eis- abspaltenden Gen der oben erwähnten anderen Mikroorganismen mit Phänotyp INA+ oder aus einer Eis-abspaltenden Subeinheit davon oder aus einem synthetischen Äquivalenten oder solch einem Gen oder einer Subeinheit bestehen. Brauchbare Mittel zur Gewinnung solcher Plasmide werden z. B. von Green and Warner (a.a.O.) and Wobler (a.a.O.) beschrieben. Die Einführung solcher Plasmide in geeignete Bakterien und "Cloning" solcher Bakterien mag durch Standardverfahren der Gentechnik beeinflußt werden. Es ist auch möglich, solche Gene in eukaryotische Organismen wie z.B. Hefe einzuführen. Viele Hefearten kommen in Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten natürlich vor. Solche Hefearten sind z.B. verschiedene Saccharomyces wie z.B. Saccharomyces cerevisia, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii und Saccharomyces uvarum. Die Einführung von Genen, um den INA+ Phänotyp auf solche Hefearten zu überführen, könnte möglicherweise mittels Standardverfahren wie z.B. mit Hilfe eines "Plasmidshuttlevektors" mit einem INA+ Phänotyp oder mit Hilfe einer integrativen DNA-Transformation, die die Entfernung von Hefezellwanden, Hinzufügung eines DNA-Fragments, das eine Genkodierung für einen INA+ Phänotyp im Beisein eines Polyethylenglycols enthält und dann die Regeneration der Zellwand.The category of non-toxic microorganisms with phenotype INA+ includes natural bacteria with such properties such as Erwinia anans, Erwinia herbicola, Pseudomonas syringae and Pseudomonas fluorescens. This also includes other non-toxic bacteria that occur naturally in foodstuffs, such as Examples include species of Lactobacillus such as Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus acidophilus and Streptococcus such as Streptococcus lactus and Streptococcus thermophilus which have been transformed from plasmids containing inaZ or inaw genes which in turn consist of Pseudomonas syringae or Pseudomonas fluorescens or of an ice-releasing gene of the above-mentioned other microorganisms with phenotype INA+ or of an ice-releasing subunit thereof or of a synthetic equivalent or such a gene or subunit. Useful means for obtaining such plasmids are described, for example, by Green and Warner (loc. cit.) and Wobler (loc. cit.). The introduction of such plasmids into suitable bacteria and cloning of such bacteria may be influenced by standard genetic engineering techniques. It is also possible to introduce such genes into eukaryotic organisms such as yeast. Many yeast species occur naturally in food and other biological products. Such yeast species include various Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisia, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii and Saccharomyces uvarum. The introduction of genes to confer the INA+ phenotype to such yeast species could potentially be achieved by standard methods such as using a "plasmid shuttle vector" with an INA+ phenotype or by using integrative DNA transformation, which involves the removal of yeast cell walls, addition of a DNA fragment containing a gene coding for an INA+ phenotype in the presence of a polyethylene glycol and then regeneration of the cell wall.
Mikroorganismen mit INA+ Phänotyp können in totem oder lebendem Zustand benutzt werden, wie es auch ofi im Falle von Mikroorganismen getan wird, die gewöhnlich in Lebensmitteln vorkommen. In den Fallen, in denen die Mikroorganismen schon vor ihrer Anwendung, z.B. durch Hitzebehandlung abgetötet wurden, sollte größte Sorgfalt angewendet werden, um ungünstige Bedingungen zu vermeiden, die den Eis-abspaltenden Agenten denaturieren oder deaktivieren könnten. Die Erhitzung einer Einhängung des Mikroorganismus bis zum oder nahe des Siedepunktes z.B. könnte unangebracht sein.Microorganisms with INA+ phenotype can be used in dead or living state, as is often done for microorganisms commonly found in foods. In cases where the microorganisms have been killed prior to use, e.g. by heat treatment, great care should be taken to avoid adverse conditions that could denature or deactivate the ice-separating agent. Heating a mount of the microorganism to or near boiling point, for example, may be inappropriate.
Als Alternative könnten Eis-abspaltendes Proteine selbst für das Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzt werden. Solche Proteine könnten von jedem der oben erwähnten Mikroorganismen oder tatsächlich auch von anderen Organismen isoliert werden, die so transformiert wurden, um einen INA+ Phänotyp aufzunehmen, wie z.B. E. Coli solange das gewünschte Protein vor dem Gebrauch sorgfaltig isoliert wurde. Die Produktion (Gewinnung) von p153 in E. coli ist in Wolber, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, S. 7256-7260 (1986) beschrieben.Alternatively, ice-releasing proteins themselves could be used in the process of the present invention. Such proteins could be isolated from any of the microorganisms mentioned above or indeed from other organisms transformed to acquire an INA+ phenotype, such as E. coli, so long as the desired protein is carefully isolated prior to use. The production of p153 in E. coli is described in Wolber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, pp. 7256-7260 (1986).
Die Wiedergewinnung des Eis-abspaltenden Agenten vom Mikroorganismus, in dem sie produziert wurden, kann durch eine Vielfalt von Mitteln erreicht werden. In Fällen, in denen der Eis-abspaltende Agent z.B. von der Zelle in beträchtlichen Mengen ausgedrückt wird, kann die Wiedergewinnung durch Zentrifügierung oder Filtrierung der Zellmaße, mit anschließender Ausdehnung (Erweiterung) der resultierenden Kügelchen mit einem Puffer (wie z.B. HEPES oder Phosphat), mit anschließender Reflltrierung und Hochgeschwindigkeitszentrifiigierung erfolgen. In anderen Fällen mag beispielsweise ein Zerreißen der Zelle durch Ultraschall, Druckabscherung in einer Druckbombe, Festabscherung oder enzymatische Verdauung unter Verwendung eines Enzyms wie Lysozym nötig sein. Nach dem Zerreißen der Zelle kann die Zellmaße zentrifugiert werden, um unzerrißene Zellen zu entfernen und die zerbrochene Zellmembrane, die den wiedergewonnenen Eis-abspaltenden Agenten enthält, auszusondern. Dieses Material kann daraufhin zentriftigiert und mit einem neutralen Puffer vor der Fraktionierung zur Wiedergewinnung des Eis-abspaltenden Agenten gewaschen werden. Die Fraktionierung kann mit Hilfe von Standardverfahren ausgeführt werden, bei der jede gewonnene Fraktion auf die Präsenz des Eis-abspaltenden Agenten hin getestet wird. In geeigneten Fallen kann mehr als eine Fraktionierung durch möglicherweise verschiedenartige Verfahren erforderlich sein. Die folgenden Verfahren sind angemeßen:Recovery of the ice-separating agent from the microorganism in which it was produced can be achieved by a variety of means. In cases where the ice-separating agent is expressed by the cell in significant quantities, for example, recovery can be accomplished by centrifugation or filtration of the cell masses, followed by expansion (expansion) of the resulting beads with a buffer (such as HEPES or phosphate), followed by refiltration and high speed centrifugation. In other cases, for example, disruption of the cell by ultrasonication, pressure shearing in a pressure bomb, solid shearing, or enzymatic digestion using an enzyme such as Lysozyme may be necessary. After cell disruption, the cell mass may be centrifuged to remove unruptured cells and to separate the broken cell membrane containing the recovered ice-releasing agent. This material may then be centrifuged and washed with a neutral buffer prior to fractionation to recover the ice-releasing agent. Fractionation may be carried out using standard procedures in which each recovered fraction is tested for the presence of the ice-releasing agent. In appropriate cases, more than one fractionation may be required by possibly different methods. The following methods are appropriate:
(a) Liquid-Liquid-Extraktion mit Lösungsmitteln verschiedener Polarität. Dies entfernt weniger polare Fraktionen und läßt die Proteine in ihrer waßerartigen Phase.(a) Liquid-liquid extraction with solvents of different polarity. This removes less polar fractions and leaves the proteins in their aqueous phase.
(b) Gelfiltrierungschromatographie - z.B. Sephadex G-200 und andere molekulare Siebpackungen trennen Proteine nach ihrer Molekulargröße. Das Hinzugeben von Sodiumdodecylsulphat (SDS) mag nötig sein, um die tertiare und/oder quartiäre Proteinstruktur zu denaturieren (falls dies nicht schon ohnehin geschehen ist). Falls SDS benutzt wird ist eine Dialyse der restlichen Fraktionen nötig, um SDS zu entfernen.(b) Gel filtration chromatography - e.g. Sephadex G-200 and other molecular sieve packings separate proteins according to their molecular size. Addition of sodium dodecyl sulphate (SDS) may be necessary to denature the tertiary and/or quaternary protein structure (if this has not already occurred). If SDS is used, dialysis of the remaining fractions is necessary to remove SDS.
(c) Ionenaustauschchromatographie trennt die Proteine gemäß ihrer ionischen Aufladung. Dieses Verfahren kann auch zur Konzentration benutzt werden, da verdünnte Lösungen eines Proteins in eine Reihe eingeladen werden können bis diese Reihe voll ist und dann kann ein ion das Protein aus der Reihe herausziehen.(c) Ion exchange chromatography separates proteins according to their ionic charge. This method can also be used for concentration, since dilute solutions of a protein can be loaded into an array until the array is full, and then an ion can pull the protein out of the array.
(d) Hydroxylapatitechromatographie --(d) Hydroxyapatite chromatography --
(e) Preparative Hochdrucksliquidchromatographie unter Benutzung von verschiedenen Typen der oben genannten Reihenchromatographie und einiger anderer, wie z.B. Umkehr-Phasentrennung unter Hochdruck. Dies könnte größere Geschwindigkeit und beßere Auflösung zwischen den Fraktionen bedeuten.(e) Preparative high pressure liquid chromatography using various types of the above mentioned series chromatography and some others, such as reverse phase separation under high pressure. This could mean greater speed and better resolution between fractions.
Nahrungsmittel, die mittels des Prozeßes der vorliegenden Erfindung eingefroren werden können, sind Muskellebensmittel wie Fisch und Fleisch. Für bestmögliche Ergebniße sollte der Fisch oder das Fleisch nicht in sehr dicken Stücken sein. Beispielsweise ist der Prozeß der vorliegenden Erfindung geeigneter für Fischfillets oder Steaks, Kalbs oder Rindersteaks, Geflugel, Schwein oder Lammkotelettes als für einen ganzen Thunfisch oder eine Rinderseite. Zufriedenstellende Ergebniße wurden allerdings auch für das Einfrieren bestimmter Fischsorten im Ganzen (z.B. Forelle und platte Fisch wie Seezunge, Flunder und Scholle. Das Fleisch (sei es Fisch oder Fleisch) sollte möglichst auf eine Dicke von 3 bis 4 cm zugeschnitten sein, oder beßer weniger als 1,5 cm, um den eiskeimbildenden Mikroorganismen oder Agenten den Eintritt in das Fleisch zu ermöglichen. Statt das Fleisch zu zerkleinern, könnten als Alternative tiefe Schnitte in großen Fleischstücken auch zufriedenstellende Ergebniße erbringen. Der Prozeß der vorliegenden Erfindung ist auch brauchbar für das Einfrieren von zerkleinertem Fleisch oder Fleisch wie in Wurstchen, Hackfleisch und Fischfrikadellen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindungen könnten auch beim Einfrieren von Beeren und anderen Früchten und Gemüsen wie Erbsen oder Mais, die gewöhnlich durch intra-zelluläres Gefrieren beim Einfrieren an Qualität verlieren, zur Anwendung kommen. Beßere Ergebniße werden wiederum für Beeren erzielt, weniger für z.B. Tomaten oder andere große Früchte. Der Prozeß der vorliegenden Erfindung kann auch für das Einfrieren anderer fester Nahrungsmittel wie Schellfisch, für Lebensmittelprodukte wie Nudeln und Backwaren wie Kuchen, Brot und Waffeln benutzt werden. Die Erfindung kann auch benutzt werden, um das Einfrieren von fertigen gefrorenen Mahlzeiten wie den sogenannten "TV-Dinners" und gefrorenen Zwischenmahizeiten wie Pizza beschleunigen.Foods that can be frozen using the process of the present invention are muscle foods such as fish and meat. For best results, the fish or meat should not be in very thick pieces. For example, the process of the present invention is more suitable for fish fillets or steaks, veal or beef steaks, poultry, pork or lamb chops than for a whole tuna or side of beef. However, satisfactory results have also been obtained for freezing certain types of fish whole (e.g. trout and flat fish such as sole, flounder and plaice). The flesh (be it fish or meat) should preferably be cut to a thickness of 3 to 4 cm, or preferably less than 1.5 cm, to allow the ice nucleating microorganisms or agents to enter the flesh. Instead of mincing the meat, as an alternative, deep cuts in large pieces of meat could also give satisfactory results. The process of the present invention is also useful for freezing minced meat or meat such as in sausages, minced meat and fish cakes. The methods of the present invention could also be used for freezing berries and other fruits and vegetables such as peas or corn which usually lose quality due to intra-cellular freezing during freezing. Better results are again obtained for berries, less so for e.g. tomatoes or other large fruits. The process of the present invention can also be used for freezing other solid foods such as haddock, food products such as pasta and baked goods such as cakes, bread and waffles. The invention can also be used to Speed up the freezing of ready-made frozen meals such as so-called "TV dinners" and frozen snacks such as pizza.
Der Prozeß der vorliegenden Erfindung kann auch in der Produktion von Speiseeis und anderen Milchprodukten und ähnlichen Produkten, beispielsweise solchen auf Tofubasis von Nutzen sein. Zusätlich könnten mittels der vorliegenden Erfindung die folgenden Produkte eingefroren werden: Fruchtsaftkonzentrat, gefrorenes Fruchteis am Stiel, Soja- und andere Soßen, Suppen, Joghurt und andere Nahrungsmittel wie Frucht- und Gemüsepurees. In diesen Fällen wird der Eis-abspaltende Mikroorganismus oder das Protein - im Gegensatz zum oben beschriebenen, von Arai und Watanabe angewandten Prozeß - mit den nötigen Zutaten gemischt und das Ganze wird "en maße" gekühlt bis es gefriert. Derartige Anwendungen werden gewöhnlich unter normalem atmosphärischem Druck ausgeführt und die Produkte werden vor der Lagerung nicht mehr behandelt.The process of the present invention may also be useful in the production of ice cream and other dairy and similar products, such as tofu-based products. In addition, the following products could be frozen by the present invention: fruit juice concentrate, frozen fruit popsicles, soy and other sauces, soups, yogurt and other foods such as fruit and vegetable purees. In these cases, the ice-separating microorganism or protein is mixed with the necessary ingredients, in contrast to the process used by Arai and Watanabe described above, and the whole is cooled "en masse" until it freezes. Such applications are usually carried out under normal atmospheric pressure and the products are not further treated before storage.
Zusätzlich zum Einfrieren solcher Produkte, kann der Prozeß der vorliegenden Erfindung auch für das Einfrieren anderer Produkte benutzt werden, die man gewöhnlich einfriert, wie beispielsweise Blutkonserven und andere biologische Produkte wie Sperma, Eizellen, Embrionen und anderen Geweben. Die vorliegende Erfindung mag beim Einfrieren von Eizellen und Sperma von Zuchttieren zur Anwendung gelangen.In addition to freezing such products, the process of the present invention may also be used for freezing other products that are commonly frozen, such as blood products and other biological products such as sperm, ova, embryos and other tissues. The present invention may be used for freezing ova and sperm from breeding animals.
Zum Einfrieren von Lebensmitteln gemäß der vorliegenden Erfindung können konventionelle Gefriertruhen wie Luft- oder Kontaktplattengefrierapparat oder Vakuum- TiefKühltrockner benutzt werden. Allerdings können sie bei Temperaturen von 10-20ºC über den Temperaturen, die gewöhnlich als angemeßen gesehen werden, benutzt werden. Daher kann der Prozeß der vorliegenden Erfindung für die Benutzung eines Luftgefrierapparates im Temperaturbereich zwischen -5 und -30ºC statt des bisher üblichen Temperaturbereiches zwischen -20 bis -40ºC zufriedenstellende Ergebniße erbringen. Dementsprechend kann ein Kontaktplattengefrierapparat im Temperaturbereich zwischen -15 und -20ºC im Gegensatz zum bisher gebräuchlichen Temperatübereich zwischen -30 und -40ºC benutzt werden. Die Anwendung der vorliegenden Erfindung reduziert auch die Einfrierzeit im Vergleich der bisher gebräuchlichen Methode. Die Dauer des Einfrierens kommt allerdings auf die Dicke der einzufrierenden Lebensmittel und die Art der Lagerung im Gefrierapparat an.For freezing foodstuffs according to the present invention, conventional freezers such as air or contact plate freezers or vacuum chillers can be used. However, they can be used at temperatures 10-20ºC above the temperatures usually considered appropriate. Therefore, the process of the present invention can be adapted for use of an air freezer in the temperature range between -5 and -30ºC instead of the previously used satisfactory results can be achieved in the usual temperature range between -20 and -40ºC. Accordingly, a contact plate freezer can be used in the temperature range between -15 and -20ºC, in contrast to the previously used temperature range between -30 and -40ºC. The application of the present invention also reduces the freezing time compared to the previously used method. The duration of the freezing depends, however, on the thickness of the food to be frozen and the type of storage in the freezer.
Die Menge des Materials, das zur Eis-Abspaltung gemäß der vorliegenden Erfindung hinzugegeben werden muß, hängt von der Art des verwendeten Materials ab und insbesondere von der Temperatur, bei der Eis-Abspaltung im super-gekühlten Waßer geschieht.The amount of material to be added for ice decomposition according to the present invention depends on the type of material used and, in particular, on the temperature at which ice decomposition occurs in the super-chilled water.
Nur relativ kleine Mengen müßen zu den einzufrierenden Lebensmitteln oder anderen biologischen Produkten hinzugegeben werden, da die Eis-abspaltenden Mikroorganismen oder Agenten effektiv als Katalysatoren for die Eisabspaltung dienen.Only relatively small amounts need to be added to the food or other biological products to be frozen, since the ice-separating microorganisms or agents effectively serve as catalysts for ice decomposition.
Wie oben erwähnt, hängt die Zahl der Abspaltungßtellen auf einem Bakterium von der Spezie ab (Pseudomonas sytingae hat 4-8 Stellen pro Zelle und E. herbolica 2 Stellen pro Zelle). Einfache Experimente können die benötigte Anzahl der Bakterien mit einem Phänotyp INA+, der im betimmten Fall zu benutzen ist, bestimmen.As mentioned above, the number of cleavage sites on a bacterium depends on the species (Pseudomonas sytingae has 4-8 sites per cell and E. herbolica 2 sites per cell). Simple experiments can determine the required number of bacteria with an INA+ phenotype to use in a particular case.
P. syringae Aufhängungen zeigen Eis-abspaltende Aktivitäten in distilliertem dionisiertem Waßer bei Konzentrationen von ca. 10&sup7; kolonie-formender Einheiten (k.f.E.) pro ml und darüber. Eine Konzentration von 107k.f.u/ml ist ungefähr vergleichbar mit 1 mg Trockengewicht der Zelle/ml. Wenn in der vorliegenden Erfindung P. syringae benutzt wurde, stellte es sich als günstig heraus, Aufhängungen von Bakterien mit aerobischer Plattenzahl (APZ) mit 10&sup5; bis 10&sup8; k.f.E../ml zu benutzen. Konzentrationen von Bakterien in Aufhängungen könnten durch die Absorbierung der Aufhängung des Lichts bei 520 mm Wellenlange oder durch andere turbidimetrische Methoden bestimmt werden.P. syringae suspensions exhibit ice-separating activities in distilled deionized water at concentrations of approximately 107 colony forming units (cfu) per ml and above. A concentration of 107kfu/ml is approximately comparable to 1 mg dry weight of cell/ml. When using P. syringae in the present invention, it was found to be beneficial to prepare suspensions of bacteria with aerobic Plate number (APN) of 10⁵ to 10⁸ cfu/ml should be used. Concentrations of bacteria in suspensions could be determined by the absorption of the suspension of light at 520 mm wavelength or by other turbidimetric methods.
Es stellte sich heraus, daß die folgenden Anwendungsraten für die folgenden Nahrungsmittel, die eine bakterielle Aufhängung mit aerobischer Plattenzahl von 107 k.f.E./ml benutzen, geeignet sind: The following application rates were found to be appropriate for the following foods using a bacterial suspension with an aerobic plate count of 107 cfu/ml:
Wenn ein isolierter Eiskeimbildende Agent benutzt wird, müßen weniger Mengen Material hinzugegeben werden, um die gleiche Konzentration Abspaltungßtellen zu erhalten. Daher sind die Aktivitäten bei der Anwendung solcher Agenten in Mengen von mindestens 0,0005 mg/g Nahrungsmitteln oder biologischen Produkten, z.B. 0,0015 bis 0,01 mg/g Nahrungsmittel oder andere biologische Produkte normalerweise effektiv, obwohl höhere oder niedrigere Mengen, z.B. bis zu 0,1 mg/mg manchmal nützlich sein können.When an isolated ice nucleating agent is used, fewer amounts of material must be added to obtain the same concentration of cleavage sites. Therefore, activities are usually effective when such agents are applied in amounts of at least 0.0005 mg/g of food or biological products, e.g., 0.0015 to 0.01 mg/g of food or other biological products, although higher or lower amounts, e.g., up to 0.1 mg/mg, may sometimes be useful.
Die Eis-abspaltenden Mikroorganismen oder Agenten werden zu Nahrungsmitteln oder anderen biologischen Produkten in Eis-abspaltenden Mengen hinzugegeben.The ice-releasing microorganisms or agents are added to foods or other biological products in ice-releasing amounts.
Normalerweise werden zu Fleisch, Fisch und Gemüse Bakterien bei einer Rate von 10&sup5; K.f.E./g, z.B. im Bereich zwischen 10&sup6;-10&sup7; und in der Produktion von Speiseeis oder gefrorenem Tofukonfekt bei einer Rate von mindestens 10&sup5; k.f E./ml. hinzugegeben. Wenn ein Eis-abspaltendes Protein wie p153 benutzt wird, kann es bei einer Rate von 0,001 bis 0,01mg/g oder mehr hinzugegeben werden.Typically, bacteria are added to meat, fish and vegetables at a rate of 10⁵ cfu/g, e.g. in the range of 10⁶-10⁷, and in the production of ice cream or frozen tofu confectionery at a rate of at least 10⁵ cfu/ml. If an ice-separating protein such as p153 is used, it can be added at a rate of 0.001 to 0.01 mg/g or more.
Besagte Mikroorganismen oder Eis-abspaltende Agenten können den Nahrungsmitteln und anderen biologischen Produkten mittels jeglicher konventioneller Art und Weise beigegeben werden, wie z.B. durch das Besprühen waßerartiger Verteilung des Eis- abspaltenden Materials oder - im Falle solcher Produkte wie Speiseeis, Fruchtsafte, Purees und dergleichen - durch gründliches Untermischen der Eis-abspaltenden Mikroorganismen oder Agenten mit dem einzufrierenden Nahrungsmittel.Said microorganisms or deicing agents can be added to the foodstuffs and other biological products by any conventional means, such as by spraying water-like dispersion of the deicing material or - in the case of such products as ice cream, fruit juices, purees and the like - by thoroughly mixing the deicing microorganisms or agents with the foodstuff to be frozen.
Der Prozeß der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele anschaulich dargestellt:The process of the present invention is clearly illustrated by the following examples:
Herkunft der Eis-abspaltenden aktiven Bakterien- Pseudomonas syringae pv pisi wurde von der American Type Culture Collection (ZTCC) (Kat. # 11043, Rockville, MD) erhalten. Dieses Bakterium war ausgewählt worden, da es das potenteste der Eis-abspaltenden Bakterien ist. P. syringae wurden wiederbelebt, auf Reinheit gepruft und gelagert.Source of ice-secreting active bacteria- Pseudomonas syringae pv pisi was obtained from the American Type Culture Collection (ZTCC) (Cat. # 11043, Rockville, MD). This bacterium was selected because it is the most potent of the ice-secreting bacteria. P. syringae were revived, tested for purity and stored.
Pflege der Bakterien - Die Bakterien wurden auf NAG Platten gehalten und in eine Bruhe gegeben und wöchentlich auf neue Platten gegeben. Drei bis sieben Tage alte Kolonien von diesen NAG Platten zur Herkunft der P. syringae (es sei denn es wird anders beschrieben) wurden regelmaßig benutzt.Care of the bacteria - The bacteria were maintained on NAG plates and placed in a broth and transferred weekly to new plates. Three to seven day old Colonies from these NAG plates for the origin of P. syringae (unless otherwise stated) were regularly used.
- Die Bakterien wurden in distilliertem Waßer schwebend gehalten und die Trübung der schwebenden Haltung zu einer Aufnahme von 1.0 korrigiert. Ein Millimeter der ohne Rest aufgehenden Bakterienaulhängung wurde zu den Testproben hinzugegeben, entweder auf die Oberflache des Fisches (zerstückelt oder ganz) oder durch Mischen mit dem Fisch (zerstückelt). Alle Aufhängungen wurden am Gebrauchstag hergestellt.- The bacteria were suspended in distilled water and the turbidity of the suspended position was corrected to an uptake of 1.0. One millimeter of the fully dissolved bacterial suspension was added to the test samples, either on the surface of the fish (chopped or whole) or by mixing with the fish (chopped). All suspensions were made on the day of use.
- Fische, die in dieser Studie benutzt wurden, wurden vom Department of Fischeries, Aquaculture and Pathology, aus Teichen der University of Rhode Island erhalten. Lachs aus dem Atlantik (Salmo slalar) oder Regenbogenforelle (Salmo gairdneri) wurden mit Tricainmathnsulphonat MS-222 Fisch-Narkotikum betäubt (Argent Chemical Laboratories Inc. ,Redmont, WA), durch Auslaufen der Arterie getötet und dann ausgeweidet und geköpft. Sie wurden bei 2-4ºC in versiegelten Plastiktüten bis zu ihrem Gebrauch gelagert. Eine alternative Quelle für lebende Regenbogenforellen war ein Supermarkt in der Nähe. Diese wurden durch einen Schlag auf den Kopf getötet und dann einfach gelagert.- Fish used in this study were obtained from the Department of Fisheries, Aquaculture and Pathology, from ponds at the University of Rhode Island. Atlantic salmon (Salmo slalar) or rainbow trout (Salmo gairdneri) were anesthetized with tricaine methionine sulphonate MS-222 fish anesthetic (Argent Chemical Laboratories Inc. ,Redmont, WA), killed by artery drainage and then eviscerated and decapitated. They were stored at 2-4ºC in sealed plastic bags until use. An alternative source of live rainbow trout was a local supermarket. These were killed by a blow to the head and then simply stored.
- Die Fische wurden von Hand als Fillets zugeschnitten und gehäutet. Danach wurden die Fische für die Experimente entweder zerstückelt oder im Ganzen belaßen. Für die Experimente mit zerkleinertem Fisch wurden die Fischfillets mit einem scharfen Meßer in kleine Stücke geschnitten. Dann wurden die Fischmuskeln in eine Plastikzentriftigenröhre gegeben und die Röhre in eine Anlage gegeben) die reproduzierbare Plazierung der Untersuchung von Thermoverkupplungen für spätere Bestimmung der Gefrierkurve zuließ. Für die Experimente mit ganzen Fischfillets wurde das Fillet lotrecht zum Rückgrat in 4 cm dicke Stücke geschnitten. Daraufhin wurde ein Stück in eine Aluminiumschußel gegeben und die Schüßel in eine Anlage gestellt, die reproduzierbare Plazierung der Untersuchung von Thermoverkupplungen zur Überwachung der Gefrierkurve zuließ. Vier Proben hatten in den zwei Anlagen Platz.- The fish were cut into fillets by hand and skinned. Afterwards the fish were either chopped up or left whole for the experiments. For the experiments with chopped fish the fish fillets were cut into small pieces with a sharp knife. Then the fish muscles were placed in a plastic centrifuge tube and the tube was placed in a device) the reproducible placement of the investigation of thermocouples for later Determination of the freezing curve. For the experiments with whole fish fillets, the fillet was cut into 4 cm thick pieces perpendicular to the backbone. A piece was then placed in an aluminum bowl and the bowl was placed in a system that allowed reproducible placement of the thermocouples for monitoring the freezing curve. There was space for four samples in the two systems.
- Einfrierkurven wurden durch ein Linseismodell 7040 mit 4 Kanälen aufgezeichnet. Für alle Temperaturmeßungen wurden entweder fertige Typ T Kupfer- Constantin-Thermoverkupplungen (Modell TJ36-CPβ-116G-6, Omega Engeneering, Connecticut) oder Laborhergestellte Typ T Kupfer-Constantinthermoverkupplung benutzt. Beide wurden konstant mit einem Eisbad in Bezug gesetzt. Die Verbindungen von Thermoverkupplungen wurden mit einem Helium-Thermoverkupplungßchweißer zusammengeschweißt. Vom Kurvenblatt abgelesene Millivoltmeßungen, wurden in Temperaturen umgerechnet (Grad Celsius) mit Hilfe eines Grundprogrammes, das vom Author geschrieben worden war. Thermoverkupplungsuntersuchungen wurden in jeweils vier Proben (zerkleinerter oder ganzer Fisch) gegeben und die Anlage in eine speziell angefertigte Gefriertruhe (Scientemp Corp., Adrian, Michigan) gestellt. Bei dieser Gefriertruhe war es möglich, Temperaturen im Bereich zwischen 0ºC und -20ºC mit einer 4ºC Schwankung der ausgewählten Temperaturen. Das innere Fach war doppelt isoliert und mit einem Ventilator ausgestattet. Die Türe des Faches hatte ein 12' (304mm) quadratisches dreifach plattiertes Fenster, um ein direktes Beobachten der Probe zu ermöglichen. Ein Licht im Inneren spendete Licht. Die Proben wurden in das auf -5ºC, -10ºC oder -20ºC gekühlte Gefrierfach gelegt und die Einfrierkurven bei diesen Temperaturkurven gemeßen.- Freezing curves were recorded by a 4-channel Linseis Model 7040. Either ready-made Type T copper-constantin thermocouples (Model TJ36-CPβ-116G-6, Omega Engineering, Connecticut) or laboratory-made Type T copper-constantin thermocouples were used for all temperature measurements. Both were constantly referenced to an ice bath. Thermocouple joints were welded together using a helium thermocouple welder. Millivolt measurements read from the curve sheet were converted to temperatures (degrees Celsius) using a basic program written by the author. Thermocouple tests were placed in four samples each (minced or whole fish) and the unit placed in a custom-built freezer (Scientemp Corp., Adrian, Michigan). This freezer was capable of maintaining temperatures ranging between 0ºC and -20ºC with a 4ºC variation in the selected temperatures. The inner compartment was double insulated and equipped with a fan. The compartment door had a 12' (304mm) square triple-clad window to allow direct observation of the sample. An internal light provided light. The samples were placed in the freezer compartment cooled to -5ºC, -10ºC or -20ºC and the freezing curves were measured at these temperature curves.
- Ziffer 1 zeigt eine idealisierte Einfrierkurve mit tatsächlichen Temperaturen in einer Probe gegenüber der Zeit in einem Gefrierfach mit -5ºC. Die folgenden Zeiten und Temperaturen wurden für jeden der vier Kanäle von der Einfrierkurve aufgezeichnet:- Figure 1 shows an idealized freezing curve with actual temperatures in a sample versus time in a -5ºC freezer. The following times and temperatures were recorded for each of the four channels of the freezing curve:
- Definiert als der Zeitpunkt, an dem Gefrieren stattfindet.- Defined as the point in time at which freezing occurs.
- Definiert als die Mindesttemperatur, die von der Probe vor dem Gefrieren genommen wurde.- Defined as the minimum temperature taken from the sample before freezing.
- Definiert als der Temperaturunterschied zwischen dem Gefrierpunkt und der Abspaltung der Probe.- Defined as the temperature difference between the freezing point and the separation point of the sample.
- Definiert als die Zeitspanne zwischen dem Zeitpunkt, zu dem die Probe den Gefrierpunkt erreichte, nachdem Einfrieren stattgefunden hatte, bis zu dem Zeitpunkt, an dem Abspaltung begann.- Defined as the time between the time the sample reached the freezing point after freezing had occurred until the time when decomposition began.
- Definiert als die Zeit, die vergangen war von dem Zeitpunkt an, in dem die Probe den Gefrierpunkt erreichte bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Temperatur -5ºC erreichte.- Defined as the time elapsed from the time the sample reached freezing point until the temperature reached -5ºC.
Zerkleinerte Fischproben, vorbereitet wie oben beschrieben, wurden in Kontrollgruppen und Gruppen aufgeteilt, zu denen Pseudomonas syringae Auflösung in einer Konzentration von 10&sup7;k.f.E./ml hinzugegeben wurden. Die behandelten Gruppen wurden mit ca. 0.1 ml der Auflösung pro Gramm zerstuckelten Fisches bespruht. Die erzielten Ergebniße finden sich in der Tabelle 1. TABELLE 1 - EINFRIERKURVEN FÜR FORELLE UND LACHS Minced fish samples prepared as described above were divided into control groups and groups to which Pseudomonas syringae solution was added at a concentration of 10⁷kfu/ml. The treated groups were sprayed with approximately 0.1 ml of the solution per gram of minced fish. The results obtained are shown in Table 1. TABLE 1 - FREEZING CURVES FOR TROUT AND SALMON
¹Zeit vom Töten bis zum Einfrieren¹Time from killing to freezing
Der Vorgang des ersten Beispiels wurde mit acht Proben zerkleinertem Lachsmuskel wiederholt. Diese wurden einer Temperatur von -5ºC ausgesetzt. Den Einfrierkurven wurde für diese Proben während des gesamten Gefrierzyklus gefolgt. Die Ergebniße (zusammen mit Standardabweichungen in Klammern) finden sich in der zweiten Tabelle (die Gesamtgefrierzeit ist die Zeit, gemeßen von -1C an-dem angemeßenen Gefrierpunkt von Lachsmuskel - bis -5ºC, beinhaltet daher Abspaltungszeit). TABELLE 2 The procedure of the first example was repeated with eight samples of minced salmon muscle. These were exposed to a temperature of -5ºC. The freezing curves for these samples were followed throughout the freezing cycle. The results (together with standard deviations in parentheses) are given in the second table (the total freezing time is the time measured from -1C - the appropriate freezing point of salmon muscle - to -5ºC, therefore includes cleavage time). TABLE 2
Weitere Ergebniße, die auf dieselbe Weise erzielt wurden, finden sich im Folgenden:Further results obtained in the same way are given below:
Grad des "supercooling" ünd Abspaltungszeit für acht Proben, gründlich zerkleinerter und vermischter Lachs, von denen vier mit P. syringae behandelt wie im ersten Beispiel und vier unbehandelte. Die Proben wurden vom gleichen Fillet genommen und einer -5ºC Umgebung unterworfen (1. Reihe). Reihe 2 reprasentiert die gleichen Proben, die aufgetaut und wiedereingefroren wurden. Die Ergebniße finden sich in Tabelle 3. Tabelle 3 Degree of supercooling and dissociation time for eight samples of thoroughly minced and mixed salmon, four of which were treated with P. syringae as in the first example and four untreated. The samples were taken from the same fillet and subjected to a -5ºC environment (row 1). Row 2 represents the same samples that were thawed and refrozen. The results are shown in Table 3. Table 3
* nicht einfrierbar* cannot be frozen
Tabelle 4 - Die Gefrierparameter für das Einfrieren von ganzem Lachs, wenn er einer -7ºC Umgebung unterworfen ist, wurden mit und ohne P. syringae bestimmt. Table 4 - Freezing parameters for whole salmon when subjected to a -7ºC environment were determined with and without P. syringae.
Alle Daten der acht Werte sind Durchnittsdaten (Standardabweichungen in Klammern).All data of the eight values are average data (standard deviations in parentheses).
Die Methode des ersten Beispiels wurde wiederholt, diesmal allerdings mit Fischfillets, die wie in der Einleitung des Beispiels beschrieben, behandelt wurden. In diesem Fall wurden die Auflösungen für die Testproben bei einer Rate von 0,1 ml Konzentrationsauflösung 10&sup7; k.b.E./ml pro Gramm Fisch angewendet.The method of the first example was repeated, but this time using fish fillets treated as described in the introduction to the example. In this case the resolutions for the test samples were applied at a rate of 0.1 ml concentration resolution 10⁷ cfu/ml per gram of fish.
Die erzielten Ergebniße für Lachs finden sich in Tabelle 6 und werden in Ziffer 2 gezeigt. TABELLE 5 (Einfrierkurve für -5ºC) The results obtained for salmon are given in Table 6 and shown in section 2. TABLE 5 (Freezing curve for -5ºC)
¹Zeit in Tagen vom Töten bis zum Einfrieren¹Time in days from killing to freezing
Die Fähigkeit von P. syringae, Eis-Abspaltung in den folgenden flüßigen Nahrungsmitteln herbeizuführen, wurde getestet durch die Hinzugabe von 1 ml Auflosung von P. syringae mit einem Gehalt von 10&sup7; k.f.E./ml bis 20 ml flüßiges Nahrungsmittel und die Abspaltung und Einfriertemperaturen wurden mit Proben, die gleich behandelt wurden, aber zu denen keine Bakterien hinzugefügt worden waren, verglichen. Diese wurden getestet und das Ergebnis hiervon findet sich in den Tabellen 6, 7 und 8. TABELLE 6 - (Gefrierapparates ist auf -6C eingestellt) TABELLE 7 - (Gerfrierapparat ist auf -10ºC eingestellt) TABELLE 8 - (Gefriertruhe ist auf -16ºC eingestellt) The ability of P. syringae to induce ice release in the following liquid foods was tested by adding 1 ml of a solution of P. syringae containing 10⁷ cfu/ml to 20 ml of liquid food and the release and freezing temperatures were compared with samples treated similarly but to which no bacteria had been added. These were tested and the result of this is given in Tables 6, 7 and 8. TABLE 6 - (Freezer is set to -6C) TABLE 7 - (Freezer set to -10ºC) TABLE 8 - (Freezer set to -16ºC)
1. 37.4%Zucker1. 37.4%Sugar
2. 41.9%Zucker2. 41.9%Sugar
* Sehr ähnliche Ergebniße wurden erzielt, wenn eine Auflosung von P. syringae benutzt wurde, die einer drei-minutige Erhitzung durch Mikrowellen in einem Haushaltsmikrowellenherdausgesetzt worden war.* Very similar results were obtained using a solution of P. syringae that had been subjected to microwave heating for three minutes in a domestic microwave oven.
Die Fähigkeit von P. syringae, Abspaltung in Modellauflösungen herbeizuführen, die gewöhnlich in der Nahrungsmittelbereitung mit Salz und Bindemitte benutzt werdenl, wurde in der selben Art und Weise getestet wie die flüßigen Nahrungsmittel im 4. Beispielgetestet. Die Ergebniße finden sich in der Tabelle 9. TABELLE 9 The ability of P. syringae to induce segregation in model solutions commonly used in food preparation with salt and binder, was tested in the same way as the liquid foods in Example 4. The results are shown in Table 9. TABLE 9
* Sucrose* Sucrose
** NaCl**NaCl
*** Sucrose Plus***Sucrose Plus
# Sorbitol# Sorbitol
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