DE68904904T2 - SYNTHETIC SCM-ACTIVE, CANCER-DETECTING PEPTIDES. - Google Patents
SYNTHETIC SCM-ACTIVE, CANCER-DETECTING PEPTIDES.Info
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Tests zum Nachweis von Krebs.The present invention relates to tests for the detection of cancer.
Viele in Menschen und Tieren auftretende Krankheiten können durch die Gegenwart von Fremdsubstanzen, insbesondere im Blut, nachgewiesen werden, die für die Krankheit oder den Zustand spezifisch sind. Tests auf Antigene oder andere solche Substanzen, die als Ergebnis solcher Krankheiten gebildet werden, zeigen vielversprechende Anwendungen als diagnostisches Werkzeug zur Früherkennung und Behandlung der speziellen Krankheit, die das Antigen oder die andere Substanz bildete. Ein Verfahren zum Nachweis solcher Substanzen muß zuverlässig, reproduzierbar und empfindlich sein, um ein praktizierbares Diagnoseverfahren für medizinische Versorger darzustellen. Darüberhinaus sollte ein solches Verfahren von Personen mit durchschnittlichem Können und Ausbildung in Laborverfahren durchgeführt werden können und es sollte relativ schnell und kostengünstig durchgeführt werden können.Many diseases occurring in humans and animals can be detected by the presence of foreign substances, particularly in the blood, that are specific to the disease or condition. Tests for antigens or other such substances produced as a result of such diseases show promising applications as a diagnostic tool for early detection and treatment of the specific disease that produced the antigen or other substance. A method for detecting such substances must be reliable, reproducible and sensitive to provide a practical diagnostic procedure for health care providers. In addition, such a method should be capable of being performed by persons of average skill and training in laboratory procedures, and it should be capable of being performed relatively quickly and inexpensively.
Beispielsweise ist es bei der Behandlung verschiedener bösartiger Krankheiten, an denen Menschen und Tiere leiden, und die allgemein als Krebs bezeichnet werden, bekannt, daß Früherkennung ein Schlüssel zur wirksamen Behandlung ist, insbesondere, da viele Therapieverfahren nur in relativ frühen Stadien der Krankheit wirksam sind. In der Tat sind eigentlich alle bekannten Behandlungen von Krebs in frühen Krebsstadien nicht nur wirksamer, sondern auch sicherer. Viel zu viele Krebsfälle werden nur erst spät entdeckt, um sie wirksam zu behandeln.For example, it is used in the treatment of various malignant diseases that affect humans and animals, and the commonly referred to as cancer, it is well known that early detection is a key to effective treatment, particularly since many therapies are only effective in the relatively early stages of the disease. In fact, virtually all known treatments for cancer are not only more effective in the early stages of the disease, but also safer. Far too many cases of cancer are discovered too late to be treated effectively.
Demgemäß besteht ein großer Bedarf an zuverlässigen Tests, die Krebs in frühen Stadien diagnostizieren können. In diesem Zusammenhang werden neue Tests und Verfahren entwickelt, um Frühdiagnose von Krebs zu ermöglichen.Accordingly, there is a great need for reliable tests that can diagnose cancer at an early stage. In this context, new tests and procedures are being developed to enable early diagnosis of cancer.
Ein äußerst wünschenswertes Ziel ist es, einen solchen Test bereitzustellen, der je nach den verwendeten Materialien in der Lage ist, entweder ganz allgemein alle Arten von Krebs oder spezielle Krebsarten nachzuweisen. Die erstgenannte Anwendung eines solchen Tests ist sehr wichtig bei der Reihenuntersuchung hoher Krankenpopulationen, wie dies bei ärztlichen Routineuntersuchungen geschieht. In solchen Reihenuntersuchungen wäre ein Test, der von einer speziellen Krebsart abhängig ist, nicht wünschenswert, da es buchstäblich Hunderte von Krebsarten gibt und bei einem Test, der nur eine oder wenige Arten der Krankheit auffinden kann, ist die Wahrscheinlichkeit zu groß, viele Krebsfälle zu übersehen. Im allgemeinen werden diese Patienten entweder keine Symptome oder vage allgemeine Symptome aufweisen, die nicht ohne weiteres mit einer besonderen Krebsart in Verbindung gebracht werden können, so daß kein Grund auf Verdacht einer besonderen Art und für die Anwendung eines für diese Art spezifischen Tests besteht.A highly desirable goal is to provide such a test which, depending on the materials used, is capable of detecting either all types of cancer in general or specific types of cancer. The former application of such a test is very important in screening large populations of patients, as is done in routine medical examinations. In such screenings, a test dependent on a specific type of cancer would not be desirable, since there are literally hundreds of types of cancer, and a test which can detect only one or a few types of the disease is too likely to miss many cases of cancer. In general, these patients will either have no symptoms or vague general symptoms which cannot readily be associated with a particular type of cancer, so that there is no reason to suspect a particular type and to use a test specific to that type.
Im Gegensatz dazu ist es wünschenswert, über einen Test zu verfügen, der die speziellen Arten einer vorliegenden Malignität genau bestimmen kann, wenn das Vorliegen einer Malignität erst einmal bekannt ist oder ein starker Verdacht darauf besteht. Solch ein Test könnte in hohem Maße zur Effizienz der Behandlung beitragen, weil viele der wirksamsten Krebstherapien, wie die Chemotherapie, nur gegen eine Krebsart oder bestenfalls einen schmalen Bereich von Arten wirksam sind, und die falsche Chemotherapie mehr schadet als nützt.In contrast, it is desirable to have a test that can accurately determine the specific types of malignancy present once the presence of a malignancy is known or strongly suspected. Such a test could greatly contribute to the efficiency of treatment, because many of the most effective cancer therapies, such as chemotherapy, are effective against only one type of cancer, or at best a narrow range of types, and the wrong chemotherapy does more harm than good.
Wir haben einen solchen Test zur Krebsfrüherkennung entwickelt und darüber berichtet,und zwar in L. Cercek, B. Cercek, & C.I.V. Franklin, "Biophysical Differentiation Between Lymphocytes from Healthy Donors, Patients with Malignant Diseases and Other Disorders", Brit. J. Cancer 29, 345-352 (1974) und L. Cercek & B. Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977).We have developed and reported such a test for early cancer detection in L. Cercek, B. Cercek, & C.I.V. Franklin, "Biophysical Differentiation Between Lymphocytes from Healthy Donors, Patients with Malignant Diseases and Other Disorders", Brit. J. Cancer 29, 345-352 (1974) and L. Cercek & B. Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J. Cancer 13, 903-915 (1977).
Unser SCM-Test (Strukturiertheit der zytoplasmatischen Matrix oder auch "structuredness of cytoplasmatic matrix" genannt) macht sich die Tatsache zunutze, daß eine Subpopulation der Lymphozyten eines normalen Individuums ihre innere Struktur als Reaktion auf ein Einwirken eines Mitogens wie Phytohämagglutinin (PHA) ändert, jedoch nicht auf das Einwirken bestimmter Testreagenzien einschließlich bestimmter krebsbegleitender Antigene reagiert, während die Lymphozyten eines Individuums mit Krebs gerade in umgekehrter Weise reagieren. Mit anderen Worten, dieselbe Subpopulation von Lymphozyten von Krebspatienten reagiert in dem SCM-Test nicht auf das Einwirken eines Mitogens, sie reagiert jedoch stark auf das Einwirken einer Anzahl von krebsbegleitenden Antigenen sowie auf die synthetischen Peptide, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind.Our SCM (structuredness of cytoplasmic matrix) test takes advantage of the fact that a subpopulation of lymphocytes from a normal individual changes its internal structure in response to exposure to a mitogen such as phytohemagglutinin (PHA), but does not respond to exposure to certain test reagents including certain cancer-associated antigens, while the lymphocytes from an individual with cancer react in just the opposite way. In other words, the same subpopulation of lymphocytes from cancer patients does not respond to exposure to a mitogen in the SCM test, but responds strongly to exposure to a number of cancer-associated antigens as well as to the synthetic peptides that are the subject of the present invention.
Je nachdem, welche Substanz verwendet wird, um auf die Lymphozyten einzuwirken (das Testreagens), kann der SCM-Test zum Nachweis von Krebs allgemein oder einer spezifischen Krebsart durchgeführt werden. Wie im einzelnen ausgeführt werden wird, ist der SCM-Test bei der Früherkennung von Malignitäten vielversprechend und weist deshalb potentiell klinischen Nutzen auf.Depending on which substance is used to act on the lymphocytes (the test reagent), the SCM test can be used to detect cancer in general or a specific type of cancer As will be discussed in detail, the SCM test shows promise in the early detection of malignancies and therefore has potential clinical utility.
Es wird angenommen, daß die Änderungen, die in dem SCM-Test zu sehen sind, Änderungen in der inneren Struktur des Lymphozyten widerspiegeln, da der Lymphozyt zur Synthese aktiviert ist. Diese Änderungen sind als Abnahme der Fluoreszenzpolarisation der Zellen zu sehen, wenn polarisiertes Licht verwendet wird, um einen extrinsischen bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Stoff, nämlich Fluorescein,anzuregen, der intrazellulär durch Hydrolyse einer nichtfluoreszierenden Verbindung, nämlich Fluoresceindiacetat, gebildet wird, die von den Lymphozyten absorbiert wurde. Es ist notwendig, einen extrinischen, bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Stoff zuzugeben, da die intrinsische Fluoreszenz von zellulären Komponenten zu gering ist, um bei diesem Test Ergebnisse zu liefern. Deshalb sind im folgenden alle Bezugnahmen auf Fluoreszenzpolarisationswerte Bezugnahmen auf solche Fluoreszenzpolarisationswerte, die mit einem extrinsischen bei UV-Bestrahlung fluoreszierenden Stoff erhalten wurden, und zwar vorzugsweise mit einem solchen, der intrazellulär durch enzymatische Hydrolyse aus einer nichtfluorogenen Verbindung gebildet wird, die zugefügt und von den Zellen absorbiert wird.The changes seen in the SCM test are thought to reflect changes in the internal structure of the lymphocyte as the lymphocyte is activated for synthesis. These changes are seen as a decrease in the fluorescence polarization of the cells when polarized light is used to excite an extrinsic UV fluorescent substance, fluorescein, which is formed intracellularly by hydrolysis of a non-fluorescent compound, fluorescein diacetate, that has been absorbed by the lymphocytes. It is necessary to add an extrinsic UV fluorescent substance because the intrinsic fluorescence of cellular components is too low to give results in this test. Therefore, all references to fluorescence polarization values hereinafter are references to fluorescence polarization values obtained with an extrinsic substance that fluoresces upon UV irradiation, preferably one that is formed intracellularly by enzymatic hydrolysis from a non-fluorogenic compound that is added and absorbed by the cells.
Beim Messen der Fluoreszenzpolarisation beim SCM-Test ist der wichtige zu berechnende Wert der Nettowert der Fluoreszenzpolarisation, "P", nachdem eine Korrektur durchgeführt wurde, und zwar für (i) die intrinsische Fluoreszenz des Mediums, (ii) ein beliebiges vorliegendes extrazelluläres Fluorescein und (iii) die ungleiche Transmission der zwei Komponenten polarisierten Lichts in der Fluoreszenzpolarisationsmeßvorrichtung. Alle folgenden Verweise auf Messungen der Fluoreszenzpolarisation beziehen sich auf Messungen des Nettowertes der Fluoreszenzpolarisation, wenn nicht anders angegeben. Die Fluoreszenzpolarisation ist ein Maß für die intrazelluläre Festigkeit, bzw. Steifheit; je größer die Fluidität der intrazellulären Mobilität, desto geringer die gemessene Fluoreszenzpolarisation. Wie beim SCM-Test zu sehen ist, wird die beobachtete Abnahme der Fluoreszenzpolarisation, die durch Abnahme des P-Werts gemessen wird, hauptsächlich auf Änderungen in der Konformation der Mitochondrien, der energieerzeugenden Organellen der Zelle, zurückgeführt. Die Änderungen in den Mitochondrien werden auf Kontraktionen der Cristae oder inneren Falten der mitochondrialen Membran zurückgeführt. Die SCM spiegelt die Wechselwirkungskräfte wider zwischen Makromolekülen und kleinen Molekülen, wie Wassermoleküle, Ionen, Adenosintriphosphat und zyklischem Adenosinphosphat. Störungen dieser Wechselwirkungen ergeben Änderungen in der SCM.When measuring fluorescence polarization in the SCM test, the important value to calculate is the net value of fluorescence polarization, "P", after correction has been made for (i) the intrinsic fluorescence of the medium, (ii) any extracellular fluorescein present, and (iii) the unequal transmission of the two components of polarized light in the fluorescence polarization measuring device. All references to fluorescence polarization measurements below refer to measurements of the net value of Fluorescence polarization, unless otherwise stated. Fluorescence polarization is a measure of intracellular rigidity, or stiffness; the greater the fluidity of intracellular mobility, the lower the measured fluorescence polarization. As seen in the SCM assay, the observed decrease in fluorescence polarization, measured by decrease in P-value, is primarily attributed to changes in the conformation of mitochondria, the energy-producing organelles of the cell. The changes in the mitochondria are attributed to contractions of the cristae, or inner folds, of the mitochondrial membrane. The SCM reflects the interaction forces between macromolecules and small molecules, such as water molecules, ions, adenosine triphosphate, and cyclic adenosine phosphate. Perturbations in these interactions result in changes in the SCM.
Nicht alle Lymphozyten reagieren positiv auf den SCM-Test; nur etwa 10-20 % der Lymphozyten reagieren tatsächlich. Immunologisch sind die auf SCM reagierenden Lymphozyten mononukleare T-Zell-Leukozyten. Jene Lymphozyten, die reagieren, bilden eine Subpopulation, die durch Verfahren wie Dichtegradienten- Zentrifugation, isoliert werden können. Diese Subpopulation wird im folgenden als "potentiell auf SCM reagierende Lymphozyten" bezeichnet.Not all lymphocytes react positively to the SCM test; only about 10-20% of lymphocytes actually react. Immunologically, the lymphocytes that react to SCM are mononuclear T-cell leukocytes. Those lymphocytes that react form a subpopulation that can be isolated by techniques such as density gradient centrifugation. This subpopulation is referred to hereafter as "potentially SCM-reactive lymphocytes."
Der SCM-Test ist in der Lage, auf relativ geringe Mengen maligner Zellen zu reagieren. Etwa 10&sup9; Zellen in einer Person mit einem Körpergewicht von 70 kg reichen aus, um zu bewirken, daß die Lymphozyten beim SCM-Test in dem für Malignität charakteristischen Muster reagieren. Wenn in Mäusen die nur geringe Menge von 7,5 x 10&sup5; Ehrlich-Ascites-(Tumor)-Zellen implantiert werden, ändert sich das Reaktionsmuster im SCM- Test; es wird eine Reaktion auf krebsspezifische Antigene induziert, während die normale Reaktion auf PHA praktisch ausgelöscht wird. (L. Cercek & B. Cercek, "Changes in SCM- Responses of Lymphocytes in Mice After Implantation with Ehrlich Ascites Cells," Europ. J. Cancer 17, 167-171 (1981).The SCM test is able to respond to relatively small amounts of malignant cells. About 109 cells in a person weighing 70 kg are sufficient to cause the lymphocytes in the SCM test to respond in the pattern characteristic of malignancy. When mice are implanted with as little as 7.5 x 105 Ehrlich ascites (tumor) cells, the response pattern in the SCM test changes; a response to cancer-specific antigens is induced, while the normal response to PHA is virtually eliminated. (L. Cercek & B. Cercek, "Changes in SCM- Responses of Lymphocytes in Mice After Implantation with Ehrlich Ascites Cells," Europ. J. Cancer 17, 167-171 (1981).
Im Gegensatz dazu ist, wenn malignes Gewebe der Brust oder des Colons chirurgisch entfernt wird, die Reaktion der Lymphozyten des operierten Patienten auf ein allgemein krebsbegleitendes Antigen, Krebsbasisprotein (CaBP) innerhalb 24 Std. nach der Operation verschwunden. Die normale Reaktion auf PHA wird in diesem Patienten langsamer wieder erreicht; diese Reaktion tritt innerhalb von zwei Wochen nach der Operation wieder auf. (L. Cercek & B. Cercek, "Changes in the SCM Response Ratio (RRSCM) After Surgical Removal of Malignant Tissue", Brit. J. Cancer 31, 250-251 (1975).In contrast, when malignant tissue of the breast or colon is surgically removed, the response of the operated patient's lymphocytes to a common cancer antigen, cancer basic protein (CaBP), has disappeared within 24 hours after surgery. The normal response to PHA is regained more slowly in this patient; this response reappears within two weeks after surgery. (L. Cercek & B. Cercek, "Changes in the SCM Response Ratio (RRSCM) After Surgical Removal of Malignant Tissue", Brit. J. Cancer 31, 250-251 (1975).
Zum Vergleich der Reaktion von Lymphozyten auf krebsbegleitende Antigene und auf PHA in dem SCM-Test kann ein "SCM-Reaktions- Verhältnis" berechnet werden. Dieses Verhältnis ist das Verhältnis des Grads der Fluoreszenzpolarisation, die nach Stimulation mit einem krebsbegleitenden Antigen erhalten wird, zu dem Grad der Fluoreszenzpolarisation, die nach Stimulation mit PHA erhalten wird. Da normale Zellen nach der Behandlung mit PHA, nicht jedoch mit krebsbegleitenden Antigenen, eine Abnahme der Fluoreszenzpolarisation zeigen, ist das Reaktionsverhältnis für solch normale Zellen im allgemeinen relativ hoch - von 1,3 bis 1,6. Im Gegensatz dazu zeigen Lymphozyten, die von Patienten mit malignen Zuständen isoliert wurden, ein viel niedrigeres Reaktionsverhältnis von 0,6 zu 0,8. In einigen "prämalignen" Zuständen wie Polyposis coli und Hyperkeratose der Haut ist ein dazwischen liegendes Verhältnis von 0,8 bis 1,0 zu sehen. (Cercek, Cercek & Franklin, 1974). Dies weist darauf hin, daß der SCM-Test diagnostisch wertvoll ist, und zwar sogar noch bevor der Krebs ein klinisch oder histologisch nachweisbares Stadium erreicht hat.To compare the response of lymphocytes to cancer-associated antigens and to PHA in the SCM assay, an "SCM response ratio" can be calculated. This ratio is the ratio of the degree of fluorescence polarization obtained after stimulation with a cancer-associated antigen to the degree of fluorescence polarization obtained after stimulation with PHA. Since normal cells show a decrease in fluorescence polarization after treatment with PHA, but not with cancer-associated antigens, the response ratio for such normal cells is generally relatively high - from 1.3 to 1.6. In contrast, lymphocytes isolated from patients with malignant conditions show a much lower response ratio of 0.6 to 0.8. In some "premalignant" conditions such as polyposis coli and hyperkeratosis of the skin, an intermediate ratio of 0.8 to 1.0 is seen. (Cercek, Cercek & Franklin, 1974). This indicates that the SCM test is diagnostically valuable even before the cancer has reached a clinically or histologically detectable stage.
Wenn Lymphozyten von Krebspatienten im SCM-Test mit Stücken von ganzem Krebsgewebe getestet werden, reagieren sie nur auf Gewebe desselben Krebstyps, von dem die Lymphozyten stammen (L. Cercek & H. Cercek, "Apparent Tumour Specificity with the SCM Test", Brit. J. Cancer 31, 252-253 (1975)). Die gereinigten krebsbegleitenden Antigene, die Gegenstand dieser Erfindung sind, zeigen jedoch keine spezifische Reaktion auf eine bestimmte Krebsart, wenn sie zum Testen der Lymphozyten im SCM-Test verwendet werden. Mit anderen Worten, diese gereinigten Antigene lösen in Lymphozyten von Patienten mit jeder Art von Krebs eine Reaktion aus. Wie zuvor erläutert, kann diese Eigenschaft solche Antigene für allgemeine Untersuchungstests klinisch nutzbar machen. Die Reaktion auf den SCM-Test kann jedoch in extrem fortgeschrittenen Stadien der bösartigen Krankheit, wenn der Krebs bereits metastasiert hat, ausbleiben.When lymphocytes from cancer patients are tested in the SCM test with pieces of whole cancer tissue, they react only to tissue of the same cancer type from which the lymphocytes were derived (L. Cercek & H. Cercek, "Apparent Tumour Specificity with the SCM Test", Brit. J. Cancer 31, 252-253 (1975)). However, the purified cancer-associated antigens that are the subject of this invention do not show a specific response to a particular type of cancer when used to test lymphocytes in the SCM test. In other words, these purified antigens elicit a response in lymphocytes from patients with any type of cancer. As previously explained, this property may make such antigens clinically useful for general screening tests. However, the response to the SCM test may be absent in extremely advanced stages of the malignant disease, when the cancer has already metastasized.
Unter den krebsbegleitenden Antigenen, von denen bekannt ist, daß sie in dem SCM-Test wirksam sind, sind das Krebsbasisprotein (CaBP) und das Myelinbasisprotein (MBP). Das Krebsbasisprotein ist ein Basisprotein oder eine Gruppe ähnlicher Basisproteine, die aus Krebstumoren isoliert wurden. Das Myelinbasisprotein (MBP) ist ein Protein von annähernd 15 000 Dalton, das eine Hauptkomponente des Myelins ist. Es wird angenommen, daß eine abnorme allergische Reaktion auf Myelin Teil des Krankheitsverlaufs von einer Reihe von Systemstörungen des Nervensystems ist, wie bei dem Guillain-Barre'-Syndrom und sehr wahrscheinlich auch bei der Multiplen Sklerose. Wie erwartet, reagieren Lymphozyten aus Multipler Sklerose in dem SCM-Test auf MBP; solche Lymphozyten reagieren jedoch nicht auf CaBP, sondern reagieren wie Lymphozyten aus normalen Individuen auf PHA. Dieses Reaktionsmuster unterscheidet Lymphozyten von Patienten mit Multipler Sklerose von Lymphozyten von Patienten mit malignen Störungen.Among the cancer-associated antigens known to be effective in the SCM test are cancer basic protein (CaBP) and myelin basic protein (MBP). Cancer basic protein is a basic protein or group of similar basic proteins isolated from cancerous tumors. Myelin basic protein (MBP) is a protein of approximately 15,000 daltons that is a major component of myelin. An abnormal allergic reaction to myelin is believed to be part of the disease process of a number of systemic disorders of the nervous system, such as Guillain-Barré syndrome and most likely multiple sclerosis. As expected, lymphocytes from multiple sclerosis respond to MBP in the SCM test; however, such lymphocytes do not respond to CaBP, but respond to PHA like lymphocytes from normal individuals. This reaction pattern distinguishes lymphocytes from patients with multiple sclerosis from lymphocytes from patients with malignant disorders.
Es ist jedoch weder CaBP noch MBP zur Verwendung als allgemeine Testsubstanz in dem SCM-Test ideal. Beide müssen aus natürlichem Material gereinigt werden, was möglicherweise Unterschiede von Charge zu Charge schafft, sowie die Möglichkeit, daß Verunreinigungen einen starken Einfluß auf den Test ausüben. Darüberhinaus ist CaBP ein relativ nichtspezifisches Antigen, und ist daher nicht mehr bevorzugt. MBP ist relativ schwierig zu reinigen, da das Ausgangsmaterial Material aus dem zentralen Nervensystem ist, und das Protein relativ hydrophob und unter vielen Bedingungen unlöslich ist. Darüberhinaus ist bekannt, daß Lymphozyten aus Patienten mit Multipler Sklerose in dem SCM-Test auf MBP reagieren. Obwohl die Reaktion auf solche Lymphozyten von der Reaktion, die von Lymphozyten von Patienten mit malignem Gewebe gegeben wird, unterschieden werden kann, erfordert eine solche Differenzierung extra Kontrollen, wie die Stimulation eines Aliquots der Lymphozyten mit einem Mitogen, und erschwert daher den Test.However, neither CaBP nor MBP is ideal for use as a general test substance in the SCM test. Both must be purified from natural material, creating potential lot-to-lot variability and the possibility that impurities can have a strong influence on the test. In addition, CaBP is a relatively nonspecific antigen and is therefore no longer preferred. MBP is relatively difficult to purify because the starting material is material from the central nervous system and the protein is relatively hydrophobic and insoluble under many conditions. In addition, lymphocytes from patients with multiple sclerosis are known to respond to MBP in the SCM test. Although the response to such lymphocytes can be distinguished from the response given by lymphocytes from patients with malignant tissue, such differentiation requires extra controls, such as stimulation of an aliquot of the lymphocytes with a mitogen, and therefore complicates the test.
Als das synthetische experimentelle allergische enzephalitiserzeugende Peptid (EAE-Peptid) verfügbar wurde, wurde dieses Peptid, das ein Fragment ist, das Aminosäurereste 114-122 von Human-MBP umfaßt und die Aminosäuresequenz Phe- Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg aufweist, in dem SCM-Test getestet und gab die erwartete positive Reaktion ähnlich dem MBP. Dieses EAE wurde im Handel von Beckman Instruments vertrieben.When the synthetic experimental allergic encephalitis-causing peptide (EAE peptide) became available, this peptide, which is a fragment comprising amino acid residues 114-122 of human MBP and has the amino acid sequence Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg, was tested in the SCM assay and gave the expected positive response similar to MBP. This EAE was commercially distributed by Beckman Instruments.
Die Forschung, die direkt zu der vorliegenden Erfindung führte, begann, als die Erfinder, was als Arbeit nicht veröffentlicht oder vor dieser Anmeldung offenbart wurde, überraschenderweise entdeckten, daß Beckman-EAE-Peptid, das weiter mittels Anionenaustauschchromatographie gereinigt wurde, in dem SCM- Test nicht die erwartete Reaktion hervorrief, wenn es zum Testen der Lymphozyten von Krebspatienten verwendet wurde. Das synthetische Peptid, von dem erwartet wurde, daß es in dem SCM-Test hilfreich ist, stellte sich also als Fehlschlag heraus.The research that led directly to the present invention began when the inventors, in what was not published as work or disclosed prior to this application, surprisingly discovered that Beckman EAE peptide, which was further purified by anion exchange chromatography, did not elicit the expected response in the SCM test when added to testing lymphocytes from cancer patients. The synthetic peptide that was expected to be useful in the SCM test turned out to be a failure.
Demgemäß besteht ein Bedarf für ein Peptid, das als Ersatz für das Krebsbasisprotein und das Myelinbasisprotein als Testsubstanz für Lymphozyten aus Krebszellen in dem SCM-Test verwendbar ist. Vorzugsweise ist das Peptid nichtspezifisch bezüglich der Krebsart, die den Spender der getesteten Lymphozyten beeinträchtigt. Es ist wünschenswert, daß das Peptid für eine schnelle Untersuchung von Lymphozytenproben auf Krebs mit dem SCM-Test und zur Erkennung von Krebs im Frühstadium hilfreich ist. Eine Zusammensetzung, die solche Peptide umfaßt, wird als eine "SCM-aktive, krebserkennende Zusammensetzung" bezeichnet oder, da die Krebserkennung der Hauptzweck des Tests ist und jede Zusammensetzung diese Aktivität aufweisen muß, um in dem Test von Wert zu sein, auch einfach als "SCM-aktive Zusammensetzung" bezeichnet.Accordingly, there is a need for a peptide that is useful as a substitute for cancer basic protein and myelin basic protein as a test substance for lymphocytes from cancer cells in the SCM assay. Preferably, the peptide is nonspecific to the type of cancer affecting the donor of the lymphocytes being tested. It is desirable that the peptide be useful for rapid screening of lymphocyte samples for cancer using the SCM assay and for detecting early stage cancer. A composition comprising such peptides is referred to as an "SCM-active cancer-detecting composition" or, since cancer detection is the primary purpose of the assay and any composition must have this activity to be of value in the assay, simply referred to as an "SCM-active composition."
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Klasse von Peptiden, die diese Notwendigkeit erfüllen. Eine erfindungsgemäße SCM- aktive krebserkennende Zusammensetzung umfaßt im wesentlichen nur Peptide dieser Klasse, wobei die Peptide mindestens sieben Aminosäurereste aufweisen, in denen eine Sequenz Phe-Trp-Gly- Val enthalten ist. Vorzugsweise enthält die Zusammensetzung nur ein Peptid dieser Klasse.The present invention relates to a class of peptides that meet this need. An SCM-active cancer-detecting composition according to the invention comprises essentially only peptides of this class, the peptides having at least seven amino acid residues containing a sequence Phe-Trp-Gly-Val. Preferably, the composition contains only one peptide of this class.
Vorzugsweise weist das Peptid die Sequenz Phe-Trp-Gly- R&sub1;-R&sub2;-Gly-R&sub3;-Arg auf, worin R&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala und Val, R&sub2; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glu und Asp, und R&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asn und Gln. Noch mehr bevorzugt weist das Peptid die Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg auf, und die Zusammensetzung ist im wesentlichen frei von experimentellem allergischen enzephalitiserzeugenden Peptid.Preferably, the peptide has the sequence Phe-Trp-Gly-R₁-R₂-Gly-R₃-Arg, wherein R₁ is selected from the group consisting of Ala and Val, R₂ is selected from the group consisting of Glu and Asp, and R₃ is selected from the group consisting of Asn and Gln. Even more preferably, the peptide has the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg, and the composition is substantially free of experimental allergic encephalitis-causing peptide.
Alternativ weist das Peptid vorzugsweise die Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-R&sub1;-Gly-R&sub3;-Arg auf, wobei R&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala und Val und R&sub3; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gln und Asn. Vorzugsweise weist das Peptid die Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg auf, und die Zusammensetzung ist im wesentlichen frei von experimentellem allergischen enzephalitiserzeugenden Peptid.Alternatively, the peptide preferably has the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-R₁-Gly-R₃-Arg, where R₁ is selected from the group consisting of Ala and Val and R₃ is selected from the group consisting of Gln and Asn. Preferably, the peptide has the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg, and the composition is substantially free of experimental allergic encephalitis-causing peptide.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Anwendungsverfahren der SCM-aktiven Zusammensetzungen in dem SCM-Test. Ganz allgemein umfaßt dieses Verfahren das Testen von Lymphozyten eines Säugetierspenders auf die Gegenwart oder Abwesenheit von malignem Gewebe in dem Spender, in dem eine Suspension der Lymphozyten mit der SCM-aktiven Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird. Das Verfahren umfaßt darüberhinaus als Stufe, die Bestimmung der Abnahme der Strukturiertheit der zytoplasmatischen Matrix der Lymphozyten, die aus derjenigen Stufe stammen, in der die Suspension mit der SCM-aktiven Zusammensetzung in Kontakt gebracht wurde. Ein bevorzugtes Verfahren der quantitativen Bestimmung der Abnahme der Strukturiertheit ist: (1) Messen der Abnahme der Fluoreszenzpolarisation, die sich aus dem Kontakt mit den Lymphozyten ergibt, in dem die Fluoreszenzpolarisation PS für ein Aliquot der Lymphozyten die mit der SCM-aktiven Zusammensetzung in Kontakt gebracht wurden, gemessen wird; (2) Messen der Fluoreszenzpolarisation PC für ein Kontrollaliquot der Lymphozyten, das nicht in Kontakt war; und (3) Bestimmen des Verhältnisses von PS zu PC. Ein Verhältnis von PS zu PC von niedriger als etwa 0,9 gibt eine positive Reaktion auf die SCM-aktive Zusammensetzung und die Gegenwart von malignem Gewebe in dem Spender der Lymphozyten an.Another aspect of the present invention relates to the methods of using the SCM-active compositions in the SCM assay. Generally, this method comprises testing lymphocytes from a mammalian donor for the presence or absence of malignant tissue in the donor by contacting a suspension of the lymphocytes with the SCM-active composition. The method further comprises, as a step, determining the decrease in the structuredness of the cytoplasmic matrix of the lymphocytes resulting from the step of contacting the suspension with the SCM-active composition. A preferred method of quantitatively determining the decrease in structuredness is: (1) measuring the decrease in fluorescence polarization resulting from contact with the lymphocytes by measuring the fluorescence polarization PS for an aliquot of the lymphocytes contacted with the SCM-active composition; (2) measuring the fluorescence polarization PC for a control aliquot of lymphocytes that was not in contact; and (3) determining the ratio of PS to PC. A ratio of PS to PC less than about 0.9 indicates a positive response to the SCM-active composition and the presence of malignant tissue in the donor lymphocyte.
Ein bevorzugteres Verfahren umfaßt das Vergleichen von PS mit der Fluoreszenzpolarisation eines anderen Aliquots von Lymphozyten, die mit einem Mitogen, PM, in Kontakt waren, um ein SCM-Reaktionsverhältnis, RRSCM, zu bestimmen, wobei:A more preferred method involves comparing PS with the fluorescence polarization of another aliquot of lymphocytes that have been in contact with a mitogen, PM, to determine a SCM response ratio, RRSCM, where:
RRSCM PS/PM.RRSCM PS/PM.
Ein RRSCM-Wert von weniger als etwa 0,8 weist auf das Vorhandensein einer Malignität in dem Spender der Lymphozyten hin.An RRSCM value of less than about 0.8 indicates the presence of malignancy in the donor lymphocytes.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Gensonden, die DNA-Sequenzen umfassen, die zu den bekannten Aminosäuresequenzen der synthetischen Peptide, die hier als SCM-aktiv beschrieben werden, korrespondieren. Solche Gensonden können beim Screenen der DNA von Krebszellen für Gene nützlich sein, die homolog zu der für die synthetischen Peptide codierenden Sequenz und daher möglicherweise mit Krebs verbunden sind.Another aspect of the present invention relates to gene probes comprising DNA sequences corresponding to the known amino acid sequences of the synthetic peptides described herein as being SCM active. Such gene probes may be useful in screening the DNA of cancer cells for genes homologous to the sequence encoding the synthetic peptides and therefore potentially linked to cancer.
Die DNA-Sequenz umfaßt eine zu der Aminosäuresequenz Phe-Trp- Gly-Val korrespondierende Sequenz. Vorzugsweise umfaßt die DNA-Sequenz eine zu der Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala- Glu-Gly-Gln-Arg korrespondierende Sequenz. Alternativ umfaßt die DNA-Sequenz eine zu einem Peptid der Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg korrespondierende Sequenz.The DNA sequence comprises a sequence corresponding to the amino acid sequence Phe-Trp- Gly-Val. Preferably, the DNA sequence comprises a sequence corresponding to the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg. Alternatively, the DNA sequence comprises a sequence corresponding to a peptide of the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt Antikörper, die durch kovalente Bindung der zuvor als die die SCM-aktive Zusammensetzung enthaltenden beschriebenen Peptidklassen oder alternativ, von im wesentlichen gereinigten Peptiden der Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Glu-Gln-Arg oder Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg, die im wesentlichen frei von experimentellem allergischen enzephalitiserzeugenden Peptid sind, an einem Träger mit hohem Molekulargewicht hergestellt werden und das Immunisieren eines Tieres mit dem so erhaltenen kovalenten Konjugat. Die hergestellten Antikörper sind für die SCM-aktive, krebserkennende Zusammensetzung spezifisch. Vorzugsweise ist der hochmolekulare Träger ein Schlüsselloch- Napfschnecken-Hämocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin) und die kovalente Bindung wird durch Reaktion mit einem Carbodiimid durchgeführt.Yet another aspect of the present invention comprises antibodies prepared by covalently linking the classes of peptides previously described as containing the SCM-active composition or, alternatively, substantially purified peptides of the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Glu-Gln-Arg or Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg which are substantially free of experimental allergic encephalitis-producing peptide to a high molecular weight carrier and immunizing an animal with the resulting covalent conjugate. The antibodies produced are specific for the SCM-active cancer-detecting compound. Preferably, the high molecular weight carrier is a keyhole limpet hemocyanin and the covalent bonding is carried out by reaction with a carbodiimide.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt die Herstellung monoklonaler Antikörper, die für jegliche Peptidklassen spezifisch sind, die als die die SCM-aktive Zusammensetzung oder die im wesentlichen gereinigten einfachen Peptide hier zuvor umfassend beschrieben wurden. Dieser Aspekt umfaßt Zellen, die Antikörper gegen diese Peptidklassen oder die im wesentlichen gereinigten einfachen Peptide bilden, im besonderen immortale Zellen, die solche Antikörper herstellen und aus der Fusion solcher Antikörper produzierender Zellen mit Myelomazellen erhalten werden und monoklonale Antikörper, die von solchen immortalen Zellen hergestellt werden.Yet another aspect of the present invention involves the production of monoclonal antibodies specific for any of the peptide classes described as comprising the SCM-active composition or the substantially purified simple peptides hereinbefore. This aspect includes cells producing antibodies to these peptide classes or the substantially purified simple peptides, particularly immortal cells producing such antibodies obtained from the fusion of such antibody producing cells with myeloma cells, and monoclonal antibodies produced by such immortal cells.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Lymphozyten, die in der Lage sind, Peptide der Aminosäuresequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Glu- Gln-Arg oder Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg zu binden. Das Verfahren umfaßt die Stufen Isolieren von potentiell auf SCM reagierenden Lymphozyten, Inkubieren des Peptids mit den isolierten Lymphozyten, um einen Lymphozyten-Peptid-Komplex herzustellen, Binden eines Antikörpers, der für das SCM-aktive Peptid spezifisch ist, das bei der Herstellung des Komplexes für diesen Komplex verwendet wurde, und Nachweisen der Antikörperbindung. Vorzugsweise kann der Antikörper ein monoklonaler Antikörper sein. Der an den Lymphozyt-Peptid- Komplex gebundene Antikörper kann auch durch die Gegenwart eines fluoreszierenden Stoffes oder eines radioaktiven Markers auf dem Antikörper nachgewiesen werden oder durch die Verwendung eines zweiten enzymgebundenen Antikörpers, der für den Antipeptid-Antikörper spezifisch ist und die Durchführung eines enzymgebundenen Immunosorbentassays.Yet another aspect of the present invention relates to a method for detecting lymphocytes capable of binding peptides of the amino acid sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Glu-Gln-Arg or Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg. The method comprises the steps of isolating lymphocytes potentially reactive to SCM, incubating the peptide with the isolated lymphocytes to produce a lymphocyte-peptide complex, binding an antibody specific for the SCM-active peptide used in preparing the complex for that complex, and detecting antibody binding. Preferably, the antibody may be a monoclonal antibody. The antibody bound to the lymphocyte-peptide complex may also be detected by the presence of a fluorescent substance or a radioactive label on the antibody or by using a second enzyme-linked antibody specific for the Antipeptide antibody specific and performing an enzyme-linked immunosorbent assay.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Peptide stellen, wenn sie mit dem SCM-Test oder mit den im folgenden beschriebenen immunochemischen Assays verwendet werden, empfindliche, reproduzierbare und relativ einfache Mittel zum Nachweis von Malignitäten in einem frühen Stadium bereit.The compositions and peptides of the invention, when used with the SCM test or with the immunochemical assays described below, provide sensitive, reproducible and relatively simple means for detecting early stage malignancies.
Diese Erfindung betrifft spezielle synthetische Peptide, die als Testsubstanz in dem SCM-Test zum Krebsnachweis hilfreich sind. Die Peptide weisen eine Länge von mindestens sieben Aminosäureresten auf und umfassen darin eine Sequenz von Phe-Trp-Gly-Val.This invention relates to specific synthetic peptides that are useful as test substances in the SCM test for cancer detection. The peptides have a length of at least seven amino acid residues and comprise a sequence of Phe-Trp-Gly-Val.
Es wird nun ein Verfahren zum Reinigen und Charakterisieren dieser Peptide beschrieben sowie Verfahren zu ihrer Verwendung in dem SCM-Test, zur Konstruktion von Gensonden für die zu den Aminosäuresequenzen der Peptide korrespondierenden DNA- Sequenzen, zur Herstellung von Antikörpern einschließlich monoklonaler Antikörper, die für diese Peptide spezifisch sind, sowie Verfahren zur Verwendung solcher Antikörper in zusätzlichen Tests zum Nachweis von Lymphozyten, die in der Lage sind, die Peptide zu binden.A method is now described for purifying and characterizing these peptides, as well as methods for using them in the SCM assay, for constructing gene probes for the DNA sequences corresponding to the amino acid sequences of the peptides, for producing antibodies, including monoclonal antibodies, specific for these peptides, and methods for using such antibodies in additional assays for detecting lymphocytes capable of binding the peptides.
Mehrere Chargen synthetisches experimentelles allergisches enzephalitiserzeugendes Peptid (EAE), das von Beckman hergestellt wurde, zeigten in dem SCM-Test eine Reaktion, die der von Krebsbasisprotein (CaBP) oder anderen krebsbegleitenden Antigenen gezeigten Reaktion ähnlich war. D.h., aus Patienten mit malignen Erkrankungen isolierte Lymphozyten reagierten auf einen Test mit EAE durch Abnahme des P-Werts in dem SCM-Test, während Lymphozyten, die von gesunden Spendern oder Spendern mit verschiedenen nichtbösartigen Krankheiten in dem Test keine Reaktion zeigten. Die einzige Ausnahme bildete, wie erwartet, Multiple Sklerose,Several batches of synthetic experimental allergic encephalitis-causing peptide (EAE) manufactured by Beckman showed a response in the SCM test that was similar to that shown by cancer basic protein (CaBP) or other cancer-associated antigens. That is, from patients Lymphocytes isolated from donors with malignant diseases responded to a test with EAE by decreasing the P-value in the SCM test, while lymphocytes isolated from healthy donors or donors with various non-malignant diseases did not respond in the test. The only exception was, as expected, multiple sclerosis,
Zu einem späteren Zeitpunkt wurden Zubereitungen von Beckman- EAE weiter durch Anionenaustauschchromatographie gereinigt. Diese reinere EAE zeigte unerwarteterweise nicht die von Patienten mit bösartigen Krankheiten erwartete Reaktion. Diese Entdeckung führte zu der Hypothese, daß die bisher beobachtete Reaktion in dem SCM-Test auf Verunreinigungen im EAE-Peptid anstatt auf das EAE-Peptid selbst zurückzuführen war. Demgemäß wurden mehrere "Verunreinigungen" aus den älteren Zubereitungen des EAE-Peptids durch Anionenaustauschchromatographie auf Diethylaminoethyl-Cellulose (DEAE-Cellulose) in Ammonium bicarbonat gereinigt bzw. isoliert.At a later date, preparations of Beckman EAE were further purified by anion exchange chromatography. This purer EAE unexpectedly did not show the response expected by patients with malignant disease. This discovery led to the hypothesis that the previously observed response in the SCM test was due to impurities in the EAE peptide rather than the EAE peptide itself. Accordingly, several "impurities" from the older preparations of EAE peptide were purified or isolated by anion exchange chromatography on diethylaminoethyl cellulose (DEAE cellulose) in ammonium bicarbonate.
Entsalztes EAE wurde lyophilisiert und dann in 10 mM wäßrigem Ammoniumbicarbonat rekonstituiert und bei nicht mehr als 4 % Säulenvolumen auf eine 0,8 cm x 26 cm-Säule aus mikrogranulärer DEAE-Cellulose (Whatman DE-52) geladen. Die Säule wurde mit 10 ml 10 mM wäßrigem Ammoniumbicarbonat gewaschen und dann bei Raumtemperatur mit einem linearen wäßrigen Ammoniumbicarbonatgradienten eluiert, wobei die Konzentration mit einer Geschwindigkeit von 0,1 % pro Minute von 10 mM auf 1 M Ammoniumbicarbonat erhöht wurde. 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt und Aliquote auf ihre Aktivität in dem SCM-Test getestet.Desalted EAE was lyophilized and then reconstituted in 10 mM aqueous ammonium bicarbonate and loaded at no more than 4% column volume onto a 0.8 cm x 26 cm column of microgranular DEAE cellulose (Whatman DE-52). The column was washed with 10 mL of 10 mM aqueous ammonium bicarbonate and then eluted at room temperature with a linear aqueous ammonium bicarbonate gradient, increasing the concentration from 10 mM to 1 M ammonium bicarbonate at a rate of 0.1% per minute. 1 mL fractions were collected and aliquots tested for activity in the SCM assay.
Bei dieser Fraktionierung wird das gereinigte EAE-Peptid bei der Fraktion 51 ausgewaschen, oder bei etwa 0,24 M Ammoniumbicarbonat. Die beiden "Verunreinigungen", die in dem SCM-Test eine Aktivität aufweisen, werden bei Fraktionen 42-44 ausgewaschen, oder bei 0,19 M bis 0,20 M Ammoniumbicarbonat bzw. bei Fraktionen 57-61 oder bei 0,27 M bis 0,29 M Ammoniumbicarbonat. Diese Peptide wurden als Peptid I für das Peptid, das bei den Fraktionen 42-44 oder bei 0,19 M bis 0, 20 M Ammoniumbicarbonat ausgewaschen wird, und als Peptid II für das Peptid, das bei den Fraktionen 57-61 oder bei 0,27 M bis 0,29 M Ammoniumbicarbonat ausgewaschen wird, bezeichnet.In this fractionation, the purified EAE peptide is washed out at fraction 51, or about 0.24 M ammonium bicarbonate. The two "impurities" that show activity in the SCM test are washed out at fractions 42-44 or at 0.19 M to 0.20 M ammonium bicarbonate, or at fractions 57-61, or at 0.27 M to 0.29 M ammonium bicarbonate, respectively. These peptides were designated as peptide I for the peptide washed at fractions 42-44 or at 0.19 M to 0.20 M ammonium bicarbonate, and as peptide II for the peptide washed at fractions 57-61 or at 0.27 M to 0.29 M ammonium bicarbonate.
Das aus dieser Fraktionierung gereinigte EAE zeigte keine SCM-Aktivität, wenn es zum Testen der Lymphozyten aus Spendern mit bösartigen Krankheiten verwendet wurde. Im Gegensatz dazu zeigten die "Verunreinigungen", die Peptide I und II, die bei einer Höhe von einem Zehntelprozent des Haupt-EAE-Peaks vorhanden sind, SCM-Aktivität, wenn sie zum Testen solcher Lymphozyten verwendet wurden. Tabelle 1 zeigt die Reaktionen in dem SCM-Test, wenn das gereinigte EAE (Fraktion 51) und die zwei "Verunreinigungen" (Peptid I bei Fraktionen 42-44 und Peptid II bei 57-61) verwendet wurden, um Lymphozyten von Spendern mit verschiedenen bösartigen Krankheiten sowie Lymphozyten von gesunden Spendern zu testen. Wiederum war die SCM-Aktivität der "Verunreinigungs"-Peptide nicht spezifisch in bezug auf die Krebsart, von der die in den Tests verwendeten Lymphozyten stammten, was diese Peptide als Testmaterial wünschenswert macht.The EAE purified from this fractionation showed no SCM activity when used to test the lymphocytes from donors with malignancies. In contrast, the "impurities," peptides I and II, present at a level of one-tenth of a percent of the main EAE peak, showed SCM activity when used to test such lymphocytes. Table 1 shows the responses in the SCM assay when the purified EAE (fraction 51) and the two "impurities" (peptide I at fractions 42-44 and peptide II at 57-61) were used to test lymphocytes from donors with various malignancies as well as lymphocytes from healthy donors. Again, the SCM activity of the "contaminant" peptides was not specific to the type of cancer from which the lymphocytes used in the assays were derived, making these peptides desirable as test material.
Es ist bekannt, daß die Aminosäuresequenz von EAE selbst Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg ist. Die Aminosäureanalyse des Peptids I, das bei 0,19 bis 0,20 M Ammoniumbicarbonat herausgelöst wird, zeigte, daß diese die gleiche war wie diejenige des gereinigten SCM-inaktiven EAE, mit der Ausnahme, daß sowohl Serin als auch Glutaminsäure fehlten. Da EAE nur ein Serin und eine Glutaminsäure aufweist, ist Peptid I ein Heptapeptid mit der Sequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg (I).It is known that the amino acid sequence of EAE itself is Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg. Amino acid analysis of peptide I elicited at 0.19 to 0.20 M ammonium bicarbonate showed that it was the same as that of purified SCM-inactive EAE, except that both serine and glutamic acid were absent. Since EAE has only one serine and one glutamic acid, peptide I is a heptapeptide with the sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg (I).
Auf ähnliche Weise zeigte die Aminosäureanalyse des Peptids II, das bei 0,27 bis 0,29 M Ammoniumbicarbonat herausgelöst wurde, daß es diesselbe Aminosäurezusammensetzung wie EAE aufweist, mit der Ausnahme, daß Serin fehlt. Daher ist das Peptid II ein Octapeptid mit der Sequenz Phe-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg (II). Dieses Elutionsmuster ist folgerichtig, da zu erwarten ist, daß das Glutamat-haltige Peptid bei neutralem pH-Wert negativer geladen ist und fester an die positiv geladene DEAE-Cellulosesäule bindet. Die Aminosäurezusammensetzung dieser Peptide wurde nach Hydrolyse der getrockneten Peptide mit 2 % Thioglycolsäure in 6 N HCl in versiegelten Glasampullen und Stickstoff bestimmt. Nachdem die Hydrolysate lyophilisiert waren, wurden die Reste mit 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) in 0,04 M Natriumboratpuffer aufgelöst. Die Aminosäuren wurden durch ihre Fluoreszenz als o-Phthaldialdehydderivate nach einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, wie in "Amino Acid Analysis by HPLC", Beckman, Altex Division, Berkeley, California 94710 beschrieben ist.Similarly, amino acid analysis of peptide II, eluted at 0.27 to 0.29 M ammonium bicarbonate, showed that it has the same amino acid composition as EAE, except that serine is absent. Therefore, peptide II is an octapeptide with the sequence Phe-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Arg (II). This elution pattern is consistent since the glutamate-containing peptide is expected to be more negatively charged at neutral pH and to bind more tightly to the positively charged DEAE-cellulose column. The amino acid composition of these peptides was determined after hydrolysis of the dried peptides with 2% thioglycolic acid in 6 N HCl in sealed glass vials and nitrogen. After the hydrolysates were lyophilized, the residues were dissolved with 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.04 M sodium borate buffer. The amino acids were determined by their fluorescence as o-phthaldialdehyde derivatives after high-performance liquid chromatography (HPLC) as described in "Amino Acid Analysis by HPLC", Beckman, Altex Division, Berkeley, California 94710.
Es wird angenommen, daß ein Peptid einer ähnlichen Struktur, dem Glutaminsäure fehlt, das aber Serin enthält, mit der Aminosäuresequenz Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg (III), das als Peptid III bezeichnet wird, in dem SCM-Test ähnlich aktiv ist. Es ist bekannt, daß ein etwas längeres Peptid, das aus Lymphozyten aus Spendern mit Krebs isoliert wurde und selbst SCM-Aktivität aufweist, Serin enthält; dieses längere Peptid weist die ungefähre Aminosäurezusammensetzung (Asx&sub2;, Glx&sub3;, Ser, His, Gly&sub5;, Thr, Arg, Ala&sub3;, Tyr, Met&sub2;, Val&sub3;, Phe&sub3;, Ile, Leu&sub3;) auf. Die Gegenwart von Serin in diesem SCM-aktiven Peptid führt zu dem Schluß, daß die Gegenwart von Serin in dem Peptid nicht notwendigerweise die SCM-Aktivität zerstört.A peptide of similar structure, lacking glutamic acid but containing serine, with the amino acid sequence Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Gly-Gln-Arg (III), designated peptide III, is believed to be similarly active in the SCM assay. A slightly longer peptide isolated from lymphocytes from donors with cancer, which itself has SCM activity, is known to contain serine; this longer peptide has the approximate amino acid composition (Asx2, Glx3, Ser, His, Gly5, Thr, Arg, Ala3, Tyr, Met2, Val3, Phe3, Ile, Leu3). The presence of serine in this SCM-active peptide leads to the conclusion that the presence of serine in the peptide does not necessarily destroy SCM activity.
Auf ähnliche Weise legt die Tatsache, daß ein etwas längeres Peptid als diese 7 oder 8 Aminosäurepeptide, die als Verunreinigungen aus EAE isoliert wurden, ebenfalls SCM-Aktivität aufweist, nahe, daß die Sequenzen I, II oder III als Teil einer längeren Sequenz eingebaut werden können, ohne die SCM- Aktivität zu eliminieren. Daher sind auch solche längere Sequenzen, die die Sequenz I, II oder III enthalten, Teil der Erfindung.Similarly, the fact that a slightly longer peptide than these 7 or 8 amino acid peptides isolated as impurities from EAE also exhibits SCM activity suggests that sequences I, II or III can be incorporated as part of a longer sequence without eliminating the SCM activity. Therefore, longer sequences containing sequence I, II or III are also part of the invention.
Es ist ebenfalls ein allgemein anerkanntes Prinzip der Proteinchemie, daß bestimmte Aminosäuresubstitutionen, "konservative" Aminosäuresubstitutionen genannt, in einem Peptid ohne einer Änderung der Konformation oder der Funktion jenes Peptids vorgenommen werden können. Solche die Aminosäuren in den Peptiden I, II oder III beeinflussenden Änderungen umfassen Val für Ala, Asp für Glu, Asn für Gln und Thr für Ser. Demgemäß wird angenommen, daß veränderte Peptidmoleküle, die die Struktur von I, II oder III aufweisen, in denen irgendeine oder alle der zuvor beschriebenen konservativen Aminosäuresubstitutionen vorgenommen wurden, SCM-Aktivität zeigen, und sind demgemäß Teil der vorliegenden Erfindung.It is also a well-recognized principle of protein chemistry that certain amino acid substitutions, called "conservative" amino acid substitutions, can be made in a peptide without changing the conformation or function of that peptide. Such changes affecting the amino acids in peptides I, II or III include Val for Ala, Asp for Glu, Asn for Gln and Thr for Ser. Accordingly, altered peptide molecules having the structure of I, II or III in which any or all of the previously described conservative amino acid substitutions have been made are believed to exhibit SCM activity and are accordingly part of the present invention.
Diese synthetischen Peptide sind in dem SCM-Test zum Nachweis von Malignitäten hilfreich, und eine Reihe von Beispielen, in denen Lymphozyten von Patienten mit verschiedenen Formen von Krebs entweder mit Peptid I oder Peptid II getestet wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.These synthetic peptides are useful in the SCM assay for the detection of malignancies, and a number of examples in which lymphocytes from patients with various forms of cancer were tested with either Peptide I or Peptide II are listed in Table 1.
Um den SCM-Test durchzuführen, wird die Lymphozytensubpopulation, die als "potentiell auf SCM reagierende Lymphozyten" beschrieben wird, aus dem peripheren Blut der Testperson abgetrennt. Diese Abtrennung kann durch die in L. Cercek & B. Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J. Cancer, 13, 903-915 (1977) und in der früheren Patentanmeldung der Cerceks mit dem Titel "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients", serial Nr. 838,264, eingereicht am 10. März 1986, beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Diese Verfahren umfassen im wesentlichen die Entfernung phagozytischer Zellen, indem die Lymphozyten mit Eisenpulver behandelt werden und die Lymphozyten dann durch eine Ficoll( )-Triosil( ) Dichtegradientenlösung zentrifugiert werden. Die als "potentiell auf SCM reagierende Lymphozyten" charakterisierten Lymphozyten weisen eine Schwebdichte von etwa 1,059 g/cm³ bis etwa 1,067 g/cm³ bei 20ºC und einer Osmolalität von etwa 0,315 bis 0,320 Osm/kg auf.To perform the SCM test, the lymphocyte subpopulation described as "potentially SCM-responsive lymphocytes" is separated from the subject's peripheral blood. This separation can be performed by the method described in L. Cercek & B. Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review," Europ. J. Cancer, 13, 903-915 (1977) and in the Cerceks' earlier patent application entitled entitled "Automated Collection of Buoyant Density Specific Cells from Density Gradients", serial No. 838,264, filed March 10, 1986. These procedures essentially involve removing phagocytic cells by treating the lymphocytes with iron powder and then centrifuging the lymphocytes through a Ficoll( )-Triosil( ) density gradient solution. The lymphocytes characterized as "potentially SCM-responsive lymphocytes" have a buoyant density of about 1.059 g/cc to about 1.067 g/cc at 20°C and an osmolality of about 0.315 to 0.320 Osm/kg.
Sind die geeigneten Lymphozyten isoliert, wird der SCM-Test gemäß den Verfahren durchgeführt, die in dem European Journal of Cancer-Artikel und in der früheren Patentanmeldung der Cerceks mit dem Titel "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions", serial Nr. 867,079, eingereicht am 27. Mai 1986, beschrieben sind. Der SCM-Test mißt die Abnahme der Fluoreszenzpolarisation, nachdem die Lymphozyten mit einer Testsubstanz inkubiert wurden, und zwar entweder mit einem krebsbegleitenden Antigen wie einem synthetischen Peptid der vorliegenden Erfindung, oder alternativ mit einem Mitogen, wie Phytohämagglutinin, Concanavalin A oder Mitogen aus Kermesgewächsen. Wie erwähnt, reagieren Lymphozyten von Krebspatienten mit einer Abnahme der gemessenen Fluoreszenzpolarisation auf krebsbegleitende Antigene einschließlich der synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung, aber nicht auf Mitogene, während Lymphozyten von Personen, die frei von bösartigen Krankheiten sind, nur auf Mitogene reagieren aber nicht auf die krebsbegleitenden Antigene.Once the appropriate lymphocytes are isolated, the SCM test is performed according to the procedures described in the European Journal of Cancer article and in the Cerceks' prior patent application entitled "Method for Measuring Polarized Fluorescence Emissions," serial number 867,079, filed May 27, 1986. The SCM test measures the decrease in fluorescence polarization after the lymphocytes are incubated with a test substance, either a cancer-associated antigen such as a synthetic peptide of the present invention, or alternatively a mitogen such as phytohemagglutinin, concanavalin A, or kermes mitogen. As mentioned, lymphocytes from cancer patients respond to cancer-associated antigens including the synthetic peptides of the present invention, but not to mitogens, with a decrease in the measured fluorescence polarization, while lymphocytes from individuals free of malignant diseases respond only to mitogens but not to the cancer-associated antigens.
Da die intrinsische Fluoreszenz der zellulären Komponenten sehr gering ist, muß ein extrinsischer bei UV-Strahlung fluoreszierender Stoff verwendet werden. Demgemäß wird die Verbindung Fluoresceindiacetat (FDA) zu den Zellen gegeben. FDA selbst ist nichtfluorogen, wird jedoch von den Lymphozyten aufgenommen und intrazellulär durch Enzymwirkung zu der fluoreszierenden Verbindung Fluorescein hydrolysiert.Since the intrinsic fluorescence of the cellular components is very low, an extrinsic substance that fluoresces under UV radiation must be used. Accordingly, the compound fluorescein diacetate (FDA) is added to the cells. FDA itself is non-fluorogenic, but is taken up by lymphocytes and hydrolyzed intracellularly by enzyme action to the fluorescent compound fluorescein.
Diese Messungen der SCM in lebenden Zellen werden mit Zellsuspensionen in einem Fluoreszenzspektrophotometer ausgeführt, das mit einem Polarisator ausgestattet ist, der so gestaltet ist, daß er vertikal polarisiertes Licht zwischen dem Erregungsmonochromator und der Zellprobe durchläßt, und das mit einem drehbaren Analysator versehen ist, der in der Lage ist, entweder vertikal oder horizontal polarisiertes Licht zwischen der Zellprobe und dem Emissionsmonochromator durchzulassen. Die vollständige Anordnung von Fluoreszenzspektrophotometer, Polarisator und Analysator wird als "Fluoreszenz-Polarisations-Meßvorrichtung" bezeichnet.These measurements of SCM in living cells are carried out on cell suspensions in a fluorescence spectrophotometer equipped with a polarizer designed to pass vertically polarized light between the excitation monochromator and the cell sample, and with a rotatable analyzer capable of passing either vertically or horizontally polarized light between the cell sample and the emission monochromator. The complete arrangement of fluorescence spectrophotometer, polarizer and analyzer is called a "fluorescence polarization measuring device".
Obwohl die Selektion der Anregungs- und Emissionswellenlängen eine Frage der Auswahl ist und die optimale Wellenlänge von dem verwendeten fluorogenen Mittel abhängt, wurden, wenn FDA als Quelle des fluorogenen Mittels verwendet wurde, beste Ergebnisse bei Verwendung einer Anregungswellenlänge von 470 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm erhalten. Bei allen im folgenden beschriebenen Beispielen wurde diese Wellenlängenkombination verwendet, wobei als Lichtquelle eine Xenonlampe verwendet wurde. Gute Ergebnisse wurden auch erreicht, wenn eine Anregungswellenlänge von 442 nm und eine Emissionswellenlänge von 527 nm verwendet wurde.Although the selection of excitation and emission wavelengths is a matter of choice and the optimal wavelength depends on the fluorogenic agent used, when FDA was used as the source of the fluorogenic agent, best results were obtained using an excitation wavelength of 470 nm and an emission wavelength of 510 nm. All of the examples described below used this wavelength combination, using a xenon lamp as the light source. Good results were also obtained when an excitation wavelength of 442 nm and an emission wavelength of 527 nm were used.
Die erhaltenen Fluoreszenzpolarisationswerte müssen für die in der Suspension beobachtete Fluorescein-Fluoreszenzpolarisation, die nicht intrazellulärer Natur ist, korrigiert werden, da nur die intrazelluläre Reaktion in dem SCM-Test korrekt gemessen wird. Wenn dieser Test durchgeführt wird, wird die Polarisation P des emittierten Lichts von einem Aliquot der mit einem krebsbegleitenden Antigen stimulierten Lymphozyten, wie einer Zusammensetzung oder einem synthetischen Peptid der vorliegenden Erfindung, oder wahlweise mit einem Mitogen, mit der Polarisation des emittierten Lichts von einem Aliquot von Kontrollymphozyten verglichen, die weder mit einem krebsbegleitenden Antigen noch mit einem Mitogen stimuliert worden sind.The fluorescence polarization values obtained must be corrected for the fluorescein fluorescence polarization observed in the suspension, which is not intracellular in nature, since only the intracellular reaction is correctly measured in the SCM test. When this test is performed, the polarization P of the emitted light is measured from an aliquot of lymphocytes stimulated with a cancer-associated antigen, such as a composition or a synthetic peptide of the present invention, or optionally with a mitogen, was compared with the polarization of the emitted light from an aliquot of control lymphocytes that had not been stimulated with either a cancer-associated antigen or a mitogen.
Um die Reaktion der Lymphozyten auf das krebsbegleitende Antigen auszudrücken und um die Auflösung des SCM-Test zu steigern, wird das SCM-Reaktionsverhältnis RRSCM berechnet. Der RRSCM-Wert ist das Verhältnis des Grades der Fluoreszenzpolarisation, die nach Stimulation mit dem krebsbegleitenden Antigen PCAA erhalten wird, zu demjenigen nach PHA-Stimulation PPHA, wobei beide zu vergleichbaren Zeiten nach 30-100 Min. Inkubation gemessen werden:To express the response of lymphocytes to the cancer-associated antigen and to increase the resolution of the SCM test, the SCM response ratio RRSCM is calculated. The RRSCM value is the ratio of the degree of fluorescence polarization obtained after stimulation with the cancer-associated antigen PCAA to that after PHA stimulation PPHA, both measured at comparable times after 30-100 min. incubation:
RRSCM = PCAA/PPHARRSCM = PCAA/PPHA
Wenn der SCM-Test mit einem erfindungsgemäßen synthetischen Peptid durchgeführt wird, ist die erhaltene Reaktion von der Art der Malignität, an der der Lymphozytenspender leidet, unabhängig. Lymphozyten von Patienten mit vielen verschiedenen Formen von Krebs zeigen eine ähnliche Reaktion, wenn solche synthetischen Peptide verwendet werden, um sie in dem SCM-Test zu testen (Tabelle 1). Lymphozyten von Spendern mit Zervix-, Mund- und Larynxkrebs zeigten alle eine positive SCM-Reaktion, die sich in einer Abnahme des gemessenen P-Werts zeigte, wenn sie mit dem Peptid I getestet wurde. Lymphozyten von Spendern mit Zervixkrebs, Larynxkrebs und Krebs des Sinus maxillaris sowie von Spendern mit Oatzellkarzinom der Lunge und retromolarem Krebs wiesen alle eine ähnliche positive Reaktion auf, wenn sie mit Peptid II getestet wurden. Im Gegensatz dazu wies gereinigtes EAE selbst keine Reaktion auf, wenn es zum Testen der Lymphozyten von Spendern mit mehreren dieser Arten von Malignitäten verwendet wurde.When the SCM test is performed with a synthetic peptide of the invention, the response obtained is independent of the type of malignancy suffered by the lymphocyte donor. Lymphocytes from patients with many different forms of cancer show a similar response when such synthetic peptides are used to test them in the SCM test (Table 1). Lymphocytes from donors with cervical, oral and laryngeal cancer all showed a positive SCM response, as evidenced by a decrease in the measured P-value, when tested with Peptide I. Lymphocytes from donors with cervical, laryngeal and maxillary sinus cancer, as well as from donors with oat cell carcinoma of the lung and retromolar cancer all showed a similar positive response when tested with Peptide II. In contrast, purified EAE itself showed no response when used to test lymphocytes from donors with several of these types of malignancies.
Da die Aminosäuresequenzen der synthetischen SCM-aktiven, krebserkennenden Peptide bekannt sind, ist es möglich, Gensonden zu konstruieren, die aus zu diesen Aminosäuresequenzen korrespondierenden DNA-Oligonucleotidsequenzen bestehen. Eine einfache Art, dies durchzuführen, besteht darin, die zu der aus vier Aminosäuren bestehenden Sequenz, die anscheinend sämtlichen SCM-aktiven, krebserkennenden Peptiden gemeinsam ist, Phe-Trp-Gly-Ala, korrespondierenden Codons zu verwenden. Die Verwendung sämtlicher möglicher Codon-Sequenzen gemäß dem genetischen Code ergibt eine Mischung aus acht 11-basigen Sonden mit folgender Struktur:Since the amino acid sequences of the synthetic SCM-active cancer-detecting peptides are known, it is possible to construct gene probes consisting of DNA oligonucleotide sequences corresponding to these amino acid sequences. A simple way to do this is to use the codons corresponding to the four amino acid sequence that appears to be common to all SCM-active cancer-detecting peptides, Phe-Trp-Gly-Ala. Using all possible codon sequences according to the genetic code yields a mixture of eight 11-base probes with the following structure:
T-T-[T/C]-T-G-G-G-G-[T/C/A/G]-G-C.T-T-[T/C]-T-G-G-G-G-[T/C/A/G]-G-C.
In dieser Struktur stehen die Basen in Klammern für gegeneinander austauschbare Basen in dieser speziellen Position. Die letzte Base des Codons für Ala kann jede der vier Basen sein, daher trägt diese Base nichts zur Spezifität bei und kann ignoriert werden. Die Notwendigkeit multipler Sondensequenzen besteht deswegen, weil der genetische Code degeneriert ist, so daß es zwei mögliche Codons für Phe gibt, die sich in der 3. Position unterscheiden, und vier für Gly. Glücklicherweise gibt es nur einen Codon für Trp, daher ist diese Aminosäure in der Sequenz erwünscht. Durch die Verwendung üblicher Oligonucleotidsynthesetechniken ist es möglich, Mischungen definierter Sequenzen von viel höherer Komplexität zu sequenzieren; Mischungen von bis zu 384 separaten Sequenzen wurden hergestellt. Die Herstellung und Verwendung gemischter Sonden dieses Typs wurden in R.B. Wallace, M.J. Johnson, T. Hirose, T. Miyake, E.H. Kawashima & K. Itakura, "The Use of Synthetic Oligonucleotides as Hybridization Probes. II. Hybridization of Oligonucleotides of Mixed Sequence to Rabbit β-Globin DNA", Nucl. Acids Res., 9, 879-894 (1981) beschrieben.In this structure, the bases in parentheses represent interchangeable bases in that particular position. The last base of the codon for Ala can be any of the four bases, so this base contributes nothing to specificity and can be ignored. The need for multiple probe sequences is because the genetic code is degenerate so that there are two possible codons for Phe that differ in the 3rd position and four for Gly. Fortunately, there is only one codon for Trp, so this amino acid is desired in the sequence. By using standard oligonucleotide synthesis techniques, it is possible to sequence mixtures of defined sequences of much higher complexity; mixtures of up to 384 separate sequences have been prepared. The preparation and use of mixed probes of this type have been described in R.B. Wallace, M.J. Johnson, T. Hirose, T. Miyake, E.H. Kawashima & K. Itakura, "The Use of Synthetic Oligonucleotides as Hybridization Probes. II. Hybridization of Oligonucleotides of Mixed Sequence to Rabbit β-Globin DNA", Nucl. Acids Res., 9, 879-894 (1981).
Obwohl diese Vorgehensweise zur Herstellung genetischer Sonden wahrscheinlich die einfachste und schnellste ist, weist sie mehrere Nachteile auf. Die Hybridisierung solcher relativ kurzer Sonden kann nichtspezifisch sein und sogar spezifische Hybridisierung findet innerhalb des Genoms mit größerer Häufigkeit statt, als zu erwarten wäre. Die Verwendung kurzer Sonden kann deshalb eine nichtakzeptable Häufigkeit falscher positiver Hybridisierungsergebnisse liefern.Although this approach to preparing genetic probes is probably the simplest and fastest, it has several disadvantages. Hybridization of such relatively short probes may be nonspecific, and even specific hybridization occurs within the genome at a higher frequency than would be expected. The use of short probes may therefore produce an unacceptable rate of false-positive hybridization results.
Ein alternatives Verfahren ist die Synthese und Verwendung von einzelnen längeren Sonden, die auf der gesamten 7- oder 8-Aminosäuresequenz des synthetischen SCM-aktiven, krebserkennenden Peptids basieren. Diese Sonden werden gemäß der erwarteten Häufigkeit der Codonnutzung in menschlichen Genen konstruiert, gemäß R. Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations", J. Mol. Biol., 183, 1 (1985). Tabelle 2 zeigt die optimalen Sondensequenzen, die gemäß Lathe für jede der Aminosäuresequenzen bestimmt wurde, von denen erwartet wurde, daß sie SCM-Aktivität aufweisen, insgesamt 20 Sequenzen. Der Vorteil dieser längeren Sonden ist größere Spezifität, so daß die Häufigkeit von Kreuzreaktionen verglichen mit kürzeren Sonden merklich herabgesetzt ist. Darüberhinaus ist eine exakte Homologie zur genauen Hybridisierung nicht nötig, wenn mit solchen Sonden gearbeitet wird; einige fehlerhafte Paarungen in einer langen Sonde sind nicht entscheidend.An alternative method is to synthesize and use single longer probes based on the entire 7 or 8 amino acid sequence of the synthetic SCM-active cancer-detecting peptide. These probes are designed according to the expected frequency of codon usage in human genes, according to R. Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations," J. Mol. Biol., 183, 1 (1985). Table 2 shows the optimal probe sequences determined according to Lathe for each of the amino acid sequences expected to have SCM activity, a total of 20 sequences. The advantage of these longer probes is greater specificity, so that the frequency of cross-reactions is significantly reduced compared to shorter probes. Furthermore, exact homology is not necessary for accurate hybridization when working with such probes; a few mismatches in a long probe are not critical.
Diese genetischen Sonden sollten sich als hilfreich zum Nachweis von Genen in Lymphozyten oder anderen Zellen erweisen, die für Sequenzen codieren, die homolog zur Sequenz der synthetischen Peptide sind, und daher möglicherweise Hinweise auf Krebs geben. Ein solcher Nachweis kann erreicht werden, indem man entweder zufällige (statistische) Genomklone, die durch ein "Shotgun"-Experiment durch Hybridisierung erhalten wurden, screent oder indem durch Standardverfahren aus mRNA hergestellte cDNA gescreent wird. Das letztere Verfahren bietet den Vorteil, daß bestimmt werden kann, wann und unter welchen Bedingungen Gene, die für Sequenzen codieren, die zu den synthetischen Peptiden homolog sind, exprimiert werden.These genetic probes should prove useful for detecting genes in lymphocytes or other cells that encode sequences homologous to the sequence of the synthetic peptides and thus potentially provide evidence of cancer. Such detection can be achieved either by screening random (statistical) genome clones obtained by a "shotgun" experiment by hybridization or by using standard methods to generate The latter method offers the advantage of being able to determine when and under what conditions genes encoding sequences homologous to the synthetic peptides are expressed.
Die Peptidmoleküle, die zuvor als SCM-Aktivität aufweisend beschrieben wurden, sind zu klein, um wirksam immunogen zu sein. Solche Moleküle können jedoch Antikörper erzeugen, wenn sie kovalent an einen Proteinträger mit hohem Molekulargewicht gebunden sind. Der Träger ist vorzugsweise ein Schlüsselloch- Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin), wie es in W.J. Gullick, J. Downward und M.D. Waterfield, "Antibodies to the Autophosphorylation Sites of the Epidermal Growth Factor Receptor as Probes of Structure and Function", EMBO J., 4, 2869-2877 (1985) und M.B. Rittenberg & A.A. Amkraut, "Immunogenicity of Trinitrophenyl-Hemocyanin: Production of Primary and Secondary Anti-Hapten Precipitins", J. Immunol, 97, 421 - 430 (1966). Der Träger kann auch ein Serumalbumin wie Rinderserumalbumin sein, wie es bei B.F. Erlanger, "The Preparation of Antigenic Hapten-Carrier Conjugates: A Survey", Methods in Enzymol., 70, 85-105 (1980) beschrieben ist. Moleküle, die kleiner als die Serumalbumine sind, die Molekulargewichte von annähernd 60 000 aufweisen, sind keine wirksamen Träger, so daß die Terminologie "Träger mit einem hohen Molekulargewicht" in diesem Zusammenhang Proteinmoleküle mit einem Molekulargewicht von mindestens 60 000 bedeutet. Das Kopplungsmittel ist vorzugsweise ein Carbodiimid, wie die wasserlöslichen Carbodiimide 1-Ethyl3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid und 1-Cyclohexyl3-[2-morpholino-(4)-ethyl]carbodiimid wie in S. Bauminger & M. Wilchek "The Use of Carbodiimides in the Preparation of Immunizing Conjugates", Methods in Enzymol., 70, 151-159 (1980) beschrieben ist. Das Kopplungsmittel kann auch Glutaraldehyd sein, wie in M. Reichlin, "Use of Glutaraldehyde as a Coupling Agent for Proteins and Peptides", Methods in Enzymol., 70, 159 - 166 (1980) und in dem EMBO J. - Artikel von Gullick, Downward & Waterfield beschrieben ist. Das kovalent gekoppelte Konjugat wird dann verwendet, um Tiere, wie Kaninchen, zu immunisieren. Sobald sie erzeugt sind, werden solche Antikörper, die spezifisch mit dem SCM-aktiven, krebser kennenden Peptid reagieren, durch Affinitätschromatographie gereinigt.The peptide molecules previously described as having SCM activity are too small to be effectively immunogenic. However, such molecules can generate antibodies when covalently linked to a high molecular weight protein carrier. The carrier is preferably a keyhole limpet hemocyanin as described in WJ Gullick, J. Downward and MD Waterfield, "Antibodies to the Autophosphorylation Sites of the Epidermal Growth Factor Receptor as Probes of Structure and Function", EMBO J., 4, 2869-2877 (1985) and MB Rittenberg & AA Amkraut, "Immunogenicity of Trinitrophenyl-Hemocyanin: Production of Primary and Secondary Anti-Hapten Precipitins", J. Immunol, 97, 421 - 430 (1966). The carrier may also be a serum albumin such as bovine serum albumin as described in BF Erlanger, "The Preparation of Antigenic Hapten-Carrier Conjugates: A Survey", Methods in Enzymol., 70, 85-105 (1980). Molecules smaller than serum albumins, which have molecular weights approaching 60,000, are not effective carriers, so the terminology "high molecular weight carrier" in this context means protein molecules having a molecular weight of at least 60,000. The coupling agent is preferably a carbodiimide, such as the water-soluble carbodiimides 1-ethyl3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide and 1-cyclohexyl3-[2-morpholino-(4)-ethyl]carbodiimide as described in S. Bauminger & M. Wilchek "The Use of Carbodiimides in the Preparation of Immunizing Conjugates", Methods in Enzymol., 70, 151-159 (1980). The coupling agent can also be glutaraldehyde, as described in M. Reichlin, "Use of Glutaraldehyde as a Coupling Agent for Proteins and Peptides", Methods in Enzymol., 70, 159 - 166 (1980) and in the EMBO J. article by Gullick, Downward & Waterfield. The covalently coupled conjugate is then used to immunize animals such as rabbits. Once generated, those antibodies which react specifically with the SCM-active cancer-recognizing peptide are purified by affinity chromatography.
Als ein Modellsystem zur Herstellung solcher Antikörper wurden Antikörper gegen das ungereinigte Beckman-EAE erzeugt, die die Peptide I und II enthalten, in dem das EAE an das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin mit einem Carbodiimid gekoppelt wurde. Dieses Kopplungsverfahren inaktivierte die SCM-Aktivitäten der Peptide I und II nicht.As a model system for generating such antibodies, antibodies against the crude Beckman EAE containing peptides I and II were generated by coupling the EAE to keyhole limpet hemocyanin with a carbodiimide. This coupling procedure did not inactivate the SCM activities of peptides I and II.
Antikörper-produzierende Zellen aus der Milz von Tieren, die gemäß dem vorherigen Verfahren immunisiert wurden, werden dann isoliert und mittels gut bekannten Verfahren mit Myelomazellen verschmolzen, wie ursprünglich bei G. Kohler & C. Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity ", Nature, 256, 495-497 (1975) beschrieben ist. Das Produkt einer solchen Fusion sind immortale Antikörper-produzierende Myelomazellen. Dieses Verfahren umfaßt die Zellfusion der Antikörper-produzierenden Milzzellen mit HGPRT-Myelomazellen unter Verwendung von Polyethylenglycol und anschließender Selektion der dadurch hergestellten verschmolzenen Zellen in Gegenwart von Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin, worauf die Hybridomazellen auf den betreffenden Antikörper gescreent werden. Die so hergestellten Hybridomazellen sekretieren ihre Antikörper in das Kulturmedium, wobei eine Quelle für monoklonale Antikörper bereitgestellt wird, die spezifisch gegen eine antigene Determinante oder ein antigenes Epitop sind.Antibody-producing cells from the spleens of animals immunized according to the previous procedure are then isolated and fused with myeloma cells using well-known methods as originally described in G. Kohler & C. Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature, 256, 495-497 (1975). The product of such a fusion is immortal antibody-producing myeloma cells. This procedure involves cell fusion of the antibody-producing spleen cells with HGPRT myeloma cells using polyethylene glycol and subsequent selection of the fused cells thus produced in the presence of hypoxanthine, thymidine and aminopterin, after which the hybridoma cells are screened for the antibody of interest. The hybridoma cells thus prepared secrete their antibodies into the culture medium, providing a source of monoclonal antibodies specific to an antigenic determinant or epitope.
Sobald sie isoliert sind, können solche Antikörper in einer Reihe von Immunoassays verwendet werden, die ein alternatives Verfahren zum Screenen von Malignitäten bereitstellen. Die Antikörper können beispielsweise in einem immunochemischen Assay zum Screenen von Lymphozyten verwendet werden, indem die potentiell auf SCM reagierende Subpopulation der Lymphozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wird, die Lymphozyten mit dem SCM-aktiven, krebserkennenden Peptid inkubiert werden, um einen Lymphozyt-Peptid-Komplex zu bilden, und anschließendes Umsetzen des Komplexes mit einem für das Peptid spezifischen Antikörper. Solche Antikörper können dann entweder dadurch nachgewiesen werden, daß sie einen fluoreszierenden oder radioaktiven Marker aufweisen, der direkt an die Antikörper gekoppelt ist, oder indem ein zweiter Antikörper verwendet wird, der für den ersten Antikörper spezifisch ist und kovalent an ein Enzym gebunden ist und die enzymatische Aktivität in dem häufig verwendeten enzymgebundenen Immunosorbenttest (ELISA) getestet wird.Once isolated, such antibodies can be used in a variety of immunoassays that provide an alternative method for screening for malignancies. For example, the antibodies can be used in an immunochemical assay to screen lymphocytes by purifying the potentially SCM-responsive subpopulation of lymphocytes using density gradient centrifugation, incubating the lymphocytes with the SCM-active cancer-recognizing peptide to form a lymphocyte-peptide complex, and then reacting the complex with an antibody specific for the peptide. Such antibodies can then be detected either by having a fluorescent or radioactive label directly coupled to the antibodies or by using a second antibody specific for the first antibody covalently linked to an enzyme and testing the enzymatic activity in the commonly used enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Solche immunochemischen Assays können eine empfindliche Technik zum Auffinden von Lymphozyten bereitstellen, die SCM-aktive Peptide binden und mit diesen reagieren können. Da normale Lymphozyten nicht auf die SCM-aktiven Peptide reagieren, obwohl Reaktionen auf die Peptide innerhalb einer Stunde nach der Implantation von 3,5 x 10&sup5; Ehrlich Ascitenzellen in Mäusen (äquivalent, bezogen auf das Körpergewicht, zu weniger als 10&sup9; Tumorzellen im Menschen) ausgelöst werden können, kann dieser Test hilfreich sein beim Auffinden der ersten Anzeichen von Malignitäten, und kann ein positives Ergebnis anzeigen, lange bevor offenkundige klinische oder histologische Anzeichen von Krebs nachweisbar sind.Such immunochemical assays can provide a sensitive technique for detecting lymphocytes that can bind and react with SCM-active peptides. Since normal lymphocytes do not respond to the SCM-active peptides, although responses to the peptides can be elicited within one hour of implantation of 3.5 x 105 Ehrlich ascites cells in mice (equivalent, based on body weight, to less than 109 tumor cells in humans), this test can be helpful in detecting the first signs of malignancies and can indicate a positive result long before overt clinical or histological signs of cancer are detectable.
Obwohl die vorliegende Erfindung in beträchtlicher Genauigkeit im Hinblick auf bestimmte bevorzugte Versionen davon beschrieben wurde, sind andere Versionen möglich. Daher sind Sinn und Umfang der anliegenden Ansprüche nicht auf die Beschreibung der bevorzugten, hierin enthaltenen Versionen beschränkt. Tabelle I SCM-Reaktionen (als % der Kontrolle) auf Fraktionen von Beckmann-EAE SCM-aktive Zusammensetzung: Diagnose des Blutspenders Beckman-EAE Gereinigtes EAE Peptid Ca-Mund Ca-Sinus maxillaris Ca-larynx Ca-cervix uteri Lungen-Oatzellen-Karzinom Ca-retromolar Gesunde Spender (2) Ca = KrebsAlthough the present invention has been described in considerable detail with respect to certain preferred versions thereof, other versions are possible. Therefore, sense and scope of the appended claims is not limited to the description of the preferred versions contained herein. Table I SCM responses (as % of control) to fractions of Beckman-EAE SCM active composition: Blood donor diagnosis Beckman-EAE Purified EAE peptide Ca-mouth Ca-maxillary sinus Ca-larynx Ca-cervix uteri Lung Oat cell carcinoma Ca-retromolar Healthy donors (2) Ca = cancer
"Beckman EAE" ist das ursprünglich von Beckman Instruments vertriebene EAE und wurde in dem SCM-Assay ohne weitere Reinigung verwendet."Beckman EAE" is the EAE originally distributed by Beckman Instruments and was used in the SCM assay without further purification.
"Gereinigtes EAE" ist das EAE, das von Verunreinigungen gereinigt wurde und bei Fraktion 51 von der DEAE-Cellulosesäule herausgelöst wurde."Purified EAE" is the EAE that has been purified of impurities and separated from the DEAE-cellulose column at fraction 51.
"Peptid I" ist eines der Peptide, die aus Beckman-EAE gereinigt und bei Fraktionen 42-44 herausgelöst wurde."Peptide I" is one of the peptides purified from Beckman EAE and isolated at fractions 42-44.
"Peptid II" ist das andere aus Beckman-EAE gereinigte Peptid, und wurde bei Fraktion 57 herausgelöst."Peptide II" is the other peptide purified from Beckman EAE, and was isolated at fraction 57.
Peptid I und Varianten, die durch konservative Aminosäuresubstitutionen hergestellt wurden: Peptide I and variants produced by conservative amino acid substitutions:
Peptid II, und durch konservative Aminosäuresubstitutionen hergestellte Varianten: Peptide II, and variants produced by conservative amino acid substitutions:
Peptid III, und durch konservative Aminosäuresubstitutionen hergestellte Varianten: Peptide III, and variants produced by conservative amino acid substitutions:
Durch Substitution ausgewechselte Aminosäuren in den Peptiden I, II oder III sind unterstrichen.Amino acids replaced by substitution in peptides I, II or III are underlined.
Die Codonbestimmungen sind R. Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations", J. Mol. Biol., 183, 1-12 (1985), entnommen und sind so gestaltet bzw. designed, daß sie für die normale Codonnutzung in Human-DNA optimal sind, die durch Untersuchungen einer großen Anzahl humancodierender Sequenzen bestimmt wurden.The codon determinations are taken from R. Lathe, "Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations", J. Mol. Biol., 183, 1-12 (1985), and are designed to be optimal for the normal codon usage in human DNA, which was determined by examining a large number of human coding sequences.
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