DE60224287T2 - LYTIC REAGENT COMPOSITION FOR DETERMINING CELL CORE-CONTAINING RED BLOOD BODIES - Google Patents

LYTIC REAGENT COMPOSITION FOR DETERMINING CELL CORE-CONTAINING RED BLOOD BODIES Download PDF

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Description

Technisches GebietTechnical area

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lytische Reagenszusammensetzung zur Bestimmung zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe. Genauer gesagt, ermöglicht die lytische Reagenszusammensetzung die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten in einer Blutprobe durch eine Gleichstromimpedanzmessung. Überdies kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner zum Messen der Gesamt-Hämoglobinkonzentration der Blutprobe verwendet werden.The The present invention relates to a lytic reagent composition for determining nucleated blood cells in a blood sample. More precisely, possible the lytic reagent composition differentiation nucleated red blood cells from other cell types in a blood sample by a DC Impedance measurement. moreover For example, the lytic reagent composition can also be used to measure total hemoglobin concentration the blood sample can be used.

HintergrundtechnikBackground Art

Normales peripheres Blut enthält reife rote Blutkörperchen, die keinen Zellkern aufweisen. Zellkernhaltige rote Blutkörperchen (NRBCs), oder Erythroblasten, sind unreife rote Blutkörperchen. Sie kommen normalerweise im Knochenmark, aber nicht im peripheren Blut vor. Bei bestimmten Krankheiten wie Anämie und Leukämie kommen NRBCs jedoch auch im peripheren Blut vor. Klinisch gesehen ist es daher wichtig, NRBCs zu messen. Traditionell wird die Differenzierung und Zählung von NRBCs manuell durchgeführt. Das Verfahren umfaßt das Ausstreichen einer Blutprobe auf einen Objektträger und das Färben des Trägers, gefolgt von der manuellen visuellen Analyse des einzelnen Trägers. Die NRBC-Konzentration wird als Anzahl an NRBCs pro 100 weiße Blutkörperchen angegeben. Für gewöhnlich werden 200 weiße Blutkörperchen und die Anzahl an NRBCs, die in derselben Region auf einem Blutabstrich vorhanden sind, gezählt und die Anzahl durch 2 geteilt, um die NRBC-Konzentration als die Anzahl an NRBCs/100 WBK auszudrücken. Dieser Ansatz ist extrem zeitaufwendig und auch in bezug die Interpretation desjenigen, der den Träger analysiert, subjektiv. normal contains peripheral blood mature red blood cells, which have no cell nucleus. Nuclear red blood cells (NRBCs), or erythroblasts, are immature red blood cells. They usually come in the bone marrow, but not in the peripheral Blood before. In certain diseases such as anemia and leukemia come NRBCs, however, are also present in peripheral blood. Clinically it is therefore important to measure NRBCs. Traditionally, the differentiation and counting done manually by NRBCs. The method comprises spreading a blood sample on a slide and the dyeing of the wearer, followed by the manual visual analysis of the individual wearer. The NRBC concentration is expressed as number of NRBCs per 100 white blood cells specified. For usually will be 200 white blood corpuscle and the number of NRBCs in the same region on a blood smear are present, counted and the number divided by 2 to the NRBC concentration than the Number of NRBCs / 100 WBK. This approach is extremely time consuming and also in terms of interpretation of the one who is the carrier analyzed, subjectively.

In den letzten Jahren sind mehrere Fluoreszenz-Durchflußzytometrie-Verfahren zur Differenzierung von NRBCs entwickelt worden. Diese Verfahren nutzen eine spezielle Kernfärbungstechnik zur Unterscheidung von NRBCs von anderen Zellarten, da es schwierig ist, NRBCs, basierend auf ihren elektronischen oder optischen Eigenschaften, zu differenzieren.In In recent years, several fluorescence flow cytometry methods have been used have been developed for the differentiation of NRBCs. This procedure use a special nuclear staining technique to distinguish NRBCs from other cell types, as it is difficult is NRBCs, based on their electronic or optical properties, to differentiate.

US-Patent Nr. 5,298,426 (Inami et al.) offenbart ein Fluoreszenzverfahren zur Differenzierung von NRBCs. Das Verfahren nutzt eine Zweischrittfärbung unter Verwendung eines ersten Fluids, das eine saure hypotonische fluoreszierende Farbstofflösung ist, und eines zweiten Fluids, das die Osmolalität und den pH des ersten Fluids verändert. Inami et al. lehren, daß das erste Fluid einen Erythroblast-färbenden Farbstoff enthält, der in zellkernhaltige rote Blutkörperchen diffundiert und speziell deren Kern färbt, und dann das Trennen einer Gruppe von NRBCs von anderen Zellgruppen auf einem zweidimensionalen Plot, wodurch die Ergebnisse der NRBC-Differenzierung berechnet werden. U.S. Patent No. 5,298,426 (Inami et al.) Discloses a fluorescent method for differentiating NRBCs. The method utilizes a two-step dyeing using a first fluid that is an acid hypotonic fluorescent dye solution and a second fluid that alters the osmolality and pH of the first fluid. Inami et al. teach that the first fluid contains an erythroblast staining dye that diffuses into coronary red cells and specifically stains their nucleus, and then separates a group of NRBCs from other cell groups on a two-dimensional plot, thereby calculating the results of NRBC differentiation ,

Die US-Patente Nr. 5,516,695 und 5,648,225 (Kim et al.) offenbaren ein Mehrzweck-Lysereagenssystem und ein Verfahren der Verwendung zur Unterteilung zellkernhaltiger Blutkörperchen. Das Lysereagens umfaßt ein nicht-quartäres Ammoniumsalz, einen aliphatischen Aldehyd, einen Nicht-Phosphatpuffer, der gegenüber dem aliphatischen Aldehyd inert ist, und einen Kernfarbstoff. Das Verfahren umfaßt die Schritte der Lyse einer Blutprobe mit dem Lysereagens, das Inkubieren des Probegemisches bei einer erhöhten Temperatur und das Bestimmen der zellkernhaltigen Blutkörperchen, einschließlich NRBCs, mit einem automatischen elektrooptischen Hämatologieinstrument.The U.S. Patent Nos. 5,516,695 and 5,648,225 (Kim et al.) Disclose a multipurpose lysis reagent system and method of use for subdividing nucleated blood cells. The lysing reagent comprises a non-quaternary ammonium salt, an aliphatic aldehyde, a non-phosphate buffer which is inert to the aliphatic aldehyde, and a nuclear dye. The method comprises the steps of lysing a blood sample with the lysis reagent, incubating the sample mixture at an elevated temperature, and determining the coronary corpuscles, including NRBCs, with an automatic electro-optic hematology instrument.

US-Patent Nr. 5,559,037 (Kim et al.) offenbart ein Verfahren für die durchflußzytometrische Analyse von NRBCs und Leukozyten. Das Verfahren umfaßt die Lyse von roten Blutkörperchen und NRBC-Zytoplasma aus einer Vollblutprobe, um den NRBC-Kern einem vitalen Kernfarbstoff auszusetzen und das Eindringen des vitalen Kernfarbstoffes in die Leukozyten zu minimieren, und die Analyse der Probe durch Messen der Fluoreszenz und zweier Lichtstreuungswinkel. Da Leukozyten auch zell kernhaltige Zellen sind, muß eine Färbung dieser Zellen verhindert werden, um eine Interferenz mit der Fluoreszenzmessung zu vermeiden. Die Konservierung der Leukozytenmembran und die Minimierung des Eindringens des Kernfarbstoffes in die Leukozyten werden durch gleichzeitige Fixierung der Leukozyten mit einem aliphatischen Aldehyd während der Lyse der roten Blutkörperchen erreicht. Aldehydfixative sind als gefährliche Chemikalien bekannt. Überdies erfordert dieses Verfahren das Erwärmen des Reagens auf 42°C, um die NRBC- und Leukozyten-Differenzierung zu erreichen. U.S. Patent No. 5,559,037 (Kim et al.) Discloses a method for flow cytometric analysis of NRBCs and leukocytes. The method involves lysing red blood cells and NRBC cytoplasm from a whole blood sample to expose the NRBC core to a vital nuclear dye and to minimize penetration of the nuclear vital dye into the leukocytes, and analysis of the sample by measuring fluorescence and two light scattering angles. Since leukocytes are also cell-nucleated cells, staining of these cells must be prevented to avoid interference with fluorescence measurement. Preservation of the leukocyte membrane and minimization of nuclear dye penetration into the leukocytes are achieved by simultaneous fixation of leukocytes with an aliphatic aldehyde during lysis of the red blood cells. Aldehyde fixatives are known as dangerous chemicals. Moreover, this procedure requires heating the reagent to 42 ° C to achieve NRBC and leukocyte differentiation.

EP 1 004 880 A2 offenbart Reagenzien und ein Verfahren zur Unterscheidung und Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Die Reagenzien umfassen ein hämolytisches Mittel zum Auflösen roter Blutkörperchen und konditionieren weißer Blutkörperchen und NRBCs in einer Probe, damit diese gefärbt werden kann; und mindestens einen fluoreszierenden Farbstoff, der so gewählt ist, daß er weiße Blutkörperchen und NRBCs differenziert färbt. Das Verfahren umfaßt die Schritte der Lyse roter Blutkörperchen, das Färben von weißen Blutkörperchen und NRBCs, das Analysieren der Probe durch Messen mindestens eines Streulichtparameters und mindestens eines Fluoreszenzparameters. EP 1 004 880 A2 discloses reagents and a method for distinguishing and enumerating nucleated red blood cells. The reagents comprise a hemolytic red blood cell dissolving agent and condition white blood cells and NRBCs in a sample to stain them can; and at least one fluorescent dye selected to stain white blood cells and NRBCs differently. The method comprises the steps of lysing red blood cells, staining white cells and NRBCs, analyzing the sample by measuring at least one scattered light parameter and at least one fluorescence parameter.

US-Patent Nr. 5,874,310 (Li et al.) offenbart Reagenzien und ein Verfahren zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Das Verfahren umfaßt das Aussetzen einer Blutprobe einem Lysereagenssystem zur Lyse reifer Blutkörperchen und Analyse der Probe in einer Durchflußzelle durch zwei Kleinwinkel-Lichtstreuungsmessungen zur Differenzierung von NRBCs von anderen Zellarten. Das Verfahren umfaßt ferner die gleichzeitige Differenzierung weißer Blutkörperchen unter Verwendung elektronischer und optischer Analyse, wobei die elektronische Analyse eine DC-Impedanzmessung ist. U.S. Patent No. 5,874,310 (Li et al.) Discloses reagents and a method for differentiating nucleated red blood cells. The method comprises exposing a blood sample to a lysing reagent system for lysing mature blood cells and analyzing the sample in a flow cell by two small angle light scattering measurements to differentiate NRBCs from other cell types. The method further includes the simultaneous differentiation of white blood cells using electronic and optical analysis, wherein the electronic analysis is a DC impedance measurement.

US-Patent Nr. 5,917,584 (Li et al.) offenbart ein Verfahren zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Das Verfahren umfaßt die Lyse reifer roter Blutkörperchen in einer Blutprobe; die Analyse der Probe in einer Durchflußzelle durch zwei Winkel einer Lichtstreuungsmessung zur Differenzierung von NRBCs von ande ren Zellarten, wobei das zweite Lichtstreuungssignal ein Mittelwinkel- oder ein Rechtwinkel-Lichtstreuungssignal ist. U.S. Patent No. 5,917,584 (Li et al.) Discloses a method for differentiating nucleated red blood cells. The method comprises lysing mature red blood cells in a blood sample; analyzing the sample in a flow cell through two angles of light scattering measurement to differentiate NRBCs from other cell types, the second light scattering signal being a center angle or a right angle light scattering signal.

Die oben beschriebenen Verfahren ermöglichen die Differenzierung und Zählung von NRBCs und Leukozyten durch Fluoreszenz-Durchflußzytometrie und Lichtstreuungsmessungen. Fluoreszenz- und Lichtstreuungsmessungen sind jedoch komplexe und teure Detektionsverfahren.The allow the method described above the differentiation and counting of NRBCs and leukocytes by fluorescence flow cytometry and light scattering measurements. Fluorescence and light scattering measurements however, are complex and expensive detection methods.

Viele der derzeitigen automatisierten Nicht-Fluoreszenz-Hämatologie-Analysegeräte wie Abbott Cell-Dyn® 3500, COULTER® Gen•STM, Bayer Advia*120® und SysmexTM NE-9000 können nur eine NRBC-Markierung für die mögliche Gegenwart von NRBCs in einer analysierten Blutprobe liefern, wenn die Instrumente eine erhöhte Menge an Signalen nahe einem Debrisbereich roter Blutkörperchen eines erhaltenen Zellverteilungshistogramms erkennen. Solche Verfahren neigen jedoch dazu, falsche positive Markierungen zu erzeugen, da viele andere Blutanomalien verstärkte Signale in demselben Bereich verursachen können, wie Plättchenklumpen und Sichelzellen sowie Trümmer roter Zellen aus unzureichend lysierten Blutproben. In diesen Verfahren werden NRBCs nicht eindeutig identifiziert. Statt dessen wird von dem Instrument nur ein übliches NRBC-Probenverteilungsmuster in einem Histogramm oder einem Punktdiagramm erkannt, das mit einem ähnlichen Muster, erzeugt durch die oben genannten anderen Umstände, verwechselt werden kann. Die markierten Proben, einschließlich der falschen positiven Markierungen, müssen in Kliniklaboren mit einem manuellen Verfahren erneut überprüft werden.Many of the current automated non-fluorescent hematology analyzers, such as Abbott Cell-Dyn ® 3500, COULTER ® Gen • S TM, Bayer Advia * 120 ® and Sysmex TM NE-9000 only NRBC marker for the possible presence of NRBCs can in of an analyzed blood sample when the instruments detect an increased amount of signals near a red blood cell debris area of a obtained cell distribution histogram. However, such methods tend to produce false positives because many other blood anomalies can cause amplified signals in the same area, such as platelet lumps and sickle cells, and red cell debris from insufficiently lysed blood samples. In these procedures, NRBCs are not uniquely identified. Instead, the instrument recognizes only a common NRBC sample distribution pattern in a histogram or dot diagram that may be confused with a similar pattern created by the other circumstances noted above. The labeled samples, including the false positives, must be retested in clinical laboratories using a manual procedure.

Ferner ist ein allgemein bekanntes Problem mit NRBC-enthaltenden Proben die fehlerhafte Zählung weißer Blutkörperchen (WBK), aufgezeichnet mit einem Hämatologieanalysegerät, bei diesen Proben. Da die Zellkernvolumen der NRBCs nahe denen der weißen Blutkörperchen liegen, werden die NRBCs auf Hämatologieanalysegeräten, die die Größe der Blutkörperchen messen, üblicherweise als weiße Blutkörperchen gezählt, wodurch die WBK erhöht werden. Daher mußt die NRBC-Beteiligung an den WBK, aufgezeichnet mit einem Hämatologieanalysegerät für Proben, die NRBC enthalten, korrigiert werden. Derzeit werden in der Praxis in Kliniklaboren die NRBC-Zahlen, die durch manuelles Zählen erhalten wurden, von den WBK, aufge zeichnet von dem Hämatologieanalysegerät, subtrahiert. Das ist zeitaufwendig und fehleranfällig.Further is a well-known problem with NRBC-containing samples the erroneous count of white blood cells (WBK) recorded with a hematology analyzer in these Rehearse. Because the nuclear volumes of NRBCs are close to those of white blood cells NRBCs are used on hematology analyzers the size of the blood cells measure, usually as white blood corpuscle counted which increases the WBK become. Therefore must the NRBC involvement in the WBK recorded with a hematology analyzer for samples, The NRBC included, to be corrected. Currently in practice in clinic labs the NRBC numbers obtained by manual counting were subtracted from the WBK recorded by the hematology analyzer. This is time consuming and error prone.

In einem anderen Aspekt sind verschiedene lytische Reagenszusammensetzungen für die Analyse weißer Blutkörperchen in der Technik bekannt. US-Patent Nr. 5,618,733 (Tsuji et al.) offenbart ein Reagens zur Analyse von Leukozyten, das ein ionisches oberflächenaktives Mittel; mindestens eine organische Verbindung mit einer hydrophoben Gruppe und einer Säuregruppe mit einer negativen Ladung in einer wäßrigen Lösung zur Konservierung der Leukozytenmorphologie durch das Vereinigen mit einer kationischen Komponente in Leukozyten; ein nicht-ionisches oberflächenaktiv Mittel und einen Puffer umfaßt.In another aspect, various lytic white blood cell reagent compositions are known in the art. U.S. Patent No. 5,618,733 (Tsuji et al.) Discloses a reagent for the analysis of leukocytes, which is an ionic surfactant; at least one organic compound having a hydrophobic group and an acid group having a negative charge in an aqueous solution for preserving the leukocyte morphology by combining with a cationic component in leukocytes; a nonionic surfactant and a buffer.

US-Patent Nr. 4,528,274 (Carter et al.) offenbart ein Lysereagens zur Bestimmung von mindestens zwei Leukozytenpopulationen in Blut. Das Lysereagens umfaßt eine wäßrige Lösung aus mindestens zwei quartären Ammoniumsalzen und einem nicht-kationischen oberflächenaktiven Additiv, das nicht-ionisches polyoxyethyliertes Alkylphenol umfaßt. Der Stand der Technik lehrt, daß die quartären Ammoniumsalze und das Additiv in ausreichenden Mengen vorliegen, um die Populationen an weißen Blutkörperchen bezogen aufeinander innerhalb der Meßzeit des Blutanalysegerätes zu positionieren. U.S. Patent No. 4,528,274 (Carter et al.) Discloses a lysing reagent for the determination of at least two leukocyte populations in blood. The lysing reagent comprises an aqueous solution of at least two quaternary ammonium salts and a non-cationic surfactant additive comprising nonionic polyoxyethylated alkylphenol. The prior art teaches that the quaternary ammonium salts and the additive are present in sufficient quantities to position the populations of white blood cells with respect to each other within the time of measurement of the blood analyzer.

Die Lysereagenzien ermöglichen die Differenzierung von Subpopulationen weißer Blutkörperchen durch die Konservierung der Morphologie der weißen Blutkörperchen oder durch die Kontrolle der Größe der Subpopulationen. Diese Reagenzien differenzieren jedoch zellkernhaltige rote Blutkörperchen von anderen Zellarten nicht.The lysing reagents allow for the differentiation of subpopulations of white blood cells by preserving the white blood cell morphology or by controlling the size of the white blood cells Subpopulations. However, these reagents do not differentiate cell nucleated red cells from other cell types.

Ferner ist die Messung der Hämoglobinkonzentration (Hgb-Konzentration) von Blutproben ein wesentlicher Bestandteil der Blutanalyse, der für die Krankheitsdiagnose und zum Überwachen der Reaktionen auf eine medizinische Behandlung wichtig ist. Man sollte in der Lage sein, mehrere diagnostische Analysen wie die Zählung zellkernhaltiger Blutkörperchen und das Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe unter Verwendung desselben Reagens und gleichzeitige Detektionen zu bewerkstelligen.Further is the measurement of hemoglobin concentration (Hgb concentration) of blood samples an integral part the blood analysis for the disease diagnosis and monitoring The response to medical treatment is important. you should be able to do several diagnostic analyzes like that count nucleated blood cells and measuring hemoglobin concentration a blood sample using the same reagent and simultaneous Detections accomplish.

Von den vielen allgemein bekannten Verfahren zur Hämoglobinbestimmung ist die Cyanmethämoglobin-Methode von dem International Committee for Standardization in Hematology als ein Standard empfohlen worden. Die Gegenwart von Cyanid im Reagensabfall hat jedoch zu ernsten Umweltproblemen geführt. In den letzten zehn Jahren sind enorme Bemühungen in die Entwicklung automatisierter Hämoglobinanalyseverfahren ohne die Nutzung von Cyanid gesteckt worden.From The many well-known methods for hemoglobin determination is the Cyanmethemoglobin method by the International Committee for Standardization in Hematology has been recommended as a standard. The presence of cyanide in the reagent waste has, however, led to serious environmental problems. In the last ten years are enormous efforts in the development of automated hemoglobin analysis methods without the use of cyanide has been put.

US-Patent Nr. 5,242,832 (Sakata) offenbart ein Cyanid-freies Lysereagens zum Zählen weißer Blutkörperchen und Messen der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe. Das Lysereagens umfaßt mindestens ein erstes oberflächenaktives Mittel, das ein quartäres Ammoniumsalz ist, mindestens ein zweites oberflächenaktives Mittel, das kationische und amphotere oberflächenaktive Mittel umfaßt, und mindestens einen Hämoglobinstabilisator, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Tiron, 8-Hydroxychinolin, Bipyridin, 1-10-Phenanthrolin, phenolische Verbindungen, Eisphenol, Pyrazol und Derivate, 2-Phenyl-5-pyrazolon und Derivate, Phenyl-3-pyrazolon und Imidazol und seine Derivate. U.S. Patent No. 5,242,832 (Sakata) discloses a cyanide-free lysing reagent for counting white blood cells and measuring hemoglobin concentration in a blood sample. The lysing reagent comprises at least a first surfactant which is a quaternary ammonium salt, at least one second surfactant which comprises cationic and amphoteric surfactants, and at least one hemoglobin stabilizer selected from the group comprising tiron, 8-hydroxyquinoline, bipyridine, 1- 10-phenanthroline, phenolic compounds, bisphenol, pyrazole and derivatives, 2-phenyl-5-pyrazolone and derivatives, phenyl-3-pyrazolone and imidazole and its derivatives.

PCT/US95/02897 (Kim) offenbart ein Cyanid-freies Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Hämoglobin in einer Vollblutprobe. Das Reagens umfaßt einen Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Imidazol und Derivaten, N-Hydroxyacetamid, H-Hydroxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin, und ein oberflächenaktives Mittel mit einer starken erythrolytischen Fähigkeit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lauryldimethylaminoxid und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Das Analyseverfahren ist schnell, weniger als 10 Sekunden. Das Reagens funktioniert jedoch nur unter extrem alkalischen Bedingungen, pH 11 bis 14. Überdies wird von Kim weder die Fähigkeit zum Zählen von Leukozyten noch zur Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten gelehrt. PCT / US95 / 02897 (Kim) discloses a cyanide-free method and reagent for the determination of hemoglobin in a whole blood sample. The reagent comprises a ligand selected from the group consisting of imidazole and derivatives, N-hydroxyacetamide, H-hydroxylamine, pyridine, oxazole, thiazole, pyrazole, pyrimidine, purine, quinoline and isoquinoline, and a surfactant having a strong erythrolytic ability selected from the group consisting of lauryldimethylamine oxide and octylphenoxypolyethoxyethanol. The analysis procedure is fast, less than 10 seconds. However, the reagent only works under extremely alkaline conditions, pH 11 to 14. Moreover, Kim does not teach the ability to count leukocytes nor to differentiate cell nucleated red blood cells from other cell types.

US-Patent Nr. 5,763,280 (Li et al.) offenbart Cyanid-freie Reagenzien zum Messen von Hämoglobin in einer Blutprobe, zum Zählen von Leukozyten und zur Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen. Das Reagens umfaßt ein hämolytisches oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus quartären Ammoniumsalzen, Pyridiniumsalzen, organischen Phosphatestern und organischen Sulfonaten zur Lyse von Erythrozyten und Freisetzung von Hämoglobin, und einen organischen Liganden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Triazol und seinen Derivaten, Tetrazol und seinen Derivaten, Alkalimetallsalzen von Oxonsäure, Melamin, Anilin-2-sulfonsäure, Chinaldinsäure, 2-Amino-1,3,4-thiadiazol, Triazin und seinen Derivaten, Urazol, DL-Pipecolinsäure, Isonicotinamid, Anthranilonitril, 6-Aza-2-thiothymin, Adenin, 3-(2-Thienyl)acrylsäure, Benzoesäure und Alkalimetall- und Ammoniumsalzen von Benzoesäure und Pyrazin und seinen Derivaten, um so ein stabiles Chromogen mit Hämoglobin zu bilden. U.S. Patent No. 5,763,280 (Li et al.) Discloses cyanide-free reagents for measuring hemoglobin in a blood sample, for counting leukocytes, and for differentiating leukocyte subpopulations. The reagent comprises a hemolytic surfactant selected from the group consisting of quaternary ammonium salts, pyridinium salts, organic phosphate esters and organic sulfonates for lysing erythrocytes and releasing hemoglobin, and an organic ligand selected from the group consisting of triazole and its derivatives , Tetrazole and its derivatives, alkali metal salts of oxonic acid, melamine, aniline-2-sulfonic acid, quinaldic acid, 2-amino-1,3,4-thiadiazole, triazine and its derivatives, uracol, DL-pipecolic acid, isonicotinamide, anthranilonitrile, 6-aza 2-thiothymine, adenine, 3- (2-thienyl) acrylic acid, benzoic acid and alkali metal and ammonium salts of benzoic acid and pyrazine and its derivatives to form a stable chromogen with hemoglobin.

Auch US-Patent Nr. 5,882,934 (Li et al.) offenbart Cyanid-freie Reagenzien zur Messung von Hämoglobin in einer Blutprobe, zum Zählen von Leukozyten und zur Differenzierung von Leukozyt-Subpopulationen. Die Reagenzien umfassen ferner neben hämolytischen oberflächenaktiven Mitteln und organischen Liganden zum Einstellen der Leitfähigkeit der Reagenzien für die Impedanzmessung Salze. Keines der oben beschriebenen Cyanid-freien Reagenzien und Hämoglobinmeßverfahren ermöglicht jedoch die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten und die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen in einer Blutprobe.Also U.S. Patent No. 5,882,934 (Li et al.) Discloses cyanide-free reagents for measuring hemoglobin in a blood sample, for counting leukocytes and for differentiating leukocyte subpopulations. The reagents further include salts in addition to hemolytic surfactants and organic ligands for adjusting the conductivity of the impedance measurement reagents. However, none of the cyanide-free reagents and hemoglobin measurement methods described above allow differentiation of nuclear-containing red blood cells from other cell types and the enumeration of nucleated red blood cells in a blood sample.

Basierend auf dem Vorstehenden besteht nach wie vor der Bedarf nach einem Reagens, das ein einfaches und kostengünstigeres Analyseverfahren zur Differenzierung und Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen ermöglicht. Ferner ist ein multifunktionales Reagens wünschenswert, das die Zählung zellkernhaltiger Blutkörperchen, Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten und Messung der Hämoglobinkonzentration in Abwesenheit von Cyanid ermöglicht.Based In the above, there is still a need for one Reagent, which is a simple and cheaper analytical method for differentiation and counting nucleated red blood cells allows. Further, a multifunctional reagent is desirable which increases the count of nucleated blood cells Differentiation of nucleated red blood cells from other cell types and measurement of hemoglobin concentration in the absence of cyanide.

EP0444241-A offenbart eine lytische Reagenszusammensetzung zur Lyse roter Blutkörperchen, umfassend ein quartäres Ammoniumsalz und ein oberflächenaktives Mittel. Es ist auf die Lyse roter Blutkörperchen, das Zählen von Leukozyten und das Messen der Hämoglobinkonzentration im Blut gerichtet. EP0444241-A discloses a lytic red blood cell lytic reagent composition comprising a quaternary ammonium salt and a surfactant. It is aimed at lysing red blood cells, counting leukocytes, and measuring hemoglobin concentration in the blood.

EP0177137-A bezieht sich auf eine Zusammensetzung zur Differenzierung weißer Blutkörperchen, aber auch auf die Quantifizierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen. Zusammensetzungen, die aliphatische Alkoholether und ein quartäres Ammoniumsalz umfassen, werden auch offenbart. Die Zusammensetzungen umfassen keine ethoxylierten Akylphenole. EP0177137-A refers to a composition for the differentiation of white blood cells, but also to the quantification of cell nucleated red blood cells. Compositions comprising aliphatic alcohol ethers and a quaternary ammonium salt are also disclosed. The compositions do not include ethoxylated alkylphenols.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine lyische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe. Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt mindestens ein oberflächenaktives Mittel auf der Basis eines quartären Ammoniums, ein ethoxyliertes Phenol und einen ethoxylierten Alkohol, und hat einen pH im Bereich von etwa 2 bis etwa 11. Beim Mischen mit einer mit einem Verdünnungsmittel vorverdünnten Blutprobe lysiert die lytische Reagenszusammensetzung rote Blutkörperchen und ermöglicht eine Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten durch DC-Impedanzmessung. The The present invention relates to a lyric reagent composition for lysing red blood cells and for measuring nucleated blood cells in a blood sample. The lytic reagent composition comprises at least one surfactant Funds based on a quaternary Ammonium, an ethoxylated phenol and an ethoxylated alcohol, and has a pH in the range of about 2 to about 11. When mixed with one with a diluent prediluted Blood sample lyses the lytic reagent composition red blood cells and allows a differentiation of nucleated red blood cells from other cell types by DC impedance measurement.

Die lytische Reagenszusammensetzung kann weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfassen, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Bestimmen der Hämoglobingesamtkonzentration einer Blutprobe durch Messen des spektrophotometrischen Absorptionsvermögens bei vorbestimmten Wellenlängen zu bilden.The Lytic reagent composition may further contain an organic ligand in an amount sufficient to contain a chromogen with hemoglobin for determining total hemoglobin concentration a blood sample by measuring spectrophotometric absorbance predetermined wavelengths to build.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein lytisches Reagenssystem zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einer Blutprobe, das eine lytische Reagenszusammensetzung und ein Verdünnungsmittel umfaßt. Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt mindestens ein oberflächenaktives Mittel auf der Basis eines quartären Ammoniums, ein ethoxyliertes Phenol und einen ethoxylierten Alkohol und hat einen pH im Bereich von etwa 2 bis etwa 11. Das Verdünnungsmittel ist eine neutrale wäßrige Lösung, umfassend ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und ein antimikrobielles Mittel. Das lytische Reagenssystem kann ferner entweder in einer lytischen Reagenszusammensetzung oder in dem Verdünnungs mittel einen organischen Liganden zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe umfassen.The The present invention further relates to a lytic reagent system for measuring nucleated blood cells in a blood sample, the one lytic reagent composition and a diluent includes. The lytic reagent composition comprises at least one surfactant Funds based on a quaternary Ammonium, an ethoxylated phenol and an ethoxylated alcohol and has a pH in the range of about 2 to about 11. The diluent is a neutral aqueous solution comprising a salt or salts to adjust the conductivity of the diluent such that she for one Impedance measurement is sufficient, and an antimicrobial agent. The lytic reagent system may also be either in a lytic Reagent composition or in the diluent an organic Ligands for measuring hemoglobin concentration include a blood sample.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine lytische Reagenszusammensetzung, umfassend mindestens ein oberflächenaktiv Mittel auf der Basis von quartärem Ammonium, ein ethoxyliertes Phenol, einen ethoxyliertes Alkohol und ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist. Die lytische Reagenszusammensetzung kann ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen. Diese lytische Reagenszusammensetzung kann zum kombinierten Verdünnen und Lysieren und zur Herstellung einer Blutprobe zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen in einem Schritt verwendet werden.In a further embodiment The present invention also relates to a lytic reagent composition, comprising at least one surface-active Funds based on quaternary Ammonium, an ethoxylated phenol, an ethoxylated alcohol and a salt or salts for adjusting the conductivity the lytic reagent composition such that it is sufficient for impedance measurement is. The lytic reagent composition may further comprise an organic Ligands for include hemoglobin measurement. This lytic reagent composition can be used for combined dilution and Lysing and making a blood sample to measure nucleated blood corpuscle be used in one step.

Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings

Die 1A, 1B und 1C sind die DC-Histogramme von Vollblutproben, verarbeitet gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung.The 1A . 1B and 1C are the DC histograms of whole blood samples processed according to the method described in Example 1 using the lytic reagent composition of Example 1 of the present invention.

2 zeigt eine Reihe von Absorptionsspektren einer Blutprobe, verarbeitet gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2. Insgesamt zwölf Spektren wurden in 120 Sekunden mit einem 10-Sekunden-Intervall gewonnen. 2 Figure 9 shows a series of absorption spectra of a blood sample processed according to the method described in Example 2 using the lytic reagent composition of Example 2. A total of twelve spectra were obtained in 120 seconds with a 10 second interval.

3A zeigt ein Spektrum einer Vollblutprobe, behandelt gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3. 3B zeigt ein Histogramm einer klinischen Vollblutprobe, erhalten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3. 3A Figure 4 shows a spectrum of a whole blood sample treated according to the method described in Example 3 using the lytic reagent and diluent compositions of Example 3. 3B Figure 9 shows a histogram of a clinical whole blood sample obtained according to the method described in Example 1 using the lytic reagent and diluent compositions of Example 3.

4A zeigt die Korrelation der NRBC-Konzentration, erhalten durch die Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu den manuellen Referenzergebnissen. 4A Figure 9 shows the correlation of the NRBC concentration obtained by the use of the lytic reagent composition and the method of the present invention described in Example 4 to the manual reference results.

4B zeigt die Korrelation der Hämoglobinkonzentration, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu der, die unter Verwendung von Lyse S® III diff auf COUNTER Gen•S erhalten wurde. 4C zeigt die Korrelation einer korrigierten WBK-Zählung, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, beschrieben in Beispiel 4, zu der korrigierten WBK-Zählung, erhalten durch Korrigieren der Zählung, die auf dem COULTER COUNTER® ZBI mit manueller NRBC-Zählung erhalten wurde. 4B shows the correlation of hemoglobin concentration obtained using the lytic Reagent composition of the present invention, described in Example 4, to that on COUNTER Gen • S was obtained using Lyse S III diff ®. 4C shows the correlation of corrected WBC count obtained using the lytic reagent and method of the present invention, described in Example 4 to the corrected WBC count obtained by correcting the count based on the COULTER COUNTER ® ZBI with manual NRBC Count was obtained.

5A zeigt ein Histogramm einer Vollblutprobe, erhalten gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren unter Verwendung einer einzelnen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5. 5B zeigt ein Spektrum derselben Probe, verarbeitet mit der einzelnen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5 gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren. 5A Figure 4 shows a histogram of a whole blood sample obtained according to the method described in Example 5 using a single reagent composition of Example 5. 5B Figure 12 shows a spectrum of the same sample processed with the single reagent composition of Example 5 according to the method described in Example 5.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten AusführungsformenFull Description of the Preferred Embodiments

In einer Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf eine lytische Reagenszusammensetzung zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen gerichtet. Genauer gesagt, ermöglicht die lytische Reagenszusammensetzung die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von anderen Zellarten in einer Blutprobe durch DC-Impedanzmessung. In diesem Zusammenhang können die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaltige rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen umfassen.In an embodiment the present invention is directed to a lytic reagent composition for Measuring nucleated blood cells directed. More precisely, possible the lytic reagent composition differentiation nucleated red blood cells of other cell types in a blood sample by DC impedance measurement. In this connection can the coronary corpuscles containing nucleated Red blood cells and white blood corpuscle include.

Die lytische Reagenszusammensetzung umfaßt eine wäßrige Lösung von:

  • (a) einem quartären Ammoniumsalz oder -salzen, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur:
    Figure 00100001
    wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist; R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist;
  • (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 50 liegt; und
  • (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H, wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; R2 -O- ist und n zwischen 20 und 35 liegt.
The lytic reagent composition comprises an aqueous solution of:
  • (a) a quaternary ammonium salt or salts represented by the following molecular structure:
    Figure 00100001
    wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 12 to 16 carbon atoms; R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups of 1 to 4 carbon atoms and X - is a chloride or bromide anion;
  • (b) an ethoxylated alkylphenol wherein the alkyl group has from 6 to 12 carbon atoms and the number of ethylene oxide ranges from about 10 to about 50; and
  • (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H, wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 10 to 22 carbon atoms; R 2 is -O- and n is between 20 and 35.

Der pH der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem breiten Bereich von etwa 2 bis etwa 11.Of the pH of the lytic reagent composition is in a wide range from about 2 to about 11.

Quartäres Ammoniumsalz lysiert rote Blutkörperchen und die Zellmembranen zellkernhaltiger Blutkörperchen. Die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes in der lytischen Reagenszusammensetzung muß eine Menge sein, die zur Lyse roter Blutkörperchen ausreicht, während die Zellkernvolumen zellkernhaltiger Blutkörperchen konserviert werden. Mit der oben beschriebenen lytischen Reagenszusammensetzung werden rote Blutkörperchen einer Probe beim Mischen mit der lytischen Reagenszusammensetzung vollständig lysiert. Die Zellmembranen der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen (NRBC) werden lysiert, und die Größen ihrer Kerne sind klein. Die Membranen weißer Blutkörperchen werden jedoch nur teilweise lysiert, und die verbleibenden Größen sind relativ groß. Ist die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes zu hoch, werden die weißen Blutkörperchen weiter schrumpfen und die Größen der Lymphozyten werden denen der NRBCs stark ähneln. Demzufolge werden NRBCs und weiße Blutkörperchen gemessen an ihrer Größe nicht unterscheidbar sein. Ist die Konzentration eines quartären Ammoniumsalzes zu gering, werden die roten Blutkörperchen nicht vollständig lysiert und können die Detektion zellkernhaltiger Blutkörperchen stören. Überdies können auch lysierte Zellmembrantrümmer die Detektion stören, wenn sie nicht gelöst und ihre Größe ausreichend reduziert wurde. Die Konzentration des quartären Ammoniumsalzes in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 6 g/L bis etwa 50 g/L, bevorzugt etwa 10 g/L bis etwa 40 g/L.Quaternary ammonium salt lyses red blood cells and the cell membranes of nucleated blood cells. The concentration a quaternary Ammonium salt in the lytic reagent composition must be a lot be used to lysing red blood cells is sufficient while the nucleus volume of nucleated blood cells are conserved. With the lytic reagent composition described above Red blood cells a sample when mixed with the lytic reagent composition Completely lysed. The cell membranes of the coronary red blood cells (NRBC) are lysed and the sizes of their nuclei are small. The membranes are whiter blood corpuscle however, are only partially lysed, and the remaining sizes are relatively large. If the concentration of a quaternary ammonium salt is too high, become the white ones blood corpuscle continue to shrink and the sizes of Lymphocytes will be very similar to NRBCs. As a result, NRBCs and white blood corpuscle indistinguishable by their size be. If the concentration of a quaternary ammonium salt is too low, become the red blood cells not completely lysed and can disturb the detection of nucleated blood cells. Moreover, lysed cell membrane debris can also Disturb detection if not solved and their size is sufficient was reduced. The concentration of the quaternary ammonium salt in the lytic reagent composition is in a range of about 6 g / L to about 50 g / L, preferably about 10 g / L to about 40 g / L.

Auf der anderen Seite ist bekannt, daß sich die lytische Potenz eines quartären Ammoniumsalzes mit der Länge der R1-Gruppe erhöht. Ein quartäres Ammoniumsalz mit einer 16-Kohlenstoffkette schrumpft die zellkernhaltigen Blutkörperchen wahrscheinlich mehr als die mit 12- oder 14-Kohlenstoffketten. Für eine optimale Trennung von NRBCs von den weißen Blutkörperchen ist eine richtige Kohlenstoffkettenlänge für die R1-Gruppe bestimmt worden. Bevorzugt wird Tetradecyltrimethylammoniumsalz oder ein Gemisch von Tetradecyltrimethylammoniumsalz mit Hexadecyltrimethylammoniumsalz oder Dodecyltrimethylammoniumsalz verwendet.On the other hand, it is known that increases the lytic potency of a quaternary ammonium salt with the length of the R 1 group. A quaternary ammonium salt with a 16-carbon chain shrinks the cell nucleated blood cells probably more than those with 12- or 14-carbon chains. For proper separation of NRBCs from white blood cells, a proper carbon chain length has been determined for the R1 group. Preference is given to using tetradecyltrimethylammonium salt or a mixture of tetradecyltrimethylammonium salt with hexadecyltrimethylammonium salt or dodecyltrimethylammonium salt.

Es ist herausgefunden worden, daß das ethoxylierte Phenol in der lytischen Reagenszusammensetzung die Trennung zwischen den NRBCs und den weißen Blutkörperchen verbessert, indem die Größe der Lymphozyten konserviert wird. Darüber hinaus unterstützt das ethoxylierte Phenol auch die Auflösung von Zellmembrantrümmern und verringert die Möglichkeit einer Störung. Die Anzahl an Ethylenoxid in dem ethoxylierten Phenol liegt bevorzugt in einem Bereich von etwa 20 bis etwa 40. Die Konzentration des ethoxylierten Phenols in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 2 g/L bis etwa 40 g/L.It has been found that the ethoxylated phenol in the lytic reagent composition Separation between the NRBCs and the white blood cells is improved by the size of the lymphocytes is preserved. About that also supported the ethoxylated phenol is also the resolution of cell membrane debris and reduces the possibility a fault. The number of ethylene oxide in the ethoxylated phenol is preferred in a range of about 20 to about 40. The concentration of the ethoxylated phenol in the lytic reagent composition in a range of about 2 g / L to about 40 g / L.

Auch der ethoxylierte Alkohol in der lytischen Reagenszusammensetzung erhält die Größe von Lymphozyten. Es ist entdeckt worden, daß eine Kombination von ethoxyliertem Alkohol und ethoxyliertem Phenol für eine bessere Trennung zwischen den NRBCs und den Lymphozyten sorgt als die Verwendung von entweder ethoxyliertem Alkohol oder ethoxyliertem Phenol allein. Daher wird eine Kombination von ethoxyliertem Phenol und ethoxyliertem Alkohol verwendet. Die Konzentration des ethoxylierten Alkohols in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt in einem Bereich von etwa 1 g/L bis etwa 20 g/L.Also the ethoxylated alcohol in the lytic reagent composition receives the size of lymphocytes. It has been discovered that one Combination of ethoxylated alcohol and ethoxylated phenol for a better Separation between the NRBCs and the lymphocytes provides as the use of either ethoxylated alcohol or ethoxylated phenol alone. Therefore, a combination of ethoxylated phenol and ethoxylated Alcohol used. The concentration of the ethoxylated alcohol in the lytic reagent composition is within a range of about 1 g / L to about 20 g / L.

Geeignete Beispiele für ethoxylierten Alkohol sind das oberflächenaktive Mittel in Granulatform Plurofac A38 von BASF Corp., New Jersey und Hetoxol STA-30 von Heterene, Inc., New Jersey. Ein geeignetes Beispiel für ethoxyliertes Phenol ist Igepal SS-837 von Rhõne-Poulenc, New Jersey.suitable examples for Ethoxylated alcohol is the granular surfactant Plurofac A38 from BASF Corp., New Jersey and Hetoxol STA-30 from Heterene, Inc., New Jersey. A suitable example of ethoxylated phenol is Igepal SS-837 from Rhõne-Poulenc, New Jersey.

Gegebenenfalls kann die lytische Reagenszusammensetzung weiter Konservierungsmittel wie Antioxidationsmittel in einer Menge, die ausreicht, um die Haltbarkeit des Reagens zu verlängern, umfassen. Ein geeignetes Beispiel für ein Antioxidationsmittel ist Butylmethylphenol. Die Konservierungsmittel müssen mit den primären funktionalen Komponenten der lytischen Reagenszusammensetzung kompatibel sein.Possibly The lytic reagent composition may further be preservative such as antioxidant in an amount that is sufficient to keep the shelf life to extend the reagent, include. A suitable example of an antioxidant is butylmethylphenol. The preservatives must be with the primary functional components of the lytic reagent composition compatible be.

In einer anderen Ausführungsform kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen. Wie oben beschrieben, lysiert die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung rote Blutkörperchen beim Mischen mit einer Blutprobe, die Hämoglobin in das Probengemisch freisetzt. In der Gegenwart eines organischen Liganden kann das freigesetzte Hämoglobin ein Chromogen bilden, das photometrisch gemessen werden kann. Geeignete Beispiele für organische Liganden umfassen Tetrazol und seine Derivate wie 5-Aminotetrazol; Imidazol und seine Derivate wie Methylimidazol und Ethylimidazol; Chinaldinsäure und Benzoesäure und Alkalimetallsalze von Benzoesäure.In another embodiment For example, the lytic reagent composition may also be an organic Ligands for the hemoglobin measurement include. As described above, the lytic reagent composition lyses the present invention, red blood cells when mixed with a Blood sample, the hemoglobin releases into the sample mixture. In the presence of an organic Ligands may be the released hemoglobin form a chromogen that can be measured photometrically. suitable examples for organic ligands include tetrazole and its derivatives such as 5-aminotetrazole; Imidazole and its derivatives such as methylimidazole and ethylimidazole; quinaldic and benzoic acid and alkali metal salts of benzoic acid.

In Gegenwart eines organischen Liganden kann die lytische Reagenszusammensetzung sowohl zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen als auch zur Hämoglobinmessung verwendet werden. Ein solches Multifunktionsmerkmal ist für ihre Anwendung in automatisierten Hämatologie-Analysegeräten von Vorteil, da weniger Reagenzien und Probentrennungsschritte erforderlich sind.In Presence of an organic ligand may be the lytic reagent composition both for measuring nucleated blood cells and for hemoglobin measurement be used. Such a multifunctional feature is for their application in automated hematology analyzers from Advantage, since fewer reagents and sample separation steps required are.

Die Konzentration des organischen Liganden in der lytischen Reagenszusammensetzung muß zur Bildung eines stabilen Hämoglobinchromogens ausreichen. Die Konzentration variiert mit der Ligandenart in Abhängigkeit der Affinität des Liganden für Hämoglobin. Allgemein gilt, daß, wenn die Menge an Ligand in der lytischen Reagenszusammensetzung nicht ausreichend ist, das gebildete Hämoglobinchro mogen instabil sein kann. Die Konzentration des organischen Liganden in der lytischen Reagenszusammensetzung liegt im Bereich von etwa 1 g/L bis etwa 10 g/L.The Concentration of the organic ligand in the lytic reagent composition must to Formation of a stable hemoglobin chromogen suffice. The concentration varies with the type of ligand depending the affinity of the ligand for Hemoglobin. In general, it holds that when the amount of ligand in the lytic reagent composition is insufficient, the hemoglobin chromogen formed unstable can be. The concentration of the organic ligand in the lytic The reagent composition ranges from about 1 g / L to about 10 g / L.

Die Konzentrationen der chemischen Komponenten in der lytischen Reagenszusammensetzung sind die Konzentrationen unter Bedingungen, in denen die Zählung der zellkernhaltigen Blutkörperchen und die Hämoglobinmessung unter Verwendung eines geeigneten Blutverdünnungsmittels für den Vorteil der Verwendung der existierenden Blutanalysegeräte erreicht werden. Die Konzentrationen der chemischen Komponenten können jedoch in Abhängigkeit des Volumenverhältnisses zwischen der lytischen Reagenszusammensetzung und dem Verdünnungsmittel verändert werden.The Concentrations of chemical components in the lytic reagent composition are the concentrations under conditions in which the count of the nucleated blood cells and hemoglobin measurement using a suitable blood diluent for the benefit the use of existing blood analyzers. The concentrations the chemical components can however in dependence the volume ratio between the lytic reagent composition and the diluent changed become.

In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf ein Reagenssystem gerichtet, das zur Messung zellkernhaltiger Blutkörperchen verwendet wird. Das Reagenssystem umfaßt

  • (I) eine lytische Reagenszusammensetzung, umfassend eine wäßrige Lösung von:
  • (a) einem quartären Ammoniumsalz oder -salzen, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur:
    Figure 00140001
    wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist; R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist;
  • (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 50 liegt; und
  • (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch die folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H, wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist; R2 -O- ist und n zwischen 20 und 35 liegt und der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem breiten Bereich von etwa 2 bis etwa 11 liegt; und
  • (II) ein Verdünnungsmittel.
In another embodiment, the present invention is directed to a reagent system used to measure nucleated blood cells. The reagent system comprises
  • (I) a lytic reagent composition comprising an aqueous solution of:
  • (a) a quaternary ammonium salt or salts represented by the following molecular structure:
    Figure 00140001
    wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 12 to 16 carbon atoms; R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups of 1 to 4 carbon atoms and X - is a chloride or bromide anion;
  • (b) an ethoxylated alkylphenol wherein the alkyl group has from 6 to 12 carbon atoms and the number of ethylene oxide ranges from about 10 to about 50; and
  • (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H, wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 10 to 22 carbon atoms; R 2 is -O- and n is between 20 and 35 and the pH of the lytic reagent composition is in a broad range from about 2 to about 11; and
  • (II) a diluent.

Die lytische Reagenszusammensetzung des Reagenssystems ist oben beschrieben worden. Des weiteren kann die lytische Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden für die Hämoglobinmessung umfassen, wie vorstehend beschrieben.The Lytic reagent composition of the reagent system is described above Service. Furthermore, the lytic reagent composition may further an organic ligand for the hemoglobin measurement include as described above.

Das Verdünnungsmittel ist eine wäßrige Lösung, die (a) ein Salz oder Salze zur Einstellung der Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart, daß sie für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und (b) ein antimikrobielles Mittel umfaßt. Geeignete Beispiele für Salze sind Alkalimetallsalze. Bevorzugt werden in dem Verdünnungsmittel Natrium- oder Kaliumsulfat, -chlorid, -phosphat oder -citrat verwendet.The thinner is an aqueous solution that (a) a salt or salts for adjusting the conductivity of the diluent such that she for one Impedance measurement is sufficient, and (b) an antimicrobial agent includes. Suitable examples of Salts are alkali metal salts. Preference is given in the diluent Sodium or potassium sulfate, chloride, phosphate or citrate.

Ein Blutverdünnungsmittel wird auf einem Hämatologieanalysegerät üblicherweise zur Verdünnung einer Blutprobe auch zum Messen roter Blutkörperchen verwendet. In letzterem Fall ist ein isotonisches Verdünnungsmittel erforderlich, um das Volumen roter Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. Daher wird das Blutverdünnungsmittel für eine kombinierte Verwendung für Messungen roter Blutkörperchen und zellkernhaltiger Blutkörperchen bevorzugt isotonisch gemacht, obgleich Isotonizität für die Messung der zellkernhaltigen Blutkörperchen nicht erforderlich ist.One Blood thinners is usually on a hematology analyzer for dilution a blood sample also used to measure red blood cells. In the latter Case is an isotonic diluent necessary to maintain the volume of red blood cells. Therefore, the blood thinner for one combined use for Measurements of red blood cells and nucleated blood cells preferably isotonic, although isotonicity for the measurement the coronary corpuscles is not required.

Das Verdünnungsmittel kann ferner einen Puffer umfassen. Es kann eine Vielzahl organischer und anorganischer Puffer in dem Verdünnungsmittel verwendet werden. Ähnlich wie oben für die Leitfähigkeit erörtert, ist das Verdünnungsmittel bevorzugt neutral, da das Verdünnungsmittel üblicherweise zur Messung roter Blutkörperchen verwendet wird, die einen neutral pH erfordert.The thinner may further comprise a buffer. It can be a variety of organic and inorganic buffer can be used in the diluent. Similar to above for the conductivity is discussed the diluent preferably neutral, since the diluent is usually for measuring red blood cells is used, which requires a neutral pH.

Das antimikrobielle Mittel muß in ausreichender Menge vorhanden sein, um das Verdünnungsmittel zu konservieren, die Funktionen des lytischen Reagens jedoch nicht zu stören.The antimicrobial agent must be in sufficient amount to preserve the diluent, However, the functions of the lytic reagent not to disturb.

Alternativ kann dem Verdünnungsmittel ein organischer Ligand für die Hämoglobinmessung zugegeben werden, statt es in die lytische Reagenszusammensetzung einzuführen.alternative can the diluent an organic ligand for the hemoglobin measurement instead of adding it to the lytic reagent composition introduce.

Zur Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und Differenzieren von NRBCs von anderen Zellarten wird eine Blutprobe mit einem geeigneten Blutverdünnungsmittel verdünnt, dann wird eine ausreichende Menge der lytischen Reagenszusammensetzung zugegeben und mit der verdünnten Probe in einer Kammer durch mechanisches oder Blasmischen gemischt, um so ein Probengemisch zu bilden (das Verdünnungsverhältnis des Gesamtreagensvolumens gegen Blut beträgt etwa 250:1). Etwa sieben bis neun Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung wird das Probengemisch mittels Vakuum durch eine nicht-fokussierende Öffnung abgezogen und mit einem DC-Detektor gemessen. Der DC-Detektor detektiert elektrische Signale, die aufgrund von Impedanzänderung erzeugt werden, wenn die verbleibenden zellkernhaltigen Blutkörperchen durch die Öffnung gehen. Aus der Messung wird ein Zellgrößenverteilungshistogramm erhalten. Überdies kann durch DC-Impedanzmessung auch eine Zählung aller zellkernhaltigen Zellen in dem Probengemisch erzeugt werden.to Use of the lytic reagent composition of the present invention Invention for measuring nucleated blood cells and differentiating NRBCs from other cell types will take a blood sample with a suitable one Blood thinners diluted then a sufficient amount of the lytic reagent composition added and diluted with the Sample mixed in a chamber by mechanical or blaspheming so as to form a sample mixture (the dilution ratio of the total reagent volume against blood amounts about 250: 1). About seven to nine seconds after adding the lytic Reagent composition is the sample mixture by vacuum subtracted a non-focussing opening and measured with a DC detector. The DC detector detects electrical signals, due to impedance change are generated when the remaining coronary corpuscles through the opening walk. From the measurement, a cell size distribution histogram is obtained. moreover can by DC impedance measurement, a count of all cell nucleated Cells are generated in the sample mixture.

Alternativ kann für die DC-Impedanzmessung auch eine fokussierte Durchflußzelle verwendet werden. Bei der Verwendung einer fokussierten Durchflußzelle wird das Probenverdünnungsverhältnis niedriger sein, da ein Mantelfluid, das zur Fokussierung verwendet wird, die in der Durchflußzelle gemessene Anzahl an Zellen weiter verringern wird. Es ist herausgefunden worden, daß in diesem Fall ein Verdünnungsverhältnis von etwa 30:1 bis etwa 35:1 für die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.alternative can for the DC impedance measurement also uses a focused flow cell become. When using a focused flow cell is the sample dilution ratio lower be because a sheath fluid used for focusing, the in the flow cell measured number of cells will continue to decrease. It's found out been that in In this case, a dilution ratio of about 30: 1 to about 35: 1 for the lytic reagent composition of the present invention can be used can.

1A zeigt ein Histogramm einer frischen normalen Vollblutprobe, erhalten unter Verwendung einer lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 1 nach dem in Beispiel 1 aufgeführten Verfahren. Wie gezeigt, haben die zellkernhaltigen Blutkörperchen, in diesem Fall alle weißen Blutkörperchen, eine bimodale Verteilung. Ein Großteil der Population in dem Peak auf der linken Seite sind Lymphozyten. Es ist jedoch beobachtet worden, daß andere Populationen weißer Zellen auch in diesen Bereich fallen können. Auf der linken Seite dieses Peaks gibt es eine freie Fläche und in diesem Bereich erscheinen keine Zellen. 1A Figure 4 shows a histogram of a fresh normal whole blood sample obtained using a lytic reagent composition of Example 1 according to the method set forth in Example 1. As shown, the coronary corpuscles, in this case all white blood cells, have a bimodal distribution. Much of the population in the peak on the left is lymphocytes. However, it has been observed that other populations of white cells may also fall into this range. There is an open area on the left side of this peak and no cells appear in this area.

Die 1B und 1C zeigen Histogramme, die unter Verwendung derselben lytischen Reagenszusammensetzung und nach demselben Verfahren aus den beiden klinischen Vollblutproben, die zellkernhaltige rote Blutkörperchen enthielten, erhalten wurden (ausgewiesen durch das manuelle Referenzverfahren). Wie gezeigt, erschien ein weiterer Peak aus den zellkernhaltigen roten Blutkörperchen (NRBC) auf der linken Seite der weißen Blutkörperchen. Scheinbar hatten die Zellkerne der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen kleinere Größen im Vergleich zu denen der weißen Blutkörperchen unter der beschriebenen Reaktionsbedingung. Eine solche Größentrennung, die durch die Nutzung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erreicht wird, ermöglicht eine Differenzierung der zellkernhaltigen roten Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen unter Verwendung des eindimensionalen Histogramms, das aus der DC-Impedanzmessung erhalten wurde.The 1B and 1C show histograms obtained using the same lytic reagent composition and method from the two clinical whole blood samples containing nucleated red blood cells (designated by the manual reference method). As shown, another nuclear coronary red blood cell (NRBC) peak appeared on the left side of the white blood cells. Apparently, the cell nuclei of the coronary red blood cells had smaller sizes compared to those of the white blood cells under the reaction conditions described. Such size separation achieved by use of the lytic reagent composition of the present invention enables differentiation of the coronary red blood cells of white blood cells using the one-dimensional histogram obtained from the DC impedance measurement.

Unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann die Gegenwart einer NRBC-Population in einer Probe identifiziert und ausgewiesen werden, da die NRBC-Population von anderen Zellenarten differenziert wird. Das Ausweisen der Gegenwart klinisch anomaler Populationen in einer Blutprobe wird oftmals das Markieren auf Hämatologie-Analysegeräten genannt, das ein wichtiges Element zur Unterstützung einer klinischen Diagnose ist.Under Use of the lytic reagent composition of the present invention Invention may be the presence of an NRBC population in a sample identified and designated as the NRBC population of different types of cells is differentiated. The identification of the present clinically abnormal populations in a blood sample is often the Marking on hematology analyzers called, this is an important element to support a clinical diagnosis is.

Ferner kann unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung die NRBC-Population gezählt werden. Wird der Schwellenwert eines DC-Detektors unter die Größe von NRBCs eingestellt, wie in den Figuren gezeigt, kann die NRBC-Population zusammen mit den weißen Blutkörperchen gezählt werden. Nach der Differenzierung der NRBC-Population von den anderen Zellarten, basierend auf der Populationsverteilung eines erhaltenen DC-Histogramms, kann die NRBC-Konzentration einer analysierten Probe berechnet werden. Die NRBC-Konzentration kann als die Anzahl an NRBCs pro Hundert weiße Blutkörperchen (NRBC/100 WBK), was dieselbe Einheit wie in der manuellen Referenz ist, ausge wiesen werden. Alternativ kann die Anzahl an NRBCs auch als eine absolute Anzahl pro Volumeneinheit einer Blutprobe ausgewiesen werden. In diesem Fall wird die Anzahl an NRBCs pro 100 weiße Blutkörperchen mit der Zählung der weißen Blutkörperchen derselben Probe multipliziert.Further can be obtained using the lytic reagent composition of the present invention Invention, the NRBC population are counted. Will the threshold of a DC detector below the size of NRBCs set, as shown in the figures, the NRBC population along with the white ones blood corpuscle counted become. After differentiating the NRBC population from the others Cell types, based on the population distribution of a received DC histogram, the NRBC concentration of an analyzed sample be calculated. The NRBC concentration may be as the number of NRBCs per hundred white blood corpuscle (NRBC / 100 WBK), which is the same unit as in the manual reference is to be reported. Alternatively, the number of NRBCs can also be as an absolute number per unit volume of a blood sample become. In this case, the number of NRBCs per 100 white blood cells with the count the white one blood corpuscle multiplied by the same sample.

Überdies wurden, wie vorstehend beschrieben, in der Vergangenheit bei der Messung weißer Blutkörperchen der Größe nach NRBCs zusammen oder teilweise zusammen mit weißen Blutkörperchen gezählt, da sie nicht von anderen zellkernhaltigen Blutkörperchen differenziert werden konnten. Die durch NRBCs verursachte Störung kann zu erhöhten und fehlerhaften Zählungen weißer Blutkörperchen führen. Mit der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann bei der Differenzierung der NRBCs der Beitrag dieser Population zu der Zählung weißer Blutkörperchen von der Gesamtzählung zellkernhaltiger Blutkörperchen subtrahiert werden, um so eine korrigierte Zählung weißer Blutkörperchen bereitzustellen.moreover were, as described above, in the past in the Measurement whiter blood corpuscle in size NRBCs counted together or partially along with white blood cells as they can not be differentiated from other coronary corpuscles could. The disorder caused by NRBCs can be too elevated and erroneous counts white blood corpuscle to lead. With the lytic reagent composition of the present invention may differentiate the NRBCs in the contribution of this population to the count white blood corpuscle from the total count nucleated blood cells subtracted to provide a corrected count of white blood cells.

2 zeigt eine Reihe photometrischer Hämoglobinabsorptionsspektren einer Vollblutprobe, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ferner einen organischen Liganden enthält und mit einem in Beispiel 2 aufgeführten manuellen Verfahren verarbeitet wurde. Insgesamt zwölf Spektren wurden in 120 Sekunden mit einem 10-Sekunden-Intervall erhalten. Wie gezeigt, wies das gebildete Hämoglobinchromogen eine maximale Absorption bei etwa 538 nm mit einer Schulter bei etwa 565 nm auf. Das Hämoglobinchromogen bildete sich schnell nach dem Mischen der lytischen Reagenszusammensetzung mit der vorverdünnten Probe. Wie durch eine vollständige Überlappung kontinuierlich erhaltener Spektren veranschaulicht, war das Hämoglobinchromogen während der 120 Sekunden der Analyse, was weit unter einer typischen Datenerfassungszeit lag, wie sie auf einem Hämatologie-Analysegerät verwendet wird, sehr stabil. 2 Figure 4 shows a series of photometric hemoglobin absorption spectra of a whole blood sample obtained using the lytic reagent composition of the present invention, which further contains an organic ligand and was processed with a manual procedure set forth in Example 2. A total of twelve spectra were obtained in 120 seconds with a 10-second interval. As shown, the hemoglobin chromogen formed had a maximum absorption at about 538 nm with a shoulder at about 565 nm. The hemoglobin chromogen formed rapidly after mixing the lytic reagent composition with the prediluted sample. As illustrated by a complete overlap of continuously obtained spectra, the hemoglobin chromogen was very stable during the 120 seconds of analysis, which was well below a typical data acquisition time as used on a hematology analyzer.

Wie vorstehend beschrieben, kann ein organischer Ligand für die Hämoglobinmessung entweder der lytischen Reagenszusammensetzung oder dem Verdünnungsmittel des lytischen Reagenssystems zugegeben werden. Die 3A und 3B veranschaulichen Ergebnisse der letzteren Alternative, worin das Verdünnungsmittel einen organischen Liganden enthält.As described above, an organic ligand may be added for hemoglobin measurement to either the lytic reagent composition or the diluent of the lytic reagent system. The 3A and 3B illustrate results of the latter alternative wherein the diluent contains an organic ligand.

3A ist ein Spektrum einer Vollblutprobe, behandelt unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der in Beispiel 3 beschriebenen Verdünnungsmittelzusammensetzung, die Imidazol als einen Hämoglobinliganden enthält. 3B zeigt ein Histogramm einer klinischen Blutprobe, die NRBC enthält, erhalten unter Verwendung der lytischen Reagens- und Verdünnungsmittelzusammensetzungen aus Beispiel 3. Das Histogramm zeigt deutlich die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von den weißen Blutkörperchen. 3A is a spectrum of a whole blood sample treated using the lytic reagent composition of the present invention and the diluent composition described in Example 3 containing imidazole as a hemoglobin ligand. 3B Figure 9 shows a histogram of a clinical blood sample containing NRBC obtained using the lytic reagent and diluent compositions of Example 3. The histogram clearly shows the differentiation of nuclear coronary red blood cells from the white blood cells.

Die lytische Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Zählung weißer Blutkörperchen, die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen und die Hämoglobinmessung mit einem Probenpräparat.The The lytic reagent composition of the present invention enables the count white blood cells, the count nucleated red blood cells and hemoglobin measurement with a sample preparation.

Beispiel 4 demonstriert die Nützlichkeit der lytischen Reagenszusammensetzung bei der Analyse klinischer Proben. Insgesamt wurden 95 normale und 74 klinische Vollblutproben, die zellkernhaltige rote Blutkörperchen enthalten, auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät mit der in Beispiel 1 aufgeführten Instrumentenkonfiguration unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2 und Isoton®III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida) als Verdünnungsmittel analysiert. Dieselben Proben wurden auch auf einem COULTER® GEN•S-Hämatologie-Analysegerät und COULTER COUNTER® ZBI als Referenzen analysiert. Die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK wurde aus einer manuellen 500-Zell-Zählung nach dem NCCLS-Standardverfahren erhalten und als Referenz verwendet.Example 4 demonstrates the utility of the lytic reagent composition in the analysis of clinical samples. A total of 95 normal and 74 clinical whole blood samples were containing nucleated red blood cells on an experimental hematology analyzer with a composition shown in Example 1 instrument configuration using the lytic reagent composition of Example 2 and Isoton ® III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida) analyzed as a diluent. The same samples were also analyzed on a COULTER ® GEN • S hematology analyzer and COULTER COUNTER ® ZBI as references. The number of NRBCs per 100 WBK was obtained from a manual 500 cell count according to the NCCLS standard procedure and used as a reference.

Das auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät erhaltene DC-Histogramm wurde durch einen experimentellen Algorithmus analysiert, um die zellkernhaltigen roten Blutkörperchen von den weißen Blutkörperchen zu differenzieren und die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK auszuweisen. Dann wurden die NRBCs von der gemessenen Gesamtanzahl zellkernhaltiger Blutkörperchen subtrahiert, um so eine korrigierte WBK-Zählung zu erhalten.The obtained on the experimental hematology analyzer DC histogram was analyzed by an experimental algorithm, around the coronary red blood cells from the white blood cells to differentiate and show the number of NRBCs per 100 WBK. Then, the NRBCs of the total number of nucleated blood corpuscle subtracted to obtain a corrected WBK count.

4A zeigt die Ergebnisse der NRBC-Zählung, die eine gute lineare Korrelation zwischen den unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen und der manuellen Referenz demonstriert. 4A Figure 3 shows the results of the NRBC count demonstrating a good linear correlation between the results obtained using the lytic reagent composition of the present invention and the manual reference.

4B zeigt die Korrelation zwischen der unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der auf COULTER® GENS erhaltenen Hämoglobinkonzentration. Die Ergebnisse demonstrieren eine hervorragende lineare Korrelation für die Hämoglobinmessung. 4B shows the correlation between the using the lytic reagent composition of the present invention and the hemoglobin concentration obtained on COULTER ® gene. The results demonstrate excellent linear correlation for hemoglobin measurement.

4C zeigt die Korrelation der korrigierten WBK-Zählung zwischen der Referenz und den unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnissen. Die Referenzergebnisse wurden durch Subtrahieren der manuellen NRBC-Ergebnisse von der WBK-Zählung, erhalten auf dem COULTER COUNTER® ZBI, erhalten. Wie gezeigt, korrelieren die durch die Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse hervorragend mit der Referenz. 4C Figure 15 shows the correlation of the corrected WBK count between the reference and the results obtained using the lytic reagent composition of the present invention. The reference results were obtained by subtracting the manual NRBC results from the WBK count, get on the COULTER COUNTER ® CBI is obtained. As shown, the results obtained by using the lytic reagent composition of the present invention are highly correlated with the reference.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine einzelne Reagenszusammensetzung für die kombinierte Verdünnung und Lysierung einer Blutkörperchenprobe ohne Vorverdünnung mit einem Verdünnungsmittel. Setzt ein Hämatologie-Analysegerät ein einzelnes Reagens ein, ohne Vorverdünnung mit einem Verdünnungsmittel, kann man die Konzentrationen der chemischen Inhaltsstoffe der lytischen Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung reduzieren und die Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung einstellen, damit sie für Impedanz-Messungen verwendet werden kann. Die Leitfähigkeit kann durch die Zugabe einer ausreichenden Menge eines Salzes oder von Salzen eingestellt werden. Geeignete Beispiele für Salze sind Alkalimetallsalze wie Sulfate, Chloride, Phosphate und Citrate. In einer einzelnen Reagenszusammensetzung sollten die Konzentrationen der chemischen Komponenten der lytischen Reagenszusammensetzung dieselben sein wie die Konzentrationen, die in dem fertigen Probengemisch enthalten sind, wenn das lytische Reagens und Verdünnungsmittel separat verwendet werden. Ist eine gleichzeitige Hämoglobinmessung gewünscht, kann die einzelne Reagenszusammensetzung ferner einen organischen Liganden, wie oben beschrieben, enthalten.In a further embodiment The present invention relates to a single reagent composition for the combined dilution and lysing a blood cell sample without predilution with a diluent. Sets a hematology analyzer a single Reagent, without pre-dilution with a diluent, you can see the concentrations of the chemical ingredients of the lytic Reduce reagent composition of the present invention and the conductivity adjust the lytic reagent composition to allow for impedance measurements can be used. The conductivity can by adding a sufficient amount of a salt or be set by salts. Suitable examples of salts are alkali metal salts such as sulfates, chlorides, phosphates and citrates. In a single reagent composition, the concentrations should be the chemical components of the lytic reagent composition be the same as the concentrations in the final sample mixture are included when the lytic reagent and diluent be used separately. Is a simultaneous hemoglobin measurement desired the single reagent composition may further comprise an organic ligand, as described above.

Die 5A und 5B veranschaulichen die Nützlichkeit einer einzelnen Reagenszusammensetzung für die kombinierte Verdünnung und Lysierung einer Blutprobe zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und von Hämoglobin. 5A zeigt ein DC-Histogramm einer klinischen Vollblutprobe, die NRBC enthält, erhalten auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, das eine einzelne Reagenszusammensetzung aus Beispiel 5 als sowohl das lytische Reagens als auch das Verdünnungsmittel verwendete. Das Histogramm zeigt deutlich die Differenzierung von NRBCs von den weißen Blutkörperchen.The 5A and 5B illustrate the utility of a single reagent composition for the combined dilution and lysing of a blood sample for measuring nucleated blood cells and hemoglobin. 5A Figure 9 shows a DC histogram of a clinical whole blood sample containing NRBC obtained on an experimental hematology analyzer using a single reagent composition of Example 5 as both the lytic reagent and the diluent. The histogram clearly shows the differentiation of NRBCs from white blood cells.

5B zeigt ein photometrisches Absorptionsspektrum einer Vollblutprobe, behandelt mit der einzelnen Reagenszusammensetzung. Das Spektrum zeigt dasselbe charakteristische Hämoglobinchromogen, das unter separater Verwendung von lytischer Reagenszusammensetzung und Verdünnungsmittel erhalten wurde. 5B Figure 4 shows a photometric absorption spectrum of a whole blood sample treated with the single reagent composition. The spectrum shows the same characteristic hemoglobin chromogen obtained separately using the lytic reagent composition and diluent.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, in keiner Weise einschränken. Es ist selbstverständlich, daß gemäß der weitergehenden Offenbarung verschiedene andere Inhaltsstoffe und Anteile eingesetzt werden. können.The The following examples illustrate the invention and are intended to teach the Scope of the invention as defined in the claims, in no way limit. It goes without saying that according to the further Revelation various other ingredients and proportions used become. can.

Beispiel 1example 1

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Tetradecyltrimethylammoniumbromid 25,0 g Igepal SS-837 (von Rhöne-Poulenc) 15,0 g oberflächenaktives Mittel in Granulatform Plurofac A38 (von BASF Corp.) 4,0 g destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter pH 5,0 A reagent having the following composition was prepared. tetradecyl 25.0 g Igepal SS-837 (by Rhone-Poulenc) 15.0 g Surfactant in granular form Plurofac A38 (from BASF Corp.) 4.0 g distilled water, adjusted to 1 liter pH 5.0

28 μl einer Vollblutprobe wurden durch ein experimentelles Hämatologie-Analysegerät aspiriert, mit 6 ml Isoton®III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida) verdünnt, dann mit 1 ml der obigen lytischen Reagenszusammensetzung gemischt, um so rote Blutkörperchen zu lysieren. Das Probengemisch wurde dann durch eine Reihe von drei nicht-fokussierten Durchflußöffnungen (parallel angeordnet) gezogen. Die Öffnungen hatten eine Länge von 120 μm und eine Breite von 100 μm. Die zellkernhaltigen Blutkörperchen wurden durch eine DC-Impedanz-Messung gezählt, und nach Pulseditierung wurde außerdem ein Histogramm der Blutkörperchen erstellt (gemittelt aus den Messungen der drei Öffnungen).28 microliters of a whole blood sample was aspirated by an experimental hematology analyzer with 6 ml Isoton ® III (Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida), washed then mixed with 1 ml of the above lytic reagent composition to lyse red blood cells so. The sample mixture was then drawn through a series of three non-focused flow ports (arranged in parallel). The openings had a length of 120 microns and a width of 100 microns. The nucleated blood cells were counted by a DC impedance measurement, and after pulse editing, a histogram of the blood cells was also made (averaged from the measurements of the three openings).

1A zeigt ein Histogramm einer frischen normalen Blutprobe, analysiert gemäß dem obigen Verfahren, das eine bimodale Verteilung der weißen Blutkörperchen zeigt. Die 1B und 1C zeigen zwei klinische anomale Proben, analysiert gemäß dem obigen Verfahren. Die klinischen Proben enthielten 230 NRBC/100 WBK bzw. 9 NRBC/100 WBK. Wie zu erkennen ist, erschien eine deutliche NRBC-Population auf der linken Seite der weißen Blutkörperchen. Die NRBC-Population wurde von den weißen Blutkörperchen differenziert und das Verhältnis zwischen den NRBCs und den weißen Blutkörperchen (× 100) wurde als die Anzahl an NRBC/100 WBK ausgewiesen. Alternativ können die NRBCs auch als absolute Zählung in einer Volumeneinheit der Blutprobe unter Einbeziehung der Gesamtzählung der weißen Blutkörperchen ausgewiesen werden. 1A Figure 15 shows a histogram of a fresh normal blood sample analyzed according to the above method showing a bimodal distribution of white blood cells. The 1B and 1C show two clinical abnormal samples analyzed according to the above method. The clinical samples contained 230 NRBC / 100 WBK and 9 NRBC / 100 WBK, respectively. As can be seen, a significant NRBC population appeared on the left side of the white blood cells. The NRBC population was differentiated from the white blood cells and the ratio between the NRBCs and the white blood cells (× 100) was reported as the number of NRBC / 100 WBK. Alternatively, the NRBCs may also be reported as an absolute count in a volume unit of the blood sample, including the total white blood cell count.

Beispiel 2Example 2

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Tetradecyltrimethylammoniumbromid 25,0 g Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc) 15,0 g oberflächenaktives Mittel in Granulatform Plurofac A38 (von BASF Corp.) 4,0 g Tetrazol 2,0 g BHT (vorgelöst in Ethanol) 0,04 g destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter pH 2,9 A reagent having the following composition was prepared. tetradecyl 25.0 g Igepal SS-837 (by Rhõne-Poulenc) 15.0 g Surfactant in granular form Plurofac A38 (from BASF Corp.) 4.0 g tetrazole 2.0 g BHT (pre-dissolved in ethanol) 0.04 g distilled water, adjusted to 1 liter pH 2.9

11,6 μl einer Vollblutprobe wurden mit 2500 μl Isoton®III verdünnt, dann wurden 403 μl der obigen lytischen Reagenszusammensetzung manuell mit der vorverdünn ten Probe gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU® 7500-Spektrophotometer gemessen. 2 zeigt die Spektren der Blutprobe, verarbeitet gemäß dem obigen Verfahren. 2 ist eine Überlagerung von insgesamt zwölf Spektren. Das erste Spektrum wurde 10 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung erhalten, und dann wurde ein Spektrum automatisch alle 10 Sekunden erhalten, wobei das letzte 130 Sekunden nach der Zugabe der lytischen Reagenszusammensetzung erhalten wurde.11.6 microliters of a whole blood sample was diluted with 2,500 ul Isoton ® III, then 403 ul of the above lytic reagent composition was mixed manually with the vorverdünn th sample. The photometric absorption spectrum of the sample was measured directly on a Beckman DU® 7500 spectrophotometer. 2 shows the spectra of the blood sample processed according to the above method. 2 is an overlay from a total of twelve spectra. The first spectrum was obtained 10 seconds after the addition of the lytic reagent composition and then a spectrum was automatically obtained every 10 seconds, the last 130 seconds after the addition of the lytic reagent composition.

Beispiel 3Example 3

Es wurden Reagenzien mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt. Lytisches Reagens Tetradecyltrimethylammoniumbromid 25,0 g Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc) 15,0 g oberflächenaktives Mittel in Granulatform Plurofac A38 (von BASF Corp.) 4,0 g destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter pH 5,0 Verdünnungsmittel Na2SO4 10,58 g NaCl 3,0 g Na2EDTA 1,5 g Imidazol 1,5 g 6N HCl, zugegeben zum Einstellen des pH auf neutral destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter pH 7,1 Osmolalität 308 mOsm Reagents having the following compositions were prepared. Lytic reagent tetradecyl 25.0 g Igepal SS-837 (by Rhõne-Poulenc) 15.0 g Surfactant in granular form Plurofac A38 (from BASF Corp.) 4.0 g distilled water, adjusted to 1 liter pH 5.0 thinner Na 2 SO 4 10.58 g NaCl 3.0 g Na 2 EDTA 1.5 g imidazole 1.5 g 6N HCl, added to adjust the pH to neutral distilled water, adjusted to 1 liter pH 7.1 osmolality 308 mOsm

11,6 μl einer frischen normalen Vollblutprobe wurden mit 2500 μl des obigen Verdünnungsmittels verdünnt, dann wurden 403 μl der obigen lytischen Reagenszusammensetzung manuell mit der vorverdünnten Probe gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU 7500-Spektrophotometer gemessen. 3A zeigt das Spektrum der Blutprobe, verarbeitet gemäß dem obigen Verfahren.11.6 μl of a fresh normal whole blood sample was diluted with 2500 μl of the above diluent, then 403 μl of the above lytic reagent composition was manually mixed with the prediluted sample. The photometric absorption spectrum of the sample was measured directly on a Beckman DU 7500 spectrophotometer. 3A shows the spectrum of the blood sample processed according to the above method.

Eine klinische Vollblutprobe, die 19 NRBC/100 WBK enthält, wurde auf einem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, mit derselben Instrumentenkonfiguration analysiert, außer daß nicht-fokussierte Durchflußöffnungen von 120 μm Länge mal 100 μm Breite und das Lysereagens und Verdünnungsmittel aus Beispiel 3 verwendet wurden. 3B zeigt das erhaltene Histogramm, das deutlich die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen zeigt.A clinical whole blood sample containing 19 NRBC / 100 WBK was analyzed on an experimental hematology analyzer described in Example 1 with the same instrument configuration except that non-focused flow openings of 120 μm length by 100 μm width and the lysis reagent and diluent Example 3 were used. 3B shows the obtained histogram clearly showing the differentiation of cell nucleated red blood cells of white blood cells.

Beispiel 4Example 4

95 normale und 74 klinische Vollblutproben, die NRBCs enthalten, wurden auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, unter Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung aus Beispiel 2 und Isoton®III als Verdünnungsmittel analysiert. Unmittelbar nach dem Messen der zellkernhaltigen Blutkörperchen wurde auch die Absorption eines Probengemisches bei 525 nm auf dem Analysegerät gemessen. Die Hämoglobinkonzentration der Probe wurde durch das Analysegerät ausgewiesen. Dann wurden dieselben Proben auch auf einem COULTER® GEN•S-Hämatologie-Analysegerät und auf einem COULTER COUNTER® ZBI analysiert. Der COUNTER® GEN•S wurde unter seiner Standardkonfiguration gemäß dem Handbuch des Herstellers unter Verwendung von Lyse S®III diff (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida) als Lysereagens und Isoton®III als Verdünnungsmittel betrieben. Die weißen Blutkörperchen der Blutproben wurden auf dem COUNTER COUNTER®ZBI gemäß dem NCCLS-Referenzverfahren zur WBK-Zählung gezählt. Der Schwellenwert auf dem COUNTER COUNTER®ZBI wurde auf 7,5 eingestellt, um so die Zählung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen sicherzustellen. Eine manuelle 500-Zell-Zählung wurde durch drei medizinischen Technologen für alle klinischen Proben als Referenz für zellkernhaltige rote Blutkörperchen erhalten und als die Anzahl zellkernhaltiger roter Blutkörperchen, beobachtet pro 100 gezählter WBK, ausgewiesen (Anzahl NRBC/100 WBK).95 normal and 74 clinical whole blood samples containing NRBCs were on the experimental hematology analyzer described in Example 1, analyzed using the lytic reagent composition of Example 2 and Isoton III ® as a diluent. Immediately after measuring the nucleated blood cells, the absorbance of a sample mixture at 525 nm was also measured on the analyzer. The hemoglobin concentration of the sample was reported by the analyzer. Then, the same samples were also analyzed on a Coulter ® GEN • S-hematology analyzer and a COULTER COUNTER ® CBI. The COUNTER ® GEN • S was operated under its standard configuration according to the manufacturer's manual, using Lyse S III diff ® (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida) as lysing reagent and Isoton III ® as a diluent. The white blood cells of the blood samples were counted on the Coulter Counter ZBI ® according to the NCCLS reference procedure for WBC count. The threshold on the Coulter Counter ® ZBI was set at 7.5 so as to ensure the counting of nucleated red blood cells. A manual 500 cell count was obtained by three medical technologists for all clinical samples as a reference for coronary red blood cells and reported as the number of coronary red blood cells observed per 100 counted WBK (NRBC / 100 WBK count).

Das erhaltene DC-Histogramm wurde durch einen experimentellen Algorithmus analysiert, um so die NRBCs von den weißen Blutkörperchen zu differenzieren und die Anzahl an NRBCs pro 100 WBK auszuweisen. Dann wurden die NRBCs von der Gesamtzahl der gezählten zellkernhaltigen Blutkörperchen subtrahiert, um so eine korrigierte WBK-Zählung zu erhalten.The resulting DC histogram was analyzed by an experimental algorithm to obtain the Differentiate NRBCs from white blood cells and identify the number of NRBCs per 100 WBK. Then, the NRBCs were subtracted from the total number of nucleated corpuscles counted so as to obtain a corrected WBK count.

4A zeigt die Ergebnisse der NRBC-Zählung, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, gegen die manuelle Referenz. Die Korrelationskoeffizienten, Anstiege und Achsenabschnitte der Regressionslinien zeigten eine gute lineare Korrelation für die NRBCs. 4A shows the results of the NRBC count obtained according to the method described above against the manual reference. The correlation coefficients, slopes, and intercepts of the regression lines showed a good linear correlation for the NRBCs.

4B zeigt die Korrelation zwischen der Hämoglobinkonzentration, erhalten unter Verwendung des obigen lytischen Reagens auf einem experimentellen Hämatologieanalysegerät, und der, die auf einem COULTER® GEN•S erhalten wurde. Das Ergebnis demonstriert eine hervorragende lineare Korrelation für die Hämoglobinkonzentration. 4B shows the correlation between hemoglobin concentration obtained using the above lytic reagent on an experimental hematology analyzer and that obtained on a COULTER GEN • S ®. The result demonstrates an excellent linear correlation for hemoglobin concentration.

4C zeigt die Korrelation zwischen der korrigierten WBK-Zählung, erhalten unter Verwendung des obigen lytischen Reagens auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät und des oben beschriebenen Verfahrens, und der, die durch das Subtrahieren der manuellen NRBC-Ergenisse von der WBK-Zählung, erhalten auf dem COULTER COUNTER®ZBI, erhalten wurden. Das Ergebnis veranschaulicht eine hervorragende Korrelation zwischen dem Verfahren der vorliegenden Erfindung und dem Referenzverfahren. 4C FIG. 14 shows the correlation between the corrected WBK count obtained using the above lytic reagent on the experimental hematology analyzer and the above-described method, and that obtained by subtracting the manual NRBC results from the WBK count obtained in FIG COULTER COUNTER ® CBI, were obtained. The result illustrates an excellent correlation between the method of the present invention and the reference method.

Beispiel 5Example 5

Es wurde ein Reagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Tetradecyltrimethylammoniumbromid 3,48 g Igepal SS-837 (von Rhõne-Poulenc) 2,09 g oberflächenaktives Mittel in Granulatform Plurofac A38 (von BASF Corp.) 0,56 g Tetrazol 0,28 g Na2SO4 7,94 g NaCl 3,46 g Na2EDTA 0,09 g ADA 1,21 g antimikrobielle Mittel 0,98 g BHT (vorgelöst in Ethanol) 0,01 g destilliertes Wasser, eingestellt auf 1 Liter pH 5,8 Osmolalität 312 mOsm A reagent having the following composition was prepared. tetradecyl 3.48 g Igepal SS-837 (by Rhõne-Poulenc) 2.09 g Surfactant in granular form Plurofac A38 (from BASF Corp.) 0.56 g tetrazole 0.28 g Na 2 SO 4 7.94 g NaCl 3.46 g Na 2 EDTA 0.09 g ADA 1.21 g antimicrobial agents 0.98 g BHT (pre-dissolved in ethanol) 0.01 g distilled water, adjusted to 1 liter pH 5.8 osmolality 312 mOsm

Eine klinische Vollblutprobe, die 31 NRBC/100 WBK enthält, wurde auf dem experimentellen Hämatologie-Analysegerät, beschrieben in Beispiel 1, mit derselben Instrumentenkonfiguration, aber unter Verwendung der obigen einzelnen Reagenszusammensetzung sowohl als Lysereagens als auch als Verdünnungsmittel analysiert. 5A zeigt das erhaltene Histogramm, das die Differenzierung zellkernhaltiger roter Blutkörperchen von weißen Blutkörperchen zeigt.A clinical whole blood sample containing 31 NRBC / 100 WBK was analyzed on the experimental hematology analyzer described in Example 1 with the same instrument configuration but using the above single reagent composition both as a lysis reagent and as a diluent. 5A shows the obtained histogram showing the differentiation of nuclear coronary red blood cells of white blood cells.

Des weiteren wurden 11,6 μl derselben Probe mit 2903 μl der obigen einzelnen Reagenszusammensetzung verdünnt und gemischt. Das photometrische Absorptionsspektrum der Probe wurde unmittelbar auf einem Beckman DU® 7500-Spektrophotometer gemessen. 5B zeigt das erhaltene Spektrum, das dasselbe charakteristische Hämoglobinchromogen, das unter separater Verwendung der lytischen Reagenszusammensetzung und eines Verdünnungsmittels erhalten wurde, aufwies.Further, 11.6 μl of the same sample was diluted with 2903 μl of the above single reagent composition and mixed. The photometric absorption spectrum of the sample was measured directly on a Beckman DU® 7500 spectrophotometer. 5B Fig. 14 shows the obtained spectrum having the same characteristic hemoglobin chromogen obtained by separately using the lytic reagent composition and a diluent.

Claims (25)

Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
Figure 00270001
wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R2 -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und wobei der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem Bereich von 2 bis 11 liegt.A lytic reagent composition for lysing red blood cells and for measuring nucleated blood cells comprising an aqueous solution of (a) at least one quaternary ammonium salt represented by the following molecular structure:
Figure 00270001
wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group of 12 to 16 carbon atoms, R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups of 1 to 4 carbon atoms, and X - is a chloride or bromide anion, (b) an ethoxylated alkylphenol wherein the alkyl group has 6 to 12 carbon atoms and the number of ethylene oxide is in a range of 10 to 50, and (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 10 to 22 carbon atoms, R 2 is -O-, and n is between 20 and 35, and wherein the pH of the lytic reagent composition is in a range of 2 to 11. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das quartäre Ammoniumsalz eine Konzentration im Bereich von etwa 6 g/L bis 50 g/L aufweist.A lytic reagent composition according to claim 1, being the quaternary Ammonium salt has a concentration in the range of about 6 g / L to 50 g / L. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.A lytic reagent composition according to claim 1, being the quaternary Ammonium salt is tetradecyltrimethylammonium bromide. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das ethoxylierte Phenol eine Konzentration in einem Bereich von etwa 2 g/L bis 40 g/L aufweist.A lytic reagent composition according to claim 1, wherein the ethoxylated phenol has a concentration in a range from about 2 g / L to 40 g / L. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der ethoxylierte Alkohol eine Konzentration in einem Bereich von etwa 1 g/L bis 20 g/L aufweist.A lytic reagent composition according to claim 1, wherein the ethoxylated alcohol has a concentration in a range from about 1 g / L to 20 g / L. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfasst, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.A lytic reagent composition according to claim 1, which further comprises an organic ligand in a sufficient amount Quantity includes a chromogen containing hemoglobin to measure hemoglobin concentration to make a blood test. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.Lytic reagent composition according to claim 6, wherein the organic ligand is selected from the group consisting of (a) tetrazole and its derivatives, (b) imidazole and its derivatives, (c) quinaldic acid and (d) benzoic acid and alkali metal salts of benzoic acid. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der organische Ligand eine Konzentration in einem Bereich von etwa 1 g/L bis 10 g/L aufweist.Lytic reagent composition according to claim 7, wherein the organic ligand has a concentration in a range from about 1 g / L to 10 g / L. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der organische Ligand Tetrazol und dessen Derivate ist.Lytic reagent composition according to claim 7, wherein the organic ligand is tetrazole and its derivatives. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaitige rote Blutkörperchen und weiße Blutkör perchen umfassen.A lytic reagent composition according to claim 1, wherein the coronary corpuscles nucleus-containing red blood cells and white Blood cells include. Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen, zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen und der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
Figure 00290001
wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 14 Kohlenstoffatomen ist, R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R2 -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und (e) Tetrazol.A lytic reagent composition for lysing red blood cells, for measuring nucleated blood cells and the hemoglobin concentration of a blood sample, comprising an aqueous solution of (a) at least one quaternary ammonium salt represented by the following molecular structure:
Figure 00290001
wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 14 carbon atoms, R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms, and X - is a chloride or bromide anion, is an ethoxylated alkyl phenol wherein the alkyl group has 6 to 12 carbon atoms, and the number is (b) of ethylene oxide in a range of 10 to 50, and (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group of 10 to 22 carbon atoms, R 2 is -O-, and n is between 20 and 35, and (e) tetrazole. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.A lytic reagent composition according to claim 11, being the quaternary Ammonium salt is tetradecyltrimethylammonium bromide. Reagenssystem zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend (I) eine lytische Reagenszusammensetzung, wobei die lytische Reagens zusammensetzung eine wäßrige Lösung umfaßt von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
Figure 00300001
wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R2 -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und wobei der pH der lytischen Reagenszusammensetzung in einem Bereich von 2 bis 11 liegt, und (II) ein Verdünnungsmittel.A red blood cell lysing reagent system for measuring nucleated corpuscles comprising (I) a lytic reagent composition, the lytic reagent composition comprising an aqueous solution of (a) at least one quaternary ammonium salt represented by the following molecular structure:
Figure 00300001
wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group of 12 to 16 carbon atoms, R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups of 1 to 4 carbon atoms, and X - is a chloride or bromide anion, (b) an ethoxylated alkylphenol wherein the alkyl group has 6 to 12 carbon atoms and the number of ethylene oxide is in a range of 10 to 50, and (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 10 to 22 carbon atoms, R 2 is -O-, and n is between 20 and 35, and wherein the pH of the lytic reagent composition is in a range of 2 to 11, and (II) a diluent. Reagenssystem nach Anspruch 13, wobei die lytische Reagenszusammensetzung weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.The reagent system of claim 13, wherein the lytic Reagent composition further an organic ligand in one includes sufficient quantity, around a chromogen with hemoglobin for measuring hemoglobin concentration to make a blood test. Reagenssystem nach Anspruch 14, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.The reagent system of claim 14, wherein the organic Ligand from the group consisting of (a) tetrazole and its derivatives, (b) imidazole and its derivatives, (c) quinaldic acid and (d) benzoic acid and Alkali metal salts of benzoic acid, selected is. Reagenssystem nach Anspruch 13, wobei das Verdünnungsmittel eine wäßrige Lösung ist, umfassend (a) mindestens ein Salz in einer Menge, um die Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels derart einzustellen, daß diese für eine Impedanzmessung ausreichend ist, und (b) ein antimikrobielles Mittel.The reagent system of claim 13, wherein the diluent an aqueous solution, full (a) at least one salt in an amount to increase the conductivity of the diluent to adjust so that these for one Impedance measurement is sufficient, and (b) an antimicrobial Medium. Reagenssystem nach Anspruch 16, wobei das Verdünnungsmittel weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.The reagent system of claim 16, wherein the diluent further comprises an organic ligand in an amount sufficient to Chromogen with hemoglobin for measuring hemoglobin concentration to make a blood test. Reagenssystem nach Anspruch 17, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.The reagent system of claim 17, wherein the organic Ligand from the group consisting of (a) tetrazole and its derivatives, (b) imidazole and its derivatives, (c) quinaldic acid and (d) benzoic acid and Alkali metal salts of benzoic acid, selected is. Reagenssystem nach Anspruch 16, wobei das Verdünnungsmittel weiter einen Puffer umfaßt, um den pH des Verdünnungsmittels auf neutral einzustellen.The reagent system of claim 16, wherein the diluent further comprises a buffer, around the pH of the diluent set to neutral. Lytische Reagenszusammensetzung zum Lysieren roter Blutkörperchen und zum Messen zellkernhaltiger Blutkörperchen, umfassend eine wäßrige Lösung von (a) mindestens einem quartären Ammoniumsalz, dargestellt durch folgende Molekularstruktur:
Figure 00310001
wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen ist, R2, R3 und R4 Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, und X– ein Chlorid- oder Bromidanion ist, (b) einem ethoxylierten Alkylphenol, wobei die Alkylgruppe 6 bis 12 Kohlenstoffatome aufweist, und die Anzahl an Ethylenoxid in einem Bereich von 10 bis 50 liegt, und (c) einem ethoxylierten Alkohol, dargestellt durch folgende Molekularstruktur: R1-R2-(CH2CH2O)n-H wobei R1 eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen ist, R2 -O- ist, und n zwischen 20 und 35 liegt, und (d) mindestens einem Salz in einer Menge, um die Leitfähigkeit der lytischen Reagenszusammensetzung derart einzustellen, daß diese für eine Impedanzmessung ausreichend ist.A lytic reagent composition for lysing red blood cells and for measuring nucleated blood cells comprising an aqueous solution of (a) at least one quaternary ammonium salt represented by the following molecular structure:
Figure 00310001
wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group having 12 to 16 carbon atoms, R 2 , R 3 and R 4 are alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, and X - is a chloride or bromide anion, (b) an ethoxylated alkylphenol, wherein the alkyl group has 6 to 12 carbon atoms and the number of ethylene oxide is in a range of 10 to 50, and (c) an ethoxylated alcohol represented by the following molecular structure: R 1 -R 2 - (CH 2 CH 2 O) n -H wherein R 1 is an alkyl, alkenyl or alkynyl group of 10 to 22 carbon atoms, R 2 is -O-, and n is between 20 and 35, and (d) at least one salt in an amount to increase the conductivity of the lytic reagent composition set so that it is sufficient for an impedance measurement. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Salz aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen von Sulfat, Chlorid, Phosphat oder Citrat, ausgewählt ist.A lytic reagent composition according to claim 20, wherein the salt is selected from the group consisting of alkali metal salts of sulfate, chloride, phosphate or citrate. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die lytische Reagenszusammensetzung weiter einen organischen Liganden in einer ausreichenden Menge umfaßt, um ein stabiles Chromogen mit Hämoglobin zum Messen der Hämoglobinkonzentration einer Blutprobe zu bilden.A lytic reagent composition according to claim 20, wherein the lytic reagent composition further comprises an organic Ligand in an amount sufficient to provide a stable chromogen hemoglobin for measuring hemoglobin concentration to make a blood test. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der organische Ligand aus der Gruppe, bestehend aus (a) Tetrazol und dessen Derivaten, (b) Imidazol und dessen Derivaten, (c) Chinaldinsäure und (d) Benzoesäure und Alkalimetallsalzen von Benzoesäure, ausgewählt ist.A lytic reagent composition according to claim 22, wherein the organic ligand is selected from the group consisting of (a) tetrazole and its derivatives, (b) imidazole and its derivatives, (c) quinaldic acid and (d) benzoic acid and alkali metal salts of benzoic acid. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das quartäre Ammoniumsalz Tetradecyltrimethylammoniumbromid ist.A lytic reagent composition according to claim 20, being the quaternary Ammonium salt is tetradecyltrimethylammonium bromide. Lytische Reagenszusammensetzung nach Anspruch 20, wobei die zellkernhaltigen Blutkörperchen zellkernhaltige rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen umfassen.A lytic reagent composition according to claim 20, wherein the coronary corpuscles containing nucleated Red blood cells and white blood corpuscle include.
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