DE60222842T2 - Method for the phenotypic and genotypic determination of the drug sensitivity of HIV intergase variants - Google Patents

Method for the phenotypic and genotypic determination of the drug sensitivity of HIV intergase variants Download PDF

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DE60222842T2 DE2002622842 DE60222842T DE60222842T2 DE 60222842 T2 DE60222842 T2 DE 60222842T2 DE 2002622842 DE2002622842 DE 2002622842 DE 60222842 T DE60222842 T DE 60222842T DE 60222842 T2 DE60222842 T2 DE 60222842T2
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Produkte zur Auswertung der Behandlung des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV – human immunodeficiency virus). Insbesondere werden molekulare Ereignisse an HIV-Integrase und ihre Wirkung auf die therapeutische Wirksamkeit von Arzneistoffen bestimmt. Geeigneterweise werden die Ereignisse durch Genotypisierung oder Phänotypisierung der HIV-Integrase analysiert. Die hierin beschriebenen Verfahren und Produkte finden Anwendung in einer Vielzahl von Gebieten, einschließlich Diagnostik, Arzneistoff-Screening, Pharmakogenetik und Arzneistoffentwicklung.The The present invention relates to methods and products for evaluation the treatment of human immunodeficiency virus (HIV - human immunodeficiency virus). In particular, molecular events HIV integrase and its effect on therapeutic efficacy determined by drugs. Suitably, the events by genotyping or phenotyping analyzed the HIV integrase. The methods described herein and products are used in a variety of fields, including diagnostics, Drug Screening, Pharmacogenetics, and Drug Development.

Zur Bekämpfung der HIV-Infektion wurden mehrere unterschiedliche Behandlungsregime entwickelt. Da jedoch das HIV-Virus schnell mutiert, kann es, weil die Reverse Transkriptase (RT), die das genetische Material dupliziert, keine Korrekturlese-Leistungsfähigkeit aufweist, den Wirkungen von Arzneistoffen oder Arzneistoffkombinationen, die dagegen eingesetzt werden, entgegenwirken. Die derzeitige HIV-Chemotherapie umfasst Inhibitoren der Reverse Transkriptase-(RT) und Proteaseenzyme. Trotz der Entwicklung neuartiger Klassen von Inhibitoren und komplexer Arzneistoffregime, nimmt die Arzneistoffresistenz zu. Somit sind ständig neue Arten von Anti-HIV-Arzneistoffen erforderlich. Die Entwicklung von Verbindungen, die andere HIV-Genprodukte in vivo hemmen, wie die Hülle, tat und Integrase (IN), ist ein Schlüsselbereich der Untersuchung.to fight The HIV infection has several different treatment regimens developed. However, since the HIV virus mutates rapidly, it may be because the reverse transcriptase (RT), which duplicates the genetic material, no proofreading efficiency having the effects of drugs or drug combinations, which are used against counteract. Current HIV chemotherapy includes Inhibitors of reverse transcriptase (RT) and protease enzymes. In spite of the development of novel classes of inhibitors and more complex Drug regime, drug resistance increases. Thus are constantly new types of anti-HIV drugs are needed. The development of compounds that inhibit other HIV gene products in vivo, such as the case, tat and Integrase (IN), is a key area of investigation.

Das Integraseprotein stellt ein Ziel für die HIV-Inhibitorforschung dar. HIV-Integrase ist für die Integration des Virusgenoms in das Genom der Wirtszelle, einem Schritt im replikativen Zyklus des Virus, erforderlich. Es handelt sich dabei um ein Protein mit etwa 32 kDa, das durch das pol-Gen codiert wird, und es wird in vivo durch Proteasespaltung des gag-pol-Vorläuferproteins während der Erzeugung von Viruspartikeln erzeugt. Der Integrationsprozess erfolgt im Anschluss an die Reverse Transkription der Virus-RNA. Als erstes bindet sich die Virusintegrase an die Virus-DNA und entfernt zwei Nukleotide vom 3'-Ende der LTR(lang terminal repeat)-Virussequenzen auf jedem Strang. Dieser Schritt wird Verarbeitung des 3'-Endes genannt und findet im Zytoplasma innerhalb eines Nukleoproteinkomplexes mit der Bezeichnung Präintegrationskomplex (PIC – pre-integration complex) statt. Zweitens werden in einem Strangtransfer genannten Prozess die beiden Stränge der Zell-DNA, in welche die Virus-DNA eingefügt wird, d. h. die Ziel-DNA, versetzt gespalten. Die 3'-Enden der Virus-DNA werden an die 5'-Enden der gespaltenen Ziel-DNA ligiert. Abschließend werden verbleibende Lücken repariert, wahrscheinlich durch Wirtsenzyme.The Integrase protein represents a target for HIV inhibitor research dar. HIV integrase is for the integration of the viral genome into the genome of the host cell, a Step in the replicative cycle of the virus, required. It deals this is a protein of about 32 kDa, which is due to the pol gene It is encoded in vivo by protease cleavage of the gag-pol precursor protein while produced by the production of virus particles. The integration process occurs following the reverse transcription of the viral RNA. First, the viral integrase binds to the viral DNA and removes it two nucleotides from the 3 'end the LTR (long terminal repeat) virus sequences on every strand. This step is called processing of the 3'-end and is found in the cytoplasm within a nucleoprotein complex the name Präintegrationskomplex (PIC - pre-integration complex). Second, are called in a strand transfer Process the two strands the cell DNA, in which inserted the viral DNA is, d. H. the target DNA, spiked. The 3 'ends of the viral DNA are attached to the 5 'ends of the split Target DNA ligated. Finally will be remaining gaps repaired, probably by host enzymes.

Mit der steigenden Anzahl zur Verfügung stehender Anti-HIV-Verbindungen wird auch die Anzahl potentieller Behandlungsprotokolle für mit HIV infizierte Patienten weiter zunehmen. Viele der derzeit verfügbaren Verbindungen werden als Teil einer Kombinationstherapie verabreicht. Die hohe Komplexität der Behandlungsoptionen gekoppelt mit der Fähigkeit des Virus, Resistenz gegen HIV-Inhibitoren zu entwickeln, erfordert die häufige Bewertung der Behandlungsstrategien. Die Fähigkeit, die replikative Leistungsfähigkeit von Viren bei Patienten, die einem Arzneistoffregime unterzogen werden, genau zu überwachen, und diese Daten zum Modifizieren der Dosen oder Kombinationen von Inhibitoren zu verwenden, ermöglicht es Medizinern, die Bildung von Arzneistoff-resistentem Virus wirksam zu reduzieren und eine optimal zugeschnittene Behandlung für jeden Patienten bereitzustellen.With the increasing number available standing anti-HIV compounds is also the number of potential treatment protocols for HIV infected patients continue to increase. Many of the currently available connections are administered as part of a combination therapy. The height complexity the treatment options coupled with the virus's ability to resist to develop against HIV inhibitors requires frequent evaluation the treatment strategies. The ability, the replicative efficiency of viruses in patients who underwent a drug regime to be closely monitored, and these data for modifying doses or combinations of Allows to use inhibitors It medicines, the formation of drug-resistant virus effective to reduce and optimally tailored treatment for each To provide patients.

Es wurden hochentwickelte Patientenüberwachungstechniken zum Analysieren aktueller Therapien entwickelt, wie z. B. Antivirogram® (beschrieben in WO 97/27480 und US-Patentschrift Nr. 6,221,578 B1 ) und PhenosenseTM ( WO 97/27319 ). Diese Zell-basierten Assays bestimmen die Resistenz des im Patienten befindlichen Virus gegenüber einem definierten Arzneistoffregime durch die Bereitstellung von Informationen über die Suszeptibilität des Virenstammes des Patienten gegenüber der Behandlung basierend auf Protease- und Reverse Transkriptase-Inhibitorbehandlung. Zu weiteren Überwachungsstrategien zählen immunologische Mittel oder Sequenzierungstechniken.Sophisticated patient monitoring techniques have been developed to analyze current therapies, such as: B. Antivirogram ® (described in WO 97/27480 and U.S. Patent No. 6,221,578 B1 ) and Phenosense ™ ( WO 97/27319 ). These cell-based assays determine the resistance of the patient's virus to a defined drug regime by providing information about the susceptibility of the patient's virus strain to treatment based on protease and reverse transcriptase inhibitor treatment. Other monitoring strategies include immunological agents or sequencing techniques.

Das Antivirogram®- und das GenseqTM-Assay bestimmen den Phänotyp bzw. den Genotyp der Reverse Transkriptase- und Protease-Gene eines Patienten. Die relevanten Codierungsbereiche werden aus Patientenproben erhalten, revers transkribiert und durch Polymerasekettenreaktion (PCR – polymerase chain reaction) amplifiziert. Innerhalb der Lymphozytenzellen werden die relevanten Codierungsbereiche mit Virusdeletionskonstrukten kombiniert, um chimäre Viren zu erzeugen. Die Fähigkeit dieser chimären Viren, in Zellen in Kultur einzudringen und diese abzutöten, wird in Gegenwart von HIV Reverse Transkriptase- und Protease-Inhibitoren bewertet. Es kann eine Datenbank, die phänotypische und genotypische Informationen kombiniert, entwickelt werden, wie in WO 00/73511 beschrieben.The Antivirogram ® - and Genseq ™ assay to determine the phenotype and the genotype of the reverse transcriptase and protease genes of a patient. The relevant coding regions are obtained from patient samples, reverse transcribed and amplified by polymerase chain reaction (PCR). Within the lymphocyte cells, the relevant coding regions are combined with virus deletion constructs to generate chimeric viruses. The ability of these chimeric viruses to invade and kill cells in culture is assessed in the presence of HIV reverse transcriptase and protease inhibitors. A database combining phenotypic and genotypic information can be developed, as in WO 00/73511 described.

Während Phänotypisierungs- und Genotypisierungs-Assays wie Antivirogram® und GenseqTM für Reverse Transkriptase- und Protease-Gene entwickelt wurden, konnten keine Protokolle für die Auswertung der Arzneistoffresistenz am Integrasegen entwickelt werden.While phenotyping and genotyping assays such as Antivirogram ® and TM Genseq for Re Since transcriptase and protease genes have been developed, no protocols for the evaluation of drug resistance on the integrase gene have been developed.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNGDETAILED DESCRIPTION THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung stellt Techniken zur Auswertung der Humanen Immundefizienz (HIV)-Arzneistoffwirksamkeit bereit. Es werden Assays für Wildtyp- oder Mutanten-HIV-Integrase bereitgestellt, unter Verwendung eines Primersatzes, der für die Amplifizierung und Analyse des genetischen Materials des HIV ausgelegt ist. Die Bewertung der im Patienten befindlichen Virusintegrase führt zu einer besseren Vorhersage der Arzneistoffe, die für die Behandlung der Stämme, die in dem infizierten Individuum vorliegen, geeignet sind. Die Protokolle und Produkte können für diverse diagnostische, klinische, toxikologische, forensische und Forschungszwecke, einschließlich Arzneistoffentwicklung, Entwicklung einer Patiententherapie, Arzneistoffwirksamkeitstests und Patientenmanagement verwendet werden. Die hierin beschriebenen Assays können in Kombination mit anderen Assays verwendet werden. Die Ergebnisse können in Computermodelle und Datenbanken implementiert werden. Die hierin beschriebenen Produkte können in Kits eingefügt werden.The The present invention provides techniques for human evaluation Immunodeficiency (HIV) drug efficacy ready. There will be assays for wild-type or mutant HIV integrase provided using a Primer set for the amplification and analysis of the genetic material of HIV is designed. The evaluation of the viral integrase present in the patient leads to a better prediction of the drugs necessary for the treatment of the strains present in the infected individual. The protocols and products can for various diagnostic, clinical, toxicological, forensic and research purposes, including Drug development, development of patient therapy, drug efficacy tests and patient management. The ones described herein Assays can used in combination with other assays. The results can be implemented in computer models and databases. The herein described products can inserted in kits become.

Die vorliegende Offenbarung beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einer Behandlung, umfassend: i) die Verwendung wenigstens einer HIV-RNA-Probe, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; ii) reverses Transkribieren und Amplifizieren der HIV-RNA mit Primern, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifisch sind, um wenigstens ein DNA-Konstrukt zu erhalten, welches das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; iii) das Herstellen wenigstens eines rekombinanten Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem amplifizierten wenigstens einen DNA-Konstrukt und einem Plasmid, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms umfasst, und iv) das Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einer Behandlung durch die Überwachung des wenigstens einen rekombinanten Virus in Gegenwart der wenigstens einen Behandlung.The The present disclosure describes a method of determination the susceptibility at least one HIV virus at least one treatment comprising: i) the use of at least an HIV RNA sample, wherein the sample comprises at least one IN gene or includes a part thereof; ii) reverse transcription and amplification HIV RNA with primers used for are specific to the IN region of the HIV genome, at least one DNA construct too obtained, which comprises the at least one IN gene or a part thereof; iii) producing at least one recombinant virus by homologous Recombination or ligation between the amplified at least a DNA construct and a plasmid containing the wild-type HIV sequence comprising a deletion in the IN region of the HIV genome, and iv) determining the phenotypic susceptibility at least one HIV virus at least one treatment by monitoring the at least one recombinant virus in the presence of the at least one treatment.

Insbesondere beschreibt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Bestimmung der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, umfassend: i) die Verwendung wenigstens einer HIV-RNA- haltigen Probe, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; ii) reverses Transkribieren und Amplifizieren der HIV-RNA mit Primern, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifisch sind, um wenigstens ein Amplifikat zu erhalten, welches das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; iii) die Verwendung von Nukleinsäureamplifikation zum Erzeugen eines Plasmids, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms umfasst; iv) das Herstellen wenigstens eines rekombinanten Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem Plasmid, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfasst, und v) das Überwachen des wenigstens einen rekombinanten Virus in Gegenwart der wenigstens einen Behandlung, um die phänotypische Suszeptibilität des wenigstens einen HIV-Virus gegenüber dem wenigstens einen Arzneistoff zu bestimmen.Especially The present disclosure describes a method of determination the susceptibility at least one HIV virus at least one drug comprising: i) the use of at least an HIV-RNA-containing A sample, wherein the sample is at least one IN gene or part thereof includes; ii) reverse transcription and amplification of HIV RNA with primers for are specific to the IN region of the HIV genome, at least one To obtain amplificate containing the at least one IN gene or includes a part thereof; iii) the use of nucleic acid amplification for generating a plasmid containing the wild type HIV sequence a deletion in the IN region of the HIV genome comprises; iv) manufacturing at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplificate and a plasmid containing the wild-type HIV sequence with a deletion in the IN area, and v) monitoring the at least one recombinant virus in the presence of the at least one treatment, around the phenotypic susceptibility of at least one HIV virus across from to determine the at least one drug.

Reverse Transkription und Amplifikation können mit einem einzelnen Primersatz erfolgen. Alternativ dazu kann mehr als ein Primersatz in einem halbverschachtelten Ansatz verwendet werden, um das genetische Material revers zu transkribieren und zu amplifizieren. Insbesondere wird mehr als ein Primersatz bei einem verschachtelten Ansatz verwendet. Im Anschluss an die Erzeugung des rekombinanten Konstruktes kann das chimäre Virus gezüchtet und der Virustiter (ausgedrückt als Multiplizität der Infektion – MOI [multiplicity of infection]) bestimmt werden, bevor mit der Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität fortgefahren wird. Das Indikatorgen, welches ein Signal codiert, das die Replikation des Virus in Gegenwart eines Arzneistoffes oder die Suszeptibilität des Virus in Gegenwart eines Arzneistoffes anzeigt, kann in den Kulturzellen wie MT4-Zellen vorliegen. Außerdem kann das Indikatorgen in das chimäre Konstrukt eingefügt sein, das in die Kulturzellen eingeführt wurde, oder es kann separat einge führt sein. Geeignete Indikatorgene codieren fluoreszierende Proteine, insbesondere grünes fluoreszierendes Protein oder Mutanten davon. Um die homologe Rekombination zuzulassen, kann genetisches Material in die Zellen eingeführt werden, und zwar unter Verwendung einer Vielzahl in der Technik bekannter Techniken, einschließlich Calciumphosphatpräzipitation, Liposome, Virusinfektion und Elektroporation. Die Überwachung kann mit hohem Durchsatz erfolgen.Reverse Transcription and amplification can be achieved with a single primer set respectively. Alternatively, more than one set of primers in one Semi-nested approach used to make the genetic material reverse transcribed and amplified. In particular, will used more than one primer set in a nested approach. Following the generation of the recombinant construct, the chimera Virus bred and virus titer (expressed as multiplicity the infection - MOI [multiplicity of infection]) before determining the phenotypic susceptibility is continued. The indicator gene encoding a signal the replication of the virus in the presence of a drug or the susceptibility of the virus in the presence of a drug can be found in the Cultured cells such as MT4 cells are present. In addition, the indicator gene in the chimera Construct inserted that was introduced into the culture cells or it can be done separately introduced be. Suitable indicator genes encode fluorescent proteins, especially green fluorescent protein or mutants thereof. To the homologous recombination allow genetic material to be introduced into the cells using a variety of techniques known in the art Techniques, including calcium phosphate precipitation, Liposomes, viral infection and electroporation. The supervision can be done with high throughput.

Ein humanes Immundefizienzvirus (HIV), wie hierin verwendet, betrifft jedes HIV, einschließlich Labor-HIV-Stämme, Wildtyp-HIV-Stämme, Mutanten-HIV-Stämme und jede biologische Probe, die wenigstens ein HIV-Virus umfasst, wie zum Beispiel ein klinisches HIV-Isolat. HIV-Stämme, die mit der vorliegenden Erfindung kompatibel sind, sind alle solchen Stämme, die in der Lage sind, Säugetiere, insbesondere Menschen zu infizieren. Beispiele sind HIV-1 und HIV-2. Für die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung betrifft ein HIV-Virus jede Probe, die wenigstens ein HIV-Virus umfasst. So wie zum Beispiel ein Patient HIV-Viren mit unterschiedlichen Mutationen im Integrase-(IN)-Gen in seinem Körper aufweisen kann. Es versteht sich, dass eine Probe eine Vielzahl unterschiedlicher HIV-Viren enthalten kann, die unterschiedliche Mutationenprofile im IN-Gen enthalten. Eine Probe kann zum Beispiel aus einem Individuum erhalten werden, aus Zellkulturen, oder sie kann unter Verwendung einer Rekombinationstechnologie oder Klonen erzeugt werden. HIV-Stämme, die mit der vorliegenden Erfindung kompatibel sind, sind alle solchen Stämme, die in der Lage sind, Säugetiere, insbesondere Menschen zu infizieren. Die zum Erhalt eines Plasmids verwendeten Virusstämme sind vorzugsweise HIV-Wildtypsequenzen wie LAI oder HXB2D. LAI, auch bekannt als IIIB, ist ein Wildtyp-HIV-Stamm. Ein bestimmter Klon davon, d. h. eine Sequenz, ist HXB2D. Diese Sequenz kann in ein Plasmid eingefügt werden.A human immunodeficiency virus (HIV), as used herein, refers to any HIV, including laboratory HIV strains, wild-type HIV strains, mutant HIV strains, and any biological sample that includes at least one HIV virus, such as a clinical HIV isolate. HIV strains compatible with the present invention are all those strains capable of infecting mammals, especially humans. Examples are HIV-1 and HIV-2. For the practice of the present invention an HIV virus any sample that includes at least one HIV virus. For example, a patient may have HIV viruses with different mutations in the integrase (IN) gene in his body. It is understood that a sample may contain a variety of different HIV viruses that contain different mutation profiles in the IN gene. For example, a sample can be obtained from an individual, from cell cultures, or it can be generated using recombinant technology or cloning. HIV strains compatible with the present invention are all those strains capable of infecting mammals, especially humans. The virus strains used to obtain a plasmid are preferably HIV wild-type sequences such as LAI or HXB2D. LAI, also known as IIIB, is a wild-type HIV strain. One particular clone thereof, ie a sequence, is HXB2D. This sequence can be inserted into a plasmid.

Anstelle von Virus-RNA kann auch HIV-DNA, z. B. Provirus-DNA, für die hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Wenn RNA verwendet wird, ist reverse Transkription in DNA durch eine geeignete Reverse Transkriptase erforderlich. Die Protokolle, welche die Analyse von RNA beschreiben, sind auch für die DNA-Analyse geeignet. Wenn ein Protokoll jedoch von DNA ausgeht, wird der Fachmann auf dem Gebiet wissen, dass keine reverse Transkription erforderlich ist. Die zum Amplifizieren des RNA-Stranges ausgelegten Primer verschmelzen auch mit und amplifizieren DNA. Reverse Transkription und Amplifikation können mit einem einzelnen Primersatz erfolgen. Geeigneterweise kann ein halbverschachtelter, und noch geeigneter ein verschachtelter Ansatz verwendet werden, um das genetische Material revers zu transkribieren und zu amplifizieren.Instead of viral RNA may also include HIV DNA, e.g. Proviral DNA for which herein described methods are used. When RNA is used, is reverse transcription into DNA by a suitable reverse transcriptase required. The protocols that describe the analysis of RNA, are also for the DNA analysis suitable. However, if a protocol starts from DNA, the skilled person will Know in the field that no reverse transcription is required is. The primers designed to amplify the RNA strand fuse also with and amplify DNA. Reverse transcription and amplification can with a single primer set. Suitably, a half-nested, and more appropriately a nested approach used to reverse transcribe the genetic material and to amplify.

Somit kann das Phänotypisierungsverfahren der vorliegenden Offenbarung auch Folgendes umfassen: i) die Verwendung wenigstens einer HIV-DNA-haltigen Probe, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; ii) das Amplifizieren der HIV-DNA mit Primern, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifisch sind, um wenigstens ein Amplifikat zu erhalten, welches das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; iii) das Erzeugen eines Plasmids, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfasst; iv) das Herstellen wenigstens eines rekombinanten Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem Plasmid, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfasst, und v) das Überwachen des wenigstens einen rekombinanten Virus in Gegenwart des wenigstens einen Arzneistoffes zum Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff.Consequently can the phenotyping method the present disclosure also includes i) the use at least one HIV DNA-containing sample, the sample at least an IN gene or a part thereof; ii) amplification of HIV DNA with primers used for are specific to the IN region of the HIV genome, at least one To obtain amplificate containing the at least one IN gene or includes a part thereof; iii) generating a plasmid which the wild-type HIV sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, includes; iv) producing at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplificate and a plasmid containing the wild-type HIV sequence with a Deletion in the IN area, and v) monitoring the at least one recombinant virus in the presence of the at least one drug for determining the phenotypic susceptibility at least one HIV virus at least one drug.

Nukleinsäure kann durch Techniken wie Polymerasekettenreaktion (PCR), Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA – nucleic acid sequence based amplification), selbstunterhaltende Sequenzreplikation (3SR – self-sustained sequence replication), transkriptionsbasierte Amplifikation (TAS – transcription based amplification), Ligationskettenreaktion (LCR – ligation chain reaction) amplifiziert werden. Häufig kommt PCR zum Einsatz.Nucleic acid can by techniques such as polymerase chain reaction (PCR), nucleic acid sequence-based Amplification (NASBA - nucleic acid sequence based amplification), self-sustained sequence replication (3SR - self-sustained sequence replication), transcription based amplification (TAS - transcription based amplification), ligation chain reaction (LCR) be amplified. Often PCR is used.

Jede Art von Patientenprobe kann verwendet werden, um das Integrasegen zu erhalten, wie zum Beispiel Serum und Gewebe. Virus-RNA kann unter Verwendung bekannter Verfahren, wie in Boom, R. et al. (J. Clin. Microbiol. 28(3): 495–503 (1990)) beschrieben, isoliert werden. Alternativ dazu kann eine Reihe kommerzieller Verfahren wie das QIAAMP® Virus-RNA-Kit (Qiagen, Inc.) verwendet werden, um Virus-RNA aus Körperfluiden wie Plasma, Serum oder zellfreien Fluiden zu erhalten. DNA kann durch in der Technik bekannte Verfahren (z. B. Maniatis, 1989) und kommerzielle Verfahren (z. B. Qiagen) erhalten werden.Any type of patient sample can be used to obtain the integrase gene, such as serum and tissue. Viral RNA can be synthesized using known methods as described in Boom, R. et al. (J. Clin. Microbiol. 28 (3): 495-503 (1990)). Alternatively can be used a number of commercial methods such as the QIAamp ® viral RNA kit (Qiagen Inc.,) to obtain viral RNA from bodily fluids such as plasma, serum, or cell-free fluids. DNA can be obtained by methods known in the art (e.g., Maniatis, 1989) and commercial methods (e.g., Qiagen).

Die komplette Integrase (IN) oder ein Teil des IN-Gens können verwendet werden. Das komplette IN-Gen umfasst 864 Nukleotide (nt), die eine Integrase mit einer Länge von 288 Aminosäuren codieren. Ein Teil des IN-Gens ist als ein Fragment des IN-Gens definiert, das aus dem im Patienten befindlichen Virus, aus Laborviren, einschließlich IIIB und NL4-3, oder Mutantenviren gewonnen wird. Dieses Fragment umschließt nicht die kompletten 864 Nukleotide. Das Fragment kann direkt von seiner Quelle erhalten werden, einschließlich einer Patientenprobe, oder es kann unter Verwendung von molekularbiologischen Werkzeugen im Anschluss an die Gewinnung der kompletten IN-Sequenz erhalten werden. Amplifikat betrifft das amplifizierte, und wo nötig revers transkribierte Integrasegen oder einen Teil davon. Es ver steht sich, dass diese IN auch einen anderen Ursprung haben kann, einschließlich Plasmide und Patientenmaterial. Geeigneterweise wird das Amplifikat aus Patientenmaterial erhalten. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird das Amplifikat gelegentlich als „DNA-Konstrukt" bezeichnet. Eine Virussequenz kann eine oder mehrere Mutationen im Vergleich zur Übereinstimmungsreferenzsequenz, die durch K03455 angegeben ist, enthalten. Die Sequenz K03455 liegt bei Genbank vor und ist über das Internet erhältlich. Eine einzelne Mutation oder eine Kombination von IN-Mutationen kann zu einer Veränderung in der Arzneistoffwirksamkeit korrelieren. Diese Korrelation kann eine veränderte, d. h. verringerte oder erhöhte Suszeptibilität des Virus gegenüber einem Arzneistoff anzeigen. Die Mutationen können auch die Virus-Fitness beeinflussen.The complete integrase (IN) or part of the IN gene can be used. The complete IN gene comprises 864 nucleotides (nt) that encode an integrase with a length of 288 amino acids. A portion of the IN gene is defined as a fragment of the IN gene derived from the patient's virus, laboratory viruses, including IIIB and NL4-3, or mutant viruses. This fragment does not enclose the complete 864 nucleotides. The fragment can be obtained directly from its source, including a patient sample, or it can be obtained using molecular biological tools following recovery of the complete IN sequence. Amplificate refers to the amplified and, where necessary, reverse transcribed integrase gene or a part thereof. It is understood that this IN can also have a different origin, including plasmids and patient material. Suitably, the amplificate is obtained from patient material. For the purposes of the present invention, the amplicon is sometimes referred to as a "DNA construct." A viral sequence may contain one or more mutations compared to the match reference sequence given by K03455 The sequence K03455 is available from Genbank and available on the Internet A single mutation or combination of IN mutations may correlate to a change in drug efficacy, and this correlation may indicate an altered, ie decreased or increased, susceptibility of the virus to a drug. The mutations can also affect the virus fitness.

„Chimär" bedeutet ein Konstrukt, welches Nukleinsäurematerial unterschiedlichen Ursprungs umfasst, wie zum Beispiel eine Kombination aus Wildtyp-HIV mit einem Labor-HIV-Virus oder eine Kombination aus Wildtyp-HIV-Sequenz und vom Patienten abgeleitete HIV-Sequenz."Chimera" means a construct which nucleic acid material of different origin, such as a combination from wild-type HIV with a laboratory HIV virus or a combination from wild-type HIV sequence and patient-derived HIV sequence.

Ein „Arzneistoff" steht für jeden Wirkstoff wie ein Chemotherapeutikum, Peptid, Antikörper, Antisense, Ribozym und jede Kombination davon. Zu Beispielen von Arzneistoffen zählen Proteaseinhibitoren einschließlich Ritonavir, Amprenavir, Nelfinavir; Reverse Transkriptase-Inhibitoren wie Nevirapin, Delavirdin, AZT, Zidovudin, Didanosin; Integraseinhibitoren oder Wirkstoffe, welche die Hülle beeinträchtigen (wie zum Beispiel T-20, T-1249). Behandlung oder Behandlungsregime bezieht sich auf das therapeutische Management eines Individuums durch die Verabreichung von Arzneistoffen. Unterschiedliche Arzneistoffdosierungen, Verabreichungsschemata, Verabreichungswege und Kombinationen können zum Behandeln eines Individuums verwendet werden.A "drug" stands for everyone Active ingredient such as a chemotherapeutic, peptide, antibody, antisense, ribozyme and every combination of them. Examples of drugs include protease inhibitors including Ritonavir, amprenavir, nelfinavir; Reverse transcriptase inhibitors such as nevirapine, delavirdine, AZT, zidovudine, didanosine; integrase or agents which the shell impair (such as T-20, T-1249). Treatment or treatment regimen refers to that therapeutic management of an individual by administration of drugs. Different drug doses, administration regimens, Routes of administration and combinations may be used to treat an individual be used.

Eine Veränderung in der Virusarzneistoff-Empfindlich keit ist als eine Veränderung in der Suszeptibilität eines Virenstammes gegenüber dem Arzneistoff definiert. Die Suszeptibilitäten werden im Allgemeinen als Verhältnisse von EC50- oder EC90-Werten (wobei der EC50- oder EC90-Wert die Arzneistoffkonzentration ist, bei welcher 50% bzw. 90% der Virenpopulation an der Replikation gehindert werden) eines untersuchten Virenstammes im Vergleich zum Wildtypstamm ausgedrückt. Daher kann die Suszeptibilität eines Virenstammes gegenüber einem bestimmten Arzneistoff als eine Quotientenänderung der Suszeptibilität ausgedrückt werden, wobei die Quotientenänderung zum Beispiel aus dem Verhältnis der EC50-Werte eines Mutantenvirenstammes im Vergleich zu den EC50-Werten des Wildtyps abgeleitet wird. Insbesondere kann die Suszeptibilität eines Virenstammes oder einer Population auch als Resistenz eines Virenstammes ausgedrückt werden, wobei das Ergebnis als ein Quotientenanstieg beim EC50 im Vergleich zum EC50 des Wildtyps angezeigt wird. Der IC50 ist die Arzneistoffkonzentration, bei der 50% der Enzymaktivität gehemmt sind.A change in viral drug susceptibility is defined as a change in the susceptibility of a virus strain to the drug. The susceptibilities are generally referred to as ratios of EC 50 or EC 90 values (where the EC 50 or EC 90 value is the drug concentration at which 50% and 90% of the virus population are prevented from replicating, respectively) of an examined viral strain expressed in comparison to the wild-type strain. Therefore, the susceptibility of a virus strain to a particular drug can be expressed as a susceptibility change in quotient, for example, derived from the ratio of the EC 50 values of a mutant virus strain compared to the wild-type EC 50 values. In particular, the susceptibility of a virus strain or a population can also be expressed as the resistance of a virus strain, the result being indicated as a quotient increase in the EC 50 compared to the EC 50 of the wild-type. The IC 50 is the drug concentration at which 50% of the enzyme activity is inhibited.

Die Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber einem Arzneistoff kann durch das Bestimmen der Zytopathogenität des rekombinanten Virus gegenüber Zellen getestet werden. Im Kontext dieser Erfindung steht die zytopathogene Wirkung für die Lebensfähigkeit der Zellen in der Kultur in Gegenwart chimärer Viren. Die Zellen können aus T-Zellen, Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, Langerhansschen Zellen, Blutbildungsstammzellen oder Vorläuferzellen, MT4-Zellen und PM-1-Zellen ausgewählt werden. Zu geeigneten Wirtszellen für die homologe Rekombination von HIV-Sequenzen zählen MT4 und PM-1. MT4 ist eine CD4+ T-Zelllinie, die den CXCR4-Corezeptor enthält. Die PM-1-Zelllinie exprimiert sowohl den CXCR4- als auch den CCR5-Corezeptor. Alle der oben genannten Zellen sind in der Lage, bei Rekombination der IN-Deletionsvektoren mit IN-Sequenzen, wie denen abgeleitet aus Patientenproben, neue infektiöse Viruspartikel zu erzeugen. So können sie auch zum Testen der zytopathogenen Wirkungen rekombinanter Viren verwendet werden. Die Zytopathogenität kann zum Beispiel durch die Gegenwart eines beliebigen Reportermoleküls, einschließlich Reportergene, überwacht werden. Ein Reportergen ist definiert als ein Gen, dessen Produkt Berichterstattungsfähigkeiten aufweist. Zu geeigneten Reportermolekülen zählen Tetrazoliumsalze, grüne fluoreszierende Proteine, Beta-Galactosidase, Chloramphenicoltransferase, Alkalinphosphatase und Luciferase. Mehrere Verfahren für zytopathogene Tests, einschließlich phänotypische Tests, sind in der Literatur beschrieben, welche das rekombinante Virus-Assay umfassen (Kellam and Larder, Antimicrob. Agents Chemotherap. 1994, 38, 23–30, Hertogs et al. Antimicrob. Agents Chemotherap. 1998, 42, 269–276; Pauwels et al. J. Virol Methods 1988, 20, 309–321).The susceptibility at least one HIV virus A drug may be determined by determining the cytopathogenicity of the recombinant Virus over Cells are tested. In the context of this invention is the cytopathogenic Effect for the viability of the cells in the culture in the presence of chimeric viruses. The cells can take off T cells, monocytes, macrophages, dendritic cells, Langerhans's Cells, hematopoietic stem cells or progenitor cells, MT4 cells and PM-1 cells selected become. To suitable host cells for homologous recombination count of HIV sequences MT4 and PM-1. MT4 is a CD4 + T cell line containing the CXCR4 coreceptor contains. The PM-1 cell line expresses both the CXCR4 and CCR5 coreceptors. All of the above cells are capable of recombination of IN deletion vectors with IN sequences, such as those derived from patient samples to generate new infectious virus particles. So can also for testing the cytopathogenic effects of recombinant viruses be used. Cytopathogenicity can be achieved, for example, by the Presence of any reporter molecule, including reporter genes, monitored become. A reporter gene is defined as a gene whose product reporting capabilities having. Suitable reporter molecules include tetrazolium salts, green fluorescent Proteins, beta-galactosidase, Chloramphenicol transferase, alkaline phosphatase and luciferase. Several Procedure for Cytopathogenic tests, including phenotypic Tests are described in the literature describing the recombinant Virus assay include (Kellam and Larder, Antimicrob. Agents Chemotherap. 38, 23-30, Hertogs et al. Antimicrob. Agents chemotherapy. 1998, 42, 269-276; Pauwels et al. J. Virol Methods 1988, 20, 309-321).

Die Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff kann durch die replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart wenigstens eines Arzneistoffes relativ zur replikativen Leistungsfähigkeit eines HIV-Virus mit einer Wildtyp-IN-Gensequenz bestimmt werden. Replikative Leistungsfähigkeit steht für die Fähigkeit des Virus oder chimären Konstruktes unter Kulturbedingungen zu wachsen. Dies wird gelegentlich als Virus-Fitness bezeichnet. Die Kulturbedingungen können Auslöser enthalten, welche das Wachstum des Virus beeinflussen, wobei Arzneistoffe Beispiele dafür sind. Die Verfahren zum Bestimmen der Suszeptibilität können für die Entwicklung eines Behandlungsregimes für einen mit HIV infizierten Patienten von Nutzen sein. Zum Beispiel kann ein Verfahren das Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit eines klinischen Isolats eines Patienten und das Verwenden der replikativen Leistungsfähigkeit zum Bestimmen eines entsprechenden Arzneistoffregimes für den Patienten aufweisen. Ein Ansatz ist das Antivirogram®-Assay.The susceptibility of at least one HIV virus to at least one drug may be determined by the replicative potency of the recombinant virus in the presence of at least one drug relative to the replicative potency of an HIV virus with a wild-type IN gene sequence. Replicative efficiency stands for the ability of the virus or chimeric construct to grow under culture conditions. This is sometimes referred to as virus fitness. The culture conditions may include triggers that affect the growth of the virus, with drugs being examples thereof. The methods for determining susceptibility may be useful in the development of a treatment regimen for a HIV-infected patient. For example, a method may include determining the replicative performance of a clinical isolate of a patient and using the replicative capability to determine a corresponding drug regimen for the patient. One approach is to Antivirogram ® assay.

Die IN-Phänotypisierungsassays der vorliegenden Erfindung können mit hohem Durchsatz durchgeführt werden, zum Beispiel unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die eine Vielzahl von Anti-HIV-Arzneistoffen enthält. Die vorliegenden Assays können verwendet werden, um den Einfluss von Änderungen am HIV-IN-Gen auf jede Art von Arzneistoff, der zum Behandeln von HIV von Nutzen ist zu analysieren. Zu Beispielen von Anti-HIV-Arzneistoffen, die in diesem Assay getestet werden können, zählen Nukleosid- und Nicht-Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, Nukleotid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren, Proteaseinhibitoren, Membranfusionsinhibitoren und Integraseinhibitoren, jedoch wird der Fachmann auf dem Gebiet verstehen, dass auch andere Arten von Antivirusverbindungen getestet werden können. Die Ergebnisse können durch mehrere Ansätze überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Morphologie-Screening, Mikroskopie und optische Verfahren, wie zum Beispiel Absorbanz und Fluoreszenz. In diesen Assays kann ein IC50-Wert für jeden Arzneistoff erhalten und verwendet werden, um die virale replikative Leistungsfähigkeit in Gegenwart des Arzneistoffes zu bestimmen. Neben dem IC50 können z. B. auch der IC90 oder EC50 (effektive Konzentrationen) verwendet werden. Die replikative Leistungsfähigkeit der Viren kann mit der eines Wildtyp-HIV-Virus verglichen werden, um einen relativen replikativen Leistungsfähigkeitswert zu bestimmen. Daten aus phänotypischen Assays können ferner verwendet werden, um das Verhalten eines bestimmten HIV-Isolats gegenüber einem gegebenen Arzneistoff basierend auf seinem Genotyp vorherzusagen.The IN phenotyping assays of the present invention can be performed at high throughput, for example, using a microtiter plate containing a variety of anti-HIV drugs contains fen. The present assays can be used to analyze the effect of changes in the HIV-IN gene on any type of drug useful for treating HIV. Examples of anti-HIV drugs that can be tested in this assay include nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, nucleotide reverse transcriptase inhibitors, protease inhibitors, membrane fusion inhibitors, and integrase inhibitors, however those skilled in the art will recognize Understand the field that other types of antivirus compounds can be tested. The results may be monitored by several approaches including, but not limited to, morphology screening, microscopy, and optical methods such as absorbance and fluorescence. In these assays, an IC 50 value for each drug can be obtained and used to determine viral replicative potency in the presence of the drug. In addition to the IC 50 z. As well as the IC 90 or EC 50 (effective concentrations) can be used. The replicative efficacy of the viruses can be compared to that of a wild-type HIV virus to determine a relative replicative performance value. Data from phenotypic assays can also be used to predict the behavior of a particular HIV isolate against a given drug based on its genotype.

Die Assays der vorliegenden Erfindung können zur therapeutischen Arzneistoffüberwachung verwendet werden. Der Ansatz enthält eine Kombination aus Suszeptibilitätstests, Bestimmung des Arzneistoffniveaus und Bewertung eines Schwellenwertes. Der Schwellenwert kann aus populationsbasierter pharmakokinetischer Modellierung abgeleitet sein ( WO 02/23186 ). Der Schwellenwert ist eine Arzneistoffkonzentration, die benötigt wird, um eine günstige therapeutische Wirkung in vivo zu erzielen. Das in vivo Arzneistoffniveau kann unter Verwendung von Techniken wie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Flüssigkeitschromatographie, Massenspektroskopie oder Kombinationen davon bestimmt werden. Die Suszeptibilität des Virus kann aus der Phänotypisierung oder Interpretation von Genotypisierungsergebnissen, d. h. virtuelle Phänotypisierung, abgeleitet werden ( WO 01/79540 ).The assays of the present invention can be used for therapeutic drug monitoring. The approach contains a combination of susceptibility tests, determination of drug levels and evaluation of a threshold. The threshold may be derived from population-based pharmacokinetic modeling ( WO 02/23186 ). The threshold is a drug concentration needed to achieve a beneficial in vivo therapeutic effect. The in vivo drug level can be determined using techniques such as high performance liquid chromatography, liquid chromatography, mass spectroscopy, or combinations thereof. The susceptibility of the virus can be deduced from the phenotyping or interpretation of genotyping results, ie virtual phenotyping ( WO 01/79540 ).

Die Assays der vorliegenden Erfindung können von Nutzen sein, um durch das Definieren von Cut-Offs, d. h. biologischen Cut-Offs, einen wirksamen Arzneistoff von einem unwirksamen Arzneistoff zu unterscheiden (siehe z. B. WO 02/33402 ). Ein biologischer Cut-Off ist Arzneistoffspezifisch. Diese Cut-Offs werden im Anschluss an die Phänotypisierung einer großen Population von Individuen, die Wildtypviren enthalten, bestimmt. Der Cut-Off wird von der Verteilung des Quotientenanstiegs in der Resistenz des Virus für einen bestimmten Arzneistoff abgeleitet.The assays of the present invention may be useful to distinguish an effective drug from an ineffective drug by defining cut-offs, ie, biological cut-offs (see e.g. WO 02/33402 ). A biological cut-off is drug specific. These cut-offs are determined following phenotyping of a large population of individuals containing wild-type viruses. The cut-off is derived from the distribution of the increase in quotient in the resistance of the virus to a particular drug.

Die vorliegende Offenbarung beschreibt auch ein Kit zur Phänotypisierung von HIV-Integrase. Ein solches Kit, das zum Bestimmen der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff von Nutzen ist, kann Folgendes umfassen: i) wenigstens einen der Primer ausgewählt aus SEQ ID Nr. 1–16, und ii) ein Plasmid wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Zum Zweck der Durchführung des Phänotypisierungsassays kann ein solches Kit ferner mit wenigstens einem Inhibitor vervollständigt sein. Gegebenenfalls kann ein Referenzplasmid, welches eine Wildtyp-HIV-Sequenz trägt, hinzugefügt sein. Gegebenenfalls können Zellen, die anfällig für HIV-Transfektion sind, zu dem Kit hinzugefügt sein. Außerdem können wenigstens ein Reagens zum Überwachen des Indikatorgens oder Re portermoleküle wie Enzymsubstrate hinzugefügt sein.The The present disclosure also describes a kit for phenotyping of HIV integrase. Such a kit, which for determining the susceptibility at least of an HIV virus at least one drug, may include: i) at least one of the primers selected from SEQ ID Nos. 1-16, and ii) a plasmid as described in the present invention. To the Purpose of implementation of the phenotyping assay For example, such a kit may be further completed with at least one inhibitor. Optionally, a reference plasmid carrying a wild-type HIV sequence may be added. If necessary, you can Cells that are vulnerable for HIV transfection are added to the kit be. Furthermore at least a reagent for monitoring of indicator gene or receptor molecules such as enzyme substrates.

Die vorliegende Offenbarung beschreibt auch ein Verfahren zur Bestimmung der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, umfassend: i) die Verwendung wenigstens einer HIV-RNA-haltigen Probe, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; ii) das reverse Transkribieren und Amplifizieren der HIV-RNA mit Primern, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifische sind, um ein Amplifikat zu erhalten, welches das IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; iii) das Bestimmen der Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, und iv) das Vergleichen der Nukleotidsequenz des Amplifikats mit der Sequenz bekannter Sequenzen zum Bestimmen der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff. Dieses Assayprotokoll wird üblicherweise als Genotypisierung bezeichnet.The The present disclosure also describes a method of determination the susceptibility at least one HIV virus at least one drug, comprising: i) the use of at least one HIV RNA containing A sample, wherein the sample is at least one IN gene or part thereof includes; ii) reverse transcription and amplification of the HIV RNA with primers for the IN region of the HIV genome are specific to an amplificate to obtain which comprises the IN gene or a part thereof; iii) determining the nucleotide sequence of the amplificate or a part and iv) comparing the nucleotide sequence of the amplificate at least with the sequence of known sequences for determining susceptibility of an HIV virus at least one drug. This assay protocol usually becomes referred to as genotyping.

Der Genotyp des vom Patienten abgeleiteten IN-Codierbereichs kann direkt aus der amplifizierten DNA, d. h. dem DNA-Konstrukt, bestimmt werden, indem während des Amplifikationsschrittes eine DNA-Sequenzierung durchgeführt wird. Alternativ dazu kann die Sequenz nach dem Subklonieren in einen geeigneten Vektor erhalten werden. Eine Vielzahl kommerzieller Sequenzierungsenzyme und -ausrüstungen kann bei diesem Prozess verwendet werden. Die Wirksamkeit kann durch das Bestimmen der Sequenz des IN-Codierbereichs in mehreren parallelen Reaktionen, jede mit einem unterschiedlichen Primersatz, erhöht werden. Ein solcher Prozess könnte mit hohem Durchsatz zum Beispiel auf einer Multi-Well-Platte durchgeführt werden. Es können kommerziell erhältliche Detektions- und Analysesysteme verwendet werden, um die Sequenzinformationen zu bestimmen und für eine spätere Analyse zu speichern. Die Nukleotidsequenz kann unter Verwendung mehrerer Ansätze, einschließlich der Sequenzierung von Nukleinsäuren, erhal ten werden. Diese Sequenzierung kann unter Verwendung von Techniken, einschließlich Gel-basierter Ansätze, Massenspektroskopie und Hybridisierung, durchgeführt werden. Werden jedoch mehr Resistenz-bezogene Mutationen identifiziert, kann die Sequenz an bestimmten Nukleinsäuren, Codons oder Kurzsequenzen erhalten werden. Wenn eine bestimmte Resistenz-bezogene Mutation bekannt ist, kann die Nukleotidsequenz unter Verwendung von Hybridisierungsassays (einschließlich Biochips, LipA-Assay), Massenspektroskopie, Allel-spezifische PCR oder unter Verwendung von Sonden oder Primern, die zwischen Mutanten- und Wildtypsequenz unterscheiden, bestimmt werden. Zu diesem Zweck können die Sonden oder Primer geeigneterweise für die Erkennung gekennzeichnet sein (z. B. Molecular Beacons, TaqMan®, SunRise-Primer). Geeigneterweise werden fluoreszierende oder gequenchte fluoreszierende Primer verwendet. Der Primer liegt in einer Konzentration im Bereich von 0,01 pmol bis 100 pmol, geeigneterweise zwischen 0,10 und 10 pmol vor. Die Zyklusbedingungen umfassen einen Denaturierungsschritt innerhalb von 0,5 bis 10 Minuten, geeigneterweise 1 bis 5 Minuten, bei einer Temperatur im Bereich von 85 bis 99°C. Interessanterweise liegt die Temperatur zwischen 90 und 98°C. Anschließend erfolgen mit dem Material 14 bis 45 Zyklen, geeigneterweise zwischen 20 und 40 Zyklen, noch geeigneter 25 bis 35 Zyklen. Nukleinsäure wird bei 90 bis 98°C innerhalb von 5 Sekunden bis 2 Minuten denaturiert. Geeigneterweise liegen die Denaturierungszeiträume im Bereich von 15 Sekunden bis 1 Minute. Das Verschmelzen erfolgt bei 40 bis 60°C, spezifischer zwischen 45°C und 57°C. Der Verschmelzungszeitraum beträgt 5 Sekunden bis 1 Minute, insbesondere zwischen 10 Sekunden und 35 Sekunden. Die Verlängerung erfolgt bei 60°C bis 75°C innerhalb von 10 Sekunden bis 10 Minuten. Vorzugsweise beträgt der Verlängerungszeitraum 15 Sekunden bis 5 Minuten. Ein ausgewählter Satz von Sequenzierungsprimern enthält SEQ ID Nr. 17–22. Diese bestimmte Auswahl hat den Vorteil, dass sie die Sequenzierung des kom pletten HIV-Integrasegens ermöglicht. Dementsprechend können unter Verwendung dieses Primersatzes alle möglichen Mutationen, die in dem HIV-Integrasegen auftreten können, gelöst werden.The genotype of the patient-derived IN coding region can be determined directly from the amplified DNA, ie the DNA construct, by performing DNA sequencing during the amplification step. Alternatively, the sequence can be obtained after subcloning into a suitable vector. A variety of commercial sequencing enzymes and equipment can be used in this process. The efficacy can be increased by determining the sequence of the IN coding region in several parallel reactions, each with a different set of primers. Such a process could be done with high throughput, for example on a multi-well plate. Commercially available detection and analysis systems can be used to obtain the sequence information determine and save for later analysis. The nucleotide sequence can be obtained using several approaches including sequencing of nucleic acids. This sequencing can be performed using techniques including gel-based approaches, mass spectroscopy, and hybridization. However, if more resistance-related mutations are identified, the sequence can be obtained on certain nucleic acids, codons or short sequences. If a particular resistance-related mutation is known, the nucleotide sequence can be determined using hybridization assays (including biochips, LipA assay), mass spectroscopy, allele-specific PCR, or using probes or primers that distinguish between mutant and wild-type sequences , For this purpose, the probes or primers may be suitably labeled for detection (eg., Molecular Beacons, TaqMan ®, Sunrise primer). Conveniently, fluorescent or quenched fluorescent primers are used. The primer is present in a concentration ranging from 0.01 pmol to 100 pmol, suitably between 0.10 and 10 pmol. The cycling conditions include a denaturation step within 0.5 to 10 minutes, suitably 1 to 5 minutes, at a temperature in the range of 85 to 99 ° C. Interestingly, the temperature is between 90 and 98 ° C. Subsequently, with the material 14 to 45 cycles, suitably between 20 and 40 cycles, more suitably 25 to 35 cycles. Nucleic acid is denatured at 90 to 98 ° C within 5 seconds to 2 minutes. Suitably, the denaturation periods are in the range of 15 seconds to 1 minute. The fusion takes place at 40 to 60 ° C, more specifically between 45 ° C and 57 ° C. The fusion period is 5 seconds to 1 minute, especially between 10 seconds and 35 seconds. The extension takes place at 60 ° C to 75 ° C within 10 seconds to 10 minutes. Preferably, the extension period is 15 seconds to 5 minutes. A selected set of sequencing primers contains SEQ ID NO: 17-22. This particular choice has the advantage of allowing sequencing of the complete HIV integrase gene. Accordingly, using this set of primers, all possible mutations that may occur in the HIV integrase gene can be resolved.

Der IN-Genotyp des Patienten stellt ein zusätzliches Mittel zur Bestimmung der Arzneistoffsuszeptibilität eines Virenstammes bereit. Phänotypisierung ist ein langwieriger Prozess, der bis zu seinem Abschluss häufig 2 oder mehr Wochen dauert. Daher wurden Systeme entwickelt, welche die Vorhersage des Phänotyps basierend auf den genotypischen Ergebnissen ermöglichen. Die Ergebnisse der Genotypisierung können in Verbindung mit der Phänotypisierung interpretiert und schließlich einer Datenbankabfrage unterzogen werden. Ein geeignetes System ist die virtuelle Phänotypisierung ( WO 01/79540 ). Beim virtuellen Phänotypisierungsprozess können die kompletten IN-Gene verwendet werden. Alternativ dazu können Teile der Gene verwendet werden. Es können auch Kombinationen von Mutationen, vorzugsweise Mutationen, die eine Änderung der Arzneistoffsuszeptibilität anzeigen, verwendet werden. Eine Kombination von Mutationen wird gelegentlich als ein Hot-Spot bezeichnet (siehe z. B. WO 01/79540 ). Kurz, beim Prozess der virtuellen Phänotypisierung kann der Genotyp einer vom Patienten abgeleiteten IN-Sequenz mit der phänotypischen Reaktion auf die vom Patienten abgeleitete IN-Sequenz korreliert werden. Wenn keine Phänotypisierung durchgeführt wird, kann die Sequenz mit einer Sammlung von Sequenzen in einer Datenbank abgeglichen werden. Identische Sequenzen werden entnommen und die Datenbank weiter abgefragt, um zu identifizieren, ob ein entsprechender Phänotyp für eine der entnommenen Sequenzen bekannt ist. In letzterem Fall kann ein virtueller Phänotyp bestimmt werden. Es kann ein Bericht einschließlich des EC50 des Virenstammes für eine oder mehrere Therapien, der untersuchten Sequenz des Stammes und biologischer Cut-Offs erstellt werden.The patient's IN genotype provides an additional means of determining the drug susceptibility of a viral strain. Phenotyping is a lengthy process that often takes 2 or more weeks to complete. Therefore, systems have been developed that allow the prediction of the phenotype based on the genotypic results. The results of the genotyping can be interpreted in connection with the phenotyping and finally subjected to a database query. A suitable system is virtual phenotyping ( WO 01/79540 ). In the virtual phenotyping process, the complete IN genes can be used. Alternatively, portions of the genes may be used. Combinations of mutations, preferably mutations that indicate a change in drug susceptibility, may also be used. A combination of mutations is sometimes referred to as a hot spot (see, eg, WO 01/79540 ). Briefly, in the process of virtual phenotyping, the genotype of a patient-derived IN sequence can be correlated with the phenotypic response to the patient-derived IN sequence. If no phenotyping is performed, the sequence can be aligned with a collection of sequences in a database. Identical sequences are taken and the database is further queried to identify if a corresponding phenotype is known for any of the extracted sequences. In the latter case, a virtual phenotype can be determined. A report can be made including the EC 50 of the virus strain for one or more therapies, the strain's sequence studied, and biological cut-offs.

Die vorliegende Offenbarung beschreibt auch ein Kit zur Genotypisierung von HIV-Integrase. Ein solches Kit, dass zur Bestimmung der Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff von Nutzen ist, kann wenigstens einen Primer ausgewählt aus SEQ ID Nr. 1–12 und 17–22 umfassen. Gegebenenfalls können zusätzliche Reagenzien zum Durchführen der Nukleinsäureamplifikation und anschließenden Sequenzanalyse hinzugefügt werden. Reagenzien zur Zyklussequenzierung können enthalten sein. Die Primer können fluoreszierend gekennzeichnet sein.The The present disclosure also describes a genotyping kit of HIV integrase. Such a kit that for determining the susceptibility at least of an HIV virus At least one drug is useful, at least one Primer selected from SEQ ID Nos. 1-12 and 17-22 include. If necessary, you can additional Reagents to perform the nucleic acid amplification and subsequent Sequence analysis added become. Reagents for cycle sequencing may be included. The primers can be characterized fluorescent.

Die vorliegende Offenbarung stellt ein Verfahren zur Identifizierung eines Arzneistoffes bereit, der wirksam gegen HIV-Integrase ist, umfassend: i) das Erhalten wenigstens einer HIV-Integrasesequenz, ii) das Bestimmen der phänotypischen Reaktion der Integrase gegenüber dem Arzneistoff, iii) das Verwenden der phänotypischen Reaktion zum Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneistoffes. Die phänotypische Reaktion wird gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt.The The present disclosure provides a method of identification a drug that is effective against HIV integrase, comprising: i) obtaining at least one HIV integrase sequence, ii) determining the phenotypic Reaction of the integrase the drug, iii) using the phenotypic response to determine the effectiveness of the drug. The phenotypic reaction is performed according to the procedure of the present invention.

Die in der vorliegenden Offenbarung beschriebenen Verfahren können in einem Verfahren zur Identifizierung eines Arzneistoffes, der gegen HIV-Integrase wirksam ist, verwendet werden, umfassend: i) das Erhalten wenigstens einer HIV-Integrasesequenz und das Bestimmen der Sequenz der HIV-Integrase, ii) das Vergleichen der Sequenz mit Sequenzen in einer Datenbank, von denen die Suszeptibilität der HIV-Integrase bestimmt wurde, iii) das Verwenden des Sequenzvergleichs zum Bestimmen der Wirksamkeit des Arzneistoffes. Die Suszeptibilität und die Sequenz des HIV-Integrasegens werden gemäß der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren bestimmt.The methods described in the present disclosure can be used in a method of identifying a drug effective against HIV integrase, comprising: i) obtaining at least one HIV integrase sequence and determining the sequence of the HIV integrase, ii) comparing the sequence with sequences in a database, one of which is the susceptibility of HIV integrase iii) using the sequence comparison to determine the efficacy of the drug. The susceptibility and sequence of the HIV integrase gene are determined according to the methods disclosed in the present invention.

Die Genotypisierungs- und Phänotypisierungsverfahren wie hierin beschrieben können verwendet werden, um eine genotypische und phänotypische Datenbank von IN-Sequen zen zu erstellen, umfassend: i) die Verwendung von Proben, die HIV-RNA, die das IN-Gen oder einen Teil davon umfasst, umfassen; ii) das reverse Transkribieren und Amplifizieren der HIV-RNA mit Primern, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifisch sind, um ein Amplifikat zu erhalten, welches das IN-Gen oder einen Teil davon umfasst; iii) das Bestimmen der Nukleotidsequenz des Amplifikats oder Teilen davon; iv) das Erzeugen eines Plasmids, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfasst; v) das Herstellen eines rekombinanten Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem Amplifikat und einem Plasmid, welches die Wildtyp-HIV-Sequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels PCR eingefügt wird, umfasst; vi) das Bestimmen der relativen replikativen Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart von Anti-HIV-Arzneistoffen im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer Wildtyp-IN-Gensequenz; und vii) das Korrelieren der Nukleotidsequenz und der relativen replikativen Leistungsfähigkeit in einer Datentabelle.The Genotyping and phenotyping methods as described herein used to create a genotypic and phenotypic database of IN sequences i) the use of samples containing HIV RNA, comprising the IN gene or a part thereof; ii) the reverse Transcribe and amplify the HIV RNA with primers designed for the IN area of the HIV genome to obtain an amplificate which the IN gene or a part thereof; iii) determining the Nucleotide sequence of the amplificate or parts thereof; iv) generating a plasmid containing the wild-type HIV sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion by means of nucleic acid amplification is generated comprises; v) producing a recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplificate and a plasmid containing the wild-type HIV sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion inserted by PCR is included; vi) determining the relative replicative capacity of the recombinant virus in the presence of anti-HIV drugs in comparison to an HIV virus with a wild-type IN gene sequence; and vii) correlating the nucleotide sequence and relative replicative performance in a data table.

Gemäß der hierin beschriebenen Verfahren kann eine Datenbank konstruiert werden, welche genotypische und phänotypische Daten der HIV-Integrase enthält, wobei die Datenbank ferner eine Korrelation zwischen Genotypen und zwischen Genotypen und Phänotypen bereitstellt, wobei die Korrelation die Wirksamkeit eines gegebenen Arzneistoffregimes anzeigt. Eine Datenbank von IN-Sequenzen kann erstellt und wie in WO 01/79540 beschrieben verwendet werden. Zum Beispiel kann eine solche Datenbank in Kombination mit pol- und pro-Sequenzinformationen analysiert werden und die Ergebnisse können bei der Festlegung entsprechender Behandlungsstrategien verwendet werden. Die Datenbank, welche eine Sammlung von Genotypen, Phänotypen und Proben enthält, für welche der kombinierte Genotyp/Phänotyp verfügbar ist, kann verwendet werden, um den virtuellen Phänotyp zu bestimmen (siehe oben). Außerdem können anstelle der Abfrage der kompletten IN-Sequenzen, bestimmte Codons, die zu einer Änderung in der Arzneistoffsuszeptibilität des Virus korrelieren, in einer solchen Datenbank abgefragt werden.In accordance with the methods described herein, a database containing genotypic and phenotypic data of HIV integrase may be constructed, the database further providing a correlation between genotypes and between genotypes and phenotypes, the correlation indicating the effectiveness of a given drug regime. A database of IN sequences can be created and as in WO 01/79540 can be used described. For example, such a database may be analyzed in combination with pol and per-sequence information, and the results used in determining appropriate treatment strategies. The database containing a collection of genotypes, phenotypes and samples for which the combined genotype / phenotype is available can be used to determine the virtual phenotype (see above). In addition, instead of querying the complete IN sequences, certain codons that correlate to a change in drug susceptibility of the virus can be queried in such a database.

Ein Primer kann aus SEQ ID Nr. 1–23 ausgewählt werden. Ein bestimmter Primersatz ist SEQ ID 1–10, 13, 15 und 23. Primer, die für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifisch sind, wie die hierin beschriebenen Primer und ihre Homologa, werden beansprucht. Die hierin aufgelisteten Primersequenzen können gekennzeichnet sein. Geeigneterweise kann diese Kennzeichnung mittels Fluoreszenz, Lumineszenz oder Absorbanz erkannt werden. Der Primer zum Erzeugen eines Deletionskonstruktes kann einen Teil enthalten, der nicht mit der HIV-Sequenz verschmilzt. Dieser Teil kann verwendet werden, um eine einmalige Restriktionsstelle einzufügen. Interessanterweise können Primer entwickelt werden, in welchen die einmalige Restriktionsstelle teilweise in der HIV-Sequenz vorliegt. Die Primer werden aus den hierin aufgelisteten ausgewählt oder sie weisen wenigstens 80% Homologie auf, wie durch Verfahren bestimmt wird, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wie BLAST oder FASTA. Spezifisch beträgt die Homologie wenigstens 90%, spezifischer wenigstens 95%. Außerdem bilden Primer, die sich in einem Bereich von 50 Nukleotiden (nt) stromaufwärts oder stromabwärts von den hierin gegebenen Sequenzen befinden, einen Teil der Erfindung. Besonders umfasst der Bereich 20 Nukleotide stromauf- oder stromabwärts von der Position der hierin gegebenen Primersequenzen in dem HIV-Genom. Alternativ dazu bilden Primer, welche wenigstens 8 aufeinanderfolgende Basen, die in jedem der hier beschriebenen Primer vorliegen, umfassen, eine Ausführungsform der Erfindung. Interessanterweise umfassen die Primer wenigstens 12 aufeinanderfolgende Basen, die in jedem der hierin beschriebenen Primer vorliegen.One Primer may be selected from SEQ ID Nos. 1-23 selected become. One particular set of primers is SEQ ID 1-10, 13, 15 and 23. Primer, the for specific to the IN region of the HIV genome, such as the primers described herein and their homologues are claimed. Those listed herein Primer sequences can to be marked. Suitably, this labeling can by means of Fluorescence, luminescence or absorbance are detected. The primer to generate a deletion construct may contain a part that does not fuse with the HIV sequence. This part can be used to insert a unique restriction site. Interestingly, can Primers are developed in which the unique restriction site partly in the HIV sequence is present. The primers are selected from those listed herein or they have at least 80% homology as determined by method which are known to those skilled in the art, such as BLAST or FASTA. Specific is the homology at least 90%, more specifically at least 95%. In addition, form Primers located in an area of 50 nucleotides (nt) upstream or downstream of the sequences herein are part of the invention. In particular, the region comprises 20 nucleotides upstream or downstream of the position of the primer sequences given herein in the HIV genome. Alternatively, form primers which are at least 8 consecutive Bases that are present in any of the primers described herein include, an embodiment the invention. Interestingly, the primers comprise at least 12 consecutive bases in each of those described herein Primer present.

Die vorliegende Erfindung umfasst die im Experimentteil beschriebenen Plasmide und die Verwendung der Plasmide in den hierin beschriebenen Verfahren. Die HIV-Sequenz, die in dem Plasmid eingeschlossen ist, kann auf der K03455-Sequenz basieren. Es kann die komplette HIV-Sequenz eingeschlossen sein, oder nur ein Teil davon. Ein geeignetes Plasmid-Backbone kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die pUC, pSV oder pGEM enthält.The The present invention includes those described in the Experimental section Plasmids and the use of the plasmids in those described herein Method. The HIV sequence included in the plasmid can be based on the K03455 sequence. It can include the complete HIV sequence be, or only part of it. A suitable plasmid backbone can selected from the group containing pUC, pSV or pGEM.

Ein Plasmid, welches eine deletierte Integrase umfasst, wobei die Deletion wenigstens 100 bp des HIV-Integrasegens umfasst, ist hierin bereitgestellt. Geeigneterweise sind mehr als 500 bp des Integrasegens deletiert, geeigneter ist das komplette IN-Gen deletiert. Die Deletion kann auch Teile flankierender Gene umfassen, oder sogar mehr als ein Gen, z. B. Deletion von Integrase und Protease.One A plasmid comprising a deleted integrase, wherein the deletion at least 100 bp of the HIV integrase gene is provided herein. Suitably more than 500 bp of the integrase gene are deleted, more suitable is the complete IN gene deleted. The deletion can also include parts of flanking genes, or even more than one Gene, e.g. B. deletion of integrase and protease.

Zur Herstellung von Vektoren, welche rekombinante IN-Codiersequenzen enthalten, kann die vom Patienten abgeleitete IN-RNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) revers transkribiert und amplifiziert und dann in einen Vektor eingefügt werden, der die Wildtyp-HIV-Genomsequenz enthält, dem jedoch ein kompletter IN-Codierbereich fehlt. Anfänglich wurden 36 unterschiedliche Primerkombinationen verwendet, um amplifizierte DNA-Sequenzen aus 16 Patientenproben zu erhalten. Die 5'- zu 3'-Sequenzen und die Primer, die durch SEQ ID Nr. 1–10 der Primer identifiziert werden, die erfolgreich eingesetzt werden können, um IN-Codierbereiche revers zu transkribieren und mittels PCR zu amplifizieren, sind in Tabelle 1 unten aufgeführt.to Preparation of vectors containing recombinant IN coding sequences, the patient-derived IN RNA by polymerase chain reaction (PCR) reverse transcribed and amplified and then into a vector added which contains the wild-type HIV genome sequence, but a complete one IN coding area is missing. Initially 36 different primer combinations were used to amplify DNA sequences out To receive 16 patient samples. The 5'- too 3 'sequences and the primers identified by SEQ ID Nos. 1-10 of the primers which can be successfully used to IN coding areas reverse transcribed and amplified by PCR are listed in Table 1 below.

Eine Reihe von Protokollen für reverse Transkription und PCR, die in der Technik bekannt sind, können im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein verschachtelter PCR-Ansatz zum Amplifizieren der vom Patienten abgeleiteten cDNA nach reverser Transkription kann wie in Kellam, P. and Larder, B. A., (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38: 23–30 (1994)), hierin durch Verweis eingefügt, beschrieben verwendet werden. Der verschachtelte Ansatz der vorliegenden Erfindung nutzt zwei Sätze von Primern, wobei die äußeren Primer 5'EGINT1 (SEQ ID Nr. 1) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) sind, während die inneren Primer 5'EGINT107 (SEQ ID Nr. 2) und 3'EGINT11 (SEQ ID Nr. 12) sind. Ein zusätzlicher innerer 5'-Primer, 5'EGINT2 (SEQ ID Nr. 3) kann auch als ein „Rettungsprimer" zur Verbesserung des Ertrags der amplifizierten DNA verwendet werden. Die Amplifikation unter Verwendung dieser Primer ergibt ein PCR-Produkt, welches die komplette IN-Codiersequenz einschließt. Alternativ dazu werden 5'EGINT3 (SEQ ID Nr. 4) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) als äußere PCR-Primer verwendet, während 5'EGINT4 (SEQ ID Nr. 5) oder 5'EGINT5 (SEQ ID Nr. 6) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7) als innere Primer verwendet werden, was ein PCR-Produkt ergibt, welches einen Teil der IN-Codiersequenz einschließt.A Set of logs for reverse transcription and PCR known in the art can in Context of the present invention are used. A nested one PCR approach for amplifying patient-derived cDNA after reverse transcription, as in Kellam, P. and Larder, B. A., (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38: 23-30 (1994)), incorporated herein by reference, can be used described. The nested approach of the present Invention uses two sentences of primers, with the outer primers 5'EGINT1 (SEQ ID No. 1) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) while the inner primers 5'EGINT107 (SEQ ID NO: 2) and 3'EGINT11 (SEQ ID NO: 12). An additional one inner 5 'primer, 5'EGINT2 (SEQ ID # 3) can also be used as a "rescue primer" for improvement of the yield of the amplified DNA. The amplification using these primers gives a PCR product containing the includes complete IN coding sequence. Alternatively, be 5'EGINT3 (SEQ ID No. 4) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) as outer PCR primers used while 5'EGINT4 (SEQ ID No. 5) or 5'EGINT5 (SEQ ID NO: 6) and 3'EGINT6 (SEQ ID NO: 7) can be used as an inner primer, resulting in a PCR product which includes part of the IN coding sequence.

Tabelle 1: Primer für die reverse IN-Transkription und PCR-Amplifikation. Die unterstrichenen Abschnitte verschmelzen nicht mit der zu amplifizierenden Sequenz.

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Table 1: Primer for reverse IN transcription and PCR amplification. The underlined sections do not fuse with the sequence to be amplified.
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Figure 00220001
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Zum Herstellen rekombinanter Vektoren, welche die amplifizierten, vom Patienten abgeleiteten IN-Sequenzen umfassen, können diese Sequenzen in Vektoren eingeführt werden, welche die Wildtyp-HIV-Sequenz und eine Deletion des ganzen oder eines Teils des IN-Codierbereichs aufweisen. Die Wildtyp-HIV-Sequenz kann aus einem Plasmid wie pSV40HXB2D erhalten werden, welches in der Lage ist, Lymphozytenzellen zu transfizieren, um lebensfähige Viruspartikel zu erzeugen. Eine Deletion des gesamten IN-Codierbereichs auf dem pSV40HXB2D-Vektor kann wirksam durch PCR-Amplifizierung des Plasmids unter Verwendung von Primern, welche mit Sequenzen an oder nahe den Enden des IN-Codierbereichs in dem Vektor verschmelzen, erzeugt werden. Das amplifizierte Produkt kann mit einem Restriktionsenzym, das in die Primer eingefügt wird, gespalten und dann erneut ligiert werden, um einen pSV40HXB2D-basierten IN-Deletionsvektor mit einer einmaligen Restriktionsstelle an der Stelle der Deletion zu erzeugen. Der IN-Deletionsvektor kann eine Deletion der kompletten IN-Codiersequenz aufweisen, wobei gegebenenfalls auch ein Teil der vorhergehenden RNase- und/oder der anschließenden Vif-Codiersequenzen deletiert ist. Alternativ dazu wird eine partielle Deletion der IN-Codiersequenz erzeugt. Diese Restriktionsstelle ist einmalig für das komplette Plasmid, welches das HIV-Gen enthält. Ein Beispiel einer solchen Restriktionsstelle ist die SmaI-Restriktionsstelle. Interessanterweise sind die Primer zum Erzeugen eines Deletionskonstruktes aus SEQ ID Nr. 13–16 ausgewählt.To the Preparation of recombinant vectors containing the amplified, from Patients can include inferred IN sequences, these sequences in vectors introduced which are the wild-type HIV sequence and a deletion of the whole or part of the IN coding region. The wild-type HIV sequence can are obtained from a plasmid such as pSV40HXB2D, which is described in US Pat Able to transfuse lymphocyte cells into viable virus particles to create. A deletion of the entire IN coding area on the pSV40HXB2D vector can be effective by PCR amplification of the plasmid below Use of primers with sequences at or near the ends of the IN coding area in which vector merge. The amplified product may be linked to a restriction enzyme, the inserted in the primer is cleaved and then ligated again to a pSV40HXB2D-based IN deletion vector with a unique restriction site at the To create site of the deletion. The IN deletion vector can be a Have deletion of the complete IN coding sequence, where appropriate also deletes part of the preceding RNase and / or the subsequent Vif coding sequences is. Alternatively, a partial deletion of the IN coding sequence generated. This restriction site is unique to the complete plasmid, which contains the HIV gene. An example of such a restriction site is the SmaI restriction site. Interestingly, the primers are for generating a deletion construct from SEQ ID Nos. 13-16 selected.

Der Fachmann auf dem Gebiet wird wissen, dass mehrere Arten von in der Technik bekannten HIV-Vektoren und Klonverfahren verwendet werden können, um IN-Deletionsplasmide zur Rekombination oder Ligation mit aus dem Patienten abgeleiteten Sequenzen und zur Erzeugung infektiöser Viren zu erzeugen. Im Allgemeinen müssen solche Vektoren erzeugt werden, um die Wiedereinfügung der deletierten Sequenzen ohne Zerstörung des Leserahmens des gag-pol-Gens zu ermöglichen.Those skilled in the art will appreciate that several types of art-known HIV vectors and cloning methods can be used to generate IN deletion plasmids for recombination or ligation with patient-derived sequences and for generating infectious viruses In general, such vectors must be generated to allow reinsertion of the deleted sequences without disrupting the reading frame of the gag-pol gene.

Die amplifizierten IN-Sequenzen können in den entsprechenden Vektor eingefügt werden, und zwar durch homologe Rekombination zwischen überlappenden DNA-Segmenten in dem Vektor und der amplifizierten Sequenz. Alternativ dazu kann die amplifizierte IN-Sequenz in Übereinstimmung mit Klonverfahren, die Standard in der Technik sind, an einer einmaligen Restriktionsstelle in den Vektor eingefügt werden. Letzteres ist eine direkte Klonstrategie.The amplified IN sequences can be inserted into the corresponding vector, by homologous Recombination between overlapping DNA segments in the vector and the amplified sequence. alternative For this, the amplified IN sequence can be prepared in accordance with cloning methods, which are standard in the art, at a unique restriction site inserted into the vector become. The latter is a direct cloning strategy.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren zur Entwicklung eines Arzneistoffregimes für einen mit HIV infizierten Patienten durch Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren:

  • i) wenigstens eine HIV-RNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst;
  • ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so dass wenigstens ein das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt;
  • iv) wenigstens ein rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt, und
  • v) das wenigstens eine rekombinante Virus in Gegenwart des wenigstens einen Arzneistoffs überwacht, um die phänotypische Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff zu bestimmen, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.
The present invention relates to an in vitro method of developing a drug regimen for a HIV-infected patient by determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, the method comprising:
  • i) using at least one HIV RNA-containing sample from a patient, the sample comprising at least one IN gene or part thereof;
  • ii) reverse transcribing and amplifying the HIV RNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that at least one amplicon comprising the at least one IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer from SEQ ID NO .: 1-12 is selected;
  • iii) an HIV reference sequence having a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, generates a comprehensive plasmid;
  • iv) producing at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplicon obtained in step ii) and a plasmid comprising the HIV reference sequence with a deletion in the IN region, and
  • v) monitoring the at least one recombinant virus in the presence of the at least one drug to determine the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of phenotypic susceptibility is by determining cytopathogenicity or by determining replicative capacity.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein In-vitro-Verfahren zur Entwicklung eines Arzneistoffregimes für einen mit HIV infizierten Patienten durch Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren:

  • i) wenigstens eine HIV-DNA-haltige Probe verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst;
  • ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so dass wenigstens ein das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt;
  • iv) wenigstens ein rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt, und
  • v) das wenigstens eine rekombinante Virus in Gegenwart des wenigstens einen Arzneistoffs überwacht, um die phänotypische Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff zu bestimmen, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.
The present invention also relates to an in vitro method of developing a drug regimen for a HIV-infected patient by determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, the method comprising:
  • i) at least one HIV DNA-containing sample is used, the sample comprising at least one IN gene or a part thereof;
  • ii) amplifying the HIV DNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that at least one amplicon comprising the at least one IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer from SEQ ID NO: 1 -12 is selected;
  • iii) an HIV reference sequence having a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, generates a comprehensive plasmid;
  • iv) producing at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplicon obtained in step ii) and a plasmid comprising the HIV reference sequence with a deletion in the IN region, and
  • v) monitoring the at least one recombinant virus in the presence of the at least one drug to determine the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of phenotypic susceptibility is by determining cytopathogenicity or by determining replicative capacity.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein In-vitro-Verfahren wie oben beschrieben, wobei die Suszeptibili tät wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff über die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart wenigstens eines Arzneistoffs im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt wird.The The present invention also relates to an in vitro method as described above, wherein the Suszeptibili ity at least one HIV virus at least one drug over the relative replicative capacity of the recombinant virus in the presence of at least one drug compared to an HIV virus is determined with an IN reference gene sequence.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein In-vitro-Verfahren zum Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren:

  • i) wenigstens eine HIV-RNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst;
  • ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so dass ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt; und
  • iv) die Nukleotidsequenz des Amplifikats mit der Sequenz von Sequenzen, deren phänotypische Suszeptibilität bekannt ist, zur Abschätzung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff vergleicht, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.
The present invention also relates to an in vitro method for determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, the method comprising:
  • i) using at least one HIV RNA-containing sample from a patient, the sample comprising at least one IN gene or part thereof;
  • ii) reverse transcribing and amplifying the HIV RNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that an amplicon comprising the IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer from SEQ ID NO: 1 -12 is selected;
  • iii) determining the nucleotide sequence of the amplicon or a portion thereof as obtained in step ii); and
  • iv) comparing the nucleotide sequence of the amplicon with the sequence of sequences whose phenotypic susceptibility is known for estimating the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of phenotypic susceptibility is by determining cytopathogenicity or by determining replicative capacity.

Außerdem betrifft die Erfindung ein In-vitro-Verfahren zum Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren:

  • i) wenigstens eine HIV-DNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfasst;
  • ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so dass ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt; und
  • iv) die Nukleotidsequenz des Amplifikats mit der Sequenz von Sequenzen, deren phänotypische Suszeptibilität bekannt ist, zur Abschätzung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff vergleicht, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.
In addition, the invention relates to an in vitro method for determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein in the method:
  • i) using at least one HIV-DNA-containing sample from a patient, the sample comprising at least one IN gene or a part thereof;
  • ii) amplifying the HIV DNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that an amplicon comprising the IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NOs: 1-12 is;
  • iii) determining the nucleotide sequence of the amplicon or a portion thereof as obtained in step ii); and
  • iv) comparing the nucleotide sequence of the amplicon with the sequence of sequences whose phenotypic susceptibility is known for estimating the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of phenotypic susceptibility is by determining cytopathogenicity or by determining replicative capacity.

Ferner betrifft die aktuelle Erfindung ein In-vitro-Verfahren zur Konstruktion einer genotypischen und phänotypischen Datenbank von IN-Sequenzen, bei dem man:

  • i) Proben von HIV-RNA aus einem Patienten verwendet, die das IN-Gen oder einen Teil davon umfassen;
  • ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so dass ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt;
  • iv) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt;
  • v) rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt;
  • vi) die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart von Anti-HIV-Arzneistoffen im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt.
Further, the present invention relates to an in vitro method of constructing a genotypic and phenotypic database of IN sequences, comprising:
  • i) using samples of HIV RNA from a patient comprising the IN gene or a part thereof;
  • ii) reverse transcribing and amplifying the HIV RNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that an amplicon comprising the IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer from SEQ ID NO: 1 -12 is selected;
  • iii) determining the nucleotide sequence of the amplicon or a portion thereof as obtained in step ii);
  • iv) an HIV reference sequence having a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, generates a comprehensive plasmid;
  • v) producing recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplicon obtained in step ii) and a plasmid comprising the HIV reference sequence with a deletion in the IN region;
  • vi) determining the relative replicative potency of the recombinant virus in the presence of anti-HIV drugs compared to an HIV virus with an IN reference gene sequence.

Die Erfindung betrifft ferner ein In-vitro-Verfahren zur Konstruktion einer genotypischen und phänotypischen Datenbank von IN-Sequenzen, bei dem man:

  • i) Proben von HIV-DNA verwendet, die das IN-Gen oder einen Teil davon umfassen;
  • ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so dass ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID Nr.: 1–12 ausgewählt ist;
  • iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt;
  • iv) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, dass die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt;
  • v) rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt;
  • vi) die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart von Anti-HIV-Arzneistoffen im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt.
The invention further relates to an in vitro method for constructing a genotypic and phenotypic database of IN sequences, comprising:
  • i) using samples of HIV DNA comprising the IN gene or a part thereof;
  • ii) amplifying the HIV DNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that an amplicon comprising the IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NOs: 1-12 is;
  • iii) determining the nucleotide sequence of the amplicon or a portion thereof as obtained in step ii);
  • iv) an HIV reference sequence having a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, generates a comprehensive plasmid;
  • v) producing recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplicon obtained in step ii) and a plasmid comprising the HIV reference sequence with a deletion in the IN region;
  • vi) determining the relative replicative potency of the recombinant virus in the presence of anti-HIV drugs compared to an HIV virus with an IN reference gene sequence.

EXPERIMENTTEILEXPERIMENT PART

Beispiel 1: Phänotypisierung der HIV-IntegraseExample 1 Phenotyping of HIV Integrase

1. PCR-Amplifikation der Integrasecodiersequenz1. PCR amplification of the integrase coding sequence

Die Integrasecodiersequenz wurde entweder aus dem Wildtyp-HIV-1 (IIIB) oder dem NL4.3-Virus oder aus ortsgerichteten HXB2D-Mutantenviren, die Mutationen in der Integrase enthalten (wie T66I, S153Y, M154I oder Kombinationen davon) (Hazuda et al., Science 2000, 287, 646–650), oder aus Patientenproben amplifiziert. Ausgehend von RNA, extrahiert aus Virusüberstand oder Plasma mittels des QIAamp® Virus-RNA-Extraktionskits (Qiagen), wurde cDNA durch reverse Transkription (ExpandTM Reverse Transkriptase, 30 Min. bei 42°C) mit dem Primer 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) synthetisiert, gefolgt von einer verschachtelten PCR. Die äußere PCR erfolgte mit den Primern 5'EGINT1 (SEQ ID Nr. 1) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) (ΔR-IN-vif-Konstrukt) oder 5'EGINT3 (SEQ ID Nr. 4) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) (ΔIN-Konstrukt) (ExpandTM High-Fidelity-PCR-System), und 5 μl des äußeren Produktes wurden für eine innere PCR mit den Primern 5'EGINT2 (SEQ ID Nr. 3) und 3'EGINT11 (SEQ ID Nr. 12) (ΔR-IN-vif-Konstrukt) oder 5'EGINT4 (SEQ ID Nr. 5) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7) (ΔIN-Konstrukt) verwendet. In einem zweiten Protokoll waren die äußeren Primer identisch wie oben beschrieben, und die inneren Primer sind 5'EGINT5 (SEQ ID Nr. 6) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7). Die Amplifikate können zur Genotypisierung und Phänotypisierung verwendet werden. Die Zyklusbedingun gen für beide PCRs sind Denaturierung für 3 Min. bei 95°C gefolgt von 30 Zyklen von 1 Min. bei 90°C, 30 Sek. bei 55°C und 2 Min. bei 72°C. Eine endgültige Extension erfolgte für 10 Min. bei 72°C. Für die Rekombination werden die PCR-Produkte mit Hilfe des QiaQuick® 96 PCR-BioRobot-Kits (Qiagen) gemäß des Herstellerprotokolls aufgereinigt. Wenn das Protokoll von DNA ausgeht, welche das HIV-Material wie Provirus-DNA enthält, ist der Reverse Transkriptase-Schritt nicht notwendig. Der verschachtelte Ansatz wird auch nicht benötigt, wenn von Provirus-DNA ausgegangen wird. Die erhaltenen Amplifikate wurden mit Hilfe der folgenden Primer sequenziert: In_seq1F (SEQ ID Nr. 17), In_seq2F (SEQ ID Nr. 18), In_seq3F (SEQ ID Nr. 19), IN_seq1R (SEQ ID Nr. 20), IN_seq2R (SEQ ID Nr. 21) und IN_seq3R (SEQ ID Nr. 22). Die Sequenz des IIIB- und Patienten-Amplifikats und des NL4.3-Amplifikats waren identisch mit den Referenz-IIIB- bzw. NL4.3-Sequenzen (Daten nicht gezeigt).The integrase coding sequence was either from wild-type HIV-1 (IIIB) or NL4.3 virus or from mutant HXB2D mutant viruses containing mutations in the integrase (such as T66I, S153Y, M154I or combinations thereof) (Hazuda et al. , Science 2000, 287, 646-650), or amplified from patient samples. Starting from RNA, extracted from virus supernatant or plasma using the QIAamp ® viral RNA Ex traction kits (Qiagen), cDNA was synthesized by reverse transcription (Expand ™ reverse transcriptase, 30 min. at 42 ° C) with primer 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11), followed by nested PCR. The outer PCR was performed with primers 5'EGINT1 (SEQ ID NO: 1) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) (ΔR-IN-vif construct) or 5'EGINT3 (SEQ ID NO: 4) and 3 'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) (ΔIN construct) (Expand ™ High Fidelity PCR System), and 5 μl of the outer product were used for internal PCR with primers 5'EGINT2 (SEQ ID NO: 3). and 3'EGINT11 (SEQ ID NO: 12) (ΔR-IN-vif construct) or 5'EGINT4 (SEQ ID NO: 5) and 3'EGINT6 (SEQ ID NO: 7) (ΔIN construct). In a second protocol, the outer primers were identical as described above, and the inner primers are 5'EGINT5 (SEQ ID NO: 6) and 3'EGINT6 (SEQ ID NO: 7). The amplificates can be used for genotyping and phenotyping. The cycling conditions for both PCRs are denaturation for 3 min. At 95 ° C followed by 30 cycles of 1 min. At 90 ° C, 30 sec. At 55 ° C and 2 min. At 72 ° C. Final extension was for 10 min. At 72 ° C. The PCR products using the QiaQuick ® 96 PCR BioRobot kit (Qiagen) are purified according to the manufacturer's protocol for recombination. If the protocol starts from DNA containing the HIV material such as provirus DNA, the reverse transcriptase step is not necessary. The nested approach is also not needed when assuming provirus DNA. The resulting amplificates were sequenced using the following primers: In_seq1F (SEQ ID NO: 17), In_seq2F (SEQ ID NO: 18), In_seq3F (SEQ ID NO: 19), IN_seq1R (SEQ ID NO: 20), IN_seq2R (SEQ ID No. 21) and IN_seq3R (SEQ ID NO: 22). The sequence of the IIIB and patient amplicon and the NL4.3 amplicon were identical to the reference IIIB and NL4.3 sequences, respectively (data not shown).

2. Herstellung eines ΔIN-Deletionskonstruktes2. Preparation of a ΔIN Deletion Construct

Ein ΔR-IN-vif- oder ΔIN-Deletionskonstrukt wurde durch ortsgerichtete Mutagenese auf der Matrize pSV40HXB2D mit den Primern MUT-IN1 (SEQ ID Nr. 13) und MUT-IN2 (ΔR-IN-vif-Konstrukt) (SEQ ID Nr. 14) oder MUT-IN3 (SEQ ID Nr. 15) und MUT-IN4 (SEQ ID Nr. 16) (ΔIN-Konstrukt) erzeugt (Protokoll ortsgerichtetes Mutagenesekit, Stratagene). Nach DpnI-Digestion zum Entfernen der methylierten Matrizen-DNA wurde das Konstrukt mit SmaI digeriert und ligiert, um das Plasmid zu zirkularisieren. Das Plasmid wurde in kompetente Zellen wie Top10-Zellen umgewandelt, und Kolonien wurden auf die Gegenwart des Deletionskonstruktes untersucht. Das IN-Deletionskonstrukt wurde durch Sequenzanalyse mit den Primern 5'EGINT1 (SEQ ID Nr. 1) oder 5'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) oder 3'EGINT11 (SEQ ID Nr. 12) geprüft. Für die Verwendung bei Rekombinationsexperimenten wurden in großem Umfang Plasmid- DNA-Präparate durch SmaI-Digestion linearisiert und mit PCR-amplifizierten Integrasegenen aus Wildtyp-, Mutanten- oder Patientenviren rekombiniert. Das Plasmid, welches die Integrasedeletion (ΔIN) enthält, wurde als pSV40HXB2D-ΔIN hinterlegt. Die Sequenz des Plasmids ist 14377 Nukleotide lang. Das ΔR-IN-vif-Deletionskonstrukt ist 13975 Nukleotide lang. Das pSV40HXB2D-ΔIN wurde am 5. August 2002 bei der Belgischen Hinterlegungsstelle für die koordinierte Sammlung von Mikroorganismen an der Universität Gent – Labor für Molekularbiologie hinterlegt und die Zugangsnummer ist LMBP 4574.A ΔR-IN-vif- or ΔIN deletion construct was determined by site-directed mutagenesis on the template pSV40HXB2D with the primers MUT-IN1 (SEQ ID NO: 13) and MUT-IN2 (ΔR-IN-vif construct) (SEQ ID NO: 14) or MUT-IN3 (SEQ ID NO: 15) and MUT-IN4 (SEQ ID No. 16) (ΔIN construct) generated (protocol site-directed mutagenesis kit, Stratagene). To DpnI digestion was done to remove the methylated template DNA the construct digested with SmaI and ligated to the plasmid circularize. The plasmid was converted into competent cells such as Top10 cells, and colonies were assayed for the presence of the deletion construct. The IN deletion construct was constructed by sequence analysis with the primers 5'EGINT1 (SEQ ID No. 1) or 5'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) or 3'EGINT11 (SEQ ID NO: 12). For the Use in recombination experiments has been extensive Plasmid DNA preparations by SmaI digestion linearized and with PCR-amplified integrase genes from wild-type, Mutant or patient viruses recombined. The plasmid which the integrase deletion (ΔIN) contains was deposited as pSV40HXB2D-ΔIN. The sequence of the plasmid is 14377 nucleotides long. The ΔR-IN-vif deletion construct is 13975 nucleotides long. The pSV40HXB2D-ΔIN was added on August 5, 2002 the Belgian depository for the coordinated collection of microorganisms at the University of Ghent - Laboratory of Molecular Biology deposited and the accession number is LMBP 4574.

3. Rekombination von Integrase-amplifizierten Sequenzen mit dem entsprechenden Deletionskonstrukt3. Recombination of integrase-amplified Sequences with the corresponding deletion construct

Rekombinantes Virus wurde durch Co-Transfektion durch Elektroporation des SmaI-linearisierten IN-Deletionskonstruktes und des Integraseamplifikates in MT4-Zellen oder in MT4-Zellen ausgestattet mit einem LTR-gesteuerten Reportergenkonstrukt hergestellt. Die Herstellung von rekombinantem Virus wurde durch Auswertung der zytopathogenen Wirkung (CPE – cytopathogenic effect) bewertet, die durch die HIV-Infektion von MT4-Zellen oder durch das LTR-gesteuerte Reportersignal induziert durch die HIV-Infektion in MT4-Reporterzellen induziert wird. Grünes fluoreszierendes Protein wurde als das Reportersignal verwendet. Viren werden entnommen und bei maximaler CPE titriert.recombinant Virus was generated by co-transfection by electroporation of the SmaI linearized IN deletion construct and the integrase supplement in MT4 cells or MT4 cells made with an LTR-driven reporter gene construct. The Production of recombinant virus was assessed by evaluation of the cytopathogenic Effect (CPE - cytopathogenic evaluated by the HIV infection of MT4 cells or by the LTR-driven reporter signal induced by the HIV infection is induced in MT4 reporter cells. Green fluorescent protein was used as the reporter signal. Viruses are removed and titrated at maximum CPE.

Für die Rekombination wurde das Deletionskonstrukt pSV40HXB2D-ΔIN verwendet. Rekombinationsexperimente wurden mit Amplifikat aus Wildtyp-HIV-IIIB und -NL4.3 durchgeführt, und die Patientenprobe 146514 durch beide Primersätze erzeugt. Für jede Rekombination wurden 2 μg Amplifikat mit 10 μg SmaI-digeriertem pSV40HXB2D-ΔIN durch Elektroporation in MT4-LTR-EGFP-Zellen co-transfiziert. Virusausgangsmaterialien wurden titriert und in einem Antivirusexperiment auf einem Referenzpanel einschließlich Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibi toren (NRTI – nucleoside reverse transcriptase inhibtors), Nicht-Nukleosid-Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI – non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors), Proteininhibitor (PR), Entry- und Integrase-(IN)Inhibitoren getestet (Tabelle 2).For recombination the deletion construct pSV40HXB2D-ΔIN was used. recombination experiments were performed with amplicon from wild-type HIV-IIIB and -NL4.3, and patient sample 146514 was generated by both primer sets. For every recombination were 2 μg Amplificate with 10 μg SmaI-digested pSV40HXB2D-ΔIN co-transfected into MT4-LTR-EGFP cells by electroporation. Virus raw materials were titrated and in an antivirus experiment on a reference panel including Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTI - nucleosides reverse transcriptase inhibitors), non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI - non-nucleosides reverse transcriptase inhibitors), protein inhibitor (PR), and integrase (IN) inhibitors tested (Table 2).

Die Rekombination wurde durch Nukleinsäure-Sequenzanalyse mit Hilfe von Protokollen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, geprüft. Sequenzierungsprimer, die verwendet werden können, sind In_seq1F (SEQ ID Nr. 17), In_seq2F (SEQ ID Nr. 18), In_seq3F (SEQ ID Nr. 19), IN_seq1R (SEQ ID Nr. 20), IN_seq2R (SEQ ID Nr. 21) und IN_seq3R (SEQ ID Nr. 22). Das rekombinante Virus wurde in einem Antivirus-Assay mit einem Panel von Referenzverbindungen einschließlich Nukleosid-RT-Inhibitoren (NRTI), Zidovudin (AZT), Lamivudin (3TC), Didanosin (DDI), Nicht-Nukleosid-RT-Inhibitoren (NNRTI), Nevirapin (NVP), 4-[[6-Amino-5-bromo-2-[(4-cyanophenyl)amino]-4-pyrimidinyl]oxy]-3,5-dimethyl-benzonitril, auch als Verbindung 1 bezeichnet, 4-[[6-Amino-5-bromo-2-[(4-cyanophenyl)amino]-4-pyrimidinyl]oxy]-3,5-dimethyl-benzonitril, auch als Verbindung 2 bezeichnet, Proteaseinhibitoren (PR), Saquinavir (SQV), Amprenavir (APV), Indinavir (IDV), [(1S,2R)-3-[[(4-Aminophenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]-2-hydroxy-1-(phenylmethyl)-propyl]-, (3R,3aS,6aR)-Hexahydrofuro[2,3-b]furan-3yl-ester-Carbamidsäure, auch als Verbindung 3 bezeichnet, Entry-Inhibitoren (Entry) (AMD3100, DS5000, ATA) und Integraseinhibitor (IN) 2-(1-Methylethyloxy)-α,γ-dioxo-5-(phenylmethyl)-benzen-Butansäure, auch als Verbindung 4 bezeichnet, bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. AVE steht für Antivirusexperiment. Typ steht für den Typ des untersuchten Inhibitors. Die Quotientenänderung ist die Quotientenänderung des EC50. WT III B bedeutet, dass ein Teil des Wildtyp-IIIB-Stammes amplifiziert und in dem Antivirusexperiment verwendet wurde, einschließlich Transfektion und Erzeugung von rekombinantem Virus. NL4-3 bedeutet, dass das Integrasegen dieses Laborstammes amplifiziert und anschließend für das Antivirusexperiment verwendet wurde. Patient 146514 bedeutet, dass das Integrasegen einer HIV-Probe, die dem Patienten entnommen wurde, amplifiziert und in dem Antivirusexperiment verwendet wurde. pHXB2D wurde als eine Kontrolle verwendet. Mittels dieses HIV-Klons wurde keine Rekombination bewirkt. pHXB2D wurde direkt für die Transfektion und das Antivirusexperiment verwendet. Der Primersatz 3 besteht aus den äußeren Primern 5'EGINT3 (SEQ ID Nr. 4) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) und den inneren Primern 5'EGINT4 (SEQ ID Nr. 5) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7). Der Primersatz 4 besteht aus den äußeren Primern 5'EGINT3 (SEQ ID Nr. 4) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) und den inneren Primern 5'EGINT5 (SEQ ID Nr. 5) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7). Zu weiteren geeigneten Integraseinhibitoren zählen L-731, 988, Diketosäuren und S-1360.Recombination was checked by nucleic acid sequence analysis using protocols known to those skilled in the art. Sequencing primers that can be used are In_seq1F (SEQ ID NO: 17), In_seq2F (SEQ ID NO: 18), In_seq3F (SEQ ID NO: 19), IN_seq1R (SEQ ID NO: 20), IN_seq2R (SEQ ID NO: 21) and IN_seq3R (SEQ ID NO: 22). The recombinant virus was tested in an antiviral assay with a panel of reference compounds including nucleoside RT inhibitors (NRTI), zidovudine (AZT), lamivudine (3TC), didanosine (DDI), non-nucleoside RT inhibitors (NNRTI), Nevirapine (NVP), 4 - [[6-amino-5-bromo-2 - [(4-cyanophenyl) amino] -4-pyrimidinyl] oxy] -3,5-dimethylbenzonitrile, also referred to as Compound 1, 4 - [[6-amino-5-bromo-2 - [(4-cyanophenyl) amino] -4-pyrimidinyl] oxy] -3,5-dimethylbenzonitrile, also referred to as compound 2, protease inhibitors (PR), saquinavir ( SQV), amprenavir (APV), indinavir (IDV), [(1S, 2R) -3 - [[(4-aminophenyl) sulfonyl] (2-methylpropyl) amino] -2-hydroxy-1- (phenylmethyl) -propyl ] -, (3R, 3aS, 6aR) -hexa-furrofuro [2,3-b] furan-3yl-ester-carbamic acid, also referred to as compound 3, entry inhibitors (AMD3100, DS5000, ATA) and integrase inhibitor (IN ) 2- (1-methylethyloxy) -α, γ-dioxo-5- (phenylmethyl) -benzenebutanoic acid, also referred to as Compound 4. The results are summarized in Table 2. AVE stands for anti-virus experiment. Type is the type of inhibitor tested. The quotient change is the quotient change of the EC 50 . WT III B means that part of the wild-type IIIB strain has been amplified and used in the antiviral experiment, including transfection and recombinant virus production. NL4-3 means that the integrase gene of this laboratory strain was amplified and subsequently used for the antiviral experiment. Patient 146514 means that the integrase gene of an HIV sample taken from the patient was amplified and used in the antiviral experiment. pHXB2D was used as a control. No recombination was effected by this HIV clone. pHXB2D was used directly for transfection and the antiviral experiment. Primer set 3 consists of the outer primers 5'EGINT3 (SEQ ID NO: 4) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) and the inner primers 5'EGINT4 (SEQ ID NO: 5) and 3'EGINT6 (SEQ ID No. 7). Primer set 4 consists of the outer primers 5'EGINT3 (SEQ ID NO: 4) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) and the inner primers 5'EGINT5 (SEQ ID NO: 5) and 3'EGINT6 (SEQ ID No. 7). Other suitable integrase inhibitors include L-731, 988, diketo acids, and S-1360.

Die Antivirusaktivität dieser Verbindungen gegen rekombinantes Virus aus Wildtyp-HIV-1 IIIB oder NL4.3 war identisch mit der Aktivität gegen den HIV-1 IIIB und pHXB2D-Kontrollstamm, wo keine Rekombination durchgeführt wurde. Rekombinantes Virus erzeugt aus ortsgerichtetem Mutantenvirus ergab einen Quotientenanstieg beim EC50 gegen Verbindung 4 entsprechend um das 2-Fache (T66I-Mutation), 5-Fache (S153Y), 3-Fache (M154I-Mutation), 10-Fache (T66I/S153Y-Mutationen oder T66I/M154I-Mutationen). Rekombinantes Virus erzeugt aus Patientenproben ohne Mutationen in der Integrasecodiersequenz zeigte analoge Ergebnisse zu den Wildtypstämmen in dem Antivirus-Assay. Das Panel der Protease- und Reverse Transkriptase-Inhibitoren wurde in die Liste eingeschlossen, um zu belegen, dass keine Hintergrundresistenz, ausgedrückt durch einen Quotientenanstieg des EC50, erkannt wurde. Die Reverse Transkriptase- und Protease-Gene, die in den Antivirusexperimenten vorliegen, wurden aus Wildtyp-HIV-Sequenz abgeleitet, welche keine Resistenz gegenüber den enthaltenen Arzneistoffen zeigt. Die vorliegenden Ergebnisse (Tabelle 2) zeigen, dass keine Veränderung in der Suszeptibilität für eine dieser Verbindungen gefunden wurde.The antiviral activity of these compounds against recombinant virus from wild-type HIV-1 IIIB or NL4.3 was identical to the activity against the HIV-1 IIIB and pHXB2D control strain, where no recombination was performed. Recombinant virus generated from site-directed mutant virus gave rise to an increase in the ratio of EC 50 to compound 4 corresponding to 2-fold (T66I mutation), 5-fold (S153Y), 3-fold (M154I mutation), 10-fold (T66I / S153Y Mutations or T66I / M154I mutations). Recombinant virus generated from patient samples without mutations in the integrase coding sequence showed analogous results to the wild type strains in the antiviral assay. The panel of protease and reverse transcriptase inhibitors were included in the list to prove that no background resistance, expressed by a quotient of the increase in EC 50, was detected. The reverse transcriptase and protease genes present in the anti-virus experiments were derived from wild-type HIV sequence which shows no resistance to the drugs contained. The present results (Table 2) show that no change in susceptibility to any of these compounds was found.

Figure 00350001
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Beispiel 2: Genotypisierung der IntegraseExample 2: Genotyping of the integrase

Die Verfahren und Bedingungen, die für die Sequenzanalyse des HIV-Integrasegens verwendet wurden, sind unten zusammengefasst. Die Sequenzierungsprimer (siehe Tabelle 1) decken den Bereich von 864 Nukleotiden ab, von Nukleotid 4230 bis 5093 gemäß der Sequenz, die im HIV-Klon HXB2D vorliegt. Die Sequenzierungsprimer wurden auf 1 pmol/μl verdünnt und in der Mischung und unter den Bedingungen wie unten beschrieben verwendet. Reaktionsmischung Komponente Reaktionsmischung Big Dye Terminator Mix 4 μl 2,5 Verdünnungspuffer 4 μl Wasser 4,8 μl Primer (1 pmol/μl) 3,2 μl Probe (200–500 ng/μl) 4 μl GESAMT 20 μl Thermozyklusbedingungen Startdenaturierung 3' bei 96°C Denaturierung 30'' bei 96°C | Verschmelzen 15'' bei 50°C | 30 Zyklen Verlängerung 4'bei 60°C | Halten auf 4°C The methods and conditions used for sequence analysis of the HIV integrase gene are summarized below. The sequencing primers (see Table 1) cover the range of 864 nucleotides, from nucleotides 4230 to 5093 according to the sequence present in the HIV clone HXB2D. The sequencing primers were diluted to 1 pmol / μl and used in the mixture and under conditions as described below. reaction component reaction Big Dye Terminator Mix 4 μl 2.5 dilution buffer 4 μl water 4.8 μl Primer (1 pmol / μl) 3.2 μl Sample (200-500 ng / μl) 4 μl TOTAL 20 μl Thermal cycling conditions Startdenaturierung 3 'at 96 ° C denaturation 30 "at 96 ° C | merge 15 "at 50 ° C | 30 cycles renewal 4 'at 60 ° C | Hold at 4 ° C

Nach der Zyklussequenzierung wurden die Reaktionsprodukte aufgereinigt und auf dem 3700 DNA-Analyzer analysiert.To In the cycle sequencing, the reaction products were purified and analyzed on the 3700 DNA Analyzer.

Beispiel 3: Konstruktion eines rekombinanten IN-VektorsExample 3: Construction of a recombinant IN-vector

A) Konstruktion des pSV40HXB2DΔR-IN-vifA) Construction of the pSV40HXB2DΔR-IN-vif

Der pSV40HXB2DΔR-IN-vif-Vektor weist eine Deletion der kompletten IN-Codiersequenz sowie eines Teils der vorhergehenden RNase- und der anschließenden Vif-Codiersequenz auf. Er wurde durch PCR-Amplifikation von pSV40HXB2D und erneute Ligation des amplifizierten Fragments konstruiert. Die für die Amplifikation verwendeten Primer waren MUT IN1 (5' GGG TGA CAA CTT TTT GTC TTC CTC TAT 3'; SEQ ID Nr.: 13) und IN2 (5' GGA TCC TGC AGC CCG GGA AAG CTA GGG GAT GGT TTT ATA GA 3'; SEQ ID Nr.: 23), welche eine SmaI-Stelle enthalten. Der Primer MUT IN1 (SEQ ID Nr. 13) verschmilzt mit den Nukleotiden 3954 bis 3928 und der Primer IN2 (SEQ ID Nr. 23) verschmilzt mit den Nukleotiden 5137 bis 5163. Die ersten 14 Nukleotide von IN2 (SEQ ID Nr. 23) umfassen den SmaI-Schwanz, welcher nicht mit dem Vektor verschmilzt. Das amplifizierte Produkt wurde mit SmaI gespalten und neu ligiert, um pSV40HXB2DΔR-IN-vif zu erzeugen, mit einer SmaI-Erkennungsstelle an der Stelle der Deletion.Of the pSV40HXB2DΔR-IN-vif vector has a deletion of the complete IN coding sequence as well as a part the preceding RNase and the subsequent Vif coding sequence. He was confirmed by PCR amplification of pSV40HXB2D and religation of the amplified fragment. The ones used for the amplification Primers were MUT IN1 (5 'GGG TGA CAA CTT TTT GTC TTC CTC ACT 3 '; SEQ ID NO: 13) and IN2 (5 'GGA TCC TGC AGC CCG GGA AAG CTA GGG GAT GGT TTT ATA GA 3 '; SEQ ID NO: 23), which is a SmaI site contain. The primer MUT IN1 (SEQ ID NO: 13) merges with the Nucleotides 3954 to 3928 and primer IN2 (SEQ ID NO: 23) fused with nucleotides 5137 to 5163. The first 14 nucleotides of IN2 (SEQ ID NO: 23) include the SmaI tail, which does not match merges into the vector. The amplified product was labeled with SmaI cleaved and religated to generate pSV40HXB2DΔR-IN-vif, with a SmaI recognition site at the site of the deletion.

B) Amplifikation der vom Patienten abgeleiteten IN-Sequenzen für die Einfügung in pSV40HXB2DΔR-IN-vifB) Amplification of the patient-derived IN sequences for insertion into pSV40HXB2DΔR-IN-vif

Zum Amplifizieren des kompletten IN-Codierbereichs und der flankierenden Segmente des RNase- und Vif-Codierbereichs zum Einfügen in den pSV40HXB2DΔR-IN-vif-Vektor wurde ein verschachteltes PCR-Verfahren verwendet. Die äußeren Primer waren 5'EGINT1 (SEQ ID Nr. 1) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11), während der innere Satz 5'EGINT107 (SEQ ID Nr. 2) und 3'EGINT11 (SEQ ID Nr. 12) war. Ein zusätzlicher innerer 5'-Primer, 5'EGINT2 (SEQ ID Nr. 3), wurde verwendet, um den Ertrag der amplifizierten DNA zu verbessern. (Die Sequenzen dieser Primer sind in Tabelle 1 oben angegeben.)To the Amplify the complete IN coding area and the flanking one Segments of the RNase and Vif coding area for insertion into the pSV40HXB2DΔR-IN-vif vector a nested PCR procedure was used. The outer primers were 5'EGINT1 (SEQ ID No. 1) and 3'EGINT10 (SEQ ID NO: 11) while the inner sentence 5'EGINT107 (SEQ ID NO: 2) and 3'EGINT11 (SEQ ID NO: 12). An additional interior 5 'primer, 5'EGINT2 (SEQ ID NO. 3) was used to improve the yield of the amplified DNA. (The sequences of these primers are given in Table 1 above.)

C) Konstruktion des pSV40HXB2DΔIN-VektorsC) Construction of the pSV40HXB2DΔIN vector

Zum Erzeugen des pSV40HXB2DΔIN wurde der pSV40HXB2D-Vektor PCR-amplifiziert und neu ligiert, um wirksam den größten Teil des IN-Codierbereichs zu löschen, wodurch die Nukleotide, welche die 8 N-Terminus-Aminosäuren und die 20 C-Terminus-Aminosäuren codieren, an ihrer Position blieben. Die Amplifikation erfolgte mittels der Primer MUT IN3 (5' GGG CCT TAT CTA TTC CAT CTA AAA ATA GT 3'; SEQ ID Nr.: 15) und MUT IN4 (5' GGA TCC TGC AGC CCG GGA TTA TGG AAA ACA GAT GGC A 3'; SEQ ID Nr.: 16), welche eine SmaI-Stelle enthalten. Der Primer MUT IN3 (SEQ ID Nr. 15) verschmilzt mit den Nukleotiden 4254 bis 4226 und der Primer MUT IN4 (SEQ ID Nr. 16) verschmilzt mit den Nukleotiden 5036 bis 5057. Das entstehende amplifizierte Fragment kann mit SmaI gespalten und neu an pSV40HXB2DΔIN ligiert werden.To generate the pSV40HXB2DΔIN, the pSV40HXB2D vector was PCR amplified and reissued to effectively quench most of the IN coding region, leaving the nucleotides encoding the 8 N-terminus amino acids and the 20 C-terminus amino acids in position. Amplification was performed using the primers MUT IN3 (5 'GGG CCT TAT CTA TTC CAT CTA AAA ATA GT 3', SEQ ID NO: 15) and MUT IN4 (5 'GGA TCC TGC AGC CCG GGA TTA TGG AAA ACA GAT GGC A 3 ', SEQ ID NO: 16) containing a SmaI site. The primer MUT IN3 (SEQ ID NO: 15) fuses with nucleotides 4254 to 4226 and the primer MUT IN4 (SEQ ID NO: 16) fuses with nucleotides 5036 to 5057. The resulting amplified fragment can be cleaved with SmaI and rearranged on pSV40HXB2DΔIN be ligated.

D) Amplifikation der vom Patienten abgeleiteten IN-Sequenzen zum Ein fügen in pSV40HXB2DΔIND) amplification of the patient-derived IN sequences for Insert in pSV40HXB2DΔIN

Vom Patienten abgeleitete IN-Sequenzen wurden für die Einfügung in den HIV-Deletionsvektor mittels eines verschachtelten PCR-Ansatzes wie in Teil B oben hergestellt. 5'EGINT3 (SEQ ID Nr. 4) und 3'EGINT10 (SEQ ID Nr. 11) wurden als äußere PCR-Primer verwendet, während 5'EGINT4 (SEQ ID Nr. 5) oder 5'3GINP5 (SEQ ID Nr. 6) und 3'EGINT6 (SEQ ID Nr. 7) als innere Primer verwendet wurden. Die Sequenzen und SEQ ID Nr. 4–8 dieser Primer sind in Tabelle 1 angegeben. Der unterstrichene Teil von MUT IN4 (SEQ ID Nr. 16) stellt den SmaI-Schwanz dar, der nicht mit dem Vektor verschmilzt.from Patient-derived IN sequences were identified for insertion into the HIV deletion vector by a nested PCR approach as prepared in part B above. 5'EGINT3 (SEQ ID No. 4) and 3'EGINT10 (SEQ ID No. 11) were used as outer PCR primers used while 5'EGINT4 (SEQ ID No. 5) or 5'3GINP5 (SEQ ID No. 6) and 3'EGINT6 (SEQ ID NO: 7) were used as inner primers. The sequences and SEQ ID Nos. 4-8 these primers are given in Table 1. The underlined part of MUT IN4 (SEQ ID NO: 16) represents the SmaI tail, which is not merges with the vector.

E) Homologe Rekombination und Ligation zum Einfügen der PCR-Produkte in die VektorenE) Homologous recombination and ligation to paste the PCR products in the vectors

Der pSV40HXB2DΔIN- oder der pSV40HXB2DΔR-IN-vif-Vektor wurde mit SmaI linearisiert. Die Vektoren und die amplifizierten IN-DNA-Fragmente wurden durch Elektroporation in MT4-Zellen transfiziert, wobei die MT4-Zellen mit einem LTR-Reportergenkonstrukt (MT4-rep) oder PM-1-Zellen ausgestattet waren. Durch homologe Rekombination zwischen überlappenden Teilen des Vektors und IN-Amplifikaten wurde das HIV-Genom mit einem vom Patienten ab geleiteten IN-Coderbereich rekonstituiert. Die rekombinanten Vektoren waren in der Lage, Viruspartikel in infizierten Zellen zu erzeugen. Die Virusproduktion wurde durch Auswertung der zytopathogenen Wirkung (CPE), die normalerweise durch HIV-Infektion der MT4-, MT4-rep- oder PM-1-Zellen induziert wird, bewertet, oder sie wurde durch das induzierte LTR-gesteuerte Reportersignal in MT4-rep- oder PM-1-Zellen bewertet. Homologe Rekombination mit Wildtyp-IN-Sequenzen wurde als eine Kontrolle verwendet.Of the pSV40HXB2DΔIN- or the pSV40HXB2DΔR IN vif vector was linearized with SmaI. The vectors and the amplified IN DNA fragments were transfected into MT4 cells by electroporation, wherein the MT4 cells are infected with an LTR reporter gene construct (MT4-rep) or PM-1 cells were equipped. By homologous recombination between overlapping Dividing the vector and IN amplicons was the HIV genome with a Reconstituted from the patient derived IN-coder area. The recombinant Vectors were able to capture virus particles in infected cells to create. Virus production was assessed by evaluation of the cytopathogenic Effect (CPE) normally associated with HIV infection of the MT4, MT4 rep or PM-1 cells is induced, evaluated, or has been through the induced LTR-driven reporter signal in MT4-rep or PM-1 cells rated. Homologous recombination with wild-type IN sequences was used as a control.

Die Gegenwart rekombinanter IN-DNA- und RNA-Sequenzen in den transfizierten Zellen wurde durch reverse Transkription und PCR-Analyse überwacht. Die Gegenwart von PCR-Produkten, die korrekt eingefügten IN-Sequenzen entsprechen, zeigte, dass eine erfolgreiche Rekombination stattgefunden hat und dass Virus-RNA in den Zellen erzeugt wurde.The Presence of recombinant IN DNA and RNA sequences in the transfected Cells were monitored by reverse transcription and PCR analysis. The presence of PCR products, the correctly inserted IN sequences correspond, showed that successful recombination occurred and that viral RNA was produced in the cells.

Vom Patienten abgeleitete IN-Sequenzen und Wildtyp-Kontrollen wurden alternativ durch ein standardmäßiges Restriktionsdigestions- und Ligationsverfahren in SmaI-linearisierte pSV40HXB2DΔN- oder pSV40HXB2DΔR-IN-vif-Vektoren eingefügt. Die IN-Amplifikate wurden modifiziert, um SmaI-gespaltenen Enden zu erzeugen, und dann durch Ligation in die SmaI-Stelle auf den Vektoren eingefügt.from Patients-derived IN sequences and wild-type controls were alternatively used standard restriction digestion and ligation methods in SmaI-linearized pSV40HXB2DΔN- or pSV40HXB2DΔR IN vif vectors. The IN amplicons were modified to add SmaI-cleaved ends and then by ligation into the SmaI site on the vectors inserted.

Beispiel 4: Genotypisierung der vom Patienten abgeleiteten IN-CodiersequenzenExample 4: Genotyping of the patient derived IN coding sequences

A) Erhalt und Amplifikation der vom Patienten abgeleiteten IN-SequenzenA) Obtain and amplify the patient derived IN sequences

RNA wurde gemäß der durch Boom et al. (1990) beschriebenen Verfahren aus 100 μl Plasma isoliert und mit dem GENEAMP® Reverse-Transkriptase-Kit (Perkin Elmer) wie durch den Hersteller beschrieben mittels eines HIV-1-spezifischen stromabwärtigen Primers revers transkri biert. Zwei anschließende verschachtelte PCRs wurden mittels spezifischer äußerer Primer bzw. innerer Primer durchgeführt. Die äußere Primerreaktion wurde wie in WO 97/27480 und US-Patentschrift Nr. 6,221,578 (welche durch Verweis hierin eingefügt sind) beschrieben durchgeführt. Die innere Amplifikation erfolgte wie folgt in einer 96-Well-Platte: 4 μl des äußeren Amplifikationsproduktes wurden mittels einer 10X-Amplifikationsmischung bestehend aus 5 μl 10X-PCR-Puffer, der 15 mM MgCl2, 1 μl dNTP's (10 mM), 0,5 μl von jedem Primer (0,25 μg/ml), 0,4 μl EXPAND® High-Fidelity-Polymerase (3,5 U/μl; Roche) und entionisiertes Wasser enthielt, auf ein Abschlussvolumen von 50 μl verdünnt. Die Amplifikation wurde nach einer kurzen Denaturierung des Amplifikationsproduktes unter Verwendung der äußeren Primer (2 Min. bei 94°C) initiiert. Es erfolgten zehn Amplifikationszyklen, jeder bestehend aus einem Denaturierungsschritt mit 15 Sek. bei 94°C, einem Verschmelzungsschritt mit 30 Sek. bei 60°C und einem Polymerisationsschritt mit 2 Min. bei 72°C. Dieser Amplifikation folgten umgehend 25 Zyklen bestehend aus einem Denaturierungsschritt mit 15 Sek. bei 94°C, einem Verschmelzungsschritt mit 30 Sek. bei 60°C und einem Polymerisationsschritt mit variabler Zeit bei 72°C. Der Polymerisationsschritt erfolgte anfänglich für 2 Min. und 5 Sek. und wurde dann in jedem Zyklus um 5 Sekunden verlängert. Die Amplifikation wurde durch einen zusätzlichen Polymerisationsschritt von 7 Min. bei 72°C abgeschlossen. Die Reaktionen wurden bis zur weiteren Analyse auf 4°C gehalten oder bei –20°C (für kurze Zeit) oder –70°C (für längere Zeit) gelagert. Die Produkte können auf DNA-Agarosegelen analysiert und durch UV-Erkennung visualisiert werden. Die Produkte können mittels des QIAQUICK® 96-Well-Plattensystems, wie durch den Hersteller (Qiagen) beschrieben, aufgereinigt werden.RNA was prepared according to the method described by Boom et al. (1990) described methods, 100 ul plasma and isolated with the GENEAMP ® reverse transcriptase kit biert reverse transkri (Perkin Elmer) as described by the manufacturer using an HIV-1 specific downstream primer. Two subsequent nested PCRs were performed using specific outer primers and inner primers, respectively. The outer primer reaction was as in WO 97/27480 and U.S. Patent No. 6,221,578 (which are incorporated by reference herein). Internal amplification was performed in a 96-well plate as follows: 4 μl of the outer amplification product was amplified by a 10X amplification mixture consisting of 5 μl of 10X PCR buffer containing 15 mM MgCl 2 , 1 μl dNTP's (10 mM) , 5 ul of each primer (0.25 ug / ml), 0.4 .mu.l EXPAND ® high Fidelity polymerase (3.5 U / ul; Roche) and deionized water containing diluted to a final volume of 50 ul. The amplification was initiated after a brief denaturation of the amplification product using the outer primers (2 min. At 94 ° C). There were ten cycles of amplification, each consisting of a 15 sec. Denaturation step at 94 ° C, a 30 sec. Fusion step at 60 ° C, and a 2 min. Polymerization step at 72 ° C. This amplification was immediately followed by 25 cycles consisting of a denaturation step of 15 sec at 94 ° C, a 30 sec. Fusion step at 60 ° C, and a variable time polymerization step at 72 ° C. The polymerization step was initially for 2 min. And 5 sec. And was then extended 5 sec. In each cycle. The amplification was completed by an additional 7 min. polymerization step at 72 ° C. The reactions were held at 4 ° C until further analysis or stored at -20 ° C (for a short time) or -70 ° C (for a longer time). The products can be analyzed on DNA agarose gels and visualized by UV detection. The products can be purified with the QIAquick ® 96-well plate system as indicated by the manufacturer (Qiagen) described, to be purified.

B. Sequenzierung des IN-CodierbereichsB. Sequencing of the IN coding area

Der IN-Codierbereich, der auf den amplifizierten Fragmenten vorliegt, wurde mit Hilfe von Techniken sequenziert, die in der Technik bekannt sind. Die Sequenzierung begann zunächst mit der Verteilung von 4 μl der Primerausgangsmaterialien (4,0 μM) über eine 96-Well-Platte, wo jedes Ausgangsmaterial in die Säule pipettiert wurde. In einem zweiten Schritt wurden Stammmischungen bestehend aus 14 μl entionisiertem Wasser, 17,5 μl Verdünnungspuffer, 7 μl Probe (PCR-Fragment) und 14 μl Big DyeTM Terminator Mix (Perkin Elmer) hergestellt. Eine Fraktion (7,5 μl) jeder Stammmischung, die ein spezifisches PCR-Fragment enthält, wurde an eine spezifische Stelle in der 96-Well-Platte übertragen, so dass jede Probenfraktion mit einem unterschiedlichen PCR-Primersatz gemischt wurde. Die Proben wurden über die Reihen hinweg pipettiert. Die Proben wurden in einen Thermozykler gegeben und die Sequenzierungszyklen gestartet. Die Sequenzierungsreaktion bestand aus 25 Wiederholungszyklen mit 10 Sek. bei 96°C, 5 Sek. bei 50°C bzw. 4 Min. bei 60°C. Abschließend wurden die Sequenzreaktionen auf 4°C gehalten oder bis zur weiteren Analyse eingefroren. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mittels eines standardmäßigen Ethanolpräzipitationsverfahrens präzipitiert, in 2 μl Formamid resuspendiert und für 2 Minuten bei 92°C im Thermozykler erhitzt. Die Proben wurden auf Eis abgekühlt, bis sie bereit zum Laden waren. 1 μl jeder Reaktion wurde auf ein vertikales 4,25 % Acrylamidgel in einem 377 Sequenzersystem geladen und das Gel wurde laufen gelassen, bis die Trennung der Fragmente abgeschlossen war.The IN coding region present on the amplified fragments was sequenced by techniques known in the art. Sequencing began by first distributing 4 μl of primer starting materials (4.0 μM) over a 96-well plate where each starting material was pipetted into the column. In a second step, masterbatches consisting of 14 μl deionized water, 17.5 μl dilution buffer, 7 μl sample (PCR fragment) and 14 μl Big Dye ™ Terminator Mix (Perkin Elmer) were prepared. A fraction (7.5 μl) of each strain mix containing a specific PCR fragment was transferred to a specific site in the 96 well plate so that each sample fraction was mixed with a different PCR primer set. The samples were pipetted across the rows. The samples were placed in a thermocycler and the sequencing cycles started. The sequencing reaction consisted of 25 repetitive cycles of 10 seconds at 96 ° C, 5 seconds at 50 ° C, and 4 minutes at 60 ° C. Finally, the sequence reactions were held at 4 ° C or frozen until further analysis. The sequencing reactions were precipitated by a standard ethanol precipitation method, resuspended in 2 μl formamide and heated for 2 minutes at 92 ° C in the thermocycler. The samples were chilled on ice until ready to load. 1 μl of each reaction was loaded onto a vertical 4.25% acrylamide gel in a 377 sequencer system and the gel was run until the separation of the fragments was complete.

C. Sequenzanalyse des IN-CodierbereichsC. Sequence analysis of the IN coding region

Probensequenzen wurden als ein spezifisches Projekt in den Sequenzmanager des SequencherTM (Genecodes) importiert und mit der Wildtyp-Referenzsequenz verglichen. Die Sequenzen wurden automatisch aufgebaut und auf eine minimale Übereinstimmung von 85% eingestellt. Sekundäre Spitzen wurden gesucht und das Minimum auf 60% eingestellt. Jede Sequenz, die sich über das 5'-Ende oder das 3'-Ende der Referenz hinaus erstreckte, wurde gelöscht. Wenn ein Überlappungsbereich zwischen Sequenzen aus dem gleichen Strang erreicht wurde, wurde die schlechteste Sequenzqualität gelöscht, wodurch eine Überlappung von 5–10 Basen übrig blieb. Unklare Basecalls wurden als schlechte Übereinstimmungen zu exakten Basecalls erachtet. Der Sequenzaufbau wurde innerhalb eines editierbaren Contig gespeichert.Sample sequences were imported as a specific project into the sequencer of the Sequencher ™ (Genecode) and compared to the wild-type reference sequence. The sequences were built automatically and set to a minimum match of 85%. Secondary peaks were searched and the minimum set to 60%. Any sequence extending beyond the 5 'end or the 3' end of the reference has been deleted. When an overlap region between sequences from the same strand was achieved, the worst sequence quality was deleted, leaving an overlap of 5-10 bases. Unclear basecalls were considered bad matches to exact basecalls. The sequence structure was stored within an editable contig.

Die erhaltenen Sequenzen wurden editiert, um die Interpretation der Basecalls zu vereinfachen. Unklare Sequenzen wurden entnommen und auf mögliche Fehler oder Heterogenitätspunkte überprüft. Wenn sich der Punkt der Unklarheit als korrekt erwies (beide Stränge der Sequenz stimmten überein, unterschieden sich jedoch von der Referenzsequenz) wurde dies als eine Variante interpretiert. Die Referenzsequenz wurde als eine Hilfe zum Aufbau eines Contig und als eine Führung für die Gesamtgröße und zum Beschneiden verwendet. Die Referenzsequenz wurde nicht zum Entscheiden von Basecalls verwendet. Eine Änderung wurde nur vorgenommen, wenn beide Stränge übereinstimmten. Sämtliche Lücken wurden gelöscht oder gefüllt, es sei denn sie traten in benachbarten Gruppen von Mehrfachen von drei auf (d. h. Einfügung oder Deletion kompletter Codons), basierend auf der Datenform beider Sequenzstränge. Nachdem das Editieren abgeschlossen war, wurde die neue Contig-Sequenz als eine Übereinstimmungssequenz gespeichert und zur weiteren Analyse verwendet.The obtained sequences were edited to facilitate the interpretation of Simplify basecalls. Unclear sequences were taken and on possible Errors or heterogeneity points checked. If the point of obscurity proved correct (both strands of the Sequence agreed, however, differed from the reference sequence) this was considered interpreted a variant. The reference sequence was called a Help to build a contig and as a guide for the overall size and the Used cropping. The reference sequence was not decided used by basecalls. A change was only done if both strands matched. All Gaps were deleted or filled, unless they occurred in neighboring groups of multiples of three (i.e., insertion or deletion of complete codons) based on the data form of both Sequence strands. After the editing was completed, the new contig sequence became a match sequence stored and used for further analysis.

Die detaillierte Sequenzbearbeitung erfolgte unter Befolgung bestimmter Regeln: A) Applied Biosystems, Inc. Primer-Blobs wurden an den 5'-Enden beschnitten, wo 1 aufeinanderfolgende Base außerhalb der Skala blieb, die Sequenz wurde um nicht mehr als 25% beschnitten, bis die ersten 25 Basen weniger als 1 Unklarheit enthielten, wenigstens die ersten 10 Basen vom 5'-Ende wurden entfernt, und B) die 3'-Enden wurden beschnitten, beginnend bei 300 Basen nach dem 5'-Beschnitt, die ersten 25 Basen, welche mehr als 2 Unklarheiten enthielten, wurden entfernt, das 3'-Ende wurde beschnitten, bis die letzten 25 Basen weniger als 1 Unklarheit enthielten. Die maximale Länge des erhaltenen Sequenzfragmentes nach dem Beschnitt lag bei 550 Basen.The detailed sequencing was performed following certain Rules: A) Applied Biosystems, Inc. Primer blobs were trimmed at the 5 'ends, where 1 consecutive base remained outside the scale, the Sequence was cropped by no more than 25% until the first 25 bases contained less than 1 ambiguity, at least the first 10 bases from the 5'-end were removed, and B) the 3 'ends were trimmed, starting at 300 bases after the 5 'trimming, the first 25 bases containing more than 2 ambiguities were removed, the 3'-end was clipped until the last 25 bases contained less than 1 ambiguity. The maximum length of the obtained sequence fragment after trimming was 550 Bases.

Sequenzen, die sich nicht ausrichteten, wurden aus dem Aufbau entfernt und durch Daten ersetzt, die aus neuen Sequenzanalysen entnommen wurden. Wenn weitere Ausfälle stattfanden, wurden die PCR-Reaktionen wiederholt. Chromatogramme wurden mittels eines IBM-Softwaresystems visualisiert.sequences who did not align themselves were removed from the construction and replaced by data taken from new sequence analyzes. If more failures took place, the PCR reactions were repeated. chromatograms were visualized using an IBM software system.

LEGENDEN ZU DEN FIGURENLEGENDS TO THE FIGURES

1: Überblick über das HIV-Genom unter Angabe der Primerpositionen 1 : Overview of the HIV genome indicating the primer positions

SEQUENZLISTE

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SEQUENCE LIST
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Claims (8)

In-vitro-Verfahren zur Entwicklung eines Arzneistoffregimes für einen mit HIV infizierten Patienten durch Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren: i) wenigstens eine HIV-RNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfaßt; ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so daß wenigstens ein das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt; iv) wenigstens ein rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt und v) das wenigstens eine rekombinante Virus in Gegenwart des wenigstens einen Arzneistoffs überwacht, um die phänotypische Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff zu bestimmen, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.An in vitro method of developing a drug regimen for a HIV-infected patient by determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug using: i) at least one sample of HIV-RNA from a patient; the sample comprises at least one IN gene or part thereof; ii) reverse transcribing and amplifying the HIV RNA with primers specific for the IN region of the HIV genome such that at least one amplicon comprising the at least one IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12; iii) an HIV reference sequence having a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion is generated by means of nucleic acid amplification, generates a comprehensive plasmid; iv) producing at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplicon obtained in step ii) and a plasmid comprising the HIV reference sequence with a deletion in the IN region and v) the at least one recombinant virus in the presence of at least monitoring a drug to determine the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of phenotypic susceptibility is by determining cytopathogenicity or by determining replicative capacity. In-vitro-Verfahren zur Entwicklung eines Arzneistoffregimes für einen mit HIV infizierten Patienten durch Bestimmen der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren: i) wenigstens eine HIV-DNA-haltige Probe verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfaßt; ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so daß wenigstens ein das wenigstens eine IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt; iv) wenigstens ein rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen amplifizierten wenigstens einen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt und v) das wenigstens eine rekombinante Virus in Gegenwart des wenigstens einen Arzneistoffs überwacht, um die phänotypische Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff zu bestimmen, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.In vitro method for the development of a drug regime for one HIV-infected patients by determining the phenotypic susceptibility at least one HIV at least one drug, wherein in the process: i) at least one HIV-DNA-containing sample is used, wherein the sample at least one IN gene or part of it; ii) the HIV DNA with for the IN area of the HIV genome amplified specific primers, so that at least one at least receive an IN gene or a part thereof amplificate wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12; iii) an HIV reference sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion by means of nucleic acid amplification is generated, generates comprehensive plasmid; iv) at least one recombinant virus by homologous recombination or ligation between the amplified at least one amplificate obtained in step ii) and one the HIV reference sequence with a deletion in the IN region produces comprehensive plasmid and v) the at least one recombinant Monitor virus in the presence of the at least one drug, around the phenotypic susceptibility at least one HIV to determine at least one drug, the provision the phenotypic susceptibility by determining the cytopathogenicity or by determining the replicative efficiency he follows. In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Suszeptibilität wenigstens eines HIV-Virus gegenüber wenigstens einem Arzneistoff über die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart wenigstens eines Arzneistoffs im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt wird.An in vitro method according to claim 1 or 2, wherein the susceptibility at least one HIV virus at least one drug over the relative replicative capacity of the recombinant virus in the presence of at least one drug compared to one HIV virus is determined with an IN reference gene sequence. In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren: i) wenigstens eine HIV-RNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfaßt; ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so daß ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt und iv) die Nukleotidsequenz des Amplifikats mit der Sequenz von Sequenzen, deren phänotypische Suszeptibilität bekannt ist, zur Abschätzung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff vergleicht, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.In vitro method for determination of phenotypic susceptibility at least one HIV at least a drug, wherein in the process: i) at least used an HIV RNA-containing sample from a patient, wherein the sample comprises at least one IN gene or part thereof; ii) the HIV RNA with for the IN area of the HIV genome reverse transcribed and amplified specific primers, so that the Receive IN gene or a part thereof amplificate, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12; iii) the nucleotide sequence the amplificate or a part thereof, as obtained in step ii), determined and iv) the nucleotide sequence of the amplificate with the Sequence of sequences whose phenotypic Susceptibility known is to estimate the phenotypic susceptibility at least one HIV comparing at least one drug, the provision the phenotypic susceptibility by determining the cytopathogenicity or by determining the replicative efficiency he follows. In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff, wobei man in dem Verfahren: i) wenigstens eine HIV-DNA-haltige Probe aus einem Patienten verwendet, wobei die Probe wenigstens ein IN-Gen oder einen Teil davon umfaßt; ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so daß ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt und iv) die Nukleotidsequenz des Amplifikats mit der Sequenz von Sequenzen, deren phänotypische Suszeptibilität bekannt ist, zur Abschätzung der phänotypischen Suszeptibilität wenigstens eines HIV gegenüber wenigstens einem Arzneistoff vergleicht, wobei die Bestimmung der phänotypischen Suszeptibilität durch Bestimmen der Zytopathogenität oder durch Bestimmen der replikativen Leistungsfähigkeit erfolgt.An in vitro method for determining the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, the method comprising: i) using at least one sample of HIV-DNA from a patient, the sample comprising at least one IN gene or part including; ii) amplifying the HIV DNA with primers specific for the IN region of the HIV genome so that an amplicon comprising the IN gene or a part thereof is obtained, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12 ; iii) the nucleotide sequence of the amplificate or a part thereof as obtained in step ii), and iv) the nucleotide sequence of the amplificate with the sequence of sequences whose phenotypic susceptibility for the estimation of the phenotypic susceptibility of at least one HIV to at least one drug, wherein the determination of the phenotypic susceptibility is made by determining the cytopathogenicity or by determining the replicative capacity. In-vitro-Verfahren zur Konstruktion einer genotypischen und phänotypischen Datenbank von IN-Sequenzen, bei dem man: i) Proben von HIV-RNA aus einem Patienten verwendet, die das IN-Gen oder einen Teil davon umfassen; ii) die HIV-RNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern revers transkribiert und amplifiziert, so daß ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt; iv) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt; v) rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt; vi) die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart von Anti-HIV-Arzneistoffen im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt.In vitro method of constructing a genotypic and phenotypic Database of IN sequences, where: i) samples of HIV RNA used from a patient containing the IN gene or part of it include; ii) HIV RNA specific for the IN region of the HIV genome Primers reverse transcribed and amplified so that the Receive IN gene or a part thereof amplificate, wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12; iii) the nucleotide sequence the amplificate or a part thereof, as obtained in step ii), certainly; iv) an HIV reference sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion by means of nucleic acid amplification is generated, generates comprehensive plasmid; v) recombinant Virus by homologous recombination or ligation between the in Step ii) obtained amplicon and a HIV reference sequence producing a deletion in the IN region comprising plasmid; vi) the relative replicative capacity of the recombinant virus in the presence of anti-HIV drugs compared to an HIV virus determined with an IN reference gene sequence. In-vitro-Verfahren zur Konstruktion einer genotypischen und phänotypischen Datenbank von IN-Sequenzen, bei dem man: i) Proben von HIV-DNA verwendet, die das IN-Gen oder einen Teil davon umfassen; ii) die HIV-DNA mit für den IN-Bereich des HIV-Genoms spezifischen Primern amplifiziert, so daß ein das IN-Gen oder einen Teil davon umfassendes Amplifikat erhalten wird, wobei wenigstens ein Primer aus SEQ ID NO: 1–12 ausgewählt ist; iii) die Nukleotidsequenz des Amplifikats oder eines Teils davon, wie in Schritt ii) erhalten, bestimmt; iv) ein eine HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich des HIV-Genoms, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion mittels Nukleinsäureamplifikation erzeugt wird, umfassendes Plasmid erzeugt; v) rekombinantes Virus durch homologe Rekombination oder Ligation zwischen dem in Schritt ii) erhaltenen Amplifikat und einem die HIV-Referenzsequenz mit einer Deletion im IN-Bereich umfassenden Plasmid herstellt; vi) die relative replikative Leistungsfähigkeit des rekombinanten Virus in Gegenwart von Anti-HIV-Arzneistoffen im Vergleich zu einem HIV-Virus mit einer IN-Referenzgensequenz bestimmt.In vitro method of constructing a genotypic and phenotypic Database of IN sequences, where: i) samples of HIV DNA used the IN gene or part of it; ii) the HIV DNA for the IN area of the HIV genome specific Primers amplified so that a receive the IN gene or a part thereof amplificate wherein at least one primer is selected from SEQ ID NO: 1-12; iii) the nucleotide sequence of the amplificate or a part thereof, such as obtained in step ii); iv) an HIV reference sequence with a deletion in the IN region of the HIV genome, characterized in that the deletion means nucleic acid amplification is generated, generates comprehensive plasmid; v) recombinant Virus by homologous recombination or ligation between the in Step ii) obtained amplicon and a HIV reference sequence producing a deletion in the IN region comprising plasmid; vi) the relative replicative capacity of the recombinant virus in the presence of anti-HIV drugs compared to an HIV virus determined with an IN reference gene sequence. Plasmid zur Verwendung in einem der vorhergehenden Ansprüche 1–3 und 6–7, umfassend eine deletierte Integrase, gekennzeichnet durch die Hinterlegung LMBP 4574 vom 5. August 2002.Plasmid for use in any of the foregoing claims 1-3 and 6-7, comprising a deleted integrase, characterized by the deposit LMBP 4574 dated August 5, 2002.
DE2002622842 2001-08-08 2002-08-08 Method for the phenotypic and genotypic determination of the drug sensitivity of HIV intergase variants Expired - Lifetime DE60222842T2 (en)

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US31048001P 2001-08-08 2001-08-08
US310480P 2001-08-08
EP01203012 2001-08-08
EP01203012 2001-08-08

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