DE60222167T2 - GAMMA GLUTAMYLCYSTEIN PRODUCING YEAST - Google Patents
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Abstract
Description
Technisches GebietTechnical area
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Hefe, die eine mutierte Glutathionsynthetase mit verminderter Aktivität aufweist. Daraus hergestelltes γ-Glutamylcystein und Cystein sind auf dem Gebiet der Nahrungsmittel nützlich.The The present invention relates to a yeast containing a mutated glutathione synthetase with reduced activity having. Made of this γ-glutamylcysteine and cysteine are useful in the food field.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Cystein
wird eingesetzt, um das Aroma von Nahrungsmitteln und dergleichen
zu verbessern. Bekannte Herstellungsverfahren für Cystein umfassen ein Proteinzersetzungsverfahren
und ein halbsynthetisches Verfahren. Die derzeit hauptsächlich eingesetzten
Verfahren sind das Proteolyseverfahren und das halbsynthetische
Verfahren. Obwohl natürliche
Nahrungsmittelmaterialien mit hohen Cysteingehalten zu dem Zweck nachgefragt
werden, sie für
die Verstärkung
des Aromas von Nahrungsmitteln einzusetzen, sind solche natürlichen
Nahrungsmittelmaterialien bislang wenig bekannt. Andererseits ist
berichtet worden, dass die Wärmebehandlung
oder die Enzymbehandlung von Hefeextrakten, die γ-Glutamylcystein enthalten,
zu Nahrungsmittelmaterialien mit hohen Cysteingehalten führen kann
(
γ-Glutamylcystein
wird aus Cystein und Glutaminsäure
als Substraten durch die Funktion von γ-Glutamylcysteinsynthetase synthetisiert.
Andererseits wird Glutathion aus γ-Glutamylcystein
und Glycin als Substraten durch die Funktion von Glutathionsynthetase
synthetisiert. Deshalb kann als ein Verfahren zum Züchten einer
Hefe, die γ-Glutamylcystein
in hohen Konzentrationen anhäuft,
die Unterbrechung eines Gens vorgeschlagen werden, das für Glutathionsynthetase
kodiert. Hefen, deren Gene, die für Glutathionsynthetase kodieren,
unterbrochen worden sind, sind offenbart in
Jede der vorstehend beschriebenen Hefen hat jedoch den Nachteil, dass ihre Wachstumsraten in einem hohen Maß verringert sind. Außerdem haben Otake et al. berichtet, dass die Hefe, deren für Glutathionsynthetase kodierendes Gen unterbrochen worden ist, ein schwaches Wachstum bei der Kultivierung in einem Medium, das kein Glutathion enthält, im Vergleich zu einer Kultivierung in einem Medium zeigt, das Glutathion enthält (Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54(12), 3145-3150, 1990). Da jedoch Medien, die reichlich Glutathion enthalten, im Allgemeinen teuer sind und Glutathion selbst ebenfalls teuer ist, sind solche Medien für den industriellen Einsatz nicht bevorzugt. Andererseits wäre es ebenfalls unzweckmäßig, die vorstehend beschriebenen Hefen in hohen Dichten in kostengünstigen Medien, die unzureichende Mengen Glutathion enthalten, für die Verwendung im industriellen Maßstab zu kultivieren.each However, the yeast described above has the disadvantage that their growth rates are reduced to a high degree. Besides, have Otake et al. reports that the yeast, their glutathione synthetase coding Gene has been interrupted, a weak growth in cultivation in a medium that does not contain glutathione compared to a culture in a medium containing glutathione (Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990). However, there are media that are plentiful Containing glutathione are generally expensive and glutathione itself is also expensive, are such media for industrial use not preferred. On the other hand it also inappropriate, the Yeasts described above in high densities in cost-effective Media containing insufficient amounts of glutathione for use on an industrial scale to cultivate.
Offenbarung der ErfindungDisclosure of the invention
Vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Standes der Technik ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Hefe bereitzustellen, die eine mutierte Glutathionsynthetase mit verringerter Aktivität enthält und γ-Glutamylcystein und ein γ-Glutamylcystein enthaltendes Nahrungsmittel unter Verwendung der Hefe produziert.In front Background of the prior art described above it is an object of the present invention to provide a yeast which contains a mutant glutathione synthetase with reduced activity and γ-glutamylcysteine and a γ-glutamylcysteine containing food produced using the yeast.
Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen, um die vorstehend beschriebene Aufgabe zu lösen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass eine mutierte Glutathionsynthetase mit einer spezifizierten Mutation eine mäßige Glutathionsynthetaseaktivität zeigt, die für die Anhäufung von γ-Glutamylcystein und für das Wachstum der Hefe geeignet ist, und dass die Hefe, die das mutierte Enzym enthält, γ-Gluta mylcystein anhäuft, wodurch die vorliegende Erfindung gemacht wurde.When Result of extensive investigations to those described above Task to solve The inventors of the present invention have found that mutant glutathione synthetase with a specified mutation shows a moderate glutathione synthetase activity, the for the accumulation of γ-glutamylcysteine and for the Growth of the yeast is appropriate, and that the yeast that mutated Contains enzyme, γ-glutamylcysteine accumulates, whereby the present invention was made.
D. h., die vorliegende Erfindung stellt das Folgende bereit:
- (1) Eine Hefe, die eine mutierte Glutathionsyntethase mit einer oder beiden Mutationen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einer Mutation zum Ersetzen eines Threoninrests an der Position 47 durch einen Isoleucinrest und einer Mutation zum Ersetzen eines Glycinrests an der Position 387 durch einen Asparaginsäurerest besteht, und die γ-Glutamylcystein produziert.
- (2) Die Hefe nach (1), wobei die Hefe außerdem eine Mutation zum Ersetzen eines Prolinrests an der Position 54 durch einen Leucinrest aufweist.
- (3) Die Hefe nach (2), wobei die mutierte Glutathionsynthetase die Mutation zum Ersetzen eines Threoninrests an der Position 47 durch einen Isoleucinrest und die Mutation zum Ersetzen des Prolinrests an der Position 54 durch einen Leucinrest aufweist.
- (4) Die Hefe nach (2), wobei die mutierte Glutathionsynthetase die Mutation zum Ersetzen des Glycinrests an der Position 387 durch einen Asparaginsäurerest und die Mutation zum Ersetzen des Prolinrests an der Position 54 durch einen Leucinrest aufweist.
- (5) Die Hefe nach einem der Punkte (1) bis (4), wobei eine Glutathionsynthetase ohne die Mutation die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist.
- (6) Die Hefe nach einem der Punkte (1) bis (5), wobei die Hefe zu der Gattung Saccharomyces gehört.
- (7) Verfahren zum Herstellen eines Nahrungsmittels oder Getränks, welches γ-Glutamylcystein oder Cystein enthält, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen die Hefe nach einem der Punkte (1) bis (6) kultiviert wird, die erhaltene Kultur oder ein Fraktionierungsprodukt davon oder die einer Hitzebehandlung unterworfene Kultur oder das einer Hitzebehandlung unterworfene Fraktionierungsprodukt davon mit einem Nahrungsmittel- oder Getränkeausgangsmaterial gemischt wird und das Gemisch zu einem Nahrungsmittel oder Getränk verarbeitet wird.
- (8) Verfahren nach Punkt (7), wobei das Nahrungsmittel oder Getränk ein alkoholisches Getränk, ein Brotnahrungsmittel oder ein fermentiertes Nahrungsmittelaromamaterial ist.
- (9) Verfahren zum Herstellen eines Hefeextrakts, welches die Stufen umfasst, bei denen eine Hefe nach einem der Punkte (1) bis (6) kultiviert wird und der Hefeextrakt aus den Zellen der Hefe präpariert wird.
- (1) A yeast containing a mutant glutathione synthase with one or both mutations selected from the group consisting of a mutation for replacing a threonine residue at position 47 with an isoleucine residue and a mutation for replacing a glycine residue at position 387 is an aspartic acid residue that produces γ-glutamylcysteine.
- (2) The yeast of (1), wherein the yeast further has a mutation for replacing a proline residue at the position 54 with a leucine residue.
- (3) The yeast according to (2), wherein the mutated glutathione synthetase has the mutation for replacing a threonine residue at the position 47 with an isoleucine residue and the mutation for replacing the proline residue at the Position 54 by a leucine residue.
- (4) The yeast according to (2), wherein the mutated glutathione synthetase has the mutation for replacing the glycine residue at the position 387 with an aspartic acid residue and the mutation for replacing the proline residue at the position 54 with a leucine residue.
- (5) The yeast according to any one of (1) to (4), wherein a glutathione synthetase having no mutation has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
- (6) The yeast according to any one of (1) to (5), wherein the yeast belongs to the genus Saccharomyces.
- (7) A process for producing a food or drink containing γ-glutamylcysteine or cysteine, which process comprises the steps of cultivating the yeast of any one of (1) to (6), the culture obtained or a fractionation product thereof, or the heat-treated culture or the heat-treated fractionation product thereof is mixed with a food or beverage raw material, and the mixture is processed into a food or drink.
- (8) The method according to item (7), wherein the food or drink is an alcoholic beverage, a bread food or a fermented food flavoring material.
- (9) A method for producing a yeast extract comprising the steps of cultivating a yeast according to any one of (1) to (6) and preparing the yeast extract from the cells of the yeast.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden eingehend beschrieben.The The present invention will be described in detail below.
Die erfindungsgemäße Hefe ist eine Hefe, die eine mutierte Glutathionsynthetase mit einer oder zwei der folgenden Mutationen enthält und γ-Glutamylcystein herstellt.
- (1) Eine Mutation, bei der der Threoninrest in der Position 47 durch einen Isoleucinrest ersetzt ist (im Folgenden auch als Mutation vom "T47I-Typ" bezeichnet) und
- (2) Eine Mutation, bei der der Glycinrest an der Position 387 durch einen Asparaginsäurerest ersetzt ist (im Folgenden auch als Mutation vom "G387D-Typ" bezeichnet).
- (1) A mutation in which the threonine residue at position 47 is replaced by an isoleucine residue (hereinafter also referred to as "T47I type" mutation) and
- (2) A mutation in which the glycine residue at position 387 is replaced by an aspartic acid residue (hereinafter also referred to as "G387D type mutation").
In der vorliegenden Erfindung gibt der Ausdruck "enthält eine mutierte Glutathionsyntethase" an, dass im Wesentlichen keine Wildtypglutathionsynthetase enthalten ist. In der vorliegen den Erfindung bedeutet der Ausdruck "stellt γ-Glutamylcystein her", dass γ-Glutamylcystein in einer mikrobiellen Zelle in einer größeren Menge als in einem Wildtyphefestamm angehäuft wird. Die erfindungsgemäße Hefe enthält, wenn sie in einem SD-Medium kultiviert wird, 1,0 Gew.-% oder mehr, stärker bevorzugt 1,1 Gew.-% oder mehr γ-Glutamylcystein in ihrer logarithmischen Wachstumsphase. Die erfindungsgemäße Hefe enthält außerdem, wenn sie in einem SD-Medium kultiviert wird, Glutathion in einem Bereich von 0,0001 bis 0,1 Gew.-%, vorzugsweise in einem Bereich von 0,001 bis 0,006 Gew.-% in ihrer logarithmischen Wachstumsphase. Der hier verwendetet Ausdruck "logarithmische Wachstumsphase" bezieht sich auf eine Phase, bei der die Anzahl der Hefezellen während der Kultivierung im Bezug auf die Kultivierungsdauer logarithmisch ansteigt.In In the present invention, the expression "contains a mutated glutathione synthase "indicates that essentially no wild-type glutathione synthetase is included. In the present invention, the term "represents γ-glutamylcysteine "that γ-glutamylcysteine in a microbial cell in a larger amount than in a wild-type yeast strain cumulative becomes. The yeast of the invention contains when cultured in an SD medium, 1.0 wt% or more, stronger preferably 1.1% by weight or more of γ-glutamylcysteine in their logarithmic growth phase. The yeast of the invention contains in addition, when cultured in an SD medium, glutathione in one Range of 0.0001 to 0.1 wt .-%, preferably in a range from 0.001 to 0.006 wt% in its logarithmic growth phase. The term "logarithmic Growth phase " Focus on a phase when the number of yeast cells during the cultivation increases logarithmically with respect to the cultivation period.
Die vorstehend beschriebenen Positionen der Mutation der Glutationsynthetase und die nachstehend beschriebenen optionalen Mutationen werden unter Bezugnahme auf die veröffentlichte Aminosäuresequenz bestimmt, die von dem Glutathionsynthetasegen (GSH2) von Saccharomyces cerevisiae kodiert wird (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank Zugangsnummer Y13804) (gezeigt in SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls). Die Nucleotidsequenz des selben Gens ist in SEQ ID NO:1 gezeigt.The above-described positions of mutation of glutathione synthetase and the optional mutations described below are given below Reference to the published Amino acid sequence determined that of the glutathione synthetase gene (GSH2) from Saccharomyces cerevisiae (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998)). 315-320, GenBank accession number Y13804) (shown in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing). The nucleotide sequence of the same gene is in SEQ ID NO: 1.
Wenn beispielsweise die mutierte Glutathionsynthetase, die in der erfindungsgemäßen Hefe enthalten ist, eine Deletion von einem Aminosäurerest im N-terminalen Bereich im Vergleich zu er Referenzsequenz aufweist, entsprechen die vorstehend genannten Positionen 47 und 387 den Aminosäureresten 46 bzw. 386 vom N-Terminus der mutierten Glutathionsynthetase aus.If for example, the mutant glutathione synthetase, which in the yeast of the invention is a deletion of one amino acid residue in the N-terminal region Compared to the reference sequence, the above positions 47 and 387 to amino acid residues 46 and 386, respectively, from the N-terminus mutant glutathione synthetase.
Die erfindungsgemäße Hefe kann außerdem eine oder beide der folgenden Mutationen zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Mutation aufweisen.
- (3) Eine Mutation, bei der der Prolinrest an der Position 54 durch einen Leucinrest ersetzt ist (im Folgenden auch als Mutation vom "P54L-Typ" bezeichnet).
- (3) A mutation in which the proline residue at the 54-position is replaced by a leucine residue (hereinafter also referred to as a "P54L-type mutation").
Eine bevorzugte Ausführungsform der mutierten Glutathionsynthetase, die in der erfindungsgemäßen Hefe enthalten ist, ist wie folgt.
- (i) Eine Glutathionsynthetase mit einer Mutation vom T47I-Typ und einer Mutation vom P54L-Typ.
- (ii) Eine Glutathionsynthetase mit einer Mutation vom G387D-Typ und einer Mutation vom P54L-Typ.
- (i) A glutathione synthetase having a T47I-type mutation and a P54L-type mutation.
- (ii) A glutathione synthetase having a G387D-type mutation and a P54L-type mutation.
Außerdem ist die vorstehend beschriebene mutierte Glutathionsynthetase vorzugsweise eine, bei der Glutathionsynthetase ohne die Mutation eine in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.In addition, the mutant glutathione synthetase described above is preferably one in which Glutathione synthetase without the mutation has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Da die mutierte Glutathionsynthetase mit der vorstehend beschriebenen Mutation eine verringerte Aktivität im Vergleich zu der Wildtypglutathionsynthetase aufweist, produziert die Hefe, die das mutierte Enzym enthält, γ-Glutamylcystein. Da die Hefe, die die vorstehend beschriebene mutierte Glutathionsynthetase enthält, eine verringerte Glutathionsynthetaseaktivität weiterhin aufweist, kann sie in einem Medium, das kein Glutathion enthält, außerdem ebenfalls gut wachsen.There the mutated glutathione synthetase with the one described above Mutation a reduced activity compared to the wild-type glutathione synthetase The yeast containing the mutant enzyme produces γ-glutamylcysteine. Since the yeast containing the mutant glutathione synthetase described above contains may still have a decreased glutathione synthetase activity They also grow well in a medium that does not contain glutathione.
Die erfindungsgemäße Hefe ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie γ-Glutamylcystein herstellen kann. Genauer gesagt, umfasst sie Hefen der Gattung Saccharomyces, wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, wie Schizosaccharomyces pombe, und dergleichen. Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Hefe im Hinblick auf das gute Wachstum diploid oder polyploid ist. Die diploide oder polyploide Hefe kann durch Paaren der monoploiden Hefe, die beim Züchten der Hefe eingesetzt wird, welche die vorstehend beschriebene mutierte Glutathionsynthetase enthält, mit einem monoploiden Wildtypstamm, der Glutathionsynthetase enthält, und durch Selektieren eines Stamms, der die mutierte Glutathionsynthetase enthält, und γ-Glutamylcystein produziert, von den erhaltenen diploiden Hefen erhalten werden. Auf ähnliche Weise können triploide oder höher polyploide Hefen erhalten werden.The yeast according to the invention is not particularly limited as long as they have γ-glutamylcysteine can produce. More specifically, it includes yeasts of the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces, such as Schizosaccharomyces pombe, and the like. It is preferred that the yeast of the invention in terms of good growth is diploid or polyploid. The Diploid or polyploid yeast can be obtained by mating the monoploid Yeast when breeding the yeast is used which mutated the mutant described above Contains glutathione synthetase, with a wild type monoploid strain containing glutathione synthetase, and by selecting a strain containing the mutated glutathione synthetase contains, and γ-glutamylcysteine produced from the obtained diploid yeasts. On similar Way you can triploid or higher polyploid yeasts are obtained.
Die erfindungsgemäße Hefe kann durch Gensubstitution unter Verwendung von beispielsweise einer für Glutathionsynthetase mit der vorstehend beschriebenen Mutation kodierenden DNA erzeugt werden. Die erfindungsgemäße Hefe kann auch erhalten werden, indem die Wildtyphefe einer üblichen Mutationsbehandlung, beispielsweise durch UV-Bestrahlung, oder einer Behandlung mit einem Mutagen unterworfen wird, beispielsweise N-Methyl-N-nitrosoguanidin (NTG), Ethylmethansulfonat (EMS), salpetriger Säure oder Acridin. Es kann bestätig werden, dass die erhaltene Mutante die gewünschte Mutation trägt, in dem beispielsweise eine PCR-Methode oder dergleichen angewandt wird.The yeast according to the invention may be by gene substitution using, for example, one for glutathione synthetase produced with the above-described mutation encoding DNA become. The yeast of the invention can also be obtained by the wild-type yeast of a usual Mutation treatment, for example by UV irradiation, or a Treatment with a mutagen is subjected, for example, N-methyl-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonate (EMS), nitrous acid or acridine. It can be confirmed in that the mutant obtained carries the desired mutation in which For example, a PCR method or the like is used.
Die vorstehend beschriebene Gensubstitution kann wie folgt durchgeführt werden. Eine Hefe wird mit einer rekombinanten DNA transformiert, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für Glutathionsynthetase mit der darin eingeführten gewünschten Mutation kodiert, um eine Rekombination zwischen dem mutierten Glutationsynthetasegen und dem Glutationsynthetasegen auf dem Chromosom zu bewirken. Dabei kann ein Marker gehen, das in die rekombinante DNA in Abhängigkeit von den Eigenschaften, wie der Auxotrophie des Wirtes, eingeführt wird, die Manipulation vereinfachen. Außerdem kann die Linearisierung der vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym oder dergleichen und die zusätzliche Entfernung der in Hefe funktionierenden Replikationskontrollregion von der rekombinanten DNA effektiv zu einem Stamm führen, worin die rekombinante DNA in das Chromosom einverleibt ist.The The gene substitution described above can be carried out as follows. A yeast is transformed with a recombinant DNA containing a Contains nucleotide sequence, the for Glutathione synthetase encoded with the desired mutation introduced therein to a recombination between the mutant glutathione synthetase gene and the glutathione synthetase gene on the chromosome. there may be a marker that is dependent on the recombinant DNA of the properties, such as the auxotrophy of the host, is introduced to simplify the manipulation. In addition, the linearization the above-described recombinant DNA by cleavage with a restriction enzyme or the like and the additional removal the yeast replication control region of the Recombinant DNA effectively lead to a strain, wherein the recombinant DNA is incorporated into the chromosome.
Der Stamm, worin die rekombinante DNA auf die vorstehend beschriebene Weise in das Chromosom einverleibt worden ist, wird mit einem Glutathionsynthetasegen, das inherent auf dem Chromosom vorhanden ist, einer Rekombination unterworfen, so dass die zwei fusionierten Gene, d. h. das Wildtypglutathionsynthetasegen und das mutierte Glutathionsynthetasegen, in das Chromosom eingeführt werden, so dass die anderen Teile der rekombinanten DNA (Vektorsegment und Markergen) zwischen den zwei Fusionsgenen vorhanden sein sollten. Deshalb funktioniert in diesem Zustand das Wildtypglutathionsynthetasegen.Of the Strain, wherein the recombinant DNA is as described above Has been incorporated into the chromosome, is treated with a glutathione synthetase gene, which is inherent on the chromosome, a recombination so that the two fused genes, i. H. the wild-type glutathione synthetase gene and the mutated glutathione synthetase gene into which chromosome is introduced so that the other parts of the recombinant DNA (vector segment and Marker genes) should be present between the two fusion genes. Therefore, in this state, the wild-type glutathione synthetase gene functions.
Als nächstes wird, um nur das mutierte Glutathionsynthetasegen auf der chromosomalen DNA zu belassen, eine Kopie des Glutathionsynthetasegens zusammen mit dem Vektorsegment (einschließlich dem Markergen) von der chromosomalen DNA durch Rekombination der zwei Glutathionsynthetasegene eliminiert. Dabei werden zwei Fälle unterschieden. In dem einen Fall wird das Wildtypglutathionsynthetasegen auf der chromosomalen DNA belassen, und das mutierte Glutathionsynthetasegen wird daraus ausgeschnitten. In dem anderen Fall wird im Gegensatz dazu das mutierte Glutathionsynthetasegen auf der chromosomalen DNA belassen, und das Wildtypglutathionsynthetasegen wird ausgeschnitten. In beiden Fällen wird das Markergen eliminiert, so dass das Auftreten einer zweiten Rekombination durch den Phänotyp, der dem Markergen entspricht, bestätigt werden kann. Der gewünschte gensubstituierte Stamm kann durch Amplifizieren des Glutathionsynthetasegens durch ein PCR-Verfahren und durch Untersuchen seiner Struktur selektiert werden.When next only the mutated glutathione synthetase gene on the chromosomal Leave DNA, a copy of the Glutathionsynthetasegens together with the vector segment (including the marker gene) of the chromosomal DNA by recombination of the two glutathione synthetase genes eliminated. There are two cases distinguished. In one case, the wild-type glutathione synthetase gene becomes on the chromosomal DNA, and the mutated glutathione synthetase gene is cut out of it. In the other case, in contrast to the mutated glutathione synthetase gene on the chromosomal Leave DNA, and the wild-type glutathione synthetase gene is excised. In both cases the marker gene is eliminated, so that the occurrence of a second Recombination by the phenotype, which corresponds to the marker gene, can be confirmed. The desired gensubstituierte Strain can be obtained by amplifying the glutathione synthetase gene a PCR method and selected by examining its structure become.
Das in der Gensubstitution eingesetzte mutierte Glutathionsynthetasegen kann eines sein, das eine Glutathionsynthetase mit vollständiger Länge kodiert, es kann jedoch auch ein Gen fragment sein, das einen Teil des Enzyms kodiert, so lange es die Mutationsstelle umfasst. Wenn ein Genfragment eingesetzt wird, führt die auf ähnliche Weise wie vorstehend beschrieben durchgeführte Gensubstitution auch zu einer Einführung der gewünschten Mutation in das Wildtypglutathionsynthetasegen auf der chromosomalen DNA.The mutant glutathione synthetase gene used in gene replacement may be one that encodes a full-length glutathione synthetase, however, it may also be a gene fragment that is part of the enzyme encoded as long as it includes the mutation site. If a gene fragment is used, the leads to similar ones As described above gene substitution also to an introduction of the desired Mutation in the wild-type glutathione synthetase gene on the chromosomal DNA.
In dem Fall, wenn das Glutathionsynthetasegen auf der chromosomalen DNA und das mutierte Glutathionsynthetasegen, die möglicherweise eingeführt worden sind, eine geringe Homologie in einem solchen Maß zueinander haben, dass ein Gensubstitutionsverfahren darauf nicht angewandt werden kann, kann das Glutathionsynthetasegen auf dem chromosomalen Gen unterbrochen werden, und danach kann das mutierte Glutathionsynthetasegen auf einem Plasmid oder einer chromosomalen DNA enthalten sein.In the case when the glutathione synthetase gene on the chromosomal DNA and the mutated glutathione synthetase gene, possibly introduced have a low homology to such an extent to each other have a gene substitution procedure not applied to it The glutathione synthetase gene can be located on the chromosomal Gene can be interrupted, and then the mutated glutathione synthetase gene be contained on a plasmid or a chromosomal DNA.
Das mutierte Glutationsynthetasegen mit der gewünschten Mutation kann durch ortsgerichtete Mutation unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide erhalten werden. Die Nucleotidsequenz des Glutathionsynthetasegen von Saccharomyces cerevisiae ist berichtet worden (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank Zugangsnummer Y13804, SEQ ID NO:1), und das Gen kann von der chromosomalen DNA von Saccharomyces cerevisiae durch ein PCR-Verfahren erhalten werden, bei dem ein Oligonucleotid als Primer eingesetzt wird, das auf der Grundlage der Nucleotidsequenz hergestellt wurde.The Mutated glutathione synthetase gene with the desired mutation can be obtained by site-directed mutation using synthetic oligonucleotides to be obtained. The nucleotide sequence of the glutathione synthetase gene Saccharomyces cerevisiae has been reported (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank accession number Y13804, SEQ ID NO: 1), and the gene can be derived from the chromosomal DNA obtained from Saccharomyces cerevisiae by a PCR method, in which an oligonucleotide is used as a primer on the Basis of the nucleotide sequence was prepared.
Für die Transformation von Hefen können solche Methoden eingesetzt werden, die herkömmlich bei der Transformation von Hefen verwendet werden, beispielsweise ein Protoplastenverfahren, ein KU-Verfahren, ein KUR-Verfahren, ein Elektroporationsverfahren oder dergleichen. Außerdem sind Manipulationsverfahren, wie die Sporenbildung von Hefe und die Abtrennung monoploider Hefe, und dergleichen in "Chemistry and Organisms, Experimental Line 31, Experimental Techniques an Yeasts", First Edition, Hirnkawa Shoten; "Bin Manual Series 10, Gene Experimental Methods with Yeasts", First Edition, Youdosha, und dergleichen.For the transformation of yeasts can Such methods are commonly used in transformation be used by yeasts, for example a protoplast method, a KU procedure, a KUR procedure, an electroporation procedure or similar. Furthermore are manipulation methods, such as the sporulation of yeast and the separation of monoploid yeast, and the like in "Chemistry and Organisms, Experimental Line 31, Experimental Techniques on Yeasts ", First Edition, Hirnkawa Shoten; "I'm Manual Series 10, Gene Experimental Methods with Yeasts, First Edition, Youdosha, and the like.
Die erfindungsgemäße Hefe kann zusätzlich zum Vorhandensein einer mutierten Glutathionsynthetase in ihrer γ-Glutamylcystein-Aktivität verstärkt sein.The yeast according to the invention can additionally be enhanced in the presence of a mutated glutathione synthetase in their γ-glutamylcysteine activity.
Die erfindungsgemäße Hefe produziert γ-Glutamylcystein in einer bestimmten Menge oder mehr und wächst in einem Medium gut, das im industriellen Maßstab eingesetzt wird, und kein Glutathion enthält, so dass sie hervorragend in der Eigenschaft ist, γ-Glutamylcystein pro Zeiteinheit zu produzieren.The yeast according to the invention produces γ-glutamylcysteine in a certain amount or more and growing well in a medium that on an industrial scale is used, and does not contain glutathione, making it excellent in the property is γ-glutamylcysteine to produce per unit of time.
Die durch Kultivieren der wie vorstehend beschrieben erhaltenen γ-Glutamylcystein produzierenden Hefe unter geeigneten Bedingungen erhaltene Kultur enthält γ-Glutamylcystein. Eine solche Kultur oder ein Fraktionierungsprodukt davon enthält γ-Glutamylcystein. Die Kultur kann eine Kulturbrühe sein, die Hefezellen enthält, oder sie kann daraus gewonnene Hefezellen, aufgebrochene Zellen oder Zellextrakte (Hefeextrakte) sein. Es ist auch ratsam, ein Fraktionierungsprodukt, das γ-Glutamylcystein enthält, von den Zellfragmenten oder Hefeextrakten zu erhalten.The by cultivating the γ-glutamylcysteine obtained as described above producing yeast under suitable conditions contains γ-glutamylcysteine. Such a culture or a fractionation product thereof contains γ-glutamylcysteine. The culture can be a culture broth be that contains yeast cells, or it can be obtained from yeast cells, broken cells or cell extracts (yeast extracts). It is also advisable to use a fractionation product containing γ-glutamylcysteine, from to obtain the cell fragments or yeast extracts.
Das Erhitzen der vorstehend beschriebenen Kultur, die γ-Glutamylcystein enthält, oder eines Fraktionierungsprodukts davon kann Cystein von γ-Glutamylcystein freisetzen.The Heating the above-described culture containing γ-glutamylcysteine, or a fractionation product thereof may be cysteine of γ-glutamylcysteine release.
Das für die Kultivierung einzusetzende Medium ist nicht besonders eingeschränkt, so lange es der erfindungsgemäßen Hefe erlaubt, gut zu wachsen und effizient γ-Glutamylcystein zu produzieren. Für die erfindungsgemäße Hefe kann auf Grund ihrer Fähigkeit, auf Medium, das kein Glutathion enthält, gut zu wachsen, ein Medium eingesetzt werden, das üblicherweise im industriellen Maßstab verwendet wird. Es ist zu beachten, dass erforderliche Nährstoffe in Abhängigkeit von den Eigen schaften der eingesetzten Hefe bei Bedarf zu dem Medium gegeben werden.The for the Culture to be used medium is not particularly limited, so long it the yeast of the invention allowed to grow well and efficiently produce γ-glutamylcysteine. For the yeast according to the invention may be due to their ability on medium that does not contain glutathione to grow well, a medium are used, usually on an industrial scale is used. It should be noted that necessary nutrients dependent on from the properties of the yeast used when needed to the medium are given.
Kulturbedingungen und die Herstellung von Hefeextrakten und dergleichen können auf dieselbe Weise wie bei einer üblichen Hefekultur und bei einer üblichen Herstellung von Hefeextrakten und dergleichen durchgeführt werden. Die Hefeextrakte können solche sein, die durch Behandlung von Heißwasserextrakten von Hefezellen erhalten werden, oder solche, die durch Behandlung verdauter Hefezellen erhalten werden.Culture conditions and the production of yeast extracts and the like can the same way as with a usual one Yeast culture and at a usual Preparation of yeast extracts and the like can be performed. The yeast extracts can be those by treating hot-water extracts of yeast cells or those obtained by treating digested yeast cells to be obtained.
Die vorstehend beschriebene Kultur oder das Fraktionierungsprodukt davon, das γ-Glutamylcystein oder Cystein enthält, kann für die Produktion von Nahrungsmitteln und Getränken eingesetzt werden. Die Nahrungsmittel und Getränke umfassen alkoholische Getränke, Brotnahrungsmittel und fermentierte Nahrungsmittelaromamaterialien. Die Produktion von Cystein aus γ-Glutamylcystein durch Hitzebehandlung kann während der Herstellung von Nahrungsmitteln oder Getränken oder nach deren Herstellung durchgeführt werden.The above-described culture or the fractionation product thereof, the γ-glutamylcysteine or Contains cysteine, can for the production of food and beverages are used. The Food and drinks include alcoholic beverages, Bread foods and fermented food flavoring materials. The production of cysteine from γ-glutamylcysteine by heat treatment can during the Production of food or drink or after its production carried out become.
Die vorstehend beschriebenen Nahrungsmittel und Getränke werden durch Mischen einer Kultur oder eines Fraktionierungsprodukts davon, enthaltend γ-Glutamylcystein oder Cystein, mit einem Nahrungsmittel- oder Getränkeausgangsmaterial und Verarbeiten des Gemisches in ein Nahrungsmittel oder Getränk hergestellt. Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Nahrungsmittel oder Getränk kann unter Verwendung der selben Ausgangsmaterialien wie diejenigen, die für übliche Nahrungsmittel und Getränke eingesetzt werden, und durch Einsatz des selben Verfahrens wie für übliche Nahrungsmittel und Getränke hergestellt werden, außer dass die vorstehend beschriebene Kultur oder das Fraktionierungsprodukt davon eingesetzt wird. Solche Ausgangsmaterialien umfassen beispielsweise Reis, Gerste, Maisstärke und dergleichen für alkoholische Getränke, Weizenmehl, Zucker, Tafelsalz, Butter, Fermentationshefe und dergleichen für Brotnahrungsmittel und Soja bohnen und Weizen und dergleichen für fermentierte Nahrungsmittelaromamaterialien.The above-described foods and drinks are prepared by mixing a culture or fractionating product thereof containing γ-glutamylcysteine or cysteine with a food or beverage source material and processing the mixture into a food or drink. The food or drink obtained by the method of the present invention can be used by using the same starting materials as those used for ordinary foods and drinks and using the same method as for conventional food and drink, except that the culture described above or the fractionation product thereof is used. Such starting materials include, for example, rice, barley, corn starch and the like for alcoholic beverages, wheat flour, sugar, table salt, butter, fermentation yeast and the like for bread food and soy bean and wheat and the like for fermented food flavor materials.
Kurze Beschreibung der ZeichnungenBrief description of the drawings
Beschreibung der bevorzugten AusführungsformenDescription of the preferred embodiments
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der Beispiele eingehend beschrieben.in the Below, the present invention will be described in detail with reference to the examples described.
Die
Zusammensetzungen der in den Beispielen eingesetzten Medien sind
wie folgt. Es ist anzumerken, dass Agarmedien 2% gereinigten Agar
enthalten. [Zusammensetzung
des YPD-Mediums]
(10-fach konzentrierte Stickstoffbase ist ein Gemisch von 1,7 g Bactohefestickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat (Difco Laboratories, Inc.) und 5 g Ammoniumsulfat, gelöst in 100 ml sterilisiertem Wasser, eingestellt auf etwa pH 5,2 und sterilisiert durch Filtration durch einen Filter).(10 times concentrated nitrogen base is a mixture of 1.7 g Bactohefestickstoffbase without amino acids and ammonium sulfate (Difco Laboratories, Inc.) and 5 g of ammonium sulfate, solved in 100 ml of sterilized water, adjusted to about pH 5.2 and sterilized by filtration through a filter).
[Zusammensetzung des SDFOA-Mediums][Composition of the SDFOA medium]
SD-Medien, enthalten 50 mg/l Uracil und 1 g/l 5-Fluororoctinsäurehydrat in der Endkonzentration.SD media, contain 50 mg / l uracil and 1 g / l 5-fluoro-octanoic acid hydrate in the final concentration.
Vergleichsbeispiel 1 einer Hefe, worin das für Glutathionsynthetase kodierende Gen unterbrochen istComparative Example 1 of a yeast wherein that for Glutathione synthetase coding gene is interrupted
Käuflich erwerbbare
Saccharomyces cerevisiae, die für
Nahrungsmittel eingesetzt wird, wurde einer Sporenbildung unterworfen,
wobei der monoploide Stamm S (MATα)
von Brothefe erhalten wurde. Außerdem wurde
der Uracil auxotrophe Stamm S1 von dem Stamm S erhalten, indem ein
Uracil enthaltendes SDFOA Agarmedium eingesetzt wurde. Aus dem Stamm
51 wurde ein Hefestamm K1 erhalten, worin das Glutathionsynthetasegen
(GSH2) durch das in
Beispiel 1 Züchten einer Hefe mit einer mutierten GlutathionsynthetaseExample 1 Breeding a Yeast with a mutated glutathione synthetase
<1> Präparation einer Kassette für die Substitution eines Glutathionsynthetasegen vom reduzierten Typ<1> Preparation of a cassette for substitution a reduced-type glutathione synthetase gene
- (1) Präparation einer Kassette für die Substitution eines Glutathionsynthetasegens vom Typ G387D (1) preparation a cassette for the substitution of a type G387D glutathione synthetase gene
- (2) Unter Verwendung des Primers F1 (CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC (SEQ ID NO:3)) und R1 (CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC (SEQ ID NO:4)) und Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen eine Region, die für ein Segment aus der Mitte des offenen Leserahmens (ORF) des Glutathionsynthetasegens des Stammes S1 bis etwa 40 bp stromabwärts des ORF kodiert mit Hilfe eines Polymerasekettenreaktionsverfahrens (PCR) amplifiziert.(2) Using primer F1 (CATAAAACAACTGAAGCGTTAGCTC (SEQ ID NO: 3)) and R1 (CAGGCCAAAGATTTTCAGTACGAGC (SEQ ID NO: 4)) and pyrobestic DNA polymerase (Takara Shuzo) under the conditions given by the manufacturer, a region coding for a segment from the center of the open reading frame (ORF) of the glutathione synthetase gene of strain S1 up to about 40 bp downstream of the ORF was amplified by means of a polymerase chain reaction (PCR) method.
Das
wie vorstehend beschriebene Genfragment wurde gereinigt, und eine
enzymatische Reaktion wurde 10 Minuten bei 72°C unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt,
um an jeden der Termini ein Nucleotid A anzuhängen. (Zusammensetzung
des Reaktionsgemisches)
Das vorstehend beschriebene Reaktionsprodukt wurde an das Plasmid pGEM-T Easy (Promega Corporation) gemäß den Anweisungen des Herstellers ligiert, wobei das Plasmid GSH2MS41/pGEM erhalten wurde.The The reaction product described above was added to the plasmid pGEM-T Easy (Promega Corporation) according to the instructions from the manufacturer, giving the plasmid GSH2MS41 / pGEM has been.
Dann wurde durch ortsgerichtete Mutation ein Kodon (GGT), das der Aminosäure in Position 387 (Gly) des Glutathionsynthetasegens, das in GSH2MS41/pGEM enthalten ist, entspricht, durch ein Asp-Kodon (GAT) ersetzt. Dieser Vorgang wurde unter Verwendung eines QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) gemäß den vom Hersteller bereit gestellten An weisungen durchgeführt. Als die Primer wurden der Primer F2 (CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG (SEQ ID NO:5)) und der Primer R2 (CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG (SEQ ID NO:6)) eingesetzt. Auf diese Weise wurde das Plasmid GSH2MS41dash/pGEM hergestellt.Then, a codon (GGT) corresponding to the amino acid at position 387 (Gly) of the glutathione synthetase gene contained in GSH2MS41 / pGEM was replaced by an Asp codon (GAT) by site-directed mutation. This procedure was performed using a QuickChange ™ Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. As the primers, the primer F2 (CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG (SEQ ID NO: 5)) and the primer R2 (CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG (SEQ ID NO: 6)) were used. In this way, the plasmid GSH2MS41dash / pGEM was prepared.
Andererseits wurde ein Plasmid hergestellt, das dem Plasmid pYES2 (Invitrogen) entsprach, von dem der 2 μ ori entfernt worden war. Das Plasmid pYES2 wurde mit den Restriktionsenzymen SspI und NheI geschnitten, und die geschnittenen Enden wurden abgestumpft und dann wieder ringgeschlossen, wobei das Plasmid pYES2dash erhalten wurde. Das Plasmid pYES2dash und das Plasmid GSH2MS41dash/pGEM wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI geschnitten, um ein Fragment, welches das URA3-Gen aus pYES2dash und ein Glutathionsynthetasegenfragment mit einer Mutation von GSH2MS41dash/pGEM enthält, auszuschneiden, und diese Fragmente wurden miteinander ligiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid GSH2MS41dash/pYES2dash präpariert. Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym MunI verdaut, wobei eine Kassette 1 erhalten wurde.on the other hand a plasmid was prepared which was the plasmid pYES2 (Invitrogen) corresponded, of which the 2 μ ori had been removed. The plasmid pYES2 was digested with the restriction enzymes SspI and NheI cut, and the cut ends were dulled and then ring-closed again to give the plasmid pYES2dash has been. The plasmid pYES2dash and the plasmid GSH2MS41dash / pGEM were each with the restriction enzymes SacI and SphI cut to a fragment containing the URA3 gene from pYES2dash and a glutathione synthetase gene fragment containing a mutation of GSH2MS41dash / pGEM, cut out, and these Fragments were ligated together. That's how it became Plasmid GSH2MS41dash / pYES2dash prepared. This plasmid was digested with the restriction enzyme MunI to give a cassette 1 has been.
(2) Präparation einer Kassette für die Substitution eines Glutathionsynthetasegens vom Typ T47I(2) preparation a cassette for the substitution of a type T47I glutathione synthetase gene
Unter Verwendung des Primers F3 (CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG (SEQ ID NO:7, entsprechend einer Region etwa 700 Basenpaare stromaufwärts des ORF eines GSH2-Gens, welches für Glutathionsynthetase kodiert) und des Primers R3 (CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG (SEQ ID NO:8)) und Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen wurde ein Fragment, welches das Glutathionsynthetasegen des Stammes S2 enthält, durch ein Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR) amplifiziert.Under Use of the primer F3 (CTAATATGGATGTCGGCAACCCAAG (SEQ ID NO: 7, corresponding to a region about 700 base pairs upstream of the ORF of a GSH2 gene used for Glutathione synthetase) and the primer R3 (CCACAGCTTTGGCCAATGCCTTAG (SEQ ID NO: 8)) and pyrobestic DNA polymerase (Takara Shuzo) under the conditions specified by the manufacturer became a fragment containing the glutathione synthetase gene of the strain S2 contains amplified by a polymerase chain reaction (PCR) method.
Das wie vorstehend beschrieben amplifizierte Genfragment wurde gereinigt, und eine enzymatische Reaktion wurde 10 Minuten bei 72°C unter den selben Bedingungen wie vorstehend beschrieben durchgeführt, wobei an jeden der Termini ein Nucleotid A angehängt wurde.The gene fragment amplified as described above was purified and an enzymatic reaction was carried out at 72 ° C for 10 minutes the same conditions as described above, wherein to each of the termini a nucleotide A has been added.
Das wie vorstehend beschrieben erhaltene Reaktionsprodukt wurde an das Plasmid pGEM-T Easy (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers ligiert, wobei das Plasmid GSH2FD63/pGEM behalten wurde.The The reaction product obtained as described above was added to the Plasmid pGEM-T Easy (Promega) according to the manufacturer's instructions ligated, retaining the plasmid GSH2FD63 / pGEM.
Dann wurde ein Kodon (ACT), das der Aminosäure Thr in Position 47 des Glutathionsynthetasegens, das in GSH2FD63/pGEM enthalten ist, entspricht, durch ein Ile-Kodon (ATT) ersetzt. Dieser Vorgang wurde unter Verwendung des QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Als Primer wurden der Primer F4 (CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC (SEQ ID NO:9)) und der Primer R6 (GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG (SEQ ID NO:10)) eingesetzt. Auf diese Weise wurde das Plasmid GSH2FD63dash/pGEM hergestellt.Then, a codon (ACT) corresponding to the amino acid Thr at position 47 of the glutathione synthetase gene contained in GSH2FD63 / pGEM was replaced with an ile codon (ATT). This procedure was performed using the QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the instructions carried out by the manufacturer. The primers used were the primer F4 (CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC (SEQ ID NO: 9)) and the primer R6 (GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG (SEQ ID NO: 10)). In this way, the plasmid GSH2FD63dash / pGEM was prepared.
Das Plasmid pYES2dash und das Plasmid GSH2FD63dash/pGEM wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen SacI und SphI verdaut, um ein Fragment, enthaltend das URA3-Gen aus pYES2dash, und ein Glutathionsynthetasegenfragment mit einer Mutation aus GSH2FD63dash/pGEM herauszuschneiden, und diese Fragmente wurden miteinander ligiert. Auf diese Weise wurde das Plasmid GSH2FD63dash/pYES2dash hergestellt. Dieses Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym geschnitten, wobei eine Kassette 2 erhalten wurde.The Plasmid pYES2dash and the plasmid GSH2FD63dash / pGEM were each digested with the restriction enzymes SacI and SphI to form a fragment, containing the URA3 gene from pYES2dash, and a glutathione synthetase gene fragment with a mutation out of GSH2FD63dash / pGEM, and this one Fragments were ligated together. That's how it became Plasmid GSH2FD63dash / pYES2dash prepared. This plasmid was with a restriction enzyme to give a cassette 2 was obtained.
<2> Züchtung einer Hefe, die eine Glutathionsynthetase vom reduzierten Typ enthält<2> Breeding a yeast containing a Contains glutathione synthetase of the reduced type
(1) Züchtung einer Hefe, die Glutathionsynthetase vom Typ G387D enthält(1) Breeding a yeast containing glutathione synthetase type G387D
Unter Verwendung der wie vorstehend beschrieben hergestellten Kassette 1 wurde eine Gensubstitution des Glutathionsynthetasegens des Stammes S2 durchgeführt. Nach der Vorkultivierung des Stammes S2 wurde die Kultur in 50 ml YPD-Medium subkultiviert und bis zur logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die kultivierten Zellen wurden in 1 M Sorbitol suspendiert, und die Kassette 1 wurde zur Durchführung einer Transformation durch Elektroporation zugemischt. Der transformierte Stamm wurde auf einer SD-Platte, die 1 mM Glutathion enthielt, kultiviert, und ein darauf gewachsener Stamm wurde selektiert. Nach Bestätigung der Einführung der Kassette 1 in die gewünschte Stelle auf dem Chromosom durch PCR wurde der erhaltene Stamm K2-Intermediat genannt. K2-Intermediat wurde kultiviert und auf ein SDFOA-Agarmedium ausgestrichen. Dann wurde ein Hefestamm K2, worin die Glutathionsynthetase durch den Typ G387D ersetzt war, von den gewachsenen Stämmen erhalten.Under Use of the cassette produced as described above 1 was a gene substitution of the glutathione synthetase gene of the strain S2 performed. After preculturing the strain S2, the culture was dissolved in 50 ml Subcultured YPD medium and until the logarithmic growth phase bred. The cultured cells were suspended in 1 M sorbitol, and the Cassette 1 was used a transformation by electroporation mixed. The transformed Strain was cultured on an SD plate containing 1 mM glutathione and a strain grown on it was selected. After confirmation of the introduction of the Cassette 1 in the desired Place on the chromosome by PCR, the obtained strain K2 intermediate called. K2 intermediate was cultured and loaded on an SDFOA agar medium streaked. Then, a yeast strain K2, wherein the glutathione synthetase replaced by the type G387D obtained from the grown stems.
Die Ergebnisse des Vergleichs mit der bekannten Nucleotidsequenz des Glutathionsynthetasegens von Saccharomyces cerevisiae (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank Zugangsnummer Y13804) zeigt, dass das mutierte Glutathionsynthetasegen des Stammes K2 eine Substitution des Kodons des Prolinrestes (CCT) an der Position 54 durch das Kodon des Leucinrestes (CCT) zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Mutation vom Typ G387D aufwies.The Results of the comparison with the known nucleotide sequence of Glutathione synthetase gene of Saccharomyces cerevisiae (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank accession number Y13804) shows that the mutated glutathione synthetase gene of the strain K2 is a substitution of the codon of the proline residue (CCT) at the position 54 by the codon of the leucine residue (CCT) in addition to that described above Had a mutation of type G387D.
(2) Züchtung einer Hefe, die Glutathionsynthetase vom Typ T47I enthält(2) Breeding a yeast containing glutathione synthetase type T47I
Unter Verwendung der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Kassette 2 wurde eine Gensubstitution des Glutathionsynthetasegens des Stammes S2 durchgeführt. Nach der Vorkultivierung des Stammes S2 wurde die Kultur in 50 ml YPD-Medium subkultiviert und bis zur logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die kultivierten Zellen wurden in 1 M Sorbitol suspendiert, und die Kassette 2 wurde zugemischt, um die Trans formation durch Elektroporation durchzuführen. Der transformierte Stamm wurde auf einer SD-Platte, enthaltend 1 mM Glutathion, kultiviert, und der darauf gewachsene Stamm wurde selektiert. Die Einverleibung der Kassette 2 an der gewünschten Position des Chromosoms wurde durch ein PCR-Verfahren bestätigt, und der erhaltene Stamm wurde K3-Intermediat genannt. K3-Intermediat wurde kultiviert und auf ein SDFOA-Agarmedium ausgestrichen. Die gewachsene Transformante wurde auf ein SD-Agarmedium ausgestrichen, und die gewachsenen Stämme wurden selektiert, wobei ein Stamm K3-Intermediat selektiert wurde, in den die Gensubstitutionskassette 2 eingeführt war. Der Stamm K3-Intermediat wurde kultiviert und auf ein SDFOA-Agarmedium ausgestrichen. Dann wurde der Hefestamm K3, worin das Glutathionsynthetasegen durch den Typ T47I substitutiert war, unter den gewachsenen Stämmen erhalten.Under Use of the cassette 2 obtained as described above was a gene substitution of the glutathione synthetase gene of the strain S2 performed. After preculturing the strain S2, the culture was dissolved in 50 ml Subcultured YPD medium and until the logarithmic growth phase bred. The cultured cells were suspended in 1 M sorbitol, and the cassette 2 was mixed to the transformation by electroporation perform. The transformed strain was grown on an SD plate containing 1 mM glutathione, cultured, and the stem grown on it selected. The incorporation of the cassette 2 at the desired Position of the chromosome was confirmed by a PCR method, and the obtained strain was called K3 intermediate. K3 intermediate was cultured and streaked on an SDFOA agar medium. The grown Transformant was streaked onto an SD agar medium, and the grown stems were selected, whereby a strain K3 intermediate was selected, in which the gene replacement cassette 2 was inserted. The strain K3 intermediate was cultured and streaked on an SDFOA agar medium. Then was the yeast strain K3, wherein the glutathione synthetase gene by the type T47I was substituted among the grown stems.
Die Ergebnisse eines Vergleichs mit der bekannten Nucleotidsequenz des Glutathionsynthetasegens von Saccharomyces cerevisiae (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank Zugangsnummer Y13804) zeigt, dass das mutierte Glutathionsynthetasegen des Stammes K3 eine Substitution des Kodons des Prolinrests (CCT) an der Position 54 durch das Kodon des Leucinrests (CCT) zusätzlich zu der vorstehend erwähnten Mutation vom Typ T47I aufwies.The Results of a comparison with the known nucleotide sequence of Glutathione synthetase gene of Saccharomyces cerevisiae (Inoue et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320, GenBank accession number Y13804) shows that the mutated glutathione synthetase gene of the strain K3 substitution of the codon of the proline residue (CCT) at the position 54 by the codon of leucine residue (CCT) in addition to the mutation mentioned above of the type T47I.
(3) Herstellung einer diploiden Hefe(3) Preparation of a diploid yeast
Monoploide Hefe (MATα) mit einer mutierten Glutathionsynthetase vom Typ G387D (Stamm K2) wurde mit einer monoploiden Hefe (MATα) auf herkömmliche Weise gepaart, wobei eine diploide Hefe erhalten wurde. Die diploide Hefe wurde durch ein herkömmliches Verfahren einer Sporenbildung unterworfen, um eine monoploide Hefe (MATα) mit der mutierten Glutathionsynthetase vom Typ G387D zu erhalten. Dann wurde die monoploide Hefe (MATα) mit der mutierten Glutathionsynthetase vom Typ G387D und die monoploide Hefe (MATα) mit der mutierten Glutathionsynthetase vom Typ G387D gepaart, wobei ein Stamm Z1 einer diploiden Hefe mit einer mutierten Glutathionsynthetase vom Typ G387D in der Form einer Homozygote erhalten wurde. Der diploide Hefestamm Z2 mit der mutierten Glutathionsynthetase vom Typ T47I wurde ebenfalls auf ähnliche Weise erhalten. Es wurde bestätigt, dass die Stämme Z1 und Z2 γ-Glutamylcystein in einer Menge von 1% oder mehr pro Trockenhefezelle anhäufte.Monoploid yeast (MATα) with a mutant glutathione synthetase type G387D (strain K2) was mated with a monoploid yeast (MATα) in a conventional manner to give a diploid yeast. The diploid yeast was spore-formed by a conventional method to obtain a monoploid yeast (MATα) with the mutant type G387D glutathione synthetase. Then the monoploid yeast (MATα) with the mutant glutathione synthetase type G387D and the monoploid yeast (MATα) with the mutant glutathione synthetase type G387D paired to obtain a strain Z1 of a diploid yeast with a mutated glutathione synthetase type G387D in the form of a homozygote. The diploid yeast strain Z2 with the mutant glutathione synthetase type T47I was also obtained in a similar manner. It was confirmed that the strains Z1 and Z2 accumulated γ-glutamylcysteine in an amount of 1% or more per dry yeast cell.
<3> Untersuchungen über das Wachstum einer Hefe mit einer mutierten Glutathionsynthetase und deren Produktion von γ-Glutamylcystein<3> Studies on the Growth of a yeast with a mutated glutathione synthetase and their production of γ-glutamylcysteine
(1) Wachstum der Stämme K2 und K3(1) Growth of strains K2 and K3
Die
Stämme
K1, K2 und K3 wurden in SD-Medien (enthaltend die notwendige Menge
Uracil) oder SD-Medien, enthaltend 1 mM Glutathion (enthaltend die
notwendige Menge Uracil), kultiviert. Die Messung des Wachstums
wurde zu einem Zeitpunkt begonnen, bei dem das Wachstum der Hefen
eine logarithmische Wachstumsphase erreichte und die Absorption
bei 660 nm 1,4 oder mehr wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
den
Die
spezifische Wachstumsrate (Grad des Wachstums in einer Stunde) des
Stammes K2 auf einem Medium, das Glutathion enthält, war 1,171, während die
spezifische Wachstumsrate auf einem Medium, das kein Glutathion
enthält,
1,161 war. Die spezifische Wachstumsrate des Stammes K3 war 1,169
auf dem Medium, das Glutathion enthält, und 1,156 auf dem Medium,
das kein Glutathion enthält.
Die
(2) Produktion von γ-Glutamylcystein durch die Stämme K2 uns K3(2) Production of γ-glutamylcysteine by strains K2 us K3
Die
Stämme
K1, K2 und K3 wurden in SD-Medien (enthaltend erforderliche Mengen
Uracil) kultiviert. Die Messungen des Wachstums und der angehäuften Menge
des γ-Glutamylcysteins
wurden zu einem Zeitpunkt begonnen, an dem das Wachstum der Hefen
eine logarithmische Phase erreichte und die Absorption bei 660 nm
1,4 oder höher
wurde. Die spezifischen Wachstumsraten der Stämme waren 1,104, 1,161 bzw.
1,156. Die Stämme
K2 und K3 akkumulierten Glutathion in einer Menge von 0,001% oder
höher und
0,006% oder weniger pro Trockenhefezelle. Die angehäufte Menge
des γ-Glutamylcysteins
durch jeden Stamm pro Trockenhefezelle in der logarithmischen Wachstumsphase
war folgende. Tabelle 1
Dann wurde die Produktion von γ-Glutamylcystein pro Zeiteinheit gemessen. Die Produktion von γ-Glutamylcystein pro Zeiteinheit wurde durch die Erhöhung der Menge des in einem Sakaguchi-Kolben enthaltenden γ-Glutamylcysteins pro Zeiteinheit gemessen, wenn jeder Stamm darin in 50 ml SD-Medium (enthaltend eine erforderliche Menge Uracil) kultiviert wurde. Dieser Wert wird durch die angehäufte Menge des γ- Glutamylcysteins pro Trockenzelle und durch die Wachstumsrate der Hefe kontrolliert. Die Werte waren 0,116 mg/Stunde für den Stamm K1, 0,130 mg/Stunde für den Stamm K2 und 0,127 mg/Stunde für den Stamm K3.Then was the production of γ-glutamylcysteine measured per unit time. The production of γ-glutamylcysteine per unit time was through the increase the amount of γ-glutamylcysteine contained in a Sakaguchi flask measured per unit time, with each strain contained in 50 ml of SD medium (containing a required amount of uracil) was cultured. This Value is accumulated by the Amount of γ-glutamylcysteine per dry cell and controlled by the growth rate of the yeast. Values were 0.116 mg / hr for strain K1, 0.130 mg / hr for the Strain K2 and 0.127 mg / hr for the tribe K3.
Eine
Hefe, die γ-Glutamylcystein
in einer Menge von 1 Gew.-% oder mehr pro Trockenhefezelle enthält, und
Hefeextrakte davon sind bekanntlich für die Verstärkung des Aromas von Nahrungsmitteln
einsetzbar (
(3) Untersuchungen über die Stabilität einer Subkultur der Stämme K2 und K3(3) Studies on the Stability of a Subculture of the tribes K2 and K3
Die Stämme K2, K3, Z1 und Z2 wurden auf YPD-Medien kultiviert. Diese Stämme wurden jeweils 10-fach subkultiviert, und es wurde untersucht, ob Umkehrmutationen auftraten. Die Subkultivierung wurde wie folgt durchgeführt. Jeder Stamm wurde in ein Teströhrchen, das 4 ml eines YPD-Flüssigmediums enthielt, eingeimpft und unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Nach ausreichendem Wachstum wurde ein Teil der Kultur in einem Teströhrchen, das 4 ml YPD-Flüssigmedium enthielt, subkultiviert. Dieser Vorgang wurde zehn Mal wiederholt.The strains K2, K3, Z1 and Z2 were cultured on YPD media. These tribes were each sub-cultured 10-fold, and it was examined whether reverse mutations occurred. Subculturing was performed as follows. Everyone Strain was in a test tube, 4 ml of a YPD liquid medium contained, inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. After sufficient growth, a portion of the culture in a test tube, the 4 ml YPD liquid medium contained, subcultured. This process was repeated ten times.
Ob Umkehrmutationen auftraten, wurde wie folgt untersucht. Die Hefezellen wurden aus der Kulturbrühe gewonnen, und deren chromosomale DNAs wurden gewonnen, und danach wurden die Nucleotidsequenzen der Mutationsstellen bestätigt. Zudem wurde die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum bei Kultivierung bei 30°C auf einem SD-Agarmedium, das 10 mM Methylglyoxal (enthaltend eine erforderliche Menge Uracil) enthielt, untersucht. Diese Ergebnisse zeigen die Stabilität der Subkulturen der Stämme K2, K3, Z1 und Z2.If Reversal mutations were examined as follows. The yeast cells were from the culture broth and their chromosomal DNAs were recovered, and afterwards the nucleotide sequences of the mutation sites were confirmed. moreover was the presence or absence of growth on cultivation at 30 ° C on an SD agar medium containing 10 mM methylglyoxal (containing a required amount of uracil). These results show the stability subcultures of the tribes K2, K3, Z1 and Z2.
(4) Untersuchungen der Mutation P57L(4) Investigations of mutation P57L
Der Einfluss der Mutation P54L auf die mutierte Glutathionsynthetase wurde untersucht.Of the Influence of mutation P54L on mutant glutathione synthetase was examined.
Ein Plasmid, das ein Glutathionsynthetasegen mit der Mutation vom Typ T47I oder vom Typ G387D allein enthielt, wurde hergestellt. Als das Plasmid, das ein Glutathionsynthetasegen enthält, wurde pEGSH2 eingesetzt. Dieses Plasmid wurde durch das in der Literatur beschriebene Verfahren hergestellt (Inoue, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320).One Plasmid containing a glutathione synthetase gene with type mutation T47I or G387D alone was manufactured. When the plasmid containing a glutathione synthetase gene became pEGSH2 used. This plasmid was characterized by that in the literature described method (Inoue, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1395 (1998) 315-320).
Zuerst wurde das Kodon (ACT), das der Aminosäure Thr in Position 47 entspricht, des Glutathionsynthetasegens des Plasmids pEGSH2 durch das Kodon (ATT) von Ile substituiert. Dieser Vorgang wurde unter Verwendung des QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Als Primer wurden der Primer F4 (CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC (SEQ ID NO:9)) und der Primer (GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG (SEQ ID NO:10)) eingesetzt. Auf diese Weise wurde das Plasmid pEGSH2-T47I konstruiert.First, the codon (ACT) corresponding to the amino acid Thr at position 47 of the glutathione synthetase gene of the plasmid pEGSH2 was substituted by the codon (ATT) of Ile. This procedure was performed using the QuickChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. The primer used was the primer F4 (CGGTGTCACCAGTAATTATCTATCCAACCCC (SEQ ID NO: 9)) and the primer (GGGGTTGGATAGATAATTACTGGTGACACCG (SEQ ID NO: 10)). In this way, the plasmid pEGSH2-T47I was constructed.
Dann wurde das Kodon (GGT), entsprechend der Aminosäure Gly in der Position 387, des Glutathionsynthetasegens des Plasmid pEGSH2 durch das Kodon (GAT) von Asp ersetzt. Dieser Vorgang wurde unter Verwendung des QuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Als die Primer wurde der Primer F2 (CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG (SEQ ID NO:5)) und der Primer R2 (CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG (SEQ ID NO:6)) eingesetzt. Auf diese Weise wurde das Plasmid pEGSH2-G387D konstruiert.Then, the codon (GGT) corresponding to the amino acid Gly at position 387 of the glutathione synthetase gene of the plasmid pEGSH2 was replaced by the codon (GAT) of Asp. This procedure was performed using the QuickChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the manufacturer's instructions. As the primers, the primer F2 (CCACAGCGGGAAGATGGCGGAAACAATG (SEQ ID NO: 5)) and the primer R2 (CATTGTTTCCGCCATCTTCCCGCTGTGG (SEQ ID NO: 6)) were used. In this way, the plasmid pEGSH2-G387D was constructed.
Andererseits wurde der Stamm K1dash, der Uracilerfordernis aufweist, von dem Stamm K1 wie folgt erhalten. Der Stamm K1 wurde in einem YPD-Medium bei 30°C während 80 Stunden kultiviert, und die Kultur wurde auf eine SDFOA-Platte ausgestrichen. Unter den auf der SDFOA-Platte gewachsenen Hefen wurde der Hefestamm K1dash selektiert, der Uracilerfordernis zeigte und dessen Glutathionsynthetase zerstört worden war.on the other hand became the tribe K1dash, which has uracil requirement, of the Strain K1 was obtained as follows. The strain K1 was in a YPD medium at 30 ° C while Cultured for 80 hours, and the culture was transferred to an SDFOA plate streaked. Among the yeasts grown on the SDFOA plate the yeast strain K1dash, which showed uracil requirement, was selected and its glutathione synthetase had been destroyed.
Der wie vorstehend beschrieben erhaltene Stamm K1dash wurde mit den vorstehend beschriebenen Plasmiden pEGSH2, pEGSH2-T47I und pEGSH2-G387D transformiert, wobei pEGSH2/K1dash, pEGSH2-T47I/K1dash und pEGSH2-G387D/K1dash erhalten wurden. Die Transformation der K1dash-Stämme mit jedem Plasmid wurde wie folgt durchgeführt. Nach der Vorkultivierung des Stammes K1dash wurde die Kultur in 50 ml YPD-Medium subkultiviert und bis zum Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase gezüchtet. Die kultivierten Zellen wurden in 1 M Sorbitol suspendiert, das gewünschte Plasmid wurde zugemischt, und die Transformation wurde durch Elektroporation durchgeführt. Die Transformanden wurden auf einem SD-Agarmedium, enthaltend 1 mM Glutathion, kultiviert, und die gewachsenen Stämme wurden selektiert.The strain K1dash obtained as described above was transformed with the above-described plasmids pEGSH2, pEGSH2-T47I and pEGSH2-G387D to obtain pEGSH2 / K1dash, pEGSH2-T47I / K1dash and pEGSH2-G387D / K1dash. Transformation of the K1dash strains with each plasmid was performed as follows. After pre-culturing the K1dash strain, the culture was subcultured in 50 ml of YPD medium and grown to reach the logarithmic growth phase. The cultured cells were suspended in 1 M sorbitol, the desired plasmid was added mixed, and the transformation was carried out by electroporation. The transformants were cultured on an SD agar medium containing 1 mM glutathione, and the grown strains were selected.
Die Stämme pEGSH2/K1dash, pEGSH2-T47I/K1dash und pEGSH2-G387D/K1dash wurden unter Schütteln in SD-Medien bei 30°C während 30 Stunden kultiviert, und Kulturen wurden in SD-Medien in einer Konzentration von 2% eingeimpft und unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Die Menge des in den Zellen in deren logarithmischen Wachstumsphase (10 Stunden nach Beginn der Kultivierung) angehäuften Glutathions wurde gemessen. Glutathion wurde in einer Menge von etwa 0,80% im Fall des Stammes pEGSH2/K1dash und in einer Menge von 0,001 bis 0,006% im Fall der Stämme pEGSH2-T47I/K1dash und pEGSH2-G387D/K1dash angehäuft.The strains pEGSH2 / K1dash, pEGSH2-T47I / K1dash and pEGSH2-G387D / K1dash were added with shaking in SD media at 30 ° C while Cultured for 30 hours, and cultures were seeded in SD media at 2% concentration. inoculated and shaken at 30 ° C cultured. The amount of in the cells in their logarithmic Growth phase (10 hours after beginning of cultivation) accumulated glutathione was measured. Glutathione was in an amount of about 0.80% in the Case of the strain pEGSH2 / K1dash and in an amount of 0.001 to 0.006% in the case of the strains pEGSH2-T47I / K1dash and pEGSH2-G387D / K1dash.
Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass Hefen eine verminderte Glutathionsynthetaseaktivität mit den Mutationen T47I oder G387D allein und ohne die Mutation P54L aufweisen können und eine geringe Menge Glutathion in den Zellen haben können, was zu einer hohen Produktion von γ-Glutamylcystein führt.The The results described above show that yeast decreased one Glutathionsynthetaseaktivität with the mutations T47I or G387D alone and without the mutation May have P54L and a small amount of glutathione in the cells may have leads to a high production of γ-glutamylcysteine.
Industrielle AnwendbarkeitIndustrial applicability
Erfindungsgemäß wird eine Hefe bereitgestellt, die eine mutierte Glutathionsynthetase mit verringerter Aktivität enthält und γ-Glutamylcystein produziert. Die erfindungsgemäße Hefe kann bei der Herstellung von γ-Glutamylcystein enthaltenden Nahrungsmitteln oder Cystein enthaltenden Nahrungsmitteln eingesetzt werden.According to the invention is a Yeast provided a mutated glutathione synthetase with reduced activity contains and γ-glutamylcysteine produced. The yeast of the invention can in the production of γ-glutamylcysteine containing foods or cysteine-containing foods be used.
SEQUENZPROTOKOLL 
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2166075A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-24 | The Procter and Gamble Company | Cleaning composition |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003159048A (en) * | 2001-11-26 | 2003-06-03 | Ajinomoto Co Inc | gamma-GLUTAMYLCYSTEINE PRODUCING YEAST AND METHOD FOR SCREENING THE SAME |
| ATE405637T1 (en) | 2002-12-13 | 2008-09-15 | Ajinomoto Kk | METHOD FOR THE PRODUCTION OF GAMMA-GLUTAMYLCYSTEIN |
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| KR100771077B1 (en) * | 2006-06-02 | 2007-10-29 | 주식회사 홍재그린 | Yeast nutrients for the culture medium of fermentation yeast |
| JP5315600B2 (en) * | 2006-09-05 | 2013-10-16 | 味の素株式会社 | Y-glutamylcysteine-producing yeast and use thereof |
| WO2009102050A1 (en) | 2008-02-15 | 2009-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Intestinal immune system stimulator |
| WO2009110624A1 (en) | 2008-03-04 | 2009-09-11 | 味の素株式会社 | γ-GLUTAMULCYSTEINE-PRODUCING YEAST, AND METHOD FOR PRODUCTION OF YEAST EXTRACT |
| RU2009113205A (en) | 2009-04-08 | 2010-10-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленн | YEAST HAVING AN INCREASED CONTENT OF THE SULFUR CONTAINING METHOD, A METHOD FOR SCREENING SUCH YEAST AND A METHOD FOR THEIR CULTIVATION |
| EP2558588B1 (en) * | 2010-04-12 | 2015-08-19 | Ajinomoto Co., Inc. | A YEAST EXTRACT CONTAINING gamma-Glu-X OR gamma-Glu-X-Gly AND A METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
| WO2012046731A1 (en) | 2010-10-05 | 2012-04-12 | 味の素株式会社 | YEAST AND YEAST EXTRACT CONTAINING γ-Glu-Abu, AND METHOD FOR PRODUCING THE YEAST OR YEAST EXTRACT CONTAINING γ-Glu-Abu |
| DE102013209274A1 (en) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | Wacker Chemie Ag | Microorganism and method for fermentative overproduction of gamma-glutamylcysteine and derivatives of this dipeptide |
| CN104328092B (en) * | 2014-09-28 | 2017-03-15 | 邦泰生物工程(深圳)有限公司 | A kind of glutathione synthetase mutant, encoding gene and application |
| KR102100843B1 (en) | 2018-08-08 | 2020-04-14 | 샘표식품 주식회사 | Peptide having antioxidant activity and composition comprising thereof |
| KR102546738B1 (en) | 2021-01-04 | 2023-06-22 | 씨제이제일제당 주식회사 | Glutamate-cysteine ligase variant and method of producing glutathione using thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5206220A (en) * | 1990-04-23 | 1993-04-27 | Research Corporation Technologies, Inc. | Soluble and stable sources of tyrosine, cysteine and glutamine for total parenteral nutrition |
| JPH0753102B2 (en) * | 1992-06-23 | 1995-06-07 | アサヒビール株式会社 | Yeast high in glutathione and method for producing the same |
| EP1142493B2 (en) * | 1998-11-26 | 2013-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing flavor-enhancing agent for foods |
| MY128920A (en) * | 2000-05-25 | 2007-02-28 | Ajinomoto Kk | METHOD FOR PRODUCING y-GLUTAMYLCYSTEINE |
-
2001
- 2001-11-26 JP JP2001359782A patent/JP4273689B2/en not_active Expired - Lifetime
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2002
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- 2002-11-21 AT AT02788634T patent/ATE371720T1/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-21 BR BRPI0214336A patent/BRPI0214336B8/en active IP Right Grant
- 2002-11-21 EP EP02788634A patent/EP1449913B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-21 DE DE60222167T patent/DE60222167T2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-22 TW TW091134099A patent/TWI264466B/en not_active IP Right Cessation
- 2002-11-22 PE PE2002001125A patent/PE20030599A1/en not_active Application Discontinuation
- 2002-11-22 MY MYPI20024369A patent/MY134675A/en unknown
-
2004
- 2004-05-26 US US10/853,183 patent/US7569360B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2166075A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-24 | The Procter and Gamble Company | Cleaning composition |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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