DE60217873T2 - METHOD AND CIRCUIT FOR CONTROLLING AND MEASURING ELECTRICAL PARAMETERS IN A BIOLOGICAL MEMBRANE - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Schaltung zum Regeln und Messen elektrischer Parameter durch eine biologische Membran. Im Kontext dieser Beschreibung bedeutet das Wort "umfasst" "schließt mit ein" und soll nicht "ist beschränkt auf nur" bedeuten.The The invention relates to a method and a circuit for controlling and measuring electrical parameters through a biological membrane. In the context of this description, the word "includes" means "includes" and is not intended to mean "is limited to only".
Elektronische Schaltungen werden zum Messen und Regeln elektrischer Parameter verwendet, die erforderlich sind, um die Funktion von Membranproteinen (d.h. Ionenkanälen und -trägern) zu untersuchen und zu beeinflussen, welche geladene Teilchen (z.B. Ionen) durch die Lipidmembrane, welche Zellen umgeben, tragen. Viele pharmakologische Verbindungen wirken über die Modulation von Ionenkanälen, wobei jedoch die Entwicklung neuartiger Mittel durch die Schwierigkeit des Messens von Funktion und Funktionsmodulation bei hohem Durchsatz erheblich behindert wird.electronic Circuits are used to measure and regulate electrical parameters used, which are necessary to the function of membrane proteins (i.e., ion channels and carriers) to study and influence which charged particles (e.g. Ions) through the lipid membranes surrounding cells. Lots pharmacological compounds act via the modulation of ion channels, wherein but the development of novel means by the difficulty measuring function and function modulation at high throughput is significantly hampered.
Typische Verfahren zum Untersuchen derartiger Proteine sind die Patch-Clamp-Technik und die Lipid-Bilayer-Technik. Eine Beschreibung und ein beispielhaftes Verfahren der Patch-Clamp-Technik sind in der Europäischen Patentanmeldung mit der Aktenzahl 00116515.8 zu finden. Der hierin verwendete Begriff "biologische Membran" umfasst zelluläre äußere und innere Membrane, Membrane von subzellulären Organellen, künstliche Membrane, beispielsweise Lipid-Bilayer, und andere Fachkundigen bekannte Membrane. Der Begriff "Membranproteine" umfasst Ionenkanäle, andere Kanäle, Transporter, Rezeptoren und Proteine, die zum Teil oder zur Gänze in die Membran eingebettet oder mit der Membran verbunden sind.typical Methods for studying such proteins are the patch-clamp technique and the lipid bilayer technique. A description and an exemplary method of the patch-clamp technique are in the European To find patent application with the file number 00116515.8. The herein used term "biological Membrane "includes cellular outer and inner membrane, membrane of subcellular organelles, artificial Membranes, such as lipid bilayer, and others skilled in the art Membrane. The term "membrane proteins" includes ion channels, others Channels, Transporters, receptors and proteins that are partly or wholly in the Membrane embedded or connected to the membrane.
Für eine typische Messung von elektrischen Parametern in Membranproteinen und Membranen wird eine Vorrichtung, die eine Metallelektrode (z.B. eine Pipette) enthält, mit einer Lipidmembran, die eine Zelle oder eine andere biologische oder künstliche Struktur um gibt, verbunden, und die Elektrode wird elektrisch an einen analogen Verstärker angekoppelt. Dieser Verstärker führt eine empfindliche Strom-Spannungs-Wandlung mit niedrigem Rauschen durch und regelt die Spannung durch die Membran in veränderbaren Mustern. Der Verstärker enthält für gewöhnlich eine Vielfalt von analogen elektrischen Schaltungen, welche aus Operationsverstärkern, Kondensatoren und Widerständen bestehen.For a typical Measurement of electrical parameters in membrane proteins and membranes a device containing a metal electrode (e.g., a pipette) with a lipid membrane containing a cell or another biological or artificial Structure around, connected, and the electrode is electrically connected an analog amplifier coupled. This amplifier leads one sensitive current-voltage conversion with low noise and regulates the tension across the membrane in changeable patterns. The amplifier usually contains one Variety of analog electrical circuits consisting of operational amplifiers, capacitors and resistors consist.
Mehrere Artefakte stören für gewöhnlich die Messung von elektrischen Parametern in den Membranstrukturen.Several Artifacts disturb usually the measurement of electrical parameters in the membrane structures.
Auf Grund der kleinen geometrischen Abmessungen biologischer Membrane und der damit verbundenen Messvorrichtungen können die kapazitiven Ladungsbewegungen die beobachteten Ströme überschreiten. Daher wurde besonderes Augenmerk darauf gelegt, kapazitive Stromtransienten, die sich aus Änderungen der Befehlsspannung ergeben, zu kompensieren und zu unterdrücken. Ein weiteres wesentliches Problem ist der Serienzugangswiderstand zwischen der betreffenden Membranstruktur und der Aufzeichnungselektrode, welcher Spannungs- und Stromfehler einbringt (z.B. bei Patch-Clamp-Experimenten in der Ganzzellkonfiguration).On Reason for the small geometric dimensions of biological membranes and the associated measuring devices, the capacitive charge movements exceed the observed currents. Therefore, special attention has been paid to capacitive current transients, resulting from changes the command voltage to compensate and suppress. One Another major problem is the serial access resistance between the relevant membrane structure and the recording electrode, which introduces voltage and current errors (e.g., in patch-clamp experiments in the whole-cell configuration).
Der typische Messverstärker bedient sich drei verschiedener Schaltungen, um Folgendes zu kompensieren:
- 1. "schnelle" Kapazität (die sich hauptsächlich aus der Messkammer, z.B. der Patch-Pipette oder aus kleinen Membranflächen, ergibt);
- 2. "langsame" Kapazität (die sich hauptsächlich aus größeren biologischen Membranflächen, z.B. "Ganzzellaufzeichnungen", ergibt) in Serie mit einem Serienwiderstand in der Größenordnung von mehreren Megaohm;
- 3. Serienwiderstand (der sich aus einem schmalen oder begrenzten Zugang zu der Membran ergibt).
- 1. "fast" capacity (which results mainly from the measuring chamber, eg the patch pipette or from small membrane surfaces);
- 2. "slow" capacitance (resulting mainly from larger biological membrane areas, eg, "whole cell records") in series with a series resistance on the order of several megohms;
- 3. series resistance (resulting from narrow or limited access to the membrane).
Diese Schaltungen speisen über Kondensatoren Ströme in die Messsonde ein und ändern den Befehlsspannungszeitverlauf, um kapazitive Ladungsbewegungen und Verzerrungen des gewünschten Signals zu kompensieren.These Circuits feed over Capacitors currents enter and change the probe the command voltage waveform, capacitive charge movements and distortions of the desired Compensate signal.
Die analoge Schaltung ermöglicht entweder "Spannungsklemmen"-Regeln einer konstanten oder variablen Spannung, während der Strom gemessen wird, oder "Stromklemmen"-Regeln des Stroms auf einen gewünschten konstanten Wert oder ein gewünschtes konstantes Zeitmuster und Messen der Spannung. Moderne analoge Schaltungen bringen sehr niedrige Rauschpegel ein, die hauptsächlich von kapazitiven und thermischen Fluktuationen, für gewöhnlich im Bereich von 100 fA (10-3000 Hz)eff, herrühren.The analog circuit allows either "voltage clamp" rules of a constant or variable voltage while the current is measured, or "current clamps" rules of the current on a desired constant value or desired constant time pattern and measuring the voltage. Modern analog circuits bring very low noise levels, mainly from capacitive and thermal fluctuations, usually in the range of 100 fA (10-3000 Hz) eff.
Der
Stand der Technik in Form von Gillis, Kevin D.: "Admittance-based measurement of membrane
capacitance using the EPC-9 patch-clamp amplifier" und F.J. Sigworth: "Design of the EPC-9,
a computer-controlled patch-clamp amplifier. 1. Hardware" beschreibt die Verwendung
des EPC-9-Verstärkers. Wie
Hauptprobleme bei der analogen Verstärkerkompensationsschaltung sind:
- – die Miniaturisierung für Messungen in parallelen Kanälen wird durch die große Anzahl von erforderlichen Operationsverstärkern und passiven elektronischen Elementen behindert;
- – kapazitive Kopplung, kapazitives Rauschen und Übersprechen zwischen den Kanälen schränken die Miniaturisierung und die Anordnung mehrerer Vorrichtungen und Schaltungen erheblich ein;
- – bauartgemäß (bei der Verwendung von einzelnen analogen RC-Schaltungen) können nur einzelne RC-Kombinationen kompensiert werden;
- – nur ein begrenzter Bereich von RC-Werten kann kompensiert werden.
- Miniaturization for measurements in parallel channels is hampered by the large number of operational amplifiers and passive electronic elements required;
- Capacitive coupling, capacitive noise, and crosstalk between the channels severely limit the miniaturization and arrangement of multiple devices and circuits;
- - according to the design (when using individual analog RC circuits) only individual RC combinations can be compensated;
- - only a limited range of RC values can be compensated.
Die vorliegende Erfindung setzt sich mit den Problemen auseinander, mit denen die bekannten Messverfahren und Messschaltungen behaftet sind. Die Hauptaufgaben der vorliegenden Erfindung sind:
- – Miniaturisierung der Verstärkerkonstruktion durch Reduzieren der Anzahl von aktiven und passiven analogen Schaltungselementen für parallele Messungen in biologischen Membranen mittels mehrerer Elektroden;
- – Reduktion von kapazitiver Kopplung, Rauschen und Übersprechen zwischen Elektroden durch Reduzieren der Anzahl von aktiven und passiven analogen Schaltungselementen;
- – Kompensation von komplexen Kombinationen aus Kapazitäten und Widerständen, die beim Messen elektrischer Parameter in biologischen Membranen häufig vorkommen;
- – Erweiterung des Bereichs von Kapazitäten / Widerständen, die kompensiert werden können.
- Miniaturization of the amplifier design by reducing the number of active and passive analog circuit elements for parallel measurements in biological membranes by means of several electrodes;
- Reduction of capacitive coupling, noise and crosstalk between electrodes by reducing the number of active and passive analog circuit elements;
- Compensation of complex combinations of capacitance and resistance that are common in measuring electrical parameters in biological membranes;
- - Extension of the range of capacitors / resistors that can be compensated.
Diese Probleme werden mittels eines Verfahrens mit den Merkmalen aus Anspruch 1 sowie mittels einer elektronischen Schaltung mit den Merkmalen aus Anspruch 21 gelöst. Mehrere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten und nachstehend beschrieben. Der Wortlaut der Ansprüche ist in der Beschreibung durch ausdrückliche Bezugnahme enthalten.These Problems are solved by means of a method having the features of 1 and by means of an electronic circuit with the features solved from claim 21. Several embodiments of the invention are contained in the subclaims and below described. The wording of the claims is in the description by express Reference included.
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren und einen digitalen elektronischen Verstärker, die ausgebildet sind, um in biologischen Membranen Spannungen zwischen –500 und +500 mV und Ströme im Bereich von einigen Hundert Femtoampere bis zu Hunderten von Nanoampere zu messen und zu regeln.The Invention describes a method and a digital electronic Amplifier, which are designed to be in biological membranes voltages between -500 and +500 mV and currents ranging from a few hundred Femtoampere to hundreds of Nanoampere to measure and regulate.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Vorteile werden durch Austausch der herkömmlichen analogen Schaltung zur Korrektur des Frequenz-/Transientenverhaltens des Systems erzielt. Bei der vorliegenden Erfindung wird diese Korrektur stattdessen durch Software auf einem Rechner durchgeführt, welcher bei einer Ausführungsform Stromreaktionen aus dem Ausgang eines Operationsverstärkers über einen AD-Wandler ausliest und die an die Sonde angelegte Spannung über einen DA-Wandler regelt, der an einen anderen Operationsverstärker angeschlossen ist.The advantages provided by the present invention by replacing the conventional ones analog circuit for correcting the frequency / transient response of the system. In the present invention, this correction becomes instead performed by software on a computer, which in one embodiment, current reactions read from the output of an operational amplifier via an AD converter and controls the voltage applied to the probe via a DA converter, which is connected to another operational amplifier.
Die Software ist ausgebildet, um das System derart zu regeln, dass ein bevorzugtes Stromreaktionsmuster, z.B. ein Rechteckschritt, durch Anwenden eines komplexen Spannungsmusters realisiert werden kann, welches die erforderlichen Ladetransienten und Zeitkonstanten für eine bestimmte Streukapazitäts/Widerstands-Kombination aufweist. Die Software ist auch ausgebildet, um elektrische Parameter wie Streukapazitäten, Serienwiderstände und Kombinationen daraus durch schrittweise oder kontinuierliche Näherung zu schätzen und das bevorzugte Stromreaktionsmuster zu optimieren.The Software is designed to regulate the system such that a preferred current reaction pattern, e.g. a rectangular step, through Applying a complex stress pattern can be realized which the required load transients and time constants for a given Stray capacitance / resistance combination having. The software is also designed to be electrical parameters like stray capacities, series resistors and combinations thereof by gradual or continuous approximation appreciate and to optimize the preferred current response pattern.
Mit digitaler Kompensation der Kapazitäten und Serienwiderstände der Messschaltung, welche durch einen Rechner ausgeführt wird, der über AD/DA-Wandler an die Messschaltung angeschlossen ist, ist es möglich, folgende Anforderungen zu erfüllen:
- – Miniaturisierung durch Reduzieren der Anzahl von aktiven und passiven analogen Schaltungselementen;
- – Reduktion von kapazitiver Kopplung, Rauschen und Übersprechen zwischen Kanälen;
- – geringes elektrisches Rauschen (typisch 100 fA eff 10-3000 Hz);
- – einfaches Umschalten der Verstärkung (1-100 mV/pA);
- – einfache Kompensation eines großen Bereichs von Kapazitäten und Widerständen;
- – Kompensation von komplexen Kombinationen aus Kapazitäten und Widerständen;
- – schnelles und exaktes Forcen der gewünschten Befehlsspannung (Spannungsklemme);
- – Messung und Kompensation von kapazitiver Ladungsbewegung in der Messvorrichtung und der Membran;
- – Kompensation von Strom- und Spannungsfehlern, die aus Serienwiderständen und Streukapazitäten in der Messvorrichtung entstehen.
- Miniaturization by reducing the number of active and passive analog circuit elements;
- - reduction of capacitive coupling, noise and crosstalk between channels;
- - low electrical noise (typically 100 fA eff 10-3000 Hz);
- - simple switching of the gain (1-100 mV / pA);
- - easy compensation of a wide range of capacitances and resistances;
- - Compensation of complex combinations of capacitances and resistances;
- - fast and accurate forcing of the desired command voltage (voltage terminal);
- - Measurement and compensation of capacitive charge motion in the measuring device and the membrane;
- - Compensation of current and voltage errors resulting from series resistance and stray capacitance in the measuring device.
Diese Merkmale sind für Untersuchungen, welche die elektrischen Eigenschaften von biologischen Membranproteinen messen, deren Funktion für gewöhnlich von der Spannung und dem Timing von Spannungsänderungen abhängt, wesentlich. Die mit der vorliegenden Erfindung erreichten Verbesserungen sind insbesondere für die Mehrkanalausgestaltung von elektrophysiologischen Untersuchungen, um mehrere Messungen in biologischen Membranen gleichzeitig durchzuführen, von Bedeutung.These Features are for Investigations of the electrical properties of biological Measuring membrane proteins whose function is usually determined by the voltage and the timing of voltage changes depends essential. The improvements achieved with the present invention are in particular for the multichannel design of electrophysiological examinations, to perform several measurements in biological membranes simultaneously, from Importance.
Bei einem bevorzugten Verfahren ist die Messschaltung ein IU-Wandler, der mit der biologischen Membran verbunden wird. Ein Ausgang des IU-Wandlers kann zum Analysieren des I-Ausgangssignals über einen AD-Wandler an den Rechner angeschlossen werden, wobei der Rechner vorzugsweise ein U-Eingangssignal berechnet, das über einen DA-Wandler in die Messschaltung eingegeben wird.In a preferred method, the measuring circuit is an IU transducer connected to the biological membrane. An output of the IU converter may be for analyzing the I output signal via an AD converter to the computer be closed, the computer preferably calculates a U input signal which is input via a DA converter in the measuring circuit.
Bei einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein digitales Messsystem zum Messen und Regeln von Stromstärke und Spannung quer durch biologische Membrane. Die Erfindung bedient sich digitaler Kompensation von Kapazitäten und Serienwiderständen an Stelle von analogen Schaltungen. Diese Verbesserungen werden vorzugsweise in der Erfindung durch Anschließen eines AD-Wandlers (ADC) an den Imon-Ausgang des IU-Wandlers und eines DA-Wandlers (DAC) an den Vcom-Eingang des IU-Wandlers realisiert. Der ADC wird an einen Rechner, z.B. einen Personalcomputer, angeschlossen. Derselbe Rechner steuert den DAC. Der Rechner kann ein rechteckiges, trapezförmiges oder sinusförmiges Spannungsmuster über den DAC erzeugen. Der Rechner tastet das Stromreaktions-I-Ausgangssignal der Anordnung aus biologischem Element/Elektrode über den ADC ab. Der Rechner berechnet die elektrischen Parameter der gesamten Schaltung, einschließlich des biologischen Elements. Der Rechner ändert dann das U-Eingangssignal derart, dass die gewünschte Stromreaktion der gesamten Schaltung, einschließlich des biologischen Elements, erreicht wird. Vorzugsweise kann ein U-Eingangssignal durch den Rechner infolge des Berechnens der Messschaltungseigenschaften erzeugt werden.at an embodiment The invention relates to a digital measuring system for measuring and Regulating current and tension across biological membrane. The invention uses digital compensation of capacitances and series resistances Place of analog circuits. These improvements are preferred in the invention by connection an AD converter (ADC) to the Imon output of the IU converter and a DA converter (DAC) realized at the Vcom input of the IU converter. The ADC is on a computer, e.g. a personal computer, connected. the same Computer controls the DAC. The calculator can be a rectangular, trapezoidal or sinusoidal Voltage pattern over generate the DAC. The computer samples the current response I output signal the arrangement of biological element / electrode over the ADC off. The calculator calculates the electrical parameters of the entire circuit, including of the biological element. The calculator then changes the U input signal such that the desired Current reaction of the entire circuit, including the biological element, is reached. Preferably, a U input signal through the Computer generated as a result of calculating the Meßschaltungseigenschaften become.
Ferner ist es möglich, durch den Rechner ein Korrekturspannungssignal zu erzeugen. Dieses Signal wird über einen DAC und einen Verstärker mittels einer seriellen Kombination aus einem Widerstand und einem Kondensator eingegeben. Der Widerstand oder der Kondensator können schaltbar sein, jedoch in einer anderen Ausführungsform können sie auch nichtschaltbar sein. Dies ist in diesem Zusammenhang bei allen Kondensatoren der Fall. Vorzugsweise wird das Korrekturspannungssignal zu der Elektrode, die nahe der Membran angeordnet ist, eingegeben.Further Is it possible, to generate a correction voltage signal by the computer. This Signal is over a DAC and an amplifier by means of a serial combination of a resistor and a Capacitor entered. The resistor or the capacitor can be switched but in another embodiment they may be not be switchable. This is in this context with all capacitors the case. Preferably, the correction voltage signal becomes the electrode, which is located near the membrane, entered.
Die kapazitiven Ladungsbewegungen können für gewöhnlich von Strömen, die durch Ionenflüsse geführt werden, anhand von Timing, Spannungsabhängigkeit und verschiedenen anderen Fachkundigen bekannten Mitteln unterschieden werden.The capacitive charge movements can usually from Stream, that by ion fluxes guided be based on timing, voltage dependence and different be distinguished from other experts known means.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird angenommen, dass die I-Ausgangsreaktion einer biologischen Membran auf eine Spannungsänderung dem Ohmschen Gesetz folgt, wobei innerhalb eines einem Fachkundigen bekannten Spannungsbereiches keine Ionentransportproteine geöffnet werden.at a preferred embodiment It is assumed that the initial I reaction of a biological Diaphragm on a voltage change the Ohm's law follows, being within a specialist known voltage range no ion transport proteins are opened.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind beide Membrane einer Zelle intakt und seriell angeordnet. Bei dieser Anordnung ist die durch die biologische Membran eingebrachte Kapazität klein, der Widerstand des Präparats ist groß, und die digitale Kompensation kann Kapazitäten und Serienwiderstände in der Aufzeichnungsvorrichtung kompensieren.at a preferred embodiment Both membranes of a cell are intact and serially arranged. at This arrangement is introduced through the biological membrane capacity small, drug resistance is big, and the digital compensation can reduce capacitance and series resistance in the Compensate recording device.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Membran einer Zelle körperlich unterbrochen oder elektrisch permeabel gemacht. Dies kann durch chemische Mittel, beispielsweise Ionophore, bewerkstelligt werden. Bei dieser Anordnung ist die durch die biologische Membran eingebrachte Kapazität groß, beispielsweise 4-100 pF. Der Widerstand in Serie mit der Kapazität ist klein, beispielsweise 2-50 MOhm. Die digitale Kompensation kann Kapazitäten und Serienwiderstände in der Aufzeichnungsvorrichtung kompensieren.at a further preferred embodiment a membrane of a cell is physically interrupted or made electrically permeable. This can be done by chemical means, For example, ionophores, be accomplished. In this arrangement For example, the capacity introduced by the biological membrane is large 4-100 pF. The resistance in series with the capacity is small, for example 2-50 MOhm. The digital compensation can capacities and series resistors in the recording device.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann eine Membran einer Zelle physisch oder elektrisch unterbrochen sein. Bei dieser Anordnung kann die durch die biologische Membran eingebrachte Kapazität groß sein, beispielsweise 4-100 pF, während der Widerstand in Serie mit der Kapazität klein ist, beispielsweise 2-50 MOhm. Die digitale Kompensation kann Kapazitäten und Serienwiderstände in der Aufzeichnungsvorrichtung kompensieren.at another preferred embodiment For example, a membrane of a cell may be physically or electrically interrupted be. In this arrangement, the through the biological membrane introduced capacity be great for example 4-100 pF while the resistance in series with the capacity is small, for example 2-50 MOhm. The digital compensation can be capacities and series resistors in the recording device.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die I-Ausgangsreaktion einer biologischen Membran auf eine Spannungsänderung durch blockierte Ionentransportproteine antizipiert. Die Ionentransportproteine werden vorzugsweise durch Anwendung einer das Transportprotein blockierenden Lösung blockiert. Die Lösung enthält vorzugsweise Substanzen, welche den Kanal blockieren, z.B. Schwermetallionen oder pharmazeutische Verbindungen, die Fachkundigen bekannt sind. Nach der Berechnung/Kompensation der Messschaltungseigenschaften werden die Blockiermittel durch Lösungsaustausch entfernt.at a preferred embodiment is the I-output response of a biological membrane to a voltage change anticipated by blocked ion transport proteins. The ion transport proteins are preferably blocked by using a transport protein blocking solution blocked. The solution contains preferably substances which block the channel, e.g. Heavy metal ions or pharmaceutical compounds known to those skilled in the art. To the calculation / compensation of the measurement circuit characteristics the blocking agents by solution exchange away.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die I-Ausgangsreaktion einer biologischen Membran antizipiert, indem permeable Ionen von den Lösungen entfernt werden, die das Membranprotein umgeben, oder von einer Seite des Proteins entfernt werden, wobei die Spannung auf einen Wert getrieben wird, der die elektrochemische Triebkraft auf nahezu 0 bringt.at a preferred embodiment the I-output response of a biological membrane is anticipated, by permeable ions from the solutions be removed, which surround the membrane protein, or by a Side of the protein are removed, with the tension on one Value is driven, the electrochemical driving force to almost 0 brings.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die I-Ausgangsreaktion einer biologischen Membran antizipiert, indem Cofaktoren von den Lösungen, die das Membranprotein umgeben, entfernt werden oder von einer Seite des Proteins entfernt werden, so dass ein Öffnen des Ionentransportproteins verhindert wird, beispielsweise Ca2+-Ionen oder andere sekundäre Botenstoffe, welche das Öffnen des Kanalproteins regeln. Derartige für das Öffnen von Ionentransportproteinen erforderliche Cofaktoren sind Fachkundigen bekannt.In a preferred embodiment, the initial I reaction of a biological membrane is anticipated by removing cofactors from the solutions surrounding the membrane protein or removing them from one side of the protein so as to prevent opening of the ion transport protein, for example Ca 2+ . Ions or other secondary messengers that open the canal protein to regulate. Such cofactors required for opening ion transport proteins are known to those skilled in the art.
Bei einer Ausführungsform wird eine Membran, die einen spannungsgesteuerten Ionenkanal enthält, untersucht. Der Ionenkanal kann zur Berechnung der Messschaltungseigenschaften durch Vermeiden von Spannungen im U-Eingangssignal, welche den Kanal öffnen, z.B. durch Hyperpolarisierthalten der Membran, oder durch Halten des U-Eingangssignals auf Pegeln, die den Kanal inaktivieren, z.B. durch Aufrechterhalten einer entpolarisierenden Spannung, geschlossen sein. Die Spannungsmuster, Lösungen und Reagenzien, die für derartige Manöver mit spannungsabhängigen Ionentransportproteinen oder anderen Ionentransportproteinen erforderlich sind, sind Fachkundigen bekannt.at an embodiment For example, a membrane containing a voltage-gated ion channel is examined. The ion channel can be used to calculate the measurement circuit characteristics by avoiding voltages in the U input signal which open the channel, e.g. by maintaining the membrane hyperpolarized, or by holding the membrane U input signal at levels inactivating the channel, e.g. by Maintaining a depolarizing voltage, closed be. The tension patterns, solutions and reagents used for such maneuvers with voltage-dependent Ion transport proteins or other ion transport proteins required are knowledgeable.
Ferner ist es möglich, die elektrischen Eigenschaften einer Zellmembran oder eines Ionentransportproteins in der Membran zu messen, wobei spannungsabhängige Membranproteine untersucht werden. Die Membranproteine können zur Berechnung der Messschaltungseigenschaften entweder inaktiviert oder aktiviert sein. Die Berechnung kann durch Auswählen von Spannungssequenzen in dem U-Eingangssignal, welche die Membranproteine inaktivieren oder aktivieren, erfolgen.Further Is it possible, the electrical properties of a cell membrane or an ion transport protein in the membrane, investigating voltage-dependent membrane proteins become. The membrane proteins can either inactivated to calculate the measurement circuit characteristics or be activated. The calculation can be done by selecting Voltage sequences in the U input signal affecting the membrane proteins inactivate or activate.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das U-Eingangssignal zur einfachen Erkennung oder Evaluierung optimiert, beispielsweise ein rechteckiges, trapezförmiges oder sinusförmiges Signal.at a preferred embodiment The U input signal is for easy detection or evaluation optimized, for example, a rectangular, trapezoidal or sinusoidal Signal.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden das U-Eingangssignal und das I-Ausgangssignal verglichen, um Änderungen der Membrankapazität in Abhängigkeit von der Zeit, beispielsweise durch Änderungen der Membranfläche durch Membranfusion oder Membranrückführung, zu berechnen. Vorzugsweise ist das U-Eingangssignal sinusförmig, und die Phasenverschiebung zwischen Eingangs- und Ausgangssignal wird durch die Software berechnet.at a preferred embodiment become the U input signal and the I output compared to changes in membrane capacitance in response from time, for example, by changes in the membrane area through Membrane fusion or membrane recycling, too to calculate. Preferably, the U input signal is sinusoidal, and the phase shift between input and output is calculated by the software.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können die digital berechneten Korrekturspannungssignale zum Kompensieren kapazitiver Ströme, die durch die Membran bzw. die Aufzeichnungsvorrichtung verursacht werden, in die Messschaltung eingegeben werden. Die Kapazitäten können Streukapazitäten sein.at a preferred embodiment can the digitally calculated correction voltage signals for compensation capacitive currents, caused by the membrane or recording device be entered into the measuring circuit. The capacities can be stray capacities.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Korrekturspannungssignal durch den Rechner erzeugt und über den DAC durch andere angebundene Elemente wie Verstärker oder Filter mittels eines einstellbaren Widerstands und Kondensators eingegeben werden. Das Korrekturspannungssignal wird vorzugsweise in die Elektrode eingespeist, welche mit der Lösung, welche die Membran umgibt, in Kontakt steht.at a preferred embodiment a correction voltage signal generated by the computer and via the DAC by other tethered elements such as amplifiers or filters by means of a adjustable resistor and capacitor can be entered. The Correction voltage signal is preferably fed into the electrode, which with the solution, which is in contact with the membrane.
Mit der Erfindung können die folgenden Messungen und Kompensationen durchgeführt werden:
- – Messung und Kompensation der Kapazität der Aufzeichnungsvorrichtung, welche die Membran hält, z.B. der Kapazität einer Pipette oder eines flachen perforierten Chips;
- – Messung und Kompensation der Kapazität der biologischen Membran;
- – Messung und Kompensation der Kapazität von Abschnitten der biologischen Membran;
- – Messung und Kompensation von Serienwiderstand gegenüber der biologischen Membran;
- – Messung und Kompensation von Kombinationen aus Serienwiderständen und Kapazitäten für Abschnitte der biologischen Membran.
- Measuring and compensating the capacity of the recording device holding the membrane, eg the capacity of a pipette or a flat perforated chip;
- - Measurement and compensation of the capacity of the biological membrane;
- - Measurement and compensation of the capacity of sections of the biological membrane;
- - Measurement and compensation of series resistance to the biological membrane;
- - Measurement and compensation of combinations of series resistances and capacities for sections of the biological membrane.
Messungen können durch Näherungen ersetzt werden, wenn eine Teilkompensation ausreichend ist, um die Eigenschaften des in die Membran eingebetteten Ionentransportproteins zu messen.measurements can through approximations be replaced when a partial compensation is sufficient to the Properties of the ion transport protein embedded in the membrane to eat.
Die Erfindung ermöglicht die Analyse von elektrischen Signalen, die Analyse der elektrischen Eigenschaften der Messschaltung und der die Membran haltenden Vorrichtung sowie die Analyse elektrischer Parameter der Membran und eingebetteter Proteine. Mit der Erfindung können Zeit- und Frequenzreaktionen der Messschaltung, einschließlich der Membran, variiert und analysiert werden. Mit der Erfindung können komplexe Anordnungen kapazitiver und resistiver Elemente analysiert und kompensiert werden.The Invention allows the analysis of electrical signals, the analysis of electrical properties the measuring circuit and the membrane holding device as well the analysis of electrical parameters of the membrane and embedded proteins. With the invention can Time and frequency responses of the measurement circuitry, including the Membrane, varied and analyzed. With the invention, complex Arrangements of capacitive and resistive elements are analyzed and compensated become.
Mit der Erfindung können elektronische Schaltungen miniaturisiert und automatisiert werden, um mehrere parallele elektrische Messungen in biologischen Membranen durchzuführen. Mit der Erfindung kann besagte Analyse und Kompensation automatisiert werden.With of the invention Electronic circuits are miniaturized and automated to several parallel electrical measurements in biological membranes perform. With the invention, said analysis and compensation can be automated become.
Diese und weitere Merkmale sind den Ansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen zu entnehmen, und die einzelnen Merkmale, sowohl einzeln als auch in Kombinationen, können in einer Ausführungsform der Erfindung und in anderen Gebieten implementiert werden und vorteilhafte, unabhängig schützbare Konstruktionen darstellen, für welche hier Schutz beansprucht wird. Die Unterteilung der Anmeldung in einzelne Abschnitte und die Untertitel schränken die allgemeine Gültigkeit der darin gemachten Aussagen auf keinerlei Weise ein.These and further features are the claims, the description and to take the drawings, and the individual features, both individually as well as in combinations in one embodiment of the invention and in other fields and advantageous, independently protectable Represent constructions for which protection is claimed here. The subdivision of the application in individual sections and the subtitles limit the general validity the statements made therein in no way.
Kurze Beschreibung der ZeichnungenShort description the drawings
Ausführungsformen der Erfindung werden in der Folge mit Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen ausführlicher beschrieben:embodiments The invention will be described in the following with reference to the following Drawings in more detail described:
Ausführliche Beschreibung der AusführungsformenFull Description of the embodiments
Das
in
Die Elektrode E1 ist elektrisch an einen Eingang eines Operationsverstärkers A1 angeschlossen, der in die Schaltung eines Strom-Spannungs-Wandlers IVC integriert ist. Der Wandler IVC weist eine sehr hochohmige Rückkopplungsschaltung auf, die einen Präzisionswiderstand R1 umfasst, welcher den Ausgang des Verstärkers A1 wieder mit der Elektrode E1 verbindet. Der andere Eingang zum Verstärker A1 ist an eine Bezugspotenzialquelle angeschlossen, welche einen Verstärker A3 umfasst. Der Ausgang des Verstärkers A3 ist über einen Serienwiderstand R2, welcher über einen Shuntwiderstand R3 mit der Systemerde verbunden ist, mit dem Eingang des Verstärkers A1 verbunden. Der Ausgang des Bezugsspannungsverstärkers A3 ist auch mit der Schirmung des Wandlers verbunden.The Electrode E1 is electrically connected to an input of an operational amplifier A1 connected in the circuit of a current-voltage converter IVC is integrated. The converter IVC has a very high-impedance feedback circuit on that a precision resistor R1, which again connects the output of the amplifier A1 to the electrode E1 connects. The other input to amplifier A1 is at a reference potential source connected, which comprises an amplifier A3. The exit of the amplifier A3 is over a series resistor R2, which via a shunt resistor R3 connected to the system ground, to the input of the amplifier A1 connected. The output of the reference voltage amplifier A3 is also connected to the shield connected to the converter.
Der Ausgang des Operationsverstärkers A1 in dem Strom-Spannungs-Wandler IVC ist an einen Eingang eines anderen differenziellen Verstärkers A2 angeschlossen. Der zweite Eingang zu Verstärker A2 ist von dem Bezugsverstärker A3 abgeleitet. Der Ausgang von Verstärker A2 stellt das Stromüberwachungssignal (Imon) dar, welches das Ausgangssignal darstellt, und ist an einen AD-Wandler ADC angeschlossen. Der digitale Ausgang des AD-Wandlers ADC ist an einen Rechner PC angeschlossen, welcher in diesem Fall ein Personalcomputer ist.Of the Output of the operational amplifier A1 in the current-voltage converter IVC is connected to an input of another differential amplifier A2. The second input to amplifier A2 is from the reference amplifier A3 derived. The output of amplifier A2 provides the current monitoring signal (Imon), which represents the output signal, and is connected to a AD converter ADC connected. The digital output of AD converter ADC is connected to a computer PC, which in this case a Personal computer is.
Der Eingang des Bezugsquellenverstärkers A3 stellt die Befehlsspannung (Vcom) dar, welche das Eingangssignal darstellt. Der Eingang kann einen Operationsverstärker umfassen und ist an den analogen Ausgang eines DA-Wandlers DAC angeschlossen, der durch den Rechner PC digital gesteuert wird. A3 dient dazu, eine Befehlsspannung an die Sonde anzulegen, beispielsweise einen Spannungsschritt für die Aktivierung eines Ionenkanals in der biologischen Membran M.Of the Input of the reference source amplifier A3 represents the command voltage (Vcom) representing the input signal represents. The input may comprise an operational amplifier and is connected to the analog output of a DA converter DAC, which passes through the computer PC is controlled digitally. A3 serves to provide a command voltage to apply to the probe, for example, a voltage step for the activation an ion channel in the biological membrane M.
Bei
der in
Verteilte Kapazitäten oder "Streu"-Kapazitäten sind beim Betrieb des Systems wichtig. Eine dieser ist die verteilte Rückkopplungskapazität C1, welche eine Größenordnung von 0,1 pF aufweist. Die Streukapazität C2 zwischen dem Elektrodenanschluss und der Erde hängt von der Sonde, welche die biologische Membran enthält, ab und liegt im Bereich von 4-10 pF. C3 stellt die Eingangskapazität des Verstärkers A1 auf ungefähr 4 pF dar, wie oben angegeben wurde. Eine komplexe Anordnung aus Kapazitäten und Widerständen kann in der SONDE in Abhängigkeit von der Fläche der biologischen Membran, der Geometrie und des die Membran und die SONDE usw. umgebenden Materials vorliegen.distributed capacities or "litter" capacities important in the operation of the system. One of these is the distributed one Feedback capacitance C1, which an order of magnitude of 0.1 pF. The stray capacitance C2 between the electrode terminal and the earth hangs from the probe containing the biological membrane, and is in the range of 4-10 pF. C3 represents the input capacitance of the amplifier A1 at about 4 pF as indicated above. A complex arrangement capacities and resistors can depend on the PROBE from the area biological membrane, geometry and membrane and the PROBE, etc. are present.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Verbesserung umfasst den Ersatz von herkömmlichen analogen Schaltungen zur Korrektur des Frequenz-/Transientenverhaltens des Systems. Diese Korrektur wird durch eine Software auf einem Rechner PC durchgeführt, welcher Stromreaktionen von dem Ausgang des Verstärkers A1 über den AD-Wandler ADC ausliest und die Spannung regelt, die über den DA-Wandler DAC, der an den Verstärker A3 angeschlossen ist, an die Sonde angelegt wird. Die Software auf dem Rechner PC ist ausgebildet, um das System derart zu regeln, dass ein bevorzugtes Stromreaktionsmuster, z.B. ein Rechteckschritt, durch Anlegen eines komplexen Spannungsmusters realisiert werden kann, welches die erforderlichen Ladeströme und Zeitkonstanten für bestimmte Streukapazitäts/Widerstands-Kombinationen aufweist.The comprises improvement provided by the present invention the replacement of conventional analog circuits for correcting the frequency / transient response of the system. This correction is performed by a software on a computer PC, which Current responses from the output of the amplifier A1 via the AD converter ADC read and the voltage controls that over the DA converter DAC connected to the amplifier A3, is applied to the probe. The software on the computer PC is designed to regulate the system such that a preferred Current response pattern, e.g. a rectangular step, by applying a complex voltage pattern can be realized, which the required charging currents and time constants for certain Stray capacitance / resistance combinations having.
Zum Vergleich wird eine typische, im Stand der Technik bekannte analoge Schaltung in "Design of the EPC-9, a computer controlled patch-clamp amplifier" von Sig worth, Journal of Neuroscience Methods 56 (1995), 195-202, beschrieben.To the Comparison becomes a typical analog known in the art Circuit in "Design of the EPC-9, a computer-controlled patch-clamp amplifier "from Sigworth, Journal of Neuroscience Methods 56 (1995), 195-202.
In
Beschreibung eines typischen Experiments:Description of a typical Experiments:
Eine
biologische Membran, z.B. eine Zellmembran einer CHO-Zelle, die
ein Transportprotein exprimiert, z.B. einen spannungsgesteuerten Na+-Kanal, wird an eine Kammer, z.B. eine Patch-Clamp-Pipette
in wässriger
Salzlösung,
gesiegelt. Die Befehlsspannung Vcom wird kontinuierlich auf –100 mV "hyperpolarisiert" gehalten, um die
Aktivierung des Na+-Kanals zu vermeiden.
Spannungsschritte auf –105
und –95
mV von einer Dauer von 10 ms werden in
Als nächstes wird ein Befehlsspannungsschritt von einem Haltepotenzial von –90 mV auf 40 mV angelegt, wodurch der spannungsgesteuerte Na+-Kanal geöffnet wird. Die Verzerrungen der Befehlsspannung werden nun bis zu der Größenordnung des Spannungsschritts skaliert. Der Strom durch den Kanal wird nun ohne Ladeströme und Serienwiderstandsstrom-/-spannungsfehler gemessen.Next, a command voltage step is applied from a hold potential of -90 mV to 40 mV, thereby opening the voltage controlled Na + channel. The distortions of the command voltage are now scaled up to the magnitude of the voltage step. The current through the channel is now measured without charging currents and series resistance current / voltage errors.
In diesem Beispiel wird das Öffnen des Na+-Kanals während der Messung/Näherung von kapazitiven Strömen und der Unterdrückung durch Hyperpolarisierthalten der Membran vermieden. Alternativ dazu kann ein Ionentransportprotein entweder durch Wählen einer zweckmäßigen wässrigen Lösung, die Substanzen enthält, welche den Kanal blockieren, oder durch Weglassen permeanter Moleküle, blockiert werden. Nach dem Unterdrückungsvorgang kann die Lösung gewechselt werden.In this example, the opening of the Na + channel during the measurement / approximation of capacitive currents and the suppression by hyperpolarization of the membrane is avoided. Alternatively, an ion transport protein may be blocked either by choosing an appropriate aqueous solution containing substances which block the channel, or by omitting permeant molecules. After the suppression process, the solution can be changed.
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