DE60123128T2

DE60123128T2 - Zuammensetzungen und verfahren zur verbesserung der nierenfunktion

Info

Publication number: DE60123128T2
Application number: DE60123128T
Authority: DE
Inventors: E. Charles Woodinville HART; Stavros Seattle TOPOUZIS
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-10-30
Filing date: 2001-10-26
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-10-27
Also published as: US6827938B2; WO2002060467A3; JP2004518681A; US20020183273A1; ATE339218T1; US20050049217A1; DK1355655T3; JP4249482B2; EP1355655A2; DK1355655T5; DE60123128D1; CA2427143A1; WO2002060467A2; EP1355655B1; ES2272573T3; AU2002248237A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Niereninsuffizienz kann als eine Komplikation bei Trauma, Schock, Vergiftung, akuter Pankreatitis, Septikämie, chronischer Exposition gegenüber bestimmten Medikamenten, Vergiftung und aus anderen Ursachen auftreten. Akute tubuläre Nekrose (ATN), die häufigste Ursache akuter Niereninsuffizienz, tritt gewöhnlich nach einer Periode ungenügender Blutzirkulation zu den peripheren Organen auf. Anoxie oder Vergiftung führt zum Absterben tubulärer Epithelzellen und im Verlauf zu akuter Niereninsuffizienz. Chronische Analgetikanephritis, die aus anhaltender, Exposition gegenüber Kombinationen aus Phenacetin, Aspirin und Acetominophen resultiert, kann ebenfalls eine Folge der Nekrose tubulärer Epithelzellen sein. Siehe Robbins et al., Basic Pathology, Dritte Ausgabe, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1981, 421–456.
Durch Ischämie und Nephrotoxin induzierte Nierenschäden sind die Hauptursache akuter Niereninsuffizienz und sind durch strukturelle und funktionelle Schäden an den tubulären Nierentubulusepithelzellen, vorwiegend an den proximalen Tubuli gekennzeichnet (Oliver et al., J. Clin. Invest., 30:1307–1439, 1951). Schäden am proximalen Tubulusepithel werden durch einen komplexen Regenerationsprozess repariert. Nach Zelldesquamation proliferieren entdifferenzierte proximale Tubuluszellen und wandern zur Etablierung eines neuen Epithels in den denudierten Bereich der Basalmembran (Wallin et al., Lab Invest., 66:474–484, 1992). In vielerlei Hinsicht ähnelt dieser nephrogene Reparaturprozess dem späten Entwicklungsstadium von Nephronen, wenn sich das embryonale Mesenchym in ein Tubulusepithel umwandelt (Wallin et al., ibid.; Hammermann et al., A. J. Physiol., 262:F523–532, 1992).
Während ein funktionsfähiges Tubulusepithel so kurzer Zeit wie zwei Wochen regeneriert werden kann, dauert der klinische Verlauf von ATN bei vielen Patienten länger, und die Behandlung besteht aus unterstützender Versorgung, einschließlich Dialyse. Ohne entsprechende Behandlung führt ATN zum Tod.
Es besteht ein Bedarf an Zusammensetzungen und Verfahren zur in vivo-Stimulation der Proliferation von Nierentubulusepithelzellen und damit zur Verbesserung der Nierenfunktion.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines zvegf4-Proteins oder eines für zvegf4-Protein codierenden Polynukleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung akuter tubulärer Nekrose oder chronischer Analgetikanephritis.
Die vorliegende Erfindung stellt Materialien und Verfahren zur Verbesserung der Nierenfunktion oder Verstärkung der Proliferation oder des Überlebens von Nierentubulusepithelzellen oder -epithelzellvorläufern bei einem Säuger bereit.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung der Nierenfunktion bei einem behandlungsbedürftigen Säuger bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung an den Säuger, die eine therapeutisch wirksame Menge eines zvegf4-Proteins oder eines für zvegf4-Protein codierenden Polynukleotids zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel umfasst.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verstärkung der Proliferation oder des Überlebens von Nierentubulusepithelzellen oder -epithelzellvorläufern bei einem Säuger bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung an den Säuger, die eine therapeutisch wirksame Menge eines zvegf4-Proteins oder eines für zvegf4-Protein codierenden Polynukleotids zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel umfasst.
Bei manchen Ausführungsformen der oben offenbarten Verfahren wird dem Säuger ein zvegf4-Protein verabreicht. Bei ausgewählten Ausführungsformen ist das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten, wobei jede der Ketten die Reste 258-370 der SEQ ID NO:2, die Reste 250-370 der SEQ ID NO:2 oder die Reste 246-370 der SEQ ID NO:2 umfasst. Bei anderen Ausführungsformen ist das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten, wobei jede der Ketten aus den Resten X bis 370 der SEQ ID NO:2 besteht, wobei X eine ganze Zahl zwischen 246 und einschließlich 258 ist und wobei das Protein gegebenenfalls glykosyliert ist.
Bei anderen Ausführungsformen der oben offenbarten Verfahren wird dem Säuger ein für zvegf4-Protein codierendes Polynukleotid verabreicht. Bei ausgewählten Ausführungsformen codiert das Polynukleotid für ein Polypeptid, das die Reste 258-370 der SEQ ID NO:2, die Reste 19-370 der SEQ ID NO:2 oder die Reste 1-370 der SEQ ID NO:2 umfasst.
Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung ist das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten, wobei jede der Ketten aus den Resten, einschließlich, x-y der SEQ ID NO:2 besteht, wobei das Protein gegebenenfalls glykosyliert ist und wobei x ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 35, 52, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 246, 250, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 und 263; und y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 365, 366, 367, 368, 369 und 370.
Bei anderen Ausführungsformen der oben offenbarten Verfahren leidet der Säuger an akuter tubulärer Nekrose.
Die Figur zeigt ein Hdrophilie-Profil der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz nach Hopp und Woods. Das Profil basiert auf einem aus sechs Resten bestehenden gleitenden Fenster. Verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H-, Y- und W-Reste wurden ignoriert. Die Reste sind in der Figur als Kleinbuchstaben angegeben.
„Konservative Aminosäuresubstitutionen" sind durch die BLOSUM62-Scoring-Matrix von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915–10919, 1992 definiert, einer Aminosäuresubstitutionsmatrix, die aus etwa 2.000 lokalen Mehrfachalignments von Proteinsequenzsegmenten, die hochkonservierte Regionen aus mehr als 500 Gruppen verwandter Proteine darstellen, abgeleitet ist. Der Begriff „konservative Aminosäuresubstitution", wie der hier verwendet wird, bezeichnet eine Substitution, die durch einen BLOSUM62-Wert von größer –1 dargestellt wird. Beispielsweise ist eine Aminosäuresubstitution konservativ, wenn die Substitution durch einen BLOSUM62-Wert von 0, 1, 2 oder 3 gekennzeichnet ist. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionen sind durch einen BLOSUM62-Wert von wenigstens 1 (z.B. 1, 2 oder 3) gekennzeichnet, während besonders bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionen durch einen BLOSUM62-Wert von wenigstens 2 (z.B. 2 oder 3) gekennzeichnet sind.
Ein „Polypeptid" ist ein entweder natürlich oder synthetisch gebildetes Polymer aus Aminosäureresten, die durch Peptidbrücken verbunden sind. Polypeptide aus weniger als etwa 10 Aminosäureresten werden üblicherweise als „Peptide" bezeichnet.
Ein „Protein" ist ein eine oder mehrere Polypeptidketten umfassendes Makromolekül. Ein Protein kann auch nichtpeptidische Komponenten, wie beispielsweise Kohlenhydratgruppen, umfassen. Kohlenhydrate und andere nichtpeptidische Substituenten können von der Zelle, in der das Protein hergestellt wird, an ein Protein angehängt werden und variieren je nach Zelltyp. Proteine werden hier durch die Struktur ihres Aminosäuregerüsts definiert; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen sind in der Regel nicht näher spezifiziert, können aber nichtsdestotrotz vorhanden sein. Ein Protein, das aus beispielsweise 15 bis 1500 Aminosäureresten „besteht", kann also zusätzlich ein oder mehrere Kohlenhydratketten enthalten.
Die Ausdrücke „behandeln" und „Behandlung" werden im weitesten Sinn dazu verwendet, um therapeutische und prophylaktische Eingriffe zu bezeichnen, welche einen pathologischen Zustand günstig verändern, einschließlich der Linderung von dessen Symptomen. Behandlungen umfassen Vorgehensweisen, die das Fortschreiten einer Krankheit verlangsamen oder umkehren, die Schwere einer Krankheit verringern, der Krankheit vorbeugen oder die Krankheit heilen.
Der Begriff „zvegf4-Protein" wird hier zur Bezeichnung eines Proteins verwendet, das die Wachstumsfaktordomäne eines zvegf4-Polypeptids (z.B. die Reste 258-370 von humanem zvegf4 (SEQ ID NO:2) oder murinem zvegf4 (SEQ ID NO:4)) umfasst, wobei das Protein oder eine proteolytisch aktivierte Form davon für Zellen mitogen ist, die an ihrer Zelloberfläche die PDGF α- und/oder β-Rezeptoruntereinheiten exprimieren. Man fand, dass zvegf4 die αα-, αβ- und ββ-Isoformen des PDGF-Rezeptors aktiviert. Zvegf4-Proteine umfassen, wie nachfolgend offenbart, Homodimere und Heterodimere. Mit dem Fachmann bekannten Verfahren können zvegf4-Proteine in verschiedenen Formen, einschließlich glykosylierter oder nicht-glykosylierter, pegylierter oder nicht-pegylierter Form, mit oder ohne einen Methioninrest am Anfang, und als Fusionsproteine hergestellt werden, wie nachfolgend ausführlicher offenbart ist:
Ein „für zvegf4-Protein codierendes Polynukleotid" ist ein Polynukleotid, das bei Expression durch eine Wirtszelle für ein zvegf4-Polypeptid codiert, welches posttranslational zu einem wie oben definierten dimeren zvegf4-Protein prozessiert wird. Posttranslationale Prozessierung umfasst, ohne darauf beschränkt zu sein, Disulfidbrückenbildung, Proteolyse (einschließlich Abspaltung von Sekretionspeptiden) und Anhängen von Kohlenhydraten. Ein Fachmann erkennt, dass das primäre Translationsprodukt eines für zvegf4-Protein codierenden Polynukleotids in seiner Struktur gewöhnlich vom Endprotein abweicht. Für zvegf4-Protein codierende Polynukleotide können ferner funktionsfähig verknüpfte Transkriptionspromotoren, -terminatoren und andere genetische Elemente umfassen, die für die Expression und/oder den Erhalt des Polynukleotids in der Wirtszelle oder für den Transport in die Wirtszelle sorgen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung der Nierenfunktion bei einem Patienten unter Verwendung von zvegf4 bereit. Zvegf4 ist ein Protein, dass mit dem Blutplättchen-Wachstumsfaktor (platelet-derived growth factor, PDGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) strukturell verwandt ist. Dieses Protein wird auch als „PDGF-D" bezeichnet (WO 00/27879). Zvegf4 ist ein Multidomänenprotein mit signifikanter Homologie zur Familie der PDGF/VEGF-Wachstumsfaktoren.
Vorhersagen über die Struktur, die auf der zvegf4-Sequenz und deren Homologie zu anderen Wachstumsfaktoren basieren, lassen vermuten, dass das Polypeptid Homomultimere oder Heteromultimere bilden kann, die, auf Gewebe wirken, indem sie Zellproliferation, -migration, -differenzierung oder -stoffwechsel modulieren. Experimentelle Beweise belegen diese Vorhersagen. Zvegf4-Heteromultimere können ein Polypeptid eines anderen Mitglieds der Familie der PDGF/VEGF-Proteine umfassen, einschließlich VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, zvegf3/PDGF-C (WO 00/34474), PIGF (Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9267–9271, 1991), PDGF-A (Murray et al., U.S. Patent 4,899,919; Heldin et al., U.S. Patent 5,219,759) oder PDGF-B (Chiu et al, Cell, 37:123–129, 1984; Johnsson et al., EMBO J., 3:921–928, 1984).
Die zvegf4-Polypeptidkette umfasst eine Wachstumsfaktordomäne und eine CUB-Domäne. Die Wachstumsfaktordomäne ist durch eine Anordnung von Cysteinresten und beta-Strängen gekennzeichnet, die für die „Cystinknoten"-Struktur der PDGF-Familie charakteristisch ist. Die CUB-Domäne zeigt Sequenzhomologie zu CUB-Domänen der Neuropiline (Takagi et al., Neuron, 7:295–307, 1991; Soker et al., Cell, 92:735–745, 1998), dem humanen morphogenetischen Knochenprotein-1 (Wozney et al., Science, 242:1528–1534, 1988), dem porcinen Samenplasmaprotein und dem bovinen sauren Samenflüssigkeitsprotein (Romero et al., Nat. Struct. Biol., 4:783–788, 1997), und dem Tolloid-ähnlichen Protein von X. laevis (Lin et al., Dev. Growth Der., 39:43–51, 1997).
Eine repräsentative Sequenz für humanes zvegf4-Polypeptid ist in SEQ ID NO:2 gezeigt und eine repräsentative Sequenz für murines zvegf4-Polypeptid ist in SEQ ID NO:4 gezeigt. DNA, die für diese Polypeptide codieren, sind in der SEQ ID NO:1 bzw. der SEQ ID NO:3 gezeigt. Eine Analyse der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz zeigt, dass die Reste 1 bis 18 ein sekretorisches Peptid bilden. Die CUB-Domäne erstreckt sich von Rest 52 bis Rest 179. Eine Propeptid-ähnliche Sequenz erstreckt sich von Rest 180 bis entweder Rest 245, Rest 249 oder Rest 257 und umfasst vier mögliche Spaltstellen an deren Carboxyterminus, monobasische Stellen bei an Rest 245 und Rest 249, eine dibasische Stelle an den Resten 254-255 und eine Targetstelle für Furin oder eine Furin-ähnliche Protease an den Resten 254-257. Protein, das in einem Baculovirus-Expressionssystem gebildet wurde, zeigte Spaltung zwischen den Resten 249 und 250, sowie längere Spezies mit Aminotermini an den Resten 19 und 35. Die Wachstumsfaktordomäne erstreckt sich von Rest 258 bis Rest 370 und kann weitere Reste am N-Terminus umfassen (z.B. die Reste 250 bis 257 oder die Reste 246 bis 257). Ein Fachmann weiß, dass die Domänengrenzen etwas ungenau sind und dass zu erwarten ist, dass sie um bis zu ± 5 Reste von den angegebenen Positionen abweichen. Entsprechende Domänen bei murinen und anderen nicht-humanen zvegf4s können vom Fachmann durch Sequenzalignments bestimmt werden. Spaltung des vollständigen humanen zvegf4 mit Plasmin führte zur Aktivierung des zvegf4-Polypeptids. Bei einer Western-Analyse wurde eine Bande beobachtet, die bei etwa der gleichen Größe wie die Wachstumsfaktordomäne migrierte.
Die Abspaltung des Signalpeptids bei humanem zvegf4 erfolgt vorhersagegemäß nach Rest 18 (± 3 Reste). Bei einem Vergleich humaner und muriner zvegf4-Sequenzen werden alternative Spaltstellen für das Signalpeptid nach Rest 23 und/oder Rest 24 vorhergesagt. Diese Analyse lässt vermuten, dass die zvegf4-Polypeptidkette so gespalten werden kann, dass mehrerer monomerer Spezies gebildet werden, von denen einige in Tabelle 1 gezeigt sind. Bei bestimmten Wirtszellen ist zu erwarten, dass eine Spaltung nach Lys-255 zur anschließenden Abspaltung der Reste 254-255 führt, obwohl auch Polypeptide mit einem Carboxyterminus an Rest 255 hergestellt werden können. Es ist zu erwarten, dass eine Spaltung nach Lys-257 zur anschließenden Abspaltung von Rest 257 führt. Die tatsächlichen Spaltmuster sollten erwartungsgemäß von Wirtszelle zu Wirtszelle variieren.
Tabelle 1
Wie oben offenbart, kann zvegf4 also in einer Vielzahl multimerer, ein zvegf4-Polypeptid umfassender Formen hergestellt werden. Diese zvegf4-Polypeptide umfassen zvegf4_19-370, zvegf4_52-370, zvegf4_246-370, zvegf4_250-370 und zvegf4_258-370. Auch Varianten und Derivate dieser Polypeptide können, wie hier offenbart, hergestellt werden.
Die Expression eines zvegf4-Polynukleotids in kultivierten Säugerzellen führt zur Produktion eines disulfidverbrückten, dimeren Proteins, das proteolytisch prozessiert werden kann. Das mitogen aktive Protein wird bei der proteolytischen Prozessierung zur Entfernung der CUB-Domäne und der Interdomänenregionen erzeugt. Ein Dimer der aktiven Wachstumsfaktordomäne kann direkt durch Expression eines trunkierten Polynukleotids erzeugt werden.
Zvegf4-Proteine können als Fusionsproteine hergestellt werden, die amino- oder cyrboxyterminale Extensionen, beispielsweise einen aminoterminalen Methioninrest, ein Affinitäts-Tag oder ein Targetting-Polypeptid umfassen. Ein zvegf4-Protein kann beispielsweise als Fusionsprotein mit einem Affinitäts-Tag hergestellt werden, um die Reinigung zu erleichtern. Im Grunde kann jedes Peptid oder Protein als Affinitäts-Tag verwendet werden, für das ein Antikörper oder ein anderes spezifisches bindendes Mittel verfügbar ist. Affinitäts-Tags umfassen beispielsweise einen Polyhistidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J., 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3, 1991), Glutathion S-Transferase (Smith und Johnson, Gene, 67:31, 1988), ein Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952–4, 1985), Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology, 6:1204–1210, 1988), Streptavidin-bindendes Peptid, Maltose-bindendes Protein (Guan et al., Gene, 67:21–30, 1987), Cellulose-bindendes Protein, Thioredoxin, Ubiquitin, T7-Polymerase oder andere antigene Epitope oder Bindungsdomänen. Die Fusion von zvegf4 mit beispielsweise Maltose-bindendem Protein oder Glutathion S-Transferase kann zur Verbesserung der Ausbeute in bakteriellen Expressionssystemen verwendet werden. In diesen Fällen wird der Nicht-zvegf4-Teil des Fusionsproteins gewöhnlich vor Verwendung entfernt. Die Trennung von zvegf4- und Nicht-zvegf4-Teil des Fusionsproteins wird durch eine spezifische Spaltstelle zwischen den beiden Teilen erleichtert. Solche Verfahren sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Zvegf4 kann auch mit einem Targetting-Peptid, beispielsweise einem Antikörper (einschließlich polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper, antigen-bindender Fragmente davon wie F(ab')₂- und Fab-Fragmenten, Einzelketten-Antikörpern und dergleichen) oder einer anderen Peptidfunktion, die an ein Zielgewebe bindet, fusioniert werden.
In den in SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:4 gezeigten zvegf4-Aminosäuresequenzen können Variationen erzeugt werden, um biologisch aktive Varianten von zvegf4-Proteinen bereitzustellen. Solche Variationen umfassen Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und -insertionen. In der Regel werden konservative Aminosäuresubstitutionen bevorzugt. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, dass Reste innerhalb der Regionen 273-295 und 307-317 von humanem zvegf4 (SEQ ID NO:2) an Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen beteiligt sein könnten. Die Effekte von Aminosäureänderungen an bestimmten Positionen in zvegf4-Proteinen können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren wie sequenzspezifischer Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese festgestellt werden (Cunningham und Wells, Science, 244:1081–1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4498–4502, 1991). Es können verschiedene Aminiosäuresubstitutionen erzeugt und mit bekannten Mutagenese- und Screeningverfahren gestestet werden, wie beispielsweise denen, die bei Reidhaar-Olson und Sauer offenbart sind (Science, 241:53–57, 1988) oder Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2152–2156, 1989). Andere Verfahren, die verwendet werden können, umfassen Phagendisplay (z.B. Lowman et al., Biochem., 30:10832–10837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent 5,223,409; Huse, WIPO-Offenlegungsschrift WO 92/06204), regionsspezifische Mutagenese (Derbyshire et al., Gene, 46:145, 1986; Ner et al., DNA, 7:127, 1988) und DNA-Shuffling, wie bei Stemmer (Nature, 370:389–391, 1994) und Stemmer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10747–10751, 1994) offenbart. Die resultierenden mutierten Moleküle werden auf Rezeptorbindung, mitogene Aktivität oder andere Eigenschaften (z.B. Stimulation von Wachstumsfaktorproduktion) getestet, um die für diese Funktionen entscheidenden Aminosäurereste zu identifizieren. Um die biologische Aktivität von varianten zvegf4-Polypeptiden nachzuweisen, kann man Mutageneseverfahren mit Screeningverfahren mit hohen Volumina und hohem Durchsatz kombinieren.
Zvegf4-Varianten können mit verschiedenen im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren, einschließlich Rezeptorkompetitionstests (Bowen-Pope und Ross, Methods Enzymol., 109:69–100, 1985), und durch die Verwendung löslicher Rezeptoren, einschließlich Rezeptoren, die als IgG-Fusionsproteine erzeugt wurden (U.S. Patent 5,750,375), auf Rezeptorbindungsaktivität getestet werden. Rezeptorbindungstests können an Zelllinien durchgeführt werden, die bekannte Zelloberflächenrezeptoren zur Auswertung enthalten. Die Rezeptoren können natürlich in der Zelle vorhanden sein, oder es können rekombinante Rezeptoren sein, die von gentechnisch veränderten Zellen exprimiert werden.
Die Aktivität von zvegf4-Varianten kann mit kultivierten Zellen in vitro gemessen werden. Beispielsweise kann die mitogene Aktivität mit bekannten Tests, einschließlich Tests zum Einbau von ³H-Thymidin (wie bei z.B. Raines und Ross, Methods Enzymol., 109:749–773, 1985 und Wahl et al., Mol. Cell Biol., 8:5016–5025, 1988 offenbart), Tests zum Einschluss von Farbstoffen (wie bei z.B. Mosman, J. Immunol. Meth., 65:55–63, 1983 und Raz et al., Acta Trop., 68:139–147, 1997 offenbart) oder Zellzählungen, gemessen werden. Geeignete Mitogenesetests messen den Einbau von ³H-Thymidin in (1) Kulturen mit 20 % Konfluenz, um die Fähigkeit von zvegf4-Proteinen zu untersuchen, proliferierende Zellen weiter zu stimulieren, und in (2) ruhende Zellen, die 48 Stunden bei Konfluenz gehalten werden, um die Fähigkeit von zvegf4-Proteinen zu untersuchen, eine kontaktinduzierte Wachstumshemmung zu überwinden. Geeignete Tests zum Einbau von Farbstoffen umfassen die Messung des Einbaus des Farbstoffs AlamarBlue (Raz et al., ibid.) in Zielzellen. Siehe auch Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol., 70:395–405, 1976; Ewton und Florini, Endocrinol., 106:577–583, 1980; und Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. LISA, 86:7311–7315, 1989. Die Aktivität kann auch durch Messung von Stoffwechselveränderungen in Zielzellen getestet werden, wie beispielsweise Veränderungen bei der Produktion anderer Proteine (einschließlich anderer Wachstumsfaktoren) durch immunologische Tests.
Die biologischen Aktivitäten von zvegf4-Varianten können in nicht-humanen Lebewesen durch Verabreichung exogener Proteine oder durch Expression varianter zvegf4-Polynukleotide getestet werden. Es können virale Transportsysteme (nachfolgend offenbart) verwendet werden. Zvegf4-Varianten können einzeln, zusammen mit anderen zvegf4-Proteinen oder zusammen mit anderen Verbindungen, einschließlich anderer Wachstumsfaktoren, verabreicht oder exprimiert werden. Bei den Versuchstieren erfolgt ein Monitoring der Veränderungen solcher Parameter wie klinischen Anzeichen, Körpergewicht, Differentialblutbild, klinischer Chemie, Histopathologie und dergleichen.
Zvegf4-Proteine, einschließlich vollständiger Polypeptide, varianter Polypeptide, biologisch aktiver Fragmente und Fusionsproteine, können mit herkömmlichen Methoden in gentechnisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden. Geeignete Wirtszellen sind jene Zelltypen, die mit exogener DNA transformiert oder transfiziert und in Kultur gezüchtet werden können, und umfassen Bakterien, Pilzzellen und kultivierte Zellen höherer Eukaryonten (einschließlich kultivierter Zellen multizellulärer Organismen). Methoden zur Manipulation klonierter DNA-Moleküle und zur Einschleusung von exogener DNA in eine Vielzahl von Wirtszellen sind bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989 und Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Green und Wiley and Sons, NY, 1983 offenbart. Allgemein wird eine DNA-Sequenz, die für ein zvegf4-Polypeptid codiert, funktionsfähig mit anderen genetischen Elementen verknüpft, die für deren Expression in einem Expressionsvektor erforderlich sind, in der Regel einschließlich eines Transkriptionspromotors und -terminators. Der Vektor enthält üblicherweise auch ein oder mehrere selektierbare Marker und ein oder mehrere Replikationsursprünge obwohl ein Fachmann weiß, dass in bestimmten Systemen selektierbare Marker auf separaten Vektoren bereitgestellt werden können und die Replikation der exogenen DNA durch deren Einbau in das Wirtszellgenom erfolgen kann. Die Auswahl von Promotoren, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist für einen Fachmann auf diesem Gebiet Routine. Viele dieser Elemente sind in der Literatur beschrieben und von kommerziellen Anbietern erhältlich. Siehe, z.B. WO 00/34474. Beispielhafte Expressionssysteme umfassen Hefen wie Saccharomyces cerevisiae (siehe z.B. U.S. Patent 5,527,668) oder Pichia methanolica (U.S. Patente 5,716,808, 5,736,383, 5,854,039 und 5,955,349); Säugerzellen, wie Babyhamsternierenzellen (BHK-Zellen) (ATCC-Nr. CRL 1632 oder CRL 10314), COS-1-Zellen (ATCC-Nr. CRL 1650), COS-7-Zellen (ATCC-Nr. CRL 1651), 293-Zellen (ATCC-Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59–72, 1977) oder Ovarienzellen von Chinesischem Hamster (z.B. CHO-K1, ATCC-Nr. CCL 61; oder CHO DG44, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet., 12:555,1986); Baculovirus (Luckow et al.., J. Virol., 67:4566–4579, 1993; erhältlich in Form eines Kits (Bac-to-Bac^TM-Kit; Life Technologies, Rockville, MD)); und Bakterienzellen (z.B. E. coli). Geeignete Zelllinien sind im Stand der Technik bekannt und bei öffentlichen Hinterlegungsstellen wie beispielsweise der American Type Culture Collection, Manassas, VA, erhältlich.
Zvegf4-Proteine können nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste umfassen. Nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren umfassen, ohne Einschränkung, trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanprolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, N-Methylglycin, allo-Threonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolsäure, tert-Leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin und 4-Fluorphenylalanin. Für den Einbau nicht-natürlich vorkommender Aminosäurereste in Proteine sind im Stand der Technik verschiedene Verfahren bekannt. Beispielsweise kann ein in vitro-System verwendet werden, bei dem nonsense-Mutationen mit chemisch aminoacylierter Suppressor-tRNA supprimiert werden. Verfahren zur Synthese von Aminosäuren und zur Aminoacylierung von tRNA sind im Stand der Technik bekannt. Transkription und Translation von Plasmiden, die nonsense-Mutationen enthalten, erfolgen in einem zellfreien System, welches einen E. coli-S30-Extrakt und kommerziell erhältliche Enzyme und andere Reagenzien umfasst. Die Proteine werden mittels Chromatographie gereinigt. Siehe, beispielsweise, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc., 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol., 202:301, 1991; Chung et al, Science, 259:806–809, 1993; und Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10145–10149, 1993). In einem zweiten Verfahren wird die Translation durch Mikroinjektion mutierter mRNA und chemisch aminoacylierter tRNAs in Xenopus-Oozyten durchgeführt (Turcatti et al., J. Biol. Chem, 271:19991–19998, 1996). In einem dritten Verfahren werden E. coli-Zellen in Abwesenheit einer natürlichen Aminosäure, die ersetzt werden soll (z.B. Phenylalanin) und in Anwesenheit der gewünschten nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure(n) (z.B. 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin oder 4-Fluorphenylalanin) kultiviert. Die nicht-natürlich vorkommende Aminosäure wird anstelle ihres natürlichen Gegenstücks in das Protein eingebaut. Siehe Koide et al., Biochem., 33:7470–7476, 1994. Natürlich vorkommende Aminosäurereste können durch chemische Modifikation in vitro in nicht-natürlich vorkommende Spezies umgewandelt werden. Um die Substitutionsmöglichkeiten zu erweitern, können chemische Modifikationen mit sequenzspezifischer Mutagenese kombiniert werden (Wynn und Richards, Protein Sci., 2:395–403, 1993).
Zvegf4-Polypeptide oder Fragmente davon können auch durch chemische Synthese nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, einschließlich ausschließlicher Festphasensynthese, partieller Festphasenverfahren, Fragmentkondensation oder klassischer Synthese in Lösung hergestellt werden. Siehe, beispielsweise, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, (2. Ausgabe), Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1984; Bayer und Rapp, Chem. Pept. Prot., 3:3, 1986; und Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A practical Approach, IRL Press, Oxford 1989.
Zvegf4-Proteine werden durch herkömmliche Proteinreinigungsverfahren, üblicherweise mit einer Kombination aus chromatographischen Verfahren, gereinigt. Siehe allgemein: Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Proteine, die ein Polyhistidin- Affinitäts-Tag (üblicherweise etwa 6 Histidinreste) umfassen, werden mittels Affinitätschromatographie an einem Nickelchelatharz gereinigt. Siehe beispielsweise Houchuli et al., Bio/Technol., 6:1321–1325, 1988. Proteine, die ein Glu-Glu-Tag umfassen, können durch Immunaffinitätschromatographie entsprechend üblichen Verfahren gereinigt werden. Siehe, beispielsweise, Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7952–4, 1985. Maltose-bindende Fusionsproteine werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren auf einer Amylosesäule gereinigt.
Wie mit Northern Blot- und PCR-Analyse gezeigt wird, wird zvegf4 in der Niere stark exprimiert. Wie in den nachfolgenden Beispielen im Einzelnen dargelegt ist, löst die Überexpression von zvegf4 in Mäusen bei Injektion eines für zvegf4 codierenden Adenovirusvektors die Proliferation von Tubulusepithelzellen in der Niere aus. Die Tubulusgeneration bei den behandelten Tieren war durch die Anwesenheit von Tubulusepithelzellen mit erhöhter Basophilie gekennzeichnet. Diese Änderungen ließen sich nicht bei Tieren beobachten, die einem Kontrolladenovirus, der ein nicht verwandtes Protein exprimierte, ausgesetzt waren. Diese Erkenntnisse zeigen, dass eine Zunahme an zvegf4-Protein die Funktion von und die Wechselwirkung zwischen Mesangialzellen (einem Fibroblastentyp; siehe Powell et al., Am. J. Physiol., 277 (Cell Physiol. 46:C1-C19, 1999), Epithelzellen, Endothelzellen, glatten Muskelzellen und Interstitialzellen, welche alle Schlüsselrollen bei glomerulären und vaskulären Nierenerkrankungen spielen modifizieren kann. Ferner wurde gefunden, dass zvegf4 die Zellproliferation wenigstens mancher dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Versuche zeigten auch, dass die Aktivität von zvegf4 durch zwei PDGF-Rezeptoruntereinheiten, alpha und Beta (PDGF-aR und PDGF-βR) vermittelt wird. Diese Rezeptoruntereinheiten werden weithin in den meisten Nierenzelltypen exprimiert und bei einigen Nierenpathologien ist ihre Expression hochreguliert (z.B. Iida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:6560–6564, 1991). Die oben zusammengefassten und hier im Einzelnen offenbarten Versuche lassen vermuten, dass zvegf4-Proteine einen positiven Effekt auf die Lebensfähigkeit, die Regeneration und/oder die Funktion von Nierentubuli haben. Diese Ergebnisse zeigen an, dass sich zvegf4 eignen könnte, um bestimmter Formen von Niereninsuffizienz, wie beispielsweise akute tubuläre Nekrose oder chronische Analgetikanephritis, umzukehren. In diesem Zusammenhang kann zvegf4-Protein einem Säuger direkt verabreicht werden oder in situ produziert werden, wenn man einem Säuger ein für zvegf4 codierendes Polypeptid verabreicht.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, können die generativen Effekte von zvegf4 auf Nierentubuli auf direkte oder indirekte Effekte auf Epithelzellen und/oder Epithelzellvorläufer zurückzuführen sein. „Indirekte Effekte" umfassen die Stimulation der Produktion anderer Faktoren, die direkt auf die betroffenen Zellen wirken. Zvegf4 kann die Zellproliferation stimulieren, das Überleben der Zellen fördern oder die Produktion anderer Faktoren stimulieren, die diese Effekte auf Epithelzellen oder Epithelzellvorläufer ausüben. Myofibroblasten sekretieren beispielsweise bekanntermaßen Cytokine und Wachstumsfaktoren, die Epithelzellproliferation, -differenzierung und -migration stimulieren und Schlüsselrollen bei Organogenese und Wundheilung spielen. Siehe z.B. Powell et al., ibid.; Nakagawa et al., Am. J. Pathol., 155:1689–1699, 1999; und Matsumoto und Nakamura, Kidney Int., 59:2023–2038, 2001.
Es wurde gefunden, dass die Wachstumsfaktordomäne von zvegf4 die aktive Spezies des Moleküls ist. Zur Aktivierung ist eine proteolytische Prozessierung zur Entfernung des N-terminalen Teils des Moleküls erforderlich. In der vorliegenden Erfindung kann zvegf4-Protein als die aktive Wachstumsfaktordomäne alleine oder als ein Vorläufer, der in vivo aktiviert werden muss, bereitgestellt werden. Beispielhafte Vorläufer umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, zvegf4_19-370 und zvegf4_52-370 Auch Fusionsproteine und andere biologisch aktive zvegf4-Varianten können verwendet werden. Dokument WO 01/25437 offenbart medizinische Verwendungen von Zvegf4-Polypeptiden (FCTR3, FCTR4, FCTR6).
Zur pharmazeutischen Verwendung werden zvegf4-Proteine nach herkömmlichen Verfahren formuliert. Es kommen übliche Verabreichungswege für pharmazeutische Proteine zur Anwendung. Da Patienten, die an akuter Niereninsuffizienz leiden, gewöhnlich eine Behandlung erfahren, die intravenöse Infusion, Katheterisierung oder Dialyse einschließt, kann das Protein durch bereits bestehende intravenöse Kanäle, Katheter oder Shunts verabreicht werden. Andere Verabreichungswege umfassen intravenöse, intramuskuläre und subcutane Injektion. Pharmazeutische Formulierungen werden in der Regel ein zvegf4-Protein zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie beispielsweise Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, 5 % Dextrose in Wasser oder dergleichen, umfassen. Formulierungen können ferner ein oder mehrere Hilfsstoffe, Konservierungsstoffe, Lösungsvermittler, Puffersubstanzen, Albumin zur Vorbeugung von Proteinverlust an Ampullenoberflächen usw. umfassen. Formulierungsverfahren sind im Stand der Technik allgemein bekannt und beispielsweise bei Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19. Ausgabe, 1995 offenbart. Eine „therapeutisch wirksame Menge" einer Zusammensetzung ist eine Menge, die einen statistisch signifikanten Effekt, beispielsweise ein statistisch signifikant vermindertes Fortschreiten der Krankheit oder eine statistisch signifikante Verbesserung der Organfunktion bewirkt. Im Zusammenhang mit akuter Niereninsuffizienz zeigt sich eine Verbesserung bei der Organfunktion durch verminderte Urämie, erhöhte Kreatinin- oder Insulin-Clearance, Wiederherstellung des Elektrolytgleichgewichts und/oder erhöhte Urinproduktion. Zvegf4 wird üblicherweise in einer Konzentration von etwa 10 bis 100 μg/ml Gesamtvolumen verwendet, obwohl auch Konzentrationen im Bereich von 1 ng/ml bis 1000 μg/ml verwendet werden können. Die exakte Dosis wird vom Arzt nach allgemein anerkannten Standards bestimmt, wobei die Natur und Schwere des zu behandelnden Zustands, die charakteristischen Merkmale des Patienten usw. zu berücksichtigen sind; die Bestimmung der Dosis ist für einen Fachmann Routine. Da akute Niereninsuffizienz ein lebensbedrohlicher Zustand ist, können hohe Dosen verabreicht werden. Die therapeutischen Formulierungen werden in der Regel über eine Dauer verabreicht, die zur Erlangung einer positiven Wirkung erforderlich ist, in der Regel mehrere Stunden bis mehrere Wochen. Die Dosisgabe kann während der Behandlungsdauer kontinuierlich oder mit Unterbrechungen erfolgen. Intravenöse Verabreichung erfolgt über Bolusinjektion oder Infusion über einen üblichen Zeitraum von einer bis mehreren Stunden. Formulierungen mit retardierter Freisetzung können ebenso verwendet werden.
Eine zvegf4-Therapie kann mit anderen Mitteln oder klinischen Methoden, die zur Wiederherstellung der Nierenfunktion geeignet sind, kombiniert werden. Zvegf4 kann beispielsweise in Kombination mit einem Vasodilatator oder in Kombination mit Angioplastie zur Wiederherstellung der Durchblutung von Nierenarterien verabreicht werden.
Gentherapie kann dazu verwendet werden, um einen Patienten mit zvegf4 zu versorgen. Um die Expression von zvegf4 in der Niere zu erleichtern, kann ein Transkriptionspromotor von einem Gen, das in der Niere stark exprimiert wird (z.B. dem Erythropoietingen), verwendet werden. Therapeutische Polynukleotide können Patienten oder Versuchstieren mittels viraler Transportsysteme zugeführt werden. Beispielhafte Viren für diese Zwecke umfassen Adenovirus, Herpesvirus, Retroviren, Vaccinia-Virus und adeno-assoziierte Viren (AAV). Adenovirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus, ist der zurzeit bestuntersuchte Gentransfervektor zum Transport heterologer Nukleinsäuren. Zur Übersicht siehe Becker et al., Meth. Cell Biol., 43:161–89, 1994 und Douglas und Curiel, Science & Medicine, 4:44–53, 1997. Das Adenovirussystem bietet verschiedene Vorteile. Adenovirus kann (i) relativ große DNA-Inserts aufnehmen; (ii) hochtitrig gezüchtet werden; (iii) ein breites Spektrum von Säugerzelltypen infizieren; und (iv) mit vielen verschiedenen Promotoren, einschließlich ubiquitären, gewebespezifischen und regulierbaren Promotoren, verwendet werden. Da Adenoviren im Blutkreislauf stabil sind, können sie intravenös injiziert werden.
Durch Deletion von Teilen des Adenovirusgenoms können größere heterologe DNA-Inserts (bis zu 7 kb) aufgenommen werden. Diese Inserts können durch direkte Ligation oder durch homologe Rekombination mit einem co-transfizierten Plasmid in die Virus-DNA eingebaut werden. Wenn der Adenovirus unversehrten Tieren intravenös verabreicht wird, greift er in erster Linie die Leber an. Wenn das adenovirale Transportsystem eine E1-Gendeletion hat, kann das Virus in den Wirtszellen nicht replizieren. Das Wirtsgewebe (z.B. die Leber) wird das heterologe Protein jedoch exprimieren und prozessieren (und es sekretieren, wenn eine Signalsequenz vorhanden ist).
Ein alternatives Verfahren zum Gentransport umfasst die Entnahme von Zellen aus dem Körper und das Einschleusen eines Vektors in die Zellen als nacktes DNA-Plasmid. Die transformierten Zellen werden anschließend in den Körper reimplantiert. Nackte DNA-Vektoren werden mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatpräzipitation, Verwendung einer Genkanone oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters, in die Wirtszellen eingeschleust. Siehe Wu et al., J. Biol. Chem., 263:14621–14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963–967, 1992; und Johnston und Tang, Meth. Cell Biol., 43:353–365, 1994.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
Zvegf4 wurde aufgrund seiner Homologie zur VEGF-Familie aus der Sequenz eines Klons aus einer Genbank humaner chronisch myeloischer Leukämiezellen (K562) identifiziert. Eine weitere Sequenz wurde aus einem langen Sequenzrahmen eines Klons einer Hypophysen-Genbank ermittelt. Es wurde ein Antisense-Expressed Sequence Tag (EST) für zvegf4 gefunden, dessen 5'-Partner identifiziert wurde. Dieses 5'-EST (EST448186; GenBank) scheint die 5'-untranslatierte Sequenz für zvegf4 zu enthalten. Um die Lücke in der Sequenz zu schließen, wurde aus EST448186 ein Primer konstruiert. Je 20 pm der Oligonukleotide ZC21,987 (SEQ ID NO:5) und ZC21,120 (SEQ ID NO:6) und 1,93 μg einer Schilddrüsen-Genbank wurden bei einer PCR-Reaktion mit 5 % DMSO und 1/10 Volumen eines kommerziellen Reagenz (GC-Melt^TM; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) verwendet. Die Reaktion wurde eine Minute bei 94 °C gefahren; dann folgten 30 Zyklen bei 94 °C, 20 Sekunden; 67 °C, 1 Minute; und anschließend erfolgte eine abschließende 5-minütige Inkubation bei 72 °C. Ein resultierendes 833-bp-Produkt wurde sequenziert und man fand, dass es sich um ein zvegf4-Fragment handelte, das den Rest der codierenden Sequenz mit einem MET-Codon zu Beginn, einem stro maufwärts gelegenen Stopcodon und einer 5'-untranslatierte Sequenz enthielt. Die zusammengesetzte Sequenz umfasste einen offenen Leserahmen mit 1.110 bp (SEQ ID NO:1).
Beispiel 2
Durch Sondieren einer murinen Genbank (erhalten bei Clontech Laboratories, Inc.) mit einem 1.289 bp großen EeoRI-Restriktionsfragment von humanem zvegf4, das die gesamte codierende Sequenz enthielt, wurde eine partielle murine zvegf4-Sequenz erhalten. Die Sonde wurde mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits (Rediprime^TM II Random Prime-Markierungssystem; Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England) mit ³²P markiert. Nichteingebaute Radioaktivität wurde mit einer handelsüblichen Push-Säule (NucTrap^®-Säule; Stratagene, LaJolla, CA; siehe U.S. Patent 5,336,412) verwendet. Vierundzwanzig Filterlifts wurden über Nacht bei 50 °C in einer Hybridisierungslösung (ExpressHyb^TM Hybridization Solution; Clontech Laboratories, Inc.), die 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA enthielt, die 5 Minuten gekocht und anschließend auf Eis gelegt worden war, prähybridisiert. Die Filter wurden über Nacht bei 50 °C in Hybridisierungslösung (ExpressHyb^TM), die 1,0 × 10⁶ cpm/ml zvegf4-Sonde, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA und 0,5 μg/ml murine cot-1-DNA enthielt, die 5 Minuten gekocht und anschließend auf Eis gelegt worden war, hybridisiert. Die Filterlifts wurden 2 Stunden bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,1 % SDS gewaschen und anschließend wurde die Temperatur eine Stunde lang auf 60 °C erhöht. Exposition über Nacht bei –80 °C lieferte 7 putative direkte Treffer.
Vier der direkten Treffer wurden auf einem Rasen von E.coli-K802-Zellen (erhalten von Clontech Laboratories, Inc.) ausplattiert. Filterlifts wurden hergestellt und über Nacht mit der humanen zvegf4-Sonde hybridisiert. Zwei der 4 getesteten putativen direkten Treffer waren positiv.
Aus einem positiven Plaque wurde DNA präpariert und mit BamHI und PstI verdaut. Der Verdau wurde auf einem 1%-igen Tris-Borat-EDTA-Gel laufen gelassen und ein 2,0 kb-Duplett und 2,7 kb/2,9 kb-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels üblicher Verfahren aus der Agarose extrahiert. Man fand, dass beide 2,0 kb-Fragmente stark an die humane zvegf4-Sonde hybridisieren. Diese Fragmente wurden sequenziert und man fand, dass sie einen Teil der murinen zvegf4-CUB-Domäne enthielten. Aus der Sequenz wurden Primer zur Verwendung bei einem PCR-cDNA-Screening konstruiert.
Eine Gruppe muriner cDNAs wurde mittels PCR mit den Primern ZC26,317 (SEQ ID NO:7) und ZC26,318 (SEQ ID NO:8) gescreent. Embryo, Speicheldrüse, neonatale Haut und Hoden zeigten starke Produkte mit der vorhergesagten Größe von 200 bp.
Genbanken von Mäusehoden und -speicheldrüsen wurden mittels PCR mit den Primern ZC26,317 (SEQ ID NO:7) und ZC26,318 (SEQ ID NO:8) gescreent. Die Hoden-Genbank lieferte einen Klon, genannt „zvegf4mpzp7x-6", der an seinem 5'-Ende unvollständig war und anscheinend ein Intron am 5'-Ende enthielt. Die Speicheldrüsen-Genbank lieferte einen Klon, genannt „zvegf4mpzp7x-7", der im Vergleich zu Klon zvegf4mpzp7x-6 eine 225 bp große Deletion in der Codierung besaß. Die von mpzp7x-6 und zvegf4mpzp7x-7 abgeleiteten Sequenzen wurden kombiniert, was eine vollständige murine zvegf4-Polynukleotidsequenz (SEQ ID NO:3) und eine vollständige murine zvegf4-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO:4) lieferte.
Ein vollständiger cDNA-Klon wurde durch eine zweistufige Ligation von Fragmenten aus den beiden Klonen erzeugt. Ein 3'-EcoRI/HindIII-Fragment wurde aus Klon zvegf4mpzp7x-6 präpariert. Das 528 bp-Fragment wurde gelgereinigt und in einen Phagemid-Vektor (pBluescript^® II KS (+); Stratagene) ligiert, der mit EcoRI und HindIII verdaut worden war. 3 μg des resultierenden Konstrukts wurden mit 15 Einheiten EcoRI verdaut. Das linearisierte Plasmid wurde gereinigt und mit einem 754 bp großen 5'-EcoRI-Fragment aus Klon mpzp7x-7 ligiert.
Beispiel 3
Rekombinantes humanes zvegf4 mit einem carboxyterminalen Glu-Glu-Affinitätstag wurde nach üblichen Verfahren in einem Baculovirus-Expressionssystem produziert. Die Kultur wurde abgeerntet und die Zellen wurden mit einer Lösung von 0,02 M Tris-HCl, pH 8,3, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid (Pefabloc^® SC; Boehringer-Mannheim), 0,5 μM Aprotinin, 4 mM Leupeptin, 4 mM E-64, 1 % NP-40 15 Minuten bei 4 °C auf einem Rotator lysiert. Die Lösung wurde zentrifugiert und der Überstand gewonnen. 20 ml Extrakt wurden mit 50 μl an derivatisierte Agarosekügelchen konjugierten Anti-Glu-Glu-Antikörpern (Sepharose^®; Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) in 50 μl Puffer vereinigt. Die Mischung wurde bei 4 °C über Nacht auf einem Rotator inkubiert. Die Kügelchen wurden mittels Zentrifugation zurückgewonnen und 3 × 15 Minuten bei 4 °C gewaschen. Die Pellets wurden mit Reduktionsmittel enthaltendem Probenpuffer vereinigt und 5 Minuten lang bei 98 °C erhitzt. Das Protein wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen und anschließenden Western Blot auf einer PVDF-Membran mit einem Antikörper gegen das Affinitätstag analysiert. Es wurden zwei Banden nachgewiesen, eine bei M_r ≈ 49 kD und die andere bei M_r ≈ 21 kD. Eine Sequenzanalyse ergab, dass die größere Bande zwei Sequenzen umfasste, wobei eine bei Arg-19 der SEQ ID NO:2 und die andere bei Asn-35 der SEQ ID NO:2 begann. Der Asparaginrest schien zu einer Asparaginsäure deamidiert zu sein. Die kleinere Bande begann bei Ser-250 der SEQ ID NO:2.
Beispiel 4
Eine rekombinante, aminoterminal mit einem Glu-Glu-Tag versehene zvegf4-Wachstumsfaktordomäne mit einem aminoterminalen Glu-Glu (EYMPME; SEQ ID NO:9)-Tag (zvegf4-nee-GFD), die von rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Insektenzellen produziert war, wurde mit einer Kombination aus Kationenaustauschchromatographie, Antikörperaffinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie aus dem konditioniertem Medium gereinigt. Die 28 I-Kulturen wurden abgeerntet und das Medium mit Hilfe eines 0,45 μm-Filters filtriert. Das filtrierte Medium (pH 7,0, Leitfähigkeit 9 mS) wurde direkt auf eine 25 ml-Kationenaustauschersäule (Poros^® 50 HS; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) geladen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina (column volumes, cv) PBS gewaschen und das gebundene Protein wurde mit einem 20–100 %-Gradienten von 750 mM NaCl in PBS (Puffer B) in 15 cv und anschließend mit 5 cv 100 % Puffer B mit 5 ml/min eluiert. Es wurden 5 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Proben aus der Säule wurden mittels SDS-PAGE mit Silberfärbung und Western Blot auf Anwesenheit von zvegf4-nee-GFD analysiert. zvegf4-nee-GFD enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und auf eine 8 ml-Säule mit Anti-Glu-Glu-Antikörper geladen und mit 50 ml 0,5 mg/ml EYMPTD (SEQ ID NO:10)-Peptid (erhalten von Princeton Biomolecules Corporation, Langhorne, PA) in PBS eluiert. 1 ml-Fraktionen wurden gepoolt und mit einem Biomax^TM-5-Konzentrator (Millipore Corp., Bedford, MA) auf 4 ml eingeengt und mit 1,5 ml/min auf eine 16 × 1000 mm-Gelfiltrationssäule (Sephacryl^TM S-100 HR; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) geladen. 5 ml-Fraktionen, die gereinigtes zvegf4-nee-GFD enthielten, wurden gepoolt, durch einen 0,2 μm-Filter filtriert, in 100 μl-Aliquots aliquotiert und bei –80 °C eingefroren. Die Konzentration an gereinigtem Endprotein wurde mit einem BCA-Test (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) zu 0,4 mg/ml bestimmt und als Ausbeute wurden mit 8,4 mg berechnet.
Rekombinantes zvegf4-nee-GFD wurde über SDS-PAGE (Nupage^TM 4–12 % Gel; Novex, San Diego, CA) mit Silberfärbung (FASTsilver^TM, Geno Technology, Inc., Maplewood, MO) und Western Blot mit Antikörpern gegen das Peptid-Tag analysiert. Mit konditioniertem Medium oder gereinigtem Protein wurde mit einer Elektrophorese-Minizelle (XCell II^TM-Minizelle; Novex) eine Elektrophorese durchgeführt und bei Raumtemperatur mit einem Blot-Modul (XCell II^TM; Novex) unter Rühren nach den Anweisungen in der Bedienungsanleitung auf Nitrozellulose (0,2 μm; Novex) transferiert. Der Transfer erfolgte in einer Stunde bei 500 mA in einem Puffer, der 25 mM Tris-Base, 200 mM Glycin und 20 % Methanol enthielt. Die Filter wurden anschließend bei Raumtemperatur 10 Minuten mit 10%iger fettfreier Trockenmilch in PBS blockiert. Die Nitrozellulose wurde schnell gespült, anschließend wurde der primäre murine Anti-Peptid-Antikörper (1:1000 verdünnt in 2,5 % fettfreie Trockenmilch enthaltendem PBS) zugegeben. Die Blots wurden unter leichtem Schütteln zwei Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Blots dreimal je 10 Minuten in PBS gewaschen, anschließend mit einem sekundären Antikörper (mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziege-anti-Maus-IgG) markiert, der 1:1000 in 2,5 % fettfreie, trockene Milch enthaltendem PBS verdünnt worden war, und die Blots wurden unter leichtem Schütteln zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blots wurden anschließend dreimal jeweils 10 Minuten in PBS gewaschen und anschließend schnell mit H₂O gespült. Die Blots wurden mit kommerziell erhältlichen chemilumineszierenden Substratreagenzien (SuperSignal^® ULTRA Reagents 1 und 2, 1:1 gemischt; Reagenzien erhalten von Pierce Chemical Co.) entwickelt und das Signal wurde mit einer Bildanalysesoftware (LumiImager^TM Lumi Analyst 3.0; Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) über Zeiträume von 10 Sekunden bis 5 Minuten oder solange wie nötig erfasst.
Das gereinigte zvegf4-nee-GFD erschien unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf dem Silbergel als zwei Banden mit etwa 31 und 17 kDa und unter reduzierenden Bedingungen als eine einzige Bande von 17 kDa. Dies lässt die Existenz einer dimeren Form von zvegf4-nee-GFD unter nicht-reduzierenden Bedingungen vermuten. Das gereinigte Protein bestand aus zu etwa 90 % Dimer und 10 % Monomer.
Beispiel 5
Vollständiges, carboxyterminal mit einem Glu-Glu-Tag versehenes zvegf4 (zvegf4-cee) wurde von rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Insektenzellen produziert. 2 l-Kulturen wurden abgeerntet und das Medium wurde mit einem 0,2 μm-Filter sterilfiltriert.
Das Protein wurde durch eine Kombination aus Affinitätschromatographie mit Anti-Glu-Glu (Anti-EE)-Peptid-Antikörper und S-200-Gelausschlusschromatographie aus dem konditioniertem Medium gereinigt. Das Kulturmedium (pH 6,0, Leitfähigkeit 7 mS) wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/min direkt auf eine 20 × 80 mm-(25 ml Bettvolumen) Affinitätssäule mit Anti-EE-Antikörper geladen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina PBS gewaschen, anschließend wurde gebundenes Protein mit 2 Säulenvolumina 0,4 mg/ml EYMPTD-Peptid (SEQ ID NO:10) (Princeton Biomolecules Corp., Langhorne, PA) eluiert. Es wurden 5 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Proben von der Anti-EE-Antikörper-Affinitätssäule wurden über SDS-PAGE mit Silberfärbung und Western Blot (im Wesentlichen wie oben offenbart mit Anti-zvegf4-Peptid-Antikörpern und Anti-EE-Antikörpern und sekundärem HRP-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper) auf Anwesenheit von zvegf4-cee analysiert.
Zvegf4-cee enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und durch Filtration mit einem Biomax^TM-S-Konzentrator (Millipore Corp.) auf 3,8 ml eingeengt und auf eine 16 × 1000 mm-Gelfiltrationssäule (Sephacryl^TM S-200 HR; Amersham Pharmacia Biotech) geladen. Die gereinigten, zvegf4-cee enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt, durch ein 0,2 μm-Filter filtriert, zu je 100 μl aliquotiert und bei –80 °C eingefroren. Die Konzentration an gereinigtem Endprotein wurde mittels Farbtest (BCA Assay Reagents; Pierce Chemical Co.) und HPLC-Aminosäureanalyse bestimmt.
Bei Silberfärbung erschien das gereinigte zvegf4-cee unter nicht-reduzierenden Bedingungen als eine einzige Bande bei etwa 85 kDa, unter reduzierenden Bedingungen jedoch bei etwa 50 kDa, was eine diniere Form von zvegf4-cee unter nicht-reduzierenden Bedingungen vermuten ließ.
Beispiel 6
Zur Herstellung von Adenovirusvektoren wird die für das Protein codierende Region von zvegf4 in einer PCR mit Primern, die am 5'- bzw. 3'-Terminus FseI- und AscI-Restriktionsschnittstellen anfügen, amplifiziert. Die PCR-Primer werden mit einer Matrize, die die vollständige zvegf4-cDNA enthält, wie folgt PCR-Reaktion verwendet: 5 Minuten Inkubation bei 95 °C; gefolgt von 15 Zyklen bei 95 °C für 1 Minute, 58 °C für 1 Minute und 72 °C für 1,5 Minuten; gefolgt von 7 Minuten bei 72 °C; gefolgt von einer Haltezeit bei 4 °C. Die Reaktionsprodukte werden auf ein 1,2%-iges Gel (low melt) (SeaPlaque GTG^TM; FMC, Rockland, ME) in TAE-Puffer aufgetragen. Das zvegf4-Produkt wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit einer eine Silicagelmembran (QIAquick^TMGel Extraction Kit; Quiagen, Inc., Valencia, CA) enthaltenden Spinsäule laut den Anweisungen des Kits gereinigt. Das zvegf4-Produkt wird anschließend verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit EtOH präzipitiert und in 20 ml TE (Tris/EDTA pH 8) rehydratisiert. Das zvegf4-Fragment wird anschließend in die Klonierungsstellen des transgenen Vektors pTG12-8 ligiert. Der Vektor pTG12-8 leitet sich von p2999B4 (Palmiter et al., Mol. Cell Biol., 13:5266-5275, 1993) ab, in den ein Ratten-Insulin II-Intron (etwa 200 bp) und ein Polylinker (FseI/PmeI/AscI) in die NruI-Stelle inseriert wurden. Der Vektor umfasst einen murinen Metallothionein (MT-1)-Promotor (etwa 750 bp) und die untranslatierte Region von humanem Wachstumshormon (hGH) und ein Polyadenylierungssignal (etwa 650 bp), das von 10 kb der 5'-flankierenden Sequenz von MT-1 und von 7 kb der 3'-flankierenden Sequenz von MT-1 flankiert wird. E. coli-Wirtszellen (Electromax DH10B^TM cells; erhalten von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) werden durch Elektroporation mit dem Konstrukt transformiert. Klone, die zvegf4-DNA enthalten, werden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Ein positiver Klon wird durch direkte Sequenzierung bestätigt.
Die zvegf4-cDNA wird mit den Enzymen FseI und AscI aus dem Vektor pTG12-8 freigesetzt. Die cDNA wird auf einem 1%-igen low-melt-Agarosegel isoliert und anschließend aus dem Gel ausgeschnitten. Das Gelstück wird bei 70 °C geschmolzen, zweimal mit gleichen Volumina von Tris-gepuffertem Phenol extrahiert und mit EtOH präzipitiert. Die DNA wird in 10 μl H₂O resuspendiert.
Die zvegf4-cDNA wird in die FseI-AscI-Stellen eines modifizierten pAdTrack-CMV (He et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2509-2514, 1998) kloniert. Dieses Konstrukt enthält das Gen des grün-fluorezierenden Proteins (GFP) als Marker. Der die GFP-Expression regulierende CMV-Promotor wurde gegen den SV40-Promotor ausgetauscht und das SV40-Polyadenylierungssignal wurde gegen das Polyadenylierungssignal von humanem Wachstumshormon ausgetauscht. Ferner wurde der ursprüngliche Polylinker gegen FseI-, EcoRV- und AscI-Schnittstellen ausgetauscht. Diese modifizierte Form von pAdTrack-CMV wird pZyTrack genannt. Die Ligation wird mit Hilfe eines DNA-Ligations- und Screeningkits (Fast-Link^TM; Epicentre Technologies, Madison, WI) durchgeführt. Um das Plasmid zu linearisieren werden etwa 5 μg pZyTrack-zvegf4-Plasmid mit PmeI verdaut. BJ5183-Zellen werden mit etwa 1 μg linearisiertem Plasmid und 200 ng supercoiled pAdEasy (He et al., ibid.) cotransformiert. Die Cotransformation erfolgt mit einem Bio-Rad Gene Pulser bei 2,5 kV, 200 Ohm und 25 μF. Die gesamte Cotransformation wird auf 4 LB-Platten, die 25 μg/ml Kanamycin enthalten, ausplattiert. Die kleinsten Kolonien werden gepickt und in LB/Kanamycin expandiert, und rekombinante Adenovirus-DNA wird durch übliche DNA-Miniprep-Verfahren identifiziert. Der Verdau der rekombinanten Adenovirus-DNA mit FseI und AscI bestätigt die Anwesenheit von zvegf4-DNA. Kompetente E.coli-DH10B-Zellen werden mit der rekombinanten Adenovirus-Miniprep-DNA transformiert und daraus wird DNA hergestellt.
Etwa 5 μg rekombinante Adenovirus-DNA werden mit dem Enzym PacI (New England Biolabs) 3 Stunden bei 37 °C in einem Reaktionsvolumen von 100 μl mit 20–30 U PacI verdaut. Die verdaute DNA wird zweimal mit gleichen Volumina Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das DNA-Pellet wird in 10 μl destilliertem Wasser resuspendiert. Ein T25-Kolben mit QBI-293A-Zellen (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal, Kanada), die am Tag zuvor angeimpft und bis zu einer Konfluenz von 60–70 % angezüchtet worden waren, wurde mit der mit PacI verdauten DNA transfiziert. Die mit PacI verdaute DNA wird auf ein Gesamtvolumen von 50 μl mit sterilem HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES) verdünnt. In einem separaten Röhrchen werden 20 μl 1 mg/ml N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP; Boehringer Mannheim) mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt. Die DNA wird zu dem DOTAP gegeben, durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig vermischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten lang stehengelassen. Das Medium wird von den 293A-Zellen abgetrennt und mit 5 ml serumfreiem MEM-alpha (Life Technologies, Gaithersburg, MD), das 1 mM Natriumpyruvat (Life Technologies), 0,1 mM MEM-nicht-essentielle Aminosäuren (Life Technologies) und 25 mM HEPES-Puffer (Life Technologies) enthält, gewaschen. 5 ml serumfreies MEM werden hinzugegeben und die Zellen auf 37 °C gehalten. Die DNA/Lipid-Mischung wird in den Kolben getropft, es wird vorsichtig gemischt und 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach 4 Stunden wird das Medium, das die DNA/Lipid-Mischung enthält, abaspiriert und durch 5 ml komplettes MEM, das 5 % fötales Rinderserum enthält, ersetzt. Bei den transfizierten Zellen wird ein Monitoring auf GFP-Expression und Foci-Bildung (virale Plaques) durchgeführt.
Sieben Tage nach Transfektion der 293A-Zellen mit der rekombinanten Adenovirus-DNA beginnen GFP-exprimierende Zellen, Foci zu bilden. Um die Zellen zu sammeln, wird das rohe Viruslysat mit einem Zellschaber gesammelt. Das Lysat wird in ein konisches 50 ml-Röhrchen transferiert. Um den größten Teil der Virusteilchen aus den Zellen freizusetzen werden drei Zyklen von Einfrieren/Auftauen in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und einem 37 °C-Wasserbad durchgeführt.
Die 10 cm-Platten mit nahezu konfluenten (80–90 %) 293A-Zellen werden 20 Stunden vor Infektion angesetzt. Um Ausgangsmaterial an zvegf4-rAdV-Lysat zum Arbeiten zu erhalten, wird das Rohlysat amplifiziert (Primäramplifikation). 200 ml des rAdV-Rolysats werden zu jeder 10 cm-Platte gegeben, und die Platten werden über einen Zeitraum von 48 bis 72 Stunden beobachtet, wobei unter dem Weißlichtmikroskop nach cytopathischen Effekten (CPE) und unter dem Fluoreszenzmikroskop nach Expression von GFP gesehen wird. Wenn alle Zellen CPE zeigen, wird dieses primäre (1°) Stammlysat gesammelt und es werden wie oben beschrieben Zyklen von Einfrieren/Auftauen durchgeführt.
Sekundär (2°)-Amplifikation von zvegf4-rAdV wird aus zwanzig 15 cm-Gewebekulturschalen mit 80–90 % konfluenten 293A-Zellen erhalten. Bis auf 20 ml wird das 5%-ige MEM-Medium komplett entfernt und jede Platte mit 300–500 ml 1°-amplifiziertem rAdV-Lysat angeimpft. Nach 48 Stunden sind die Zellen der Virusproduktion lysiert, das Lysat in 250 ml-Polypropylenzentrifugenflaschen gesammelt und der rAdV wird gereinigt.
Um alle Zellen zu lysieren, wird NP-40-Detergens in einer Endkonzentration von 0,5 % zu den Flaschen mit Rohlysat gegeben. Die Flaschen werden 10 Minuten auf eine Schüttlerplattform gestellt und so schnell wie möglich geschüttelt. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 15 Minuten pelletiert. Der Überstand wird in 250 ml-Polycarbonatzentrifugenflaschen transferiert und 0,5 Volumina 20 % PEG8000/2,5 M NaCl-Lösung werden zugegeben. Die Flaschen werden über Nacht auf Eis geschüttelt. Die Flaschen werden bei 20.000 × g 15 Minuten lang zentrifugiert und die Überstände werden in eine Bleichlösung abgegossen. Ein weißes Präzipitat (präzipitiertes Virus/PEG) bildet sich entlang zweier vertikaler Linien an den Flaschenwänden auf jeder Seite der Drehmarkierung. Mit einem sterilen Zellschaber wird das Präzipitat aus zwei Flaschen in 2,5 ml PBS resuspendiert. Die Viruslösung wird in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gebracht und in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 × g 10 Minuten lang zentrifugiert, um jegliche weitere Zelltrümmer zu entfernen. Die Überstände aus den 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden in ein 15 ml-Polypropylenröhrchen mit Schnappverschluss transferiert und mit CsCl auf eine Dichte von 1,34 g/ml eingestellt. Das Volumen der Viruslösung wird abgeschätzt und es werden 0,55 g/ml CsCl zugegeben. Das CsCl wird gelöst und 1 ml dieser Lösung abgewogen. Die Lösung wird in dickwandige 3,2 ml-Polycarbonatzentrifugenröhrchen (Beckman) transferiert und bei 348.000 × g 3–4 Stunden lang bei 25 °C zentrifugiert. Das Virus bildet eine weiße Bande. Die Virusbande wird mit Pipettenspitzen mit breiter Öffnung gesammelt.
Das aus dem Gradienten gewonnene Virus enthält eine große Menge CsCl, die vor der Verwendung auf Zellen entfernt werden muss. PD-10-Säulen von Pharmacia, die mit Sephadex^® G-25M (Pharmacia) vorgepackt sind, werden zur Entsalzung der Viruspräparation verwendet. Die Säule wird mit 20 ml PBS äquilibriert. Das Virus wird aufgetragen und in die Säule laufen gelassen. 5 ml PBS werden zu der Säule gegeben und Fraktionen von 8–10 Tropfen aufgefangen. Die optische Dichte einer 1:50-Verdünnung jeder Fraktion wird bei 260 nm in einem Spektrophotometer bestimmt, und es wird ein deutlicher Absorptionspeak identifiziert. Die Peakfraktionen werden gepoolt und die optische Dichte (OD) einer 1:25-Verdünnung wird bestimmt. Die OD wird mit der Formel (OD bei 260 nm) (25) (1,1 × 10¹²) = Virionen/ml in die Viruskonzentration umgerechnet.
Zur Aufbewahrung des Virus gibt man Glycerin in einer Endkonzentration von 15 % zum gereinigten Virus, mischt vorsichtig und bewahrt es in Aliquoten bei –80 °C auf.
Zur Messung der Infektivität des rekombinanten Virus befolgt man ein von Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Kanada) entwickelten Protokoll. Kurz geagt, für jedes zu untersuchende rekombinante Virus wurden zwei 96-Loch-Gewebekulturplatten mit 1 × 10⁴ 293A-Zellen pro Vertiefung in 2 % fötales Rinderserum enthaltendem MEM angesät. Nach 24 Stunden wurden 10-fache Verdünnungen jedes Virus von 1 × 10^-2 bis 1 × 10^-14 in 2 % fötales Rinderserum enthaltendem MEM hergestellt. 100 μl jeder Verdünnung werden in jede der 20 Vertiefungen gebracht. Nach 5 Tagen bei 37 °C werden die Vertiefungen entweder positiv oder negativ auf CPE ausgelesen und die PFU/ml werden berechnet.
Die verwendete TCID₅₀-Formel entspricht der von Quantum Biotechnologies, Inc. oben. Der Titer (T) wird von einer Platte bestimmt, wo der verwendete Virus von 10^-2 bis 10^-4 verdünnt ist, und 5 Tage nach der Infektion ausgelesen. Für jede Verdünnung wird ein Verhältnis (R) von auf CPE positiven Vertiefungen pro Gesamtzahl aller Vertiefungen bestimmt. Der Titer der unverdünnten Probe ist T = 10^(I+F) = TCID₅₀/ml, wobei F = 1 + d(S – 0,5) ist und S die Summe der Verhältnisse (R) ist und d der Logo der Verdünnungsreihe (z.B. d = 1 bei einer 10-fach-Verdünnungsreihe) ist. Um TCID₅₀/ml in PFU/ml umzurechnen, wird bei der Berechnung des Titers (T) 0,7 vom Exponenten subtrahiert.
Beispiel 7
Die proteincodierende Region von humaner zvegf4-DNA wurde in einer PCR mit Primern amplifiziert, die PmeI- und AscI-Restriktionsschnittstellen an den 5'- bzw. 3'-Terminus anfügen. Die resultierende zvegf4-cDNA wurde in die EcoRV-AscI-Schnittstellen von pZyTrack kloniert (Beispiel 6). Rekombinantes Adenovirus wurde in 293A-Zellen erzeugt und auf CsCl-Gradienten gereinigt. Die Anzahl an Virusteilchen wurde durch Spektrophotometrie bestimmt und die Anzahl an infektiösen Teilchen wurde in einem TCID₅₀-Test bestimmt. Das Virus wurde AdZyvegf4 genannt.
8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden mit AdZyvegf4 infiziert, um die Effekte auf die Serumchemie, das komplette Blutbild (CBC), Änderungen des Körpergewichts und des Gewichts der Organe und die Histologie zu bestimmen. An Tag –1 wurden die Mäuse markiert, einzeln gewogen und für die Auftrennung in Behandlungsgruppen in Gruppen eingeteilt (4 Mäuse pro Käfig). Mäuse aus der Gruppe 1 (n = 8 Weibchen, 7 Männchen) erhielten GFP-Adenovirus (Kontrolle), 1 × 10¹¹ Partikel. Mäuse der Gruppe 2 (n = 8 Weibchen, 6 Männchen) erhielten zvegf4-Adenovirus, 1 × 10¹¹ Partikel. Mäuse der Gruppe 3 (n = 8 Weibchen, 8 Männchen) waren unbehandelte Kontrollen. An Tag 0 erhielten die Mäuse Injektionen der geeigneten Adenoviruslösung. An Tag 10 wurde Blut für CBC-Messungen und Messungen für die klinische Chemie gesammelt (unter Etherbetäubung). An Tag 20 wurden die Mäuse gewogen und durch Genickbruch getötet, nachdem Blut für CBC-Messungen und Messungen für die klinischen Chemie gesammelt worden war (unter Etherbetäubung). Ausgewählte Gewebe wurden fixiert und ihre morphologischen Veränderungen ausgewertet. Die folgende pathologischen Befunde wurden in der Mehrzahl (80–100 %) der mit AdZyvegf4-Adenovirus behandelten Tiere beobachtet, wurden jedoch bei keiner der beiden anderen Gruppen beobachtet.
In der Leber gab es eine moderate Proliferation sinusähnlicher Zellen, insbesondere von Zellen mit kleinen eiförmigen Nuclei und ohne beobachtbares Cytoplasma, die das Sinusoid auskleiden, die in den Venenregionen des Leberlappens (Lobulus hepaticus) geclusterter waren. Die Zellen schienen spindelförmige Itozellen (oder sternförmige Zellen) zu sein, was einer der Hauptzelltypen ist, der am Ausbruch und Fortschreiten von Leberfibrose beteiligt ist.
In allen mit AdZyvegf4 behandelten Tieren waren die Glomeruli der Nieren vergrößert und durch Hyperzellularität von Mesangiumzellen gekennzeichnet. Daneben zeigten alle sechs Mäusemännchen und vier der sieben Mäuseweibchen Anzeichen von Tubulusregeneration. Diese Veränderungen ließen sich nicht bei Tieren beobachten, die einem Kontrolladenovirus ausgesetzt waren, der ein nicht verwandtes Protein exprimierte. Tubulusregeneration ist durch Anwesenheit von Tubulusepithelzellen mit erhöhter Basophilie gekennzeichnet. Eine ausführlichere histologische Untersuchung ergab wenig Hinweis auf tubulointerstitiale Proliferation oder entzündliche Zellinfiltration.
Eine erhöhte Menge bronchoalveolären Lymphgewebes wurde in den Lungen der mit AdZyvegf4 behandelten Tiere beobachtet. Bronchoalveoläres Lymphgewebe bestand vorwiegend aus Lymphocytenclustern um die Gefäße im Lungenparenchym herum, die mit einer geringeren Anzahl Plasmazellen vermischt waren, was als Zeichen für eine Reaktion auf Lungenentzündung zu sehen ist, die ein wichtiger Initiator von Lungenfibrose ist und daran teilhat.
Im Femur zeigten die meisten Tiere minimale bis schwere, das Endost betreffende Knochenfüllung des Markraums mit verminderten Mengen an hämatopoietischen Elementen, die aus einem Verlust des Knochenraums wegen der Proliferation des Endostknochens resultieren. Daneben zeigten vier der sechs Männchen und zwei der acht Weibchen eine Proliferation von Stromazellen, was durch eine erhöhte Zahl an spindelförmigen Zellen gekennzeichnet war.
Beispiel 8
Restauration der Nierenfunktion wird mit dem Modell von Nakagawa et al. (Am. J. Pathology, 155:1689–1699, 1999) festgestellt. Eine ischämische tubuläre Verletzung wird bei Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250 g bis 300 g induziert, indem man die Nierenarterien beidseitig exakt 50 Minuten lang abklemmt. Die Körpertemperatur wird auf 37 ± 1 °C gehalten, indem man die Tiere auf einen homöothermischen Tisch legt und sie mit einer rektalen Temperatursonde überwacht. Nach Entfernung der Klammer werden die Nieren über verschiedene Zeitintervalle reperfundiert. Zvegf4 wird an verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht. Die Mortalität der Tiere 1–10 Tage nach Operation ist ein Hinweis auf eine persistente renale Dysfunktion. Die Nierenfunktion kann auch durch Proteinurie, Kreatininmengen im Serum und andere dem Fachmann bekannte Verfahren beurteilt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines zvegf4-Proteins oder eines für zvegf4-Protein codierenden Polynukleotids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung akuter tubulärer Nekrose oder chronischer Analgetikanephritis.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei dem Säuger ein zvegf4-Protein verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei dem Säuger ein für zvegf4-Protein codierendes Polynukleotid verabreicht wird.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten ist, wobei jede dieser Ketten die Reste 258-370 der SEQ ID NO:2 umfasst.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten ist, wobei jede dieser Ketten die Reste 250-370 der SEQ ID NO:2 umfasst.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten ist, wobei jede dieser Ketten die Reste 246-370 der SEQ ID NO:2 umfasst.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das zvegf4-Protein ein disulfidverbrücktes Dimer aus zwei Polypeptidketten ist, wobei jede der Ketten aus den Resten, einschließlich, x – y der SEQ ID NO:2 besteht, wobei das Protein gegebenenfalls glykosyliert ist und wobei: x ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 35, 52, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 246, 250, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 und 263; und y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 365, 366, 367, 368, 369 und 370.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Säuger an akuter tubulärer Nekrose leidet.