DE60107227T2 - Gen für eine sham-sensitive terminale oxidase aus xylose fermentierende hefe - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Innerhalb der Vereinigten Staaten zielen aktuelle Forschungstätigkeiten darauf ab, alternative Energiequellen zu entwickeln, um die Abhängigkeit von importiertem Öl und nicht erneuerbaren Energien zu reduzieren. Die Verwendung von Ethanol als ein Brennstoff wurde in den vergangenen Jahren immer weiter verbreitet. Der derzeitige Verbrauch von Ethanol innerhalb der USA unter den Transport-Brennstoffen beläuft sich auf etwa 1,2 Milliarden Gallonen jährlich. In den USA wird der Großteil von Ethanol aus der Fermentation von Maisstärke gewonnen. Hochrechnungen, die vom Department of Energy angestellt wurden, geben an, dass bis zum Jahr 2020 der jährliche Verbrauch von Ethanol als Brennstoff auf geschätzte 20 Milliarden Gallonen eklatant gestiegen sein wird. Dies übersteigt bei weitem, was innerhalb der USA auf der Grundlage von Maisstärke wirtschaftlich produziert werden kann.
  • Um dieser wachsenden Nachfrage an Ethanol gerecht zu werden, wird es erforderlich sein, Zucker aus anderen Biomassen zu fermentieren. Biomasse bezieht sich auf Materialien wie landwirtschaftliche Abfallprodukte, Maisschalen, Maiskolben, cellulosehältige Materialien und dergleichen. Biomasse aus den meisten dieser Quellen enthält Xylose in einer Konzentration von bis zu etwa 25–30 % des gesamten Trockengewichts. Der D-Xylose-Gehalt von Hartholz-Spezies und krautartigen Angiospermen beträgt etwa 17 % bzw. 31 % des Gesamttrockengewichts. Da landwirtschaftliche Rückstände, Ablauge und rasch wachsende Hartholzspezies einen hohen Xylosegehalt aufweisen, sind die möglichen wirtschaftlichen und ökologischen Vorteile einer Umsetzung von Xylose in diesen erneuerbaren Materialien bedeutend. Um Biomassenumsetzung wirtschaftlich durchführbar zu gestalten, muss für Xylose eine praktische, großtechnische Verwendung gefunden werden.
  • Biomassenumsetzung setzt Mikroorganismen ein, die als Biokatalysator dienen, um cellulosehältige Materialien zu einsetzbaren Endprodukten wie Ethanol umzusetzen. Wirksame Biomassenumsetzung für großtechnische gewerbliche Anwendungen er fordert einen Mikroorganismus, der hohe Zucker- und Ethanolkonzentrationen vertragen und der in der Lage ist, mehrere Zuckerarten zugleich zu fermentieren.
  • Die Pentosen D-Xylose und L-Arabinose zählen zu den Zuckerarten in Biomasse, die am schwierigsten zu verdauen sind. Bakterien können Pentosen zu Ethanol und anderen Nebenprodukten fermentieren, und Bakterien mit verbesserter Ethanolproduktion aus Pentosezuckern wurden bereits mittels Gentechnik hergestellt. Diese Bakterien sind jedoch auf geringen pH und hohe Ethanolkonzentrationen empfindlich, ihre Verwendung in Fermentationsprozessen ist mit der Bildung von Nebenprodukten verbunden, und das Ausmaß an produziertem Ethanol bleibt zu gering, als dass die Verwendung dieser Bakterien im Rahmen von großtechnischer Ethanolproduktion wirtschaftlich rentabel gestaltet werden könnte.
  • Im Allgemeinen bevorzugen gewerbliche Hersteller von Ethanol sehr stark die Verwendung von Hefe als Biokatalysatoren, da Hefefermentationen relativ resistent gegen Verunreinigung, relativ unempfindlich auf geringen pH und Ethanol und im Rahmen von großtechnischer Produktion einfacher zu handhaben sind. Zahlreiche verschiedene Hefespezies verwenden Xylose über Respiration, doch nur wenige Spezies verwenden Xylose über Fermentation. Fermentation von Xylose zu Ethanol durch eine Hefespezies vom Wildtyp, die Xylose fermentierend ist, tritt langsam auf und resultiert in geringer Ausbeute im Vergleich zu Fermentationsgeschwindigkeiten und Ethanolausbeuten, die mit herkömmlichen Hefearten in Glucose-Fermentationsprozessen erhalten werden. Um das Kosten-Nutzen-Verhältnis von Xylosefermentation zu verbessern, ist es notwendig, die Fermentationsgeschwindigkeit und die erhaltene Ethanolausbeute zu steigern.
  • Die am häufigsten eingesetzte Hefe in gewerblichen Anwendungen ist Saccharomyces cerevisiae. Obwohl S. cerevisiae nicht in der Lage ist, auf Xylose zu wachsen oder sie zu fermentieren, wurde berichtet, dass Homogenate von S. cerevisiae leicht D-Ribulose-5-phosphat zu Ethanol fermentieren konnten und dass sie auch D-Xylulose-5-phosphat in einem geringeren Ausmaß umsetzen konnten (Dickens, 1938). Anstrengungen, Stämme von S. cerevisiae mit verstärkter Xylosefermentation durch Einführen von Genen zu bilden, die in der Lage sind, Xylose zu Metaboliten umzusetzen, die durch S. cerevisiae fermentierbar sind, waren bisher weitgehend erfolglos (Ueng et al., 1985; Chan et al., 1989; Amore et al., 1989; Sarthy et al., 1987; Toivari et al., 1996).
  • Pichia stipitis ist eine Hefespezies, die in der Lage ist, Xylose zu fermentieren, um Ethanol zu produzieren. Bei P. stipitis co-existieren fermentativer und respirativer Metabolismus, um Zellwachstum und die Umsetzung von Zucker zu Ethanol zu unterstützen (Ligthelm, 1988). P. stipitis unterscheidet sich signifikant von der Glucose-fermentierenden Hefe S. cerevisiae in ihrer Fähigkeit, Ethanol aus Xylose zu produzieren. Es ist bekannt, dass P. stipitis ein gut kontrolliertes niedriges Niveau an Sauerstoff erfordert, um die Maximalgeschwindigkeit von Ethanolproduktion zu erreichen. Im Jahr 1996 beobachteten Passoth et al. zum ersten Mal ein besonderes Muster an Respiration bei P. stipitis. Nachdem die Zellen von P. stipitis von aeroben in Sauerstoff-limitierte Bedingungen überführt worden waren, wurde keine Steigerung der Respirationskapazität beobachtet. Weiters traten keine Steigerung des Respirations-Quotienten (CO2-Produktion/O2-Verbrauch) und keine Veränderung im Niveau eines Schlüssel-Respirationsenzyms, der Pyruvat-Dehydrogenase, zu Tage. Darüber hinaus wurde Respirationsaktivität in Gegenwart fermentierbarer Zucker oder geringer Sauerstoffspannung nicht unterdrückt. In einer Studie über alternative Stoffwechselwege, die in Crabtree-positiven und -negativen Spezies vorhanden sind, zeigten Jeppsson et al. (1995), dass P. stipitis einen alternativen Respirationsweg aufweist, der gegenüber Cyanid oder Antimycin A resistent ist, jedoch auf Salicylhydroxymat (SHAM) empfindlich ist. Es wird angenommen, dass der Stoffwechselweg eine SHAM-empfindliche terminale Oxidase (STO) umfasst. Jeppsson et al. stellten die Hypothese auf, dass der STO-Weg als eine Redox-Senke dienen würde, um die Ansammlung von Xylitol in P. stipitis zu vermeiden.
  • Obwohl STO-Respiration vor 70 Jahren entdeckt worden war (Keilin, 1929), bleiben die physiologischen Rollen und die funktionellen Komponenten dieses Stoffwechsel weges unklar. STO-Respiration von höheren Pflanzen (für einen Übersichtsartikel siehe Douce & Neuburger (1989); Vanlerberghe & McIntosh (1997)), Pilzen (Lambowitz & Slayman (1971); Downie & Garland (1973)) und Hefespezies (Lloyd & Edwards (1977)) wurde weitgehend untersucht. Der STO-Stoffwechselweg zweigt sich vom herkömmlichen Cytochrom-Weg auf dem Niveau von Ubichinon genau vor Cytochrom B ab (Seidow, 1980; Storey, 1976), wobei Elektronen direkt an STO abgegeben werden, um molekularen Sauerstoff zu Wasser zu reduzieren. STO ist nicht in der Lage, Protonen zu verlagern (Moore & Rich, 1985), wodurch es zwei von drei Energie-erzeugenden Stellen in Pflanzen umgeht. Daher wird sie als ein Energie verschwendender Stoffwechselweg erachtet. Der Großteil der gegenwärtig vorhandenen Informationen bezüglich biochemischer und regulatorischer Aspekte des Stoffwechselweges wurden aus Studien über Pflanzen-STO-Proteine erhalten. Da dieses Protein eng mit der inneren Mitochondrienmembran assoziiert ist, wurden bisher keine reinen Formen für Charakterisierungsstudien des Metallzentrums und der Kinetik erhalten. Weiters verlieren die Pflanzen-STO-Proteine Aktivität, wenn sie solubilisiert werden. Diese Schwierigkeiten behinderten den Fortschritt hinsichtlich des Verständnisses der physiologischen Rollen des STO-Stoffwechselweges.
  • In den Laboratorien der Erfinder wurden Forschungstätigkeiten in Bezug auf die Identifizierung und Charakterisierung von STO-Protein und seiner Rolle in P. stipitis unternommen. Die aus diesen Bemühungen resultierenden Informationen ermöglichten es den Erfindern, gentechnisch hergestellte, Xylose fermentierende Hefestämme mit gesteigerter Ethanolproduktion aus Xylose zu entwickeln.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polynucleotid, das aus einer Sequenz besteht, die für SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase der Seq.-ID Nr. 26 kodiert. Vorzugsweise ist das isolierte Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das aus der Sequenz nach Seq.-ID Nr. 25 besteht.
  • In einem anderen Aspekt schließt die vorliegende Erfindung einen Vektor ein, der ein Polynucleotid umfasst, das eine für SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase kodierende Sequenz nach Seq.-ID Nr. 26 umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein genetisches Konstrukt bereit, umfassend eine Sequenz, die für die SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase der Seq.-ID Nr. 26 kodiert, die operabel an einen in Hefe funktionellen Promotor gebunden ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Xylose fermentierende Mutante von P. stipitis gemäß einer Ausführungsform bereit, worin die mutierte, Xylose fermentierende Hefe ein Unterbrecher von SHAM-empfindlicher terminaler Pichia-stipitis-Oxidase ist. Vorzugsweise ist der Unterbrecher für SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase von FPL-UC7 (NRRL 21.448) abgeleitet. Noch bevorzugter ist der Unterbrecher für SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase FPL-Shi 31 (NRRL Y-30.230).
  • In einer alternativen Ausführungsform umfasst die mutierte, Xylose fermentierende Hefe ein Konstrukt, das Antisense-mRNA der SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase exprimiert.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus der Fermentation von Xylose, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Mutante von Xylose fermentierender Hefe in einem xylosehältigen Material unter geeigneten Bedingungen für eine ausreichend lange Zeitspanne, um Fermentation von Xylose zu Ethanol zu ermöglichen, worin die mutierte Hefe im Vergleich zum Elternstamm vom Wildtyp, von dem die Mutante abgeleitet ist, reduzierte SHAM-empfindliche terminale Oxidase aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine rekombinante Hefe, umfassend eine Sequenz, die für die SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase nach Seq.-ID Nr. 26 kodiert, worin die kodierende Sequenz operabel an einen in Hefe funktionellen Promotor gebunden ist, worin die Hefe einer Spezies angehört, die aus der aus Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces byanus, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces sake, Saccharomyces thermotolerans, Saccharomyces urvarum und Gruppe-III-Spezies bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die rekombinante Hefe SHAM-empfindliche terminale Oxidase exprimiert und worin Expression von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase in Verbindung mit cyanidresistenter Respiration steht, wobei die Hefespezies nativ einen Antimycin-A-unempfindlichen Stoffwechselweg und einen Cytochrom-Stoffwechselweg umfasst.
  • Es ist ein Vorteil, dass die mutierte, Xylose fermentierende Hefe der vorliegenden Erfindung Xylose, im Vergleich zum Elternstamm, der Wildtyp-Konzentrationen von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase aufweist, mit höherer Geschwindigkeit fermentiert.
  • Andere Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden anhand der Lektüre der Beschreibung verständlich werden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die phylogenetische Beziehung von PsSto zu STO-Proteinen von sieben verschiedenen Hefe- und Pilzspezies.
  • 2 ist eine schematische Darstellung der PsSto-Unterbrechungskassette; das offene Kästchen stellt die PsSto-Sequenz und der schraffierte Kästchen das PsURA3-Gen dar.
  • 3A zeigt die Konstruktion einer PsSto-1-Expressionskassette mit einer Saccharomyces-cerevisiae-Promotor- und -Terminationssequenz.
  • Die 3B und 3C vergleichen die Respirationsgeschwindigkeiten von S. cerevisiae, die PsSTO1 exprimiert (voll), und von S. cerevisiae, die keine PsSTO1 aufweist (schraffiert), ohne Inhibitor (3B) und in Gegenwart von 1 mM KCN (3C).
  • 4 vergleicht Zellwachstum (∎), Ethanolproduktion
    Figure 00070001
    und Xyloseverwertung (⦁) des PsSto-Unterbrechers FPL-Shi31 (4A) mit Zellwachstum (⎕), Ethanolproduktion (Δ) und Xyloseverwertung (❍) von FPL-UC7.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Pichia stipitis ist eine Crabtree-negative Hefe mit koexistierendem oxidativem und fermentativem Metabolismus, die einen Cytochrom-Stoffwechselweg und einen Cyanid- oder Antimycin-A-resistenten, SHAM-empfindlichen Stoffwechselweg umfasst. Die Erfinder entdeckten bereits zuvor, dass die Unterbrechung des Cytochrom-Weges bei P. stipitis zu gesteigerter Xylose-Fermentation führt (US-Patent Nr. 6.071.729).
  • Wie hierin berichtet haben die Erfinder eine Codiersequenz für SHAM-empfindliche terminale Oxidase von P. stipitis identifiziert, kloniert und sequenziert. Das Gen ist als PsSTO1 für SHAM-empfindlicher terminaler Pichia-stipitis-Oxidase bezeichnet. Unter Verwendung der für PsSTO1 kodierenden Sequenz wurde eine Unterbrechung und ein Expressionsvektor entwickelt.
  • Die Unterbrechungskassette wurde verwendet, um eine Mutante von Pichia stipitis in FPL-UC7 zu bilden, die das PsSTO1-Gen enthält und Wildtyp-Konzentration von PsSto aufweist. Die PsSTO1-Unterbrechungsmutante von Pichia stipitis wurde wie in den Beispielen näher beschrieben charakterisiert. Kurz zusammengefasst zeigte die auf Xylose gezüchtete Mutante raschere Xyloseverwertung, zeigte höhere Volumenproduktion von Ethanol und wies im Vergleich zum Elternstamm, von dem die Mutante abgeleitet war, reduziertes Zellwachstum auf. Raschere Xyloseverwertung, gesteigerte Ethanolproduktion und reduziertes Zellwachstum sind wünschenswerte Eigen schaften für eine Hefe, die in gewerblichen Fermentationsprozessen zum Einsatz kommt.
  • Ein genetisches Konstrukt, das das PsSTO1-Gen, operabel an einen in Hefe funktionellen Promotor gebunden, umfasst, wurde in Saccharomyces cerevisiae eingeführt, und Expression von PsSto-Protein wurde erreicht. Es ist von Interesse anzumerken, dass die Respirationsgeschwindigkeit von transformierter S. cerevisiae im Vergleich zu jener einer Kontroll-Hefe anstieg. Respiration war gegenüber KCN resistent, was darauf schließen lässt, dass Expression von PsSTO1 S. cerevisiae funktionelle, SHAM-empfindliche Respiration verleihen kann.
  • Bis heute erwiesen sich Bemühungen, Xylose-Fermentation zu Ethanol durch S. cerevisiae durch Einführen in die Xylose-fermentierenden Hefe-Enzyme (z.B. Xylosereducatse oder Xylitoldehydrogenase) zu steigern, als unwirksam. Bei geringen Sauerstoffniveaus setzt rekombinante S. cerevisiae mit einem Wildtyp-Cytochrom-Respirationssystem Xylose zu Xylitol um. Anstatt zu Ethanol umgesetzt zu werden, sammelt sich aufgrund des Cofaktor-Ungleichgewichts der Enzyme der ersten zwei Schritte auf dem gentechnisch hergestellten Xylose-Stoffwechselweg Xylitol an. Darüber hinaus weist S. cerevisiae Transhydrogenasen auf, um NADPH zur Bildung von NAD+ zu verwenden. Die Erfinder stellten die Hypothese auf, dass es durch Einführen des Sto-Proteins in S. cerevisiae möglich sein kann, cyanidresistente Respiration zu verleihen, um die Bildung von NAD+ in S. cerevisiae zu fördern.
  • Die Erfinder transformierten S. cerevisiae mit einem PsSTO1-Gen unter Kontrolle eines konstitutiven ScGAPDH-Promotors und fanden heraus, dass Transformanten gesteigerte Respiration aufweisen, die gegen Cyanid resistent ist. Jeglicher Promotor, der in Hefe funktionell ist, kann anstelle des ScGAPDH-Promotors verwendet werden, um Expression eines heterologen PsSTO-Gens in Hefe zu ermöglichen. Es wird vernünftigerweise erwartet, dass S.-cerevisiae-Mutanten, die Sto-Proteine mit der Kombination von Xylosereducatse und Xylitoldehydrogenase exprimieren, gesteigerte Ethanolproduktion aus Biomasse aufweisen. Daher stellen die S.- cerevisiae-Mutanten der vorliegenden Erfindung gute Ziele für die Entwicklung gentechnisch hergestellter Hefe mit heterologen Enzymen, die in Xylose-Fermentation eingebunden sind, dar.
  • Es wird angenommen, dass andere, im Handel wichtige Hefespezies, die eng mit S. cerevisiae verwandt sind, auch gentechnisch verändert werden können, um Sto-Proteine zu exprimieren. Geeignete Hefespezies umfassen Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces byanus, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces sake, Saccharomyces thermotolerans und Saccharomyces urvarum, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen mutierten, Xylose-fermentierenden Hefestamm bereit, der durch reduzierte Expression einer funktionellen, SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase charakterisiert ist. Es wurde für die mutierte Hefe der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass sie mittels Fermentation von Xylose Ethanol rascher bildet als der Elternstamm, der Wildtyp-Konzentrationen an SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase aufweist.
  • Vorzugsweise weisen die mutierten Hefestämme der vorliegenden Erfindung Ethanol-Volumenproduktionsmengen auf, die etwa um 20 % oder mehr höher sind als jene des entsprechenden Elternstamms mit Wildtyp-Konzentrationen von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mutierte Hefe der vorliegenden Erfindung eine Mutante, die SHAM-empfindliche terminale Oxidase unterbricht. Mit einer „Mutante, die SHAM-empfindliche terminale Oxidase unterbricht", ist eine Mutante gemeint, in der ein Teil des funktionellen, SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase-Gens oder das gesamte Gen, der/das im Elternstamm nativ vorhanden ist, entfernt wird oder durch DNA ersetzt wird, deren Expression nicht in einem Expressionsprodukt mit Aktivität von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase resultiert.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann Expression von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase durch die Verwendung eines Antisense-Konstrukts nach unten reguliert werden, in dem ein Teil des oder der gesamte Antisense-Strang, der für die SHAM-empfindliche terminale Oxidase kodiert, unter der Regulierung eines Promotors, der auf reduzierten Sauerstoff reagiert, exprimiert wird. In dieser Ausführungsform wird die Antisense-mRNA für SHAM-empfindliche terminale Oxidase unter Sauerstoff-einschränkenden Bedingungen exprimiert, wodurch Translation des Transkripts von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase gehemmt wird. Unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzinformationen könnten gewöhnliche Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung einen Vektor konstruieren, der Antisense-RNA exprimiert.
  • Unter „Wildtyp-Hefe" wird ein Xylose fermentierender Hefestamm mit normalen oder Wildtyp-Konzentrationen von funktioneller SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase verstanden, von dem der mutierte Stamm der vorliegenden Erfindung abgeleitet wird. In bestimmten Fällen kann die „Wildtyp-Hefe", wie sie hierin definiert ist, mutagenisierte Hefe einschließen. Beispielsweise ist der P.-stipitis-Stamm FPL-UC7, aus dem das Unterbrechungsmittel für PsSTO1, FPL-Shi31, entwickelt wurde, selbst ein mutierter Hefestamm. Dennoch ist FPL-UC7 auch eine Wildtyphefe nach der vorliegenden Definition, da es eine Xylose fermentierende Hefe mit normalen Konzentrationen an funktioneller SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase, die zur Entwicklung eines mutierten Hefestamms der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist.
  • Wie im Detail in den Beispielen beschrieben wurde eine Unterbrechungskassette, die ein 1.4-kb-PsURA3-Fragment, insertiert in das PsSTO1-Gen, umfasst, durch ortsspezifische Integration in das Genom von P. stipitis FPL-UC7 (Lu et al., 1998b), ein ura3-Auxotroph, eingeführt. Ein resultierender Unterbrechungsstamm, bezeichnet als FPL-Shi31, wurde erhalten und wie nachstehend charakterisiert. Der P.-stipitis-Stamm FPL-Shi31 wurde bei der ARS Patent Culture Collection in Peoria, IL, am 20. Oktober 1999 unter dem Vertrag von Budapest hinterlegt, und ihm wurde die Zugriffszahl NRRL Y-30.230 zugewiesen. Vernünftigerweise wird erwartet, dass ähn liche sto1-Δ-Unterbrechungsmittel von P. stipitis unter Verwendung einer Unterbrechungskassette, umfassend größere oder kleinere Teile von 5'- und 3'-Regionen des PsSTO1-Gens oder seiner flankierenden Regionen, erhalten werden können.
  • Zusätzlich zu FPL-Shi31 können andere sto1-Δ-Unterbrechungsmutanten leicht durch Verwendung von FPL-UC7 (NRRL Y-21.448) oder P. stipitis FPL-PLU20 (Lu et al., 1998; Cho & Jeffries, 1999) als Vorläufer erhalten werden. Der P.-stipitis-Stamm FPR-PLU20 wurde bei der ARS Patent Culture Collection in Peoria, IL, am 30. März 1998 unter dem Vertrag von Budapest hinterlegt, und ihm wurde die Zugriffszahl NRRL Y-21.970 zugewiesen.
  • Mehrere Hefe- und Pilzspezies, zusätzlich zu P. stipitis, sind bekannt dafür, mehr als einen Respirationsweg einzusetzen. Diese Spezies können einer bis vier Gruppen zugeteilt werden: Gruppe I (ein Cytochrom-Stoffwechselweg und SHAM-empfindlicher Stoffwechselweg); Gruppe II (ein Cytochrom-Stoffwechselweg, ein Antimycin-A- und SHAM-unempfindlicher Stoffwechselweg und ein SHAM-empfindlicher Stoffwechselweg); Gruppe III (ein Antimycin-A-unempfindlicher Stoffwechselweg und ein Cytochrom-Stoffwechselweg); und Gruppe IV (Cytochrom-c-Stoffwechselweg). Gruppe I umfasst Pichia stipitis, Hansenula anomala, Hansenula California, Schwanniomyces castellii, Aspergillus niger und Neurospora crassa. Gruppe II umfasst Hansenula saturnus und Endomycposis capsularis. Gruppe III umfasst Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Candida parapilosis und Kluyveromyces lactis. Gruppe IV umfasst Hansenula glucozyma.
  • Es wird erwartet, dass eine Mutante mit reduzierter Expression von funktioneller SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase aus jeder Hefespezies der Gruppen I oder II unter Verwendung von Verfahren der Molekularbiologie und den hierin erläuterten Lehren einfach erhalten werden kann. Beispielsweise könnte man, sofern man solch eine Mutante zu erhalten wünscht, das STO-Gen aus der Zielspezies isolieren, eine Unterbrechungskassette, die einen selektierbaren Marker wie URA3 aufweist, konstruieren, einen empfindlichen Stamm (z.B. einen ura3-auxotropen Stamm) mit der Kassette transformieren und für mutmaßliche Transformanten in Selektionsmedium (z.B. Medium ohne Uracil) auswählen. Mutmaßliche Unterbrechungsmittel können durch PCR-Amplifikation wie in den Beispielen beschrieben bestätigt werden.
  • Vernünftigerweise wird erwartet, dass, zusätzlich zur Expression von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase in S. cerevisiae, Expression von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase und Cyanid-resistente Respiration durch Einführen eines heterologen SHAM-empfindlichen terminalen Oxidasegens, das operabel an einen in Hefe exprimierbaren Promotor gebunden ist, in Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces byanus, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces sake, Saccharomyces thermotolerans und Saccharomyces urvarum oder Gruppe-III-Hefe unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung und herkömmlicher Verfahren der Molekularbiologie erreicht werden kann.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Fermentieren von Xylose in einem Xylose-hältigen Material bereit, um unter Verwendung der mutierten Hefe der Erfindung als Biokatalysator Ethanol herzustellen. Vorzugsweise wird die mutierte Hefe gewonnen, nachdem die Xylose im Medium zu Ethanol fermentiert wurde, und in darauf folgenden Fermentationsprozessen verwendet.
  • Unter „Xylose-hältigem Material" wird jedes beliebige Medium verstanden, das Xylose umfasst, unabhängig davon, ob es flüssig oder fest ist. Geeignete Xylose-hältige Materialien umfassen Hydrolysate von Polysaccharid- oder lignocellulosehältige Biomasse wie Maisschalen, Holz, Papier, landwirtschaftliche Nebenprodukte und dergleichen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Unter einem „Hydrolysat" ist hierin ein Polysaccharid gemeint, das durch den Zusatz von Wasser depolymerisiert wurde, um Mono- und Oligosaccharide zu bilden. Hydrolysate können durch enzymatische oder saure Hydrolyse des Polysaccharid-hältigen Materials oder durch andere geeignete Mittel hergestellt werden.
  • Vorzugsweise ist der mutierte Hefestamm in der Lage, unter ähnlichen Bedingungen zu wachsen, die in industriellen Quellen von Xylose vorzufinden sind. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung würde am wirtschaftlichsten sein, wenn das Xylose-hältige Material mit der mutierten Hefe ohne übermäßige Manipulation inokuliert werden kann. Beispielsweise werden in der Papierindustrie große Mengen an Cellulose-Abfall produziert. Verzuckerung der Cellulose durch saure Hydrolyse ergibt Hexosen und Pentosen, die in Fermentationsreaktionen verwendet werden können. Das Hydrolysat oder die Sulfitablauge enthält jedoch hohe Konzentrationen an Sulfit und Phenolhemmern, die natürlich in Holz vorhanden sind und das Wachstum der meisten Organismen hemmen oder unterbinden. Passagieren der Hefe führt zu einer Auswahl an Hefe, die besser in der Lage ist, in Gegenwart von Sulfit oder Phenolhemmern zu wachsen.
  • Es wird erwartet, dass mutierte Hefestämme der vorliegenden Erfindung weiter manipuliert werden können, um andere wünschenswerte Eigenschaften oder sogar höhere spezifische Ethanolausbeute zu erreichen. Beispielsweise kann Selektion von mutierten Hefestämmen durch Passagieren der mutierten Hefestämme der vorliegenden Erfindung in Medium, das Hydrolysat enthält, zu verbesserter Hefe mit gesteigerter Fermentationsgeschwindigkeit führen.
  • Die Sequenz der abgeleiteten Aminosäuresequenz des mutmaßlichen Proteins, das vom Pichia-stipitis-STO1-Gen kodiert ist, wird in Seq.-ID Nr. 26 dargestellt. Die Sequenz des STO1-Gens, das aus Pichia stipitis isoliert wurde, ist in Seq.-ID Nr. 25 gezeigt. Natürlich kann die Sequenz, die für die zu exprimierende STO kodiert oder die zur Konstruktion einer Unterbrechungskassette verwendet wird, eine Sequenz mit geringfügigen Veränderungen, Substitutionen, Additionen oder Deletionen im Vergleich zur aus P. stipitis isolierten Sequenz, gezeigt in Seq.-ID Nr. 25, aufweisen.
  • Bezüglich der Expression des STO-Gens ist für gewöhnliche Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verständlich, dass bestimmte Änderungen in der Nucleinsäuresequenz zu geringen oder keinen Unterschieden in der Gesamtfunktion des Proteins oder Peptids, das durch die Sequenz kodiert wird, führen. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, besonders in der dritten Position der Codons, können Änderungen in der Nucleinsäuresequenz eventuell nicht zu einer unterschiedlichen Aminosäure, die durch dieses Codon spezifiziert wird, führen. Änderungen, die zu einer Aminosäuresubstitution führen, können wenig oder keine Auswirkung auf die dreidimensionale Struktur oder die Funktion des kodierten Proteins oder Peptids haben. Darüber hinaus können Änderungen, die zu Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren führen, auch annehmbar sein.
  • Dem ähnlich wird von geringfügigen Änderungen in der Sequenz des STO-Gens erwartet, dass sie für die Verwendung des STO-Gens in der Entwicklung einer unterbrechenden Mutante geeignet sind. Es ist wichtig, dass ein ausreichend hoher Komplementaritätsgrad zwischen dem STO-Gen, das zur Konstruktion der Unterbrechungskassette verwendet wird, und jenem des Zielwirts vorhanden ist, sodass wirksame, ortsspezifische Rekombination zu Tage treten kann.
  • Die folgenden Beispiele, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind, sind lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt.
  • BEISPIELE
  • I. Verfahren und Materialien
  • A. Mikrobielle Stämme und Erhaltung
  • Mikrobielle Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. P.-stipitis-Stämme wurden in YNB-Minimalmedium gehalten oder kultiviert, das 1,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren (YNB; Difco), 5 g/l Ammoniumsulfat und 20 g/l Glucose enthält. Für Hefetransformationen wurden Hefe-Wirtsstämme in YPD-Medium gezüchtet, das aus 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton und 20 g/l Glucose bestand. Zur Kultivierung von ura3- und leu2-Auxotrophe wurden die Medien mit 20 mg/l Uridin bzw. Leucin ergänzt. Für andere Wachstums- oder Fermentationsex perimente wurden Hefestämme normal in YNBUP-Medium gezüchtet, das 1,7 g/l Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 2,27 g/l Harnstoff, 6,56 g/l Pepton und Zucker (2–4 %) enthielt. Hefestämme wurden bei 30°C kultiviert. E. coli wurde bei 37°C in Luria-Bertani-Medium, ergänzt mit 100 mg/l Ampicillin oder Kanamycin, sofern erforderlich, kultiviert.
  • Figure 00160001
  • B. Enzyme, Primer und Chemikalien
  • Restriktionsenzyme, DNA-Modifikations-Enzyme und molekulare Reagenzien wurden bei New England Biolabs, Promega, Strategene und Roche Biochemicals erhalten. Reaktionsbedingungen waren wie von den Lieferanten empfohlen. Alle allgemeinen Chemikalien wurden bei Sigma und Fisher erworben. Alle DNA-Präparate wurden unter Verwendung von Qiaprep-Spin-Säulen von Qiagen erhalten. Zymolyase 20T wurde bei ICN gekauft, während Novozym234 bei Sigma erworben wurde. Oligo-Primer wurden von Sigma-Genosys synthetisiert. Die in dieser Studie verwendeten Oligonucleotide sind in Tabelle 2 aufgelistet; Vektoren sind in Tabelle 3 aufgelistet.
  • C. DIVA-Sequenzieren
  • Sequenzieren aller DNA-Klone wurde unter Verwendung eines automatisierten 371-ABI-Sequenzierungsautomats (Perkin-Elmer) durchgeführt. DNA-Sequenzanalyse erfolgte unter Verwendung eines Sequenzanalyse-Softwarepakets von Genetics Computer Group und von DNAMAN (Lynnon BioSoft). Phylogenetische Stammbäume wurden gemäß dem Neighbour-Joining-Verfahren (Kimura, 1983) erstellt.
  • Tabelle 2 Oligonucleotide
    Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • D. Genomwanderung zum Klonieren der alternativen Oxidase
  • Zwei hoch-konservierte Regionen der sechs alternativen Pilzoxidasen: IFLES(I/V)AGVPGMV (Seq.-ID Nr. 27 bzw. Seq.-ID Nr. 28) und HRFVGYLEEEAV (Seq.-ID Nr. 29) wurden ausgewählt, um zwei degenerierte Oligonucleotide zu bilden. Primer 1 und 2 (Seq.-ID Nr. 1 bzw. Seq.-ID Nr. 2) wurden verwendet, um eine 293-bp-Region von PsSTO1 aus P.-stipitis-Wildtyp CBS-6054 durch Pfu-DNA-Polymerase (Strategene) zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wurde bei 95°C 5 Minuten lang als Anfangszyklus durchgeführt, gefolgt von 36 Zyklen bei 95°C 60 Sekunden lang, bei 55°C 60 Sekunden lang und bei 72°C 90 Sekunden lang. Die abschließende Verlängerungsdauer betrug 15 Minuten bei 72°C. Ein μl PCR-Produkte wurde direkt in den PCR2.1-TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert, um pNQ28 zu bilden. Das 293-bp-Fragment wurde sequenziert und mit dem Consensus der alternativen Pilzoxidasegene verglichen. Diese Region wurde zum Ausgangspunkt für die Genomwanderung, um das gesamte Gen zu klonieren.
  • Das „Universal Genome Walker Kit" (Clonetech) wurde verwendet, um PsSTO1 zu klonieren. Ein μg von Genom-DNA vom Wildtyp CBS 6054 wurde verwendet, um fünf einzelne lineare Fragmenbibliotheken durch 5 stumpfendige Enzyme, die mit dem Set geliefert wurden, zu konstruieren. Die stumpfendigen, linearen Fragmente wurden mit den vom Hersteller bereitgestellten Adaptern verbunden. Gen-spezifische Primer wurden auf Grundlage der Sequenz der amplifizierten 293-bp-Region gestaltet, um „Wandern" in jede Richtung zu ermöglichen. Die zwei Adapter-spezifischen Primer (3 und 4) wurden vom Hersteller geliefert. Zum 3'-Ende-Wandern wurden die Primer 3 und 5 (Seq.-ID Nr. 3 bzw. Seq.-ID Nr. 5) verwendet, um die primären PCR-Produkte zu amplifizieren, während die Primer 4 und 6 (Seq.-ID Nr. 4 bzw. Seq.-ID Nr. 6) für die sekundären PCR verwendet wurden, wobei die erste Runde an PCR-Produkten als Matrizen dienten. Zum 5'-Ende-Wandern wurden die Primer 3 und 7 (Seq.-ID Nr. 3 bzw. Seq.-ID Nr. 7) für die primäre PCR verwendet, während die Primer 4 und 8 (Seq.-ID Nr. 4 bzw. Seq.-ID Nr. 8) für die zweite Runde verwendet wurden. Das „Advantage PCR Kit" (Clonetech) wurde bei allen PCR-Reaktionen für Wanderung verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie vom Handbuch der Hersteller empfohlen. Die sekundären PCR-Produkte wurden direkt in den PCR2.1-TOPO-Vektor zum DNA-Sequenzieren kloniert. Nach Erhalt der Sequenzen wurden die Primer 9 und 10 (Seq.-ID Nr. 9 bzw. Seq.-ID Nr. 10) verwendet, um ein 3-kb-PsSTO1-Fragment unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Strategene) zu amplifizieren. Dieses Fragment, das 1 kb von jeder flankierenden Region und der Codierregion enthielt, wurde direkt in den PCR-BluntII-TOPO-Vektor (Invitrogen) als pNQ30 kloniert. Dieser 3-kb-Klon wurde gänzlich als die letztlich hinterlegten Daten sequenziert.
  • E. Isolierung von mRNA und RT-PCR
  • Zellen von CBS 6054, gezüchtet unter gänzlich aeroben Bedingungen (OD600<2) auf YNB-Xylose (2 %), wurden verwendet, um Gesamt-RNA zu isolieren. Unter diesen Bedingungen wurde kein Ethanol gebildet (Shi et al., 1999). mRNA wurde unter Verwendung eines „Dynabeads mRNA Direct Kit" (Dynal) extrahiert. 100 μl Zellen wurden mit 1 ml Lysepuffer und Dynabead Oligo (dT)25 5 Minuten lang vermischt. Die mRNA wurde durch einen „Magnetic Separation Stand" (Promega) abgetrennt und zweimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Die mRNA wurde bei 65°C eluiert und bei –80°C zur späteren Verwendung gelagert. Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) wurde unter Verwendung eines „Super Script One-Step RT-PCR-Systems" (Life Technologies) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen betrug 50 μl, worin 0,3 μg mRNA, 0,2 μM von jedem Primer, 25 μl 2X Reaktionsgemisch und 1 μl Super-Script-RT/Taq-DNA-Polymerase-Gemisch enthalten waren. cDNA wurde bei 50°C 3 Minuten lang synthetisiert und bei 94°C 2 Minuten lang denaturiert. Die nRT-PCR wurde durch den Ablauf eines Programms durchgeführt, der sich aus 40 Zyklen zusammensetzte: 94°C 15 Sekunden lang, 55°C 30 Sekunden lang und 72°C 80 Sekunden lang. Die abschließende RT-PCR-Reaktion wurde durch 1 Zyklus bei 72°C von 10 Minuten abgeschlossen. Die Primer für RT-PCR von PsSTO1 waren Seq.-ID Nr. 11 und Seq.-ID Nr. 12.
  • F. Konstruktion der einzelnen sto1-Δ-Knockout-Färbung
  • Ein Gen-Ersetzungsverfahren, bestehend aus einem Verfahrensschritt, wurde verwendet, um das PsSTO1-Gen in FPL-UC7 (Lu et al., 1998) zu unterbrechen. Ein 1,4-kb-PsURA3-Fragment wurde aus pVY2 (Yang et al., 1994) unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase durch die Primer 13 und 14 (Seq.-ID Nr. 13 bzw. Seq.-ID Nr. 14) mit einer ClaI-Stelle an jedem Ende amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren dieselben, wie sie in Shi & Jeffries (1998) beschrieben wurden. Dieses Fragment wurde mit ClaI verdaut und in die ClaI-Stelle der PsSTO1-Codierregion in pNQ30 subkloniert, um pNQ31 zu bilden.
  • G. Hefetransformation
  • Die Unterbrechungskassette wurde von pNQ31 durch NdeI und EcoRI freigesetzt und verwendet, um FPL-UC7 zu transformieren. Diese Kassette wurde auch verwendet, um einen anderen P.-stipitis-Wirt, PLU5, zu transformieren, der zwei selektierbare Marker aufweist (Lu et al., 1998). REMI-Transformation (Synchez et al., 1998) wurde unter Verwendung des EZ-Transformations-Sets (Bio101) durchgeführt. Mutmaßliche sto1-Δ-Kolonien aus FPL-UC7 oder FPL-PLU5 wurden nach 2–3 Tagen in YNB-Glucose- (2 %) Minimalmedium ohne Uridin entnommen.
  • H. Screenen von mutmaßlichen sto1-Δ-Unterbrechern
  • Zwei μl der Hefezellen wurden unter Verwendung eines „Yeast Whole Cell Lysis Kit" (Bio101) bei 37°C 1 Stunde lang lysiert. Das resultierende Lysat wurde mit 200 μM dNTP, 10 μM von jedem Primer, 10X PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2 zu einem Volumen von 99 μl vermischt und bei 95°C 15 Minuten lang erhitzt. Fünf Einheiten von Taq-DNA-Polymerase (Roche) wurden dem Gemisch zugesetzt, und die PCR-Reaktion wurde mit 40 Zyklen unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95°C 1 Minute lang, 50°C 1 Minute lang und 72°C 1 Minute lang. Die PCR-Reaktion wurde mit einem 4-minütiger abschließender Verlängerung bei 72°C beendet. Die Primer 11 und 12 (Seq.-ID Nr. 11 und Seq.-ID Nr. 12) wurden verwendet, um die mutmaßlichen Unterbrecher zu screenen. Die einzelne Knockout-Färbung aus FPL-UC7 wurde als FPL-Shi31 bezeichnet, während die einzelne Knockout-Färbung aus FPL-PLU5 FPL-Shi41 genannt wurde.
  • I. Konstruktion einer doppelten Knockout-(sto1-Δ, cyc1-Δ) Färbung
  • Um eine doppelte Knockout-Färbung unter Verwendung von FPL-Shi41 zu erhalten, wurde eine neue PsCYC1-Unterbrechungskassette konstruiert. Eine PsLEU2-Kassette wurde durch die Primer 15 und 16 (Seq.-ID Nr. 15 bzw. Seq.-ID Nr. 16) amplifiziert, und das Fragment wurde in den BluntII-TOPO-Vektor subkloniert, um pNQ37 zu bilden. Eine 1-kb-5'-Flankierregion von PsCYC1 wurde durch die Primer 17 und 18 (Seq.-ID Nr. 17 bzw. Seq.-ID Nr. 18) mit einer BamHI-Stelle an jedem Ende amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit BamHI geschnitten und in die BamHI-Stelle von pNQ37 kloniert, um pNQ39 zu bilden. Eine 0,8-kb-3'-Flankierregion von PsCYC1 wurde durch die Primer 19 und 20 (Seq.-ID Nr. 19 bzw. Seq.-ID Nr. 20) mit einer XhoI-Stelle an jedem Ende amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit XhoI geschnitten und in die XhoI-Stelle von pNQ39 als pNQ41 kloniert. Die resultierende Unterbrechungskassette wurde durch NdeI und NcoI linearisiert und verwendet, um FPL-Shi41 zu transformieren. Die mutmaßlichen doppelten Knockout-Kolonien wurden in YNB-Glucose-Minimalmedium ohne Uridin und Leucin selektiert. die mutmaßlichen Unterbrechungskolonien wurden durch Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer 21 und 22 (Seq.-ID Nr. 21 bzw. Seq.-ID Nr. 22) gescreent.
  • J. Isolation von Mitochondrien und Proteinanalyse
  • P.-stipitis-Zellen wurden über Nacht in 25 ml Zucker-eingeschränktem Medium (3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt, g/l Xylose) in einem 125-ml-Kolben mit Prallflächen (Guvinden, 1995) gezüchtet. Der Kolben wurde bei 160 U/min bei 30°C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden 15 ml der Übernacht-Kultur verwendet, um 500 ml frisches Medium in einem 2-I-Kolben mit Prallflächen zu inokulieren. Die Kultur wurde bei 160 U/min bei 30°C 24 h lang geschüttelt. Mitochondrien von P. stripitis wurden mechanisch wie von Luttik et al. (1998) beschrieben oder durch das Saccharose-Gradienten-Ultra-Zentrifugationsverfahren (Defontaine et al., 1991; Querol & Barrio, 1990) isoliert. Für das mechanische Verfahren wurden 20 mg Zymolase 20T in 35 ml Puffer A verwendet, der 25 mM Kaliumphosphat, 1 mM MgCl2 und 1 mM EDTA (pH 7,5) enthielt. Beim Saccharose-Gradienten-Verfahren wurden die Zellen aus 1-Liter-Kulturen geerntet. Die Zellen wurden mit 0,5 mg/l Novozym 234 in 5 ml Lösung A, die 0,5 M Sorbit und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) enthielt, behandelt. Mitochondriales Protein wurde unter Verwendung von Glaskügelchen in einem Zellaufschluss-Puffer freigesetzt, der 100 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA und 5 mM β-Mercaptolethanol enthielt (Ciriacy, 1975). Nachdem es dreimal 1 Minute lang in einem Glasröhrchen verwirbelt worden war, wurde das Gemisch in ein neues Mikrozentrifugen-Röhrchen transferiert. Das Röhrchen wurde bei 16.000 g 2 Minuten lang zentrifugiert, und die oberste Schicht wurde in ein neues Mikrozentrifugen-Röhrchen übertragen. Die Proteinkonzentration wurde durch das BCA-Proteintestsystem (Pierce) bestimmt. 15 μg mitochondriales Protein wurden auf ein reduzierendes SDS-PAGE-Gel mit 10–20 % Tris-HCl-Gradienten (Biorad) geladen. Nach Elektrophorese (40 min bei 200 Volt) wurde das Protein auf eine Nylonmembran (Schleicher & Schuell) transferiert. Der Blot wurde zuerst mit 1:100-Verdünnung eines monoklonalen Maus-Antikörpers, der gegen die Sto von Sauromatum guttatum gezüchtet wurde (Elthon et al., 1989), hybridisiert, und anschließend wurde der Blot mit einem sekundären Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit einer alkalischen Phosphatase in einer Verdünnung von 1:5000 (Promega), kreuzreagiert. Die Farbe wurde mittels des NBT/BCIP-Systems (Promega) entwickelt.
  • K. Expression von PsSTO1 in S. cerevisiae
  • Um das PsSTO1-Gen in S. cerevisiae zu exprimieren, wurde die Codierregion unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase aus genomischer CBS-6054-DNA amplifiziert. Die Primer 23 und 24 (Seq.-ID Nr. 23 bzw. Seq.-ID Nr. 24) wurden verwendet, die eine XhoI-Stelle an jedem Ende enthielten. Die PCR-Bedingungen wurden in Shi & Jeffries (1998) beschrieben. Das amplifizierte Fragment wurde mit XhoI verdaut und in die SaII-Stelle eines Expressionsvektors, pYPR2831 (Horiuchi et al., 1990), unter Verwendung eines „Rapid DNA Ligation Kit" (Roche) kloniert. So wurde die PsSTO1 durch den konstitutiven Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase-(GAPDH-) Promotor aus S. cerevisiae vorangetrieben und mit dem GAPDH-Terminator beendet. Der resultierende Klon wurde als pNQ32 bezeichnet, und 5 μg der Plasmid-DNA wurden verwendet, um zwei S.-cerevisiae-Stämme, 697α (ein Geschenk von Dr. Michael Culbertson, University of Wisconsin, Madison, WI) und B06748 (Holzschu et al., 1989), zu transformieren. Der leere Vektor ohne die PsSTO1 wurde auch verwendet, um sie als Kontrolle zu transformieren. Hefetransformationen wurden unter Verwendung des „EZ-Transformation Kit" (Bio101) durchgeführt. Notwendige Aminosäuren wurden, sofern für das Wachstum von Kontrollstämmen erforderlich, zugesetzt.
  • L. Analyse von S. cerevisiae, transformiert mit PsSTO1
  • Die Primer 13 und 14 (Seq.-ID Nr. 13 und Seq.-ID Nr. 14) wurden verwendet, um die Transformanten, die die PsSTO1-Expressionskassette trugen, zu bestätigen. Transformanten, die die Expressionskassette trugen, wurden für weitere Studien verwendet. Für die 679α-Transformanten, die das pNQ32- oder pYPR2831-Plasmid trugen, wurden Zellen in 500 ml frischem YNBUP-Medium gezüchtet, das 8 % Glucose enthielt. Die Zellen wurden in einem 1-I-Kolben gezüchtet, und der Kolben wurde bei 30°C bei 140 U/min 2 Tage lang geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet und zweimal mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 5 mM Magnesiumchlorid enthielt, gewaschen und in 4,5 ml desselben Puffers resuspendiert. Die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme wurde wie zuvor beschrieben gemessen, und das Testsubstrat war 5 mM Ethanol.
  • An den B06748-Transformanten, die pNQ32- oder pYPR2831-Plasmid trugen, wurde anstelle der Messung von Respiration eine Fermentationsstudie durchgeführt. Die Stämme wurden zuerst in 50 ml frischem YNBUP-Medium, das 2 % Glucose enthielt, drei Tage lang bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden bei 140 U/min in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet und mit sterilem Wasser zweimal gewaschen. Dann wurden die 3-Tages-Zellen in frischem YNBUP-Medium bei 30°C in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben kultiviert, der bei 140 U/min geschüttelt wurde.
  • M. Bestimmung des Trockengewichts und HPLC-Analyse
  • Zellen wurden bei 16.000 g 5 Minuten lang zentrifugiert, mit Wasser dreimal gewaschen und in einem 105-°C-Ofen über Nacht getrocknet. Zumindest 2 bis 3 Replikationsproben wurden verwendet, um das Trockengewicht zu bestimmen. Eine Optische-Dichte-(O.D.-) Einheit bei λ=600 nm entspricht 0,22 g FPL-UC7-Zellen und FPL-Shi31-Zellen (Trockengewicht) pro Liter oder 0,2 g FPL-Shi21-Zellen (Trockengewicht) pro Liter. Zur Analyse von Fermentations-Endprodukten wurden täglich Proben entnommen, und die Proben wurden bei 16.000 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Überstandslösung wurde fünffach verdünnt und Hochleistungsflüssigchromatographie-(HPLC-) Analyse unter Verwendung einer ICSep-ION-300-Säule (CETAC Technologies) unterzogen. Die Säule wurde bei 60°C mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/min unter Verwendung von 0,008 M Schwefelsäure als Lösungsmittel eingesetzt. Glucose, Xylose, Xylitol und Ethanol wurden bei 16,3 min, 17,5 min, 22,8 min bzw. 34,8 min eluiert.
  • N. Cytochrom-Spektren-Studien
  • Stämme von P. stipitis wurden in Hefeextraktmedium, das 2 % Xylose, Glucose oder Ethanol als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, gezüchtet. Die Hefezellen wurden an der Oberfläche einer Platte drei Tage lang als dünne „Linien" gezüchtet und durch ein Spektroskop, wie von Sherman et al. (1974) beschrieben, untersucht. Spektralphotometrische Aufzeichnungen bei geringer Temperatur (–196°C) von FPL-UC7 und FPL-Shi31 wurden mit ganzen Zellen durchgeführt. Die Stämme wurden auf 1 Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Xylose bei 30°C drei Tage lang gezüchtet. Die Absorptionsspektren wurden wie zuvor beschrieben aufgezeichnet (Hickey et al., 1991).
  • O. Studien zum aeroben Wachstum
  • P.-stipitis-Zellen wurden in 25 ml YNBUP-Medium gezüchtet, das entweder 2 % Glucose oder 2 % Xylose in einem 125-ml-Kolben mit Prallflächen enthielt. Der Kolben wurde bei 140 U/min bei 30°C 3 Tage lang geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet und mit sterilem Wasser zweimal gewaschen. Die Kultur wurde anschließend verwendet, um 25 ml frisches YNBUP-Medium zu inokulieren, das entweder 2 % Glycerin oder 2 % Ethanol in einem 125-ml-Kolben mit Prallflächen enthielt. Der Kolben wurde bei 140 U/min bei 30°C geschüttelt. Die anfängliche Zelldichte betrug 0,05 g/l. Proben wurden alle 4 Stunden entnommen, um das Wachstum durch Messen der optischen Dichte bei λ=600 zu überwachen.
  • P. Fermentationsversuch im Schüttelkolben
  • Stämme von FPL-Shi31 und FPL-UC7 wurden 2 Tage lang unter Sauerstoffeingeschränkten Bedingungen (Shi et al., 1999) in YNBUP-Medium, das 2 % Glucose oder Xylose enthielt, gezüchtet. Zellen wurden geerntet und zweimal mit sterilem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden anschließend verwendet, um 50 ml frisches YNBUP-Medium zu inokulieren, das 8,4 % Xylose oder 9,4 % Glucose in einem 125-ml-Erlenmeyerkolben enthielt. Die anfängliche Zelldichte betrug etwa 0,9 g/l. Die Kulturen wurden bei 20°C unter Schütteln bei 100 U/min gezüchtet. Proben wurden täglich entnommen und mittels HPLC wie zuvor beschrieben analysiert.
  • Q. Respirationsmessung
  • P.-stipitis-Stämme wurden über Nacht in YNBUP-Xylose- (2 %) Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet. Anschließend wurde die Hälfte der über Nacht gezüchteten Zellen in 25 ml frisches Medium transferiert, um 16 Stunden lang zu MId-Log- Phase unter denselben Bedingungen zu wachsen. Die Zellen wurden geerntet und in einem Testpuffer, der 20 mM Kaliumphosphat (pH 7,0) und 5 mM Magnesiumchlorid enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden in 500 μl desselben Puffers wie für die Tests resuspendiert. Sauerstoffaufnahme wurde durch Verwendung einer Elektrode vom Clark-Typ (Yellow Spring Instrument) gemessen. Der Test wurde in einem Testpuffer, der 20 mM Kaliumphosphat, 5 mM Magnesiumchlorid plus Xylose oder Glucose (2 %) als Substrat enthielt, bei 30°C durchgeführt. Der Testpuffer wurde vor dem Experiment mit Luft gesättigt. 10 bis 15 μl Zellen wurden in die Testkammer injiziert, und das gesamte Reaktionsvolumen betrug 2 ml. Antimycin A, SHAM oder Rotenon wurden in Dimethylformamid aufgelöst, während Kaliumcyanid in Wasser aufgelöst wurde. Hemmlösung wurde nach Zugabe der Zellen in die Kammer injiziert.
  • R. Studien zur Sauerstoffverwertungs-Kinetik
  • P.-stipitis-Stämme wurden unter aeroben Bedingungen in 25 ml YNBUP-Medium in einem 125-ml-Kolben mit Prallflächen, der 2 % Xylose enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden bei 140 U/min bei 30°C über Nacht geschüttelt. Unter diesen Wachstumsbedingungen wurde kein Ethanol gebildet. Die Hälfte der Übernacht-Kulturen wurde anschließend verwendet, um 25 ml desselben Mediums zu inokulieren, und die Zellen wurden unter denselben Bedingungen 12 h lang kultiviert. Die Zellen wurden dann geerntet, zweimal mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) plus 5 mM Magnesiumchlorid gewaschen und in 1,2 ml desselben Puffers resuspendiert. Die eine Hälfte der Zellen wurde zur Trockengewichtsbestimmung verwendet, während die andere Hälfte zur Messung der Sauerstoffaufnahme herangezogen wurde. Kurven des Sauerstoffverbrauchs wurden durch Injizieren der Zellen in einen Testpuffer bei 30°C erhalten, der 20 mM Kaliumphosphat, 5 mM Magnesiumchlorid plus 2 % Xylose als Substrat enthielt. Die Sauerstoffkurve wurde von 100 % bis 0 % Luft aufgezeichnet. 30 bis 60 μl Zellen wurden zu dieser Messung verwendet. Der Testpuffer war vor dem Experiment mit Luft gesättigt worden. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff bei 30°C betrug 237 μM. Die Daten wurden unter Verwendung des Programms Origin (Microcal Software) graphisch dargestellt.
  • II. Ergebnisse
  • A. Klonieren des PsSTO1-Gens
  • Um PsSTO1 aus P. stipitis zu klonieren, ordneten die Erfinder die erhältlichen Pilz-Sto-Proteinsequenzen vergleichend an und fanden heraus, dass sie in zwei Regionen, nämlich IFLES(I/V)AGVPGMV und HRFVGYLEEEAV, hoch konserviert sind. Die erste Region enthält eine mutmaßliche Ubichinol-Bindungsstelle (Berthold, 1998; Andersson & Nordlund, 1999), während die zweite Region ein hoch konserviertes Ionen-Bindungsmotiv aufweist (Vanlerberghe & McIntosh, 1997). Obwohl diese zwei Segmente hoch konserviert sind, können die Organismen und deren Codonverwendung signifikant auseinander gegangen sein. Die Erfinder entwickelten zuerst eine Codonpräferenz-Tabelle für P. stipitis unter Verwendung von 19 klonierten Genen (erhalten durch Einsatz der Datenbank: http://www.dna.affrc.go.jp/~nkamura/). Anschließend amplifizierten sie eine 293-bp-Region, die im Zentrum von PsSTO1 aus der genomischen Wildtyp-DNA von CBS 6054 liegt. Dieses Segment zeigte 70 % Ähnlichkeit in Bezug auf DNA mit den STO-Genen aus zwei anderen Hefespezies, Pichia anomala und Candida albicans. Anschließend wurde es als Ausgangspunkt für Genomwanderung verwendet, um das gesamte PsSTO1-Gen zu klonieren.
  • Für die Wanderungsstrategie wurden fünf lineare Fragmentbibliotheken wie in den Verfahren beschrieben konstruiert. Für das 5'-Ende-Wandern wurden zwei sich überlappende PsSTO1-Fragmente (1,7 kb und 4 kb) aus den PvuII- und StuI-Bibliotheken erhalten. Für das 3'-Ende-Wandern wurden fünf verschiedene Längen sich überlappender PsSTO1-Fragmente aus den fünf Bibliotheken erhalten. Das Sequenzieren aller Fragmente ermöglichte das Verschmelzen der Codierregion aus 1071 bp und etwa 1,0 kb jeweils für die 5'- und die 3'-flankierenden Regionen.
  • B. Die biochemischen Eigenschaften des PsSto-Proteins
  • Der offene Leseraster von PsSTO1 kodiert für 357 Aminosäuren. Das abgeleitete Molekulargewicht für das vorhergesagte Protein beträgt etwa 41.326 Da. Es weist einen berechneten pl von 9,1 auf. Diese Werte sind mit Werten vergleichbar, die für Sto-Proteine aus anderen Hefespezies und Pilzen gefunden wurden (Huk & Kang, 1999; Sajoko et al., 1993). Ein Hydrophobie-Plot des PsSto-Proteins wies zwei transmembrane Helices auf, die allen bisher untersuchten Sto-Proteinen ähnlich sind. Eine abgeleitete Spaltungsstelle des Signalpeptids wird als die 27. Aminosäure nach dem Methion-Startcodon vorhergesagt.
  • C. Mutmaßliche cis-wirkende 5'-Elemente
  • Eine Untersuchung in der 5'-untranslatierten Region (UTR) für cis-wirkende Elemente zeigte zwei mutmaßliche TATA-Boxen bei –86 bis 79 und –194 bis –187 auf. Andere mutmaßliche Bindungsstellen umfassten ein 25-bp-AT-Segment der mitochondrialen Kontrollregion (–158 bis –133), einen herkömmlichen Transkriptionsaktivator, der auf Stresssignale reagiert, AP-1 (–689 bis –683), eine Adh-UAS2-Sequenz (–666 bis –659), einen Hitzeschockfaktor (hsp 70) und ein Stickstoff-regulierendes Element (–756 bis –743). Diese Beobachtungen gaben an, dass das PsSTO1-Gen mittels verschiedener umgebender Signale reguliert werden könnte.
  • D. PsSTO1 enthält keine Introns
  • Da Introns in mehreren Pilz-STO-Genen zu finden sind, beschlossen die Erfinder zu untersuchen, ob PsSTO1 Introns enthält. RT-PCR wurde an Wildtyp-CBS-6054-Zellen durchgeführt, die auf YNB-Xylose unter vollaeroben Bedingungen gezüchtet wurden. Eine einzelne 1,1-kb-Bande des RT-PCR-Produkts, das der Größe nach dem genomischen PCR-Produkt von PsSTO1 ähnlich war, wurde beobachtet. Komplettes Sequenzieren des klonierten RT-PCR-Produkts zeigte, dass kein Intron im PsSTO1-Gen vorhanden war.
  • E. Phylogenetische Studien der Pilz-Sto-Proteine
  • Ein phylogenetischer Stammbaum, der unter Verwendung von acht Sto-Proteinen aus Hefe und Fadenpilzen erstellt wurde, zeigte, dass sie sich in zwei getrennte Zweige aufteilten (1). PsSto zeigte 53 % Identität zu diesen Hefe- und Pilzgegenstücken. PsSTO1 wies allerdings 33 % Identität zu drei anderen Hefe-STO-Genen in Bezug auf DNA und 64 % Identität in Bezug auf Aminosäuren auf. Die PsSto ist am engsten mit der Sto von P. anomala verwandt.
  • F. Konstruktion einer sto1-Δ-Mutante in P. stipitis
  • Die Unterbrechung des STO1-Gens in P. stipitis hatte zwei Zwecke. Erstens war es seitens der Erfinder notwendig sicherzustellen, dass die klonierte Sequenz für Sto kodiert. Zweitens hofften sie, eine Mutante mit einem geschädigten STO-Stoffwechselweg zu erhalten, sodass die Elektronen nur durch die Cytochrom-c-Oxidase passieren könnten. Diese Mutante würde verwendet werden, um sie mit dem Cytochrom-c-Unterbrechungsmittel, das bereits zuvor erhalten wurde, zu vergleichen, um die physiologischen Rollen alternativer Respiration in P. stipitis zu erklären. Um dies zu tun, wurde eine Genersetzung in einem Arbeitsschritt durch Insertieren des PsURA3-Gens in der Mitte der PsSTO1-Codierregion in FPL-UC7 verwendet (2). Die mutmaßlichen Unterbrechungsmittel von sto1-Δ wurden durch Kolonien-PCR gescreent. Sie alle wiesen eine einzelne 2,4-kb-Bande auf, die der Größe der Codierregion von PsSTO1 plus dem insertierten PsURA3-Gen entsprachen. Der Elternstamm, FPL-UC7, wies nur eine 1,1-kb-Codierregionsbande auf.
  • Eine doppelte Mutante (cyc1-Δ, sto1-Δ) wurde in einem P.-stipitis-Wirtsstamm, FPL-PLU5 (Lu et al., 1998), der zwei selektierbare Marker aufweist, zu bilden versucht. Doch die mutmaßlichen doppelten Knockout-Kolonien waren als Punktziele klein. Sie waren nach der Übertragung in das selektive Medium ohne Uridin und Leucin nicht mehr lebensfähig. Daher schlossen die Erfinder, dass zumindest einer der Respirati ons-Stoffwechselwege vorhanden sein muss, um Zellwachstum unter den zur Zellkultivierung verwendeten Bedingungen zu unterstützen.
  • G. Studien zur Respirationshemmung
  • Ein sto1Δ-Stamm wurde als FPL-Shi31 bezeichnet, und er wurde durch Messen von Respiration in Gegenwart von Inhibitor Antimycin A oder SHAM bestätigt. SHAM blockiert Sto möglicherweise durch Stören der Ubichinol-Bindungsstelle (Berthold, 1998). Beim Zusetzen von 4 mM SHAM zu den sto1-Δ-Zellen, die davor auf YNB-Xylose (2 %) gezüchtet wurden, zeigte die Respirationsspur keinerlei Veränderung. Dies ließ darauf schließen, dass die SHAM-empfindliche Respiration in dieser Mutante aufgrund des Verlusts des Strukturgens völlig vermindert war. Als andererseits 10 μM Antimycin A, ein Inhibitor, der Elektronentransfer vom Cytochrom-bc1-Komplex zu Cytochrom c blockiert, den Zellen der sto1-Δ-Mutante zugesetzt wurden, viel die Respiration auf null. Diese Beobachtung ließ darauf schließen, dass die Mutante nicht in der Lage war, jegliche Respiration aufrechtzuerhalten, wenn der CYT-Stoffwechselweg blockiert war. Umgekehrt zeigte FPL-Shi21 (cyc1-Δ) Unempfindlichkeit gegenüber Antimycin A, und Respiration wurde durch SHAM völlig blockiert.
  • H. Keine anderen Sto-Isoformen wurden in den sto1-Δ-Stamm induziert
  • Um zu bestimmen, ob irgendwelche Isoformen von Sto in der sto1-Δ-Mutante (FPL-Shi31) vorhanden waren, isolierten die Erfinder mitochondriale Proteine aus vier Stämmen von P. stipitis. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen Sto aus Savromatum guttatum (Voodoo-Lilie) gezüchtet wurde, wurde verwendet, um mit der PsSto zu kreuzreagieren. In den Proben von CBS 6054, FPL-UC7 und FPL-Shi21 wurde nur eine einzelne 39-kd-Bande beobachtet, die der Größe reifer Sto-Proteine aus anderen Hefespezies entsprach. Diese Bande fehlte jedoch in der FPL-Shi31-Probe, in der die PsSTO1 unterbrochen war. Dieses Resultat ließ darauf schließen, dass keine Isoformen von Sto in FPL-Shi31 induziert sind. So wird Sto in P. stipitis FPL-UC7 durch ein einzelnes Gen kodiert, das jenen aus Untersuchungen von P. anomala (Sakajo et al., 1993) und des Reisschädlings Magnaporthe grisea (Yukioka et al., 1998) ähnlich ist. Diese Ergebnisse bestätigten auch, dass die Erfinder eine Mutante erhalten hatten, in der die STO-Respiration völlig blockiert war. Daher ist Cytochrom-c-Oxidase die einzige funktionelle terminale Oxidase in der sto1-Δ-Mutante.
  • I. Studie zu Cytochromspektren im sto1-Δ-Stamm
  • Da die Komponenten des STO-Stoffwechselweges in P. stipitis nicht eindeutig waren, beschlossen die Erfinder, den Cytochromgehalt in der sto1-Δ-Mutante zu untersuchen, um zu sehen, ob etwaige Veränderungen in der sto1-Δ-Mutante auftraten. Zellen der sto1-Δ-Mutante und der Elternstamm wurden in drei Medien kultiviert. In den anfänglichen Studien schien das Cytochrom b, c, c1 und a.a3 aus der Mutante bei spektromikroskopischen Untersuchungen normale Konzentrationen aufzuweisen. Auch wurden darauf folgende Aufzeichnungen bei niedrigen Temperaturen sowohl der Mutante als auch Elternzellen, die im Xylosemedium gezüchtet worden waren, durchgeführt. Cytochrome b, c und c1 aus der Mutante zeigten keine signifikanten Unterschiede zu jenen, die im Elternstamm beobachtet wurden. Dies wies darauf hin, dass Deletion von PsSTO1 in P. stipitis die Konzentrationen von Cytochromen b, c und c1 in der Zelle nicht verändert. Der a.a3-Peak in der Mutante war geringfügig höher als jener der Elternzelle. Der geringe Anstieg von a.a3 ließ darauf schließen, dass die Deletion von Sto die Konzentration an verbleibender Cytochrom-c-Oxidase (a.a3) beeinflussen könnte. Daraus schlossen die Erfinder, dass der STO-Stoffwechselweg keine Cytochrome als funktionelle Komponenten enthält.
  • J. Einführen von PsSTO1 in S.-cerevisiae-Stämme
  • Die Erfinder exprimierten PsSTO1 in S. cerevisiae aus zwei Gründen. Erstens wollten sie bestimmen, ob PsSto einer Crabtree-positiven Hefe, S. cerevisiae, die keinen STO-Stoffwechselweg aufweist, Cyanid-resistente Respiration verleihen konnte. Zweitens wollten sie untersuchen, wie PsSto vor einem Crabtree-positiven, physiologischen Hintergrund funktionierte. Das PsSTO1-Gen wurde in zwei verschiedene S.-cerevisiae-Stämme, 679α und B06748, eingeführt. 679α ist ein Stamm, der normale Respirationskapazität aufweist (Culbertson, persönliche Mitteilung). Durch Exprimieren von PsSTO1 in diesem Stamm konnten die Erfinder die Wirkung auf seine Respirationskapazität nach Erhalt einer zusätzlichen terminalen Oxidase bewerten. Beide Oxidasen würden Elektronen von den Rotenon-unempfindlichen NADH-Dehydrogenasen annehmen. Andererseits ist B06748 aufgrund der Deletion von ScCYC1 und ScCYC7, die für die zwei Isoformen des Cytochroms c kodieren, eine Cytochrom-c-Nullmutante (Holzschu et al., 1987). Wie bereits berichtet kann das Deletieren von Cytochrom c in S. cerevisiae und anderen Hefespezies zu gleichzeitigem Verschwinden von Cytochrom a.a3 (Cox) führen (Bottorff et al., 1991; Pearce, 1995; Shi et al., 1999). Daher ist es nicht in der Lage, Elektronen aus der Cytochrom-Respirationskette anzunehmen. Aus diesem Grund ist B06748 langsam im Wachstum und verwendet Fermentation, um Energie zu erzeugen. Vor diesem genetischen Hintergrundwissen konnten die Erfinder die Wirkung der Verwendung von Sto als die einzige terminale Oxidase in einer Crabtree-positiven Hefe bewerten. Ein konstitutiver ScGAPDH-Promotor wurde verwendet, um das PsSTO1-Gen in beiden Stämmen anzutreiben (3.11A).
  • Genomische PCR wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Transformanten entweder das pNQ32-Plasmid oder den leeren Vektor, pYPR2831, in 679α oder B06748 tragen (Daten nicht dargestellt). Für die 679α-Transformanten maßen die Erfinder Sauerstoffverbrauchsraten von den Zellen, die unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Glucose gezüchtet worden waren. Experimente zur Sauerstoffaufnahme zeigten, dass die Respirationsrate von 679α (pNQ32) 63 % höher liegt als dies für die Kontrolle aufgezeichnet wurde. Dies wies darauf hin, dass eingeführte Sto zu niedrigerer Respirationsfähigkeit in transformierten Stämmen beitrug. Die Beobachtungen der Erfinder deckten sich mit jenen Berichten im Bezug auf funktionelle Expression von Sto von Candida albicans in S. cerevisiae (Huh & Kang, 1999) und Sto von S. guttatum in Schizosaccharomyces pombe (1996). Da die Sto gegenüber Cyanid, einem Inhibitor, der die Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase blockiert, resistent ist, maßen die Erfinder die Respirationsrate auch in Gegenwart von 1 mM KCN.
  • Durch Zusetzen von KCN zu den Zellen war der 679α- (pNQ32-) Stamm, der PsSTO1 enthielt, in der Lage, etwa viermal höhere, Cyanid-resistente Respiration aufzuweisen als die Kontrolle. Die Erfinder beobachteten ein ähnliches Ergebnis, wenn 10 μM Antimycin A als Inhibitor verwendet wurde (Daten nicht dargestellt).
  • Für die B06748-Transformanten wurde ein Respiro-Fermentationsversuch unter Sauerstoff-eingeschränkten Bedingungen anstelle der Messungen zum Respirationsverbrauch durchgeführt. Die verwendete Wachstumsbedingung war, dass die Respiration von der eingeführten PsSto induziert wurde. Im Versuch zeigte der transformierte, PsSTO1 enthaltende Stamm im Vergleich zum Kontrollstamm bezüglich des Zellwachstums keinen signifikanten Unterschied (3A). Dies wies darauf hin, dass Sto nicht phosphorylierend ist. Der PsSTO1 enthaltende, transformierte Stamm wies jedoch eine langsamere Glucose-Verwertungsgeschwindigkeit (3B) und eine geringere Ethanol-Produktionsgeschwindigkeit (3C) auf als der Kontrollstamm. Diese Beobachtungen ließen darauf schließen, dass die eingeführte PsSto Elektronentransport als eine terminale Oxidase vor dem B06748-Hintergrund unterstützen konnte. In Anbetracht der gesamten Daten aus diesem Abschnitt schlossen die Erfinder, dass das Einführen von PsSTO1 in S. cerevisiae einen funktionellen, cyanidresistenten Stoffwechselweg verleihen könnte.
  • K. Ergebnisse zu aerobem Wachstum
  • Die sto1-Δ-Mutante (FPL-Shi31) wurde anschließend auf ihre Wachstumsfähigkeiten in nicht-fermentativen Kohlenstoffquellen getestet. Der Elternstamm, FPL-UC7, und die cyc1-Δ-Mutante (FPL-Shi21) wurden als Kontrollen verwendet. Die sto1-Δ-Mutante zeigte keinen signifikanten Unterschied zum Elternstamm, wenn sie auf Glycerin als Kohlenstoffquelle kultiviert wurde. Dennoch wies sie höhere Zelldichte im Ethanolmedium auf als der Elternstamm, was darauf schließen ließ, dass dieser Stamm Ethanol rascher oxidieren konnte als der Elternstamm. Umgekehrt zeigte die cyc1-Δ-Mutante (FPL-Shi21) während des 16stündigen Experiments kein Wachstum auf Glycerin und Ethanol, was mit den früheren Beobachtungen übereinstimmte (Shi et al., 1999).
  • L. Ergebnisse zu Respiro-Fermentation im Schüttelkolben
  • Um die Auswirkungen eines Verlusts des STO-Stoffwechselweges auf die Respiro-Fermentations-Fähigkeit der Mutante auszuwerten, wurde der sto1-Δ-Stamm auf sein Wachstum und seine Ethanolproduktionsgeschwindigkeit in Medium, das 8,4 Xylose oder 9,4 % Glucose enthielt, getestet. Im Xylosemedium zeigte das Wachstum der Mutante keinen signifikanten Unterschied zum Elternstamm in den ersten fünf Tagen. Die Mutante hörte nach Tag Nr. 5 auf zu wachsen, während der Elternstamm bis zum Abschluss des Versuchs weiter wuchs. Die volumetrische Ethanol-Produktionsgeschwindigkeit vom sto1-Δ-Stamm auf Xylose lag etwa 20 % über jener des Elternstamms. Die Mutante schien also auch Xylose rascher zu verwenden als der Elternstamm (4A und 4B). Die Mutante akkumulierte keine signifikanten Mengen an Polyolen. Interessanterweise zeigte die Mutante keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Zellausbeute, der Ethanolproduktion oder der Zuckerverbrauchsgeschwindigkeit im Vergleich zum Elternstamm, wenn sie auf Glucose gezüchtet wurde. In einem separaten Versuch zum Testen der Ethanol-Reoxidationsgeschwindigkeit des sto1-Δ-Stamms und des cyc1-Δ-Stamms wurden Zellen aus zwei Stämmen in YP-Medium, das 2 % Xylose enthielt, gezüchtet. Beide Stämme konsumierten den gesamten vorhandenen Zucker in 36 Stunden. Anschließend begannen sie, Ethanol zu verwenden, um das Wachstum zu unterstützen. Die Ethanol-Reassimilierungsgeschwindigkeit des sto1-Δ-Stamms war höher als jene des cyc1-Δ-Stamms oder des Elternstamms.
  • M. Respirationsgeschwindigkeit von sto1-Δ-Stamm
  • Um zu testen, ob die Deletion von Sto in sto1-Δ-Stamm seine Respirationsfähigkeit beeinflussen würde, wurden die Sauerstoff-Verbrauchsgeschwindigkeiten der Mutante, die in Xylose- und Glucose-Medium gezüchtet wurde, gemessen. Respirationsge schwindigkeiten des Elternstamms und des cyc1-Δ-Stamms wurden auch zu Vergleichszwecken gemessen. Für auf Xylose gezüchtete Zellen wurde die Respirationsgeschwindigkeit unter Verwendung von 2 % Xylose als Testsubstrat gemessen. Die auf Xylose gezüchteten Zellen der sto1-Δ-Mutante zeigten eine um etwa 21 % höhere Respirationsgeschwindigkeit als der Elternstamm. Die cyc1-Δ-Mutante zeigte jedoch eine doppelt so hohe Respirationsgeschwindigkeit wie der Elternstamm. Für auf Glucose gezüchtete Zellen wurde die Respirationsgeschwindigkeit unter Verwendung von 2 % Glucose als Testsubstrat gemessen. Die auf Glucose gezüchteten Zellen der sto1-Δ-Mutante zeigten im Vergleich zum Elternstamm keinen signifikanten Unterschied bezüglich des Sauerstoffverbrauchs. Die cyc1-Δ-Mutante wies im Vergleich zum Elternstamm eine dreifache Respirationsgeschwindigkeit auf. Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass ein Verlust des Respirations-Stoffwechselweges die Aktivität des anderen Systems beeinflussen kann. Diese Wirkung ist in der cyc1-Δ-Mutante stärker, da sie den CYT-Stoffwechselweg verliert, der hauptsächlich für die Energieerzeugung zuständig ist.
  • N. Messung der Sauerstoff-Verwertungskinetik
  • Aufgrund des vorrangigen Interesses der Erfinder, den Sauerstoffbedarf für Xyloseverwertung in P. stipitis zu verstehen, verglichen sie die Sauerstoff-Affinitätskonstante von Sto und Cox. Im Rahmen dieser Studie bildeten die Erfinder zwei P.-stipitis-Mutanten, cyc1-Δ(FPL-Shi21) und sto1-Δ(FPL-Shi31), wovon beide eine einzelne funktionelle terminale Oxidase aufwiesen. Diese Mutanten wurden von derselben genetischen Grundlage erhalten, sodass andere Faktoren ähnlich waren. Sauerstoffaffinität von Sto und Cox wurden unter Verwendung von Xylose als Substrat untersucht.
  • In physiologischen Studien können die Km- (O2) Werte aus dem nicht-linearen Bereich einer graphischen Sauerstoffkurve berechnet werden. Diese liegt zwischen der linearen Region, in der Sauerstoff das Aufnahmesystem sättigt, und 0 % Sauerstoff, wo der Sauerstoffverbrauch endet. Dies kann auf Gesamtzellniveau gemessen wer den (Rice & Hempfling, 1978; Dubreucq et al., 1990). In diesem nicht-linearen Bereich können Sauerstoff-Aufnahmegeschwindigkeiten (V) bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen (S) abgeleitet werden. Unter Verwendung von V als eine Funktion der Sauerstoffkonzentration, bei der die Tangente gezogen wird, kann der Km-Wert aus einer doppelt-reziproken graphischen Darstellung der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit gegenüber Sauerstoffkonzentrationen abgeleitet werden. Gemessene Vmax entspricht in diesem Fall der Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs jedes einzelnen Stoffwechselweges, der seiner theoretischen maximalen Kapazität entspricht. Der abgeleitete 1/Km-Wert spiegelt die Affinität der Oxidase zu Sauerstoff wider. In diesem Experiment stellt die Affinitätskonstante die Affinität der Oxidase als Elektronenspender in Bezug auf Sauerstoff dar, der als Elektronenakzeptor verwendet wird.
  • In dieser Studie wurden auf Xylose gezüchtete Zellen von FPL-Shi21 und FPL-Shi31 verwendet. Erhalten wurden die abgeleiteten Km- und Vmax-Werte. Unter den von den Erfindern vorgegebenen Wachstumsbedingungen war der abgeleitete Km von Cox 1,6-mal höher als jener von Sto, was darauf hinweist, dass Sto höhere Affinität zu Sauerstoff aufweist als Cox. Der Km von PsSto stimmt mit jenen überein, die bereits davor für Pflanzen-Mitochondrien bestimmt wurden (0,5–2 μM, Ribas-Carbo et al., 1994)
  • O. P. stipitis verwendet verschiedene, Protonen-translozierende Stellen während Xylose- oder Glucose-Stoffwechsel
  • Da bestimmte Crabtree-negative Hefespezies verschiedene NADH-Oxidationssysteme enthalten, beschlossen die Erfinder zu testen, ob die Rotenon-empfindlichen oder die Rotenon-unempfindlichen NADH-Dehydrogenasen in P. stipitis vorhanden sind. Diese Studie ist von großer Bedeutung, da sie Informationen bezüglich der ersten Komponente des Respirationssystems in P. stipitis bereitstellt. Diese Information kann auch eine Hilfe zum Verständnis der funktionellen Organisation des STO-Stoffwechselweges darstellen. Der NADH-Dehydrogenase-Komplex I (Komplex I oder Stelle I) ist empfindlich auf Rotenon, während die inneren und äußeren NADH-Dehydrogenasen gegen Rotenon resistent sind. Innere und äußere NADH-Dehydrogenase können über ihre unterschiedlichen Temperaturabhängigkeiten unterschieden werden (Marx & Brinkman, 1978).
  • Im ersten Versuch maßen die Erfinder die Respiration von Zellen vom Wildtyp CBS 6054 P. stipitis, die unter aeroben Bedingungen auf Xylose oder Glucose gezüchtet worden waren, in Gegenwart von Rotenon. Wurden 0,1 mM Rotenon den auf Glucose gezüchteten Zellen von CBS 6054 injiziert, so starben die Zellen und schwammen innerhalb einer Minute nach Injektion in der Kammer. Dies ließ darauf schließen, dass diese Zellen auf Rotenon empfindlich waren und keine Art von Respiration aufrechterhalten konnten. Dahingegen wurde, wenn 0,1 mM Rotenon in die auf Xylose gezüchteten Zellen von CBS 6054 injiziert wurden, die Respiration aufrechterhalten, und die Geschwindigkeit war jener ähnlich, die bei unbehandelten Zellen nachgewiesen wurde (Tabelle 4). Rotenon-unempfindliche NADH-Dehydrogenasen sind in den auf Xylose gezüchteten Zellen vorhanden, was die Zellen in die Lage versetzt, Stelle I zu umgehen. Ein weiterer Versuch wurde an den auf Xylose und Glucose gezüchteten Zellen in vier P.-stipitis-Stämmen durchgeführt. Auf Xylose gezüchtete Zellen vom Wildtyp CBS 6054 und der Elternstamm, FPL-UC7, zeigten sich gegenüber Rotenon unempfindlich. Die auf Xylose gezüchteten Zellen der sto1-Δ-Mutante und der cyc1-Δ-Mutante waren jedoch Rotenon-empfindlich. Andererseits waren die auf Glucose gezüchteten Zellen der vier Stämme Rotenon-empfindlich (Tabelle 5). Diese Ergebnisse ließen darauf schließen, dass es möglicherweise einen grundlegenden Unterschied bezüglich der Anzahl der Proton-translozierenden Stellen gibt, die während des Xylose- und Glucose-Stoffwechsels in den Zellen vorhanden sind.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beispielhaft dargestellten Ausführungsformen beschränkt.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (17)

  1. Isoliertes Polynucleotid, bestehend aus einer Sequenz, die für die SHAM-(Salicylhydroxymat-)empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase der Seq.-ID Nr. 26 kodiert.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, worin die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 25 besteht.
  3. Vektor, der die Sequenz aus Anspruch 1 umfasst.
  4. Xylose fermentierende Mutante von Pichia stipitis, wobei die Mutante im Vergleich zur Expression von SHAM-empfindlicher terminaler Oxidase im Ausgangsstamm, von dem die Mutante abgeleitet ist, verringerte Expression der die Seq.-ID Nr. 26 umfassenden SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase aufweist.
  5. Mutante nach Anspruch 4, worin die Mutante Xylose mit höherer Geschwindigkeit fermentiert als der Ausgangsstamm, von dem die Mutante abgeleitet ist.
  6. Mutante nach Anspruch 4, worin die Mutante eine SHAM-empfindliche terminale Oxidase unterbrechende Mutante ist.
  7. Mutante nach Anspruch 4, worin der Ausgangsstamm aus der aus Pichia stipitis FPL-UC7 (NRRL 21448) und Pichia stipitis FPL-PLU20 (NRRL Y-21970) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  8. Mutante nach Anspruch 4, worin die Mutante Pichia stipitis Shi31 (NRRL Y-30230) ist.
  9. Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus der Fermentation von Xylose, den folgenden Schritt umfassend: Kultivieren einer mutierten Hefe in xylosehältigem Material unter geeigneten Bedingungen für eine ausreichend lange Zeitspanne, um Fermentation von Xylose zu Ethanol zu ermöglichen, worin der mutierte Hefestamm eine P.-stipitis-Mutante nach Anspruch 4 ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die mutierte Hefe ein Pichia-stipitis-Stamm ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die mutierte Hefe von einem Pichia-stipitis-Stamm abgeleitet ist, der aus der aus FPL-UC7 (NRRL 21448) und FPL-PLU20 (NRRL 21970) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, worin die mutierte Hefe Pichia stipitis Shi31 (NRRL Y-30230) ist.
  13. Genkonstrukt, umfassend eine Sequenz, die für die SHAM-empfindliche terminale Pichia-stipitis-Oxidase der Seq.-ID Nr. 26 kodiert, die mit einem in Hefe exprimierbaren Promotor operabel verbunden ist.
  14. Genkonstrukt nach Anspruch 13, worin die Polynucleotidsequenz Seq.-ID Nr. 25 umfasst.
  15. Rekombinante Hefe, umfassend ein Genkonstrukt nach Anspruch 13, wobei die Hefe einer Spezies, ausgewählt aus der aus Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces byanus, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces sake, Saccharomyces thermotolerans, Saccharomyces urvarum und Spezies der Gruppe III bestehenden Gruppe, angehört, worin die rekombinante Hefe SHAM-empfindliche terminale Oxidase exprimiert und die Expression der SHAM-empfindlichen terminalen Oxidase mit cyanidresistenter Respiration zusammenhängt, wobei die Spezies der Gruppe III von Natur aus einen Antimycin-A-unempfindlichen Stoffwechselweg und einen Cytochrom-Stoffwechselweg umfassen.
  16. Rekombinante Hefe nach Anspruch 15, worin die Spezies Saccharomyces cerevisiae ist.
  17. Transgene Hefe nach Anspruch 15, worin die Spezies aus der aus Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Candida parapilosis und Kluyveromyces lactis bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
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