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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur DNA-Analyse und insbesondere ein Primer-Konstruktionssystem,
ein Verfahren zur Konstruktion von Primern, ein Speichermedium,
in welchem ein Programm aufgezeichnet ist, das es einem Computer
ermöglicht,
als Primer-Konstruktionssystem zu funktionieren, ein Speichermedium,
in welchem Daten aufgezeichnet sind, die bei der DNA-Analyse erforderlich
sind, Titerplatten, die Primer enthalten, die bei der DNA-Analyse erforderlich
sind, einen DNA-Analyse-Kit, der ein Speichermedium und Primer umfasst,
die bei der DNA-Analyse erforderlich sind, und ein Verfahren zur
DNA-Analyse.
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In den 1990er Jahren erfuhr das Humangenomprojekt
einen Aufschwung, der zu einem zunehmend besseren Verständnis der
Genomsequenzen von beispielsweise E. coli, Hefen, Nematoden, Reis,
Arabidopsis thaliana, Mäusen,
Ratten und Menschen führte.
Dies ging mit einer starken Zunahme an hoch effizienten Verfahren
zur Analyse von Nukleotidsequenzen sowie mit der Entwicklung von
Verfahren wie der Computerisierung von Sequenzanalysen und Verfahren
mit höherem
Durchsatz zur Analyse von Nukleotidsequenzen von Gen-, YAC- und
BAC-Bibliotheken und Chromosomenmarkern einher.
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Der jüngste Fortschritt des Genomprojekts
und die Entwicklung von Sequenzanalyseverfahren resultierten in
der kontinuierlichen Zu nahme von umfassenden genbezogenen Datenbanken
(siehe Figur 1), wodurch die Bioinformatik für die Datenverarbeitung solcher
großen
Mengen an genbezogenen Daten immer notwendiger wurde. Bioinformatik
ist eine aus Biologie und Informatik (Informationswissenschaft)
gebildete Bezeichnung, welche die Forschung meint, die Lebenswissenschaften
und Informationswissenschaften kombiniert, d. h. die umfassende
Wissenschaft des Umgangs mit biologischen Daten in ihrer Gesamtheit
mit der Absicht, nicht nur Genomdaten, sondern auch biologische
Daten von Genen bis zur Proteinstruktur oder Proteinfunktion besser
zu nutzen. Zurzeit wird jedoch die Bioinformatik bei der funktionellen
genetischen Analyse in der Industrie noch nicht adäquat genutzt.
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Genomische DNA umfasst sowohl Intron-
als auch Exon-Bereiche. Davon codieren Exons für Proteine, was die Analyse
von Exons für
die genetische Analyse äußerst wichtig
macht. Es ist jedoch äußerst schwierig,
Exons zu spezifizieren, die mit dem gegenwärtigen Forschungszweck kompatibel
sind, wobei an der herkömmlichen
genetischen Analyse die Auswahl von Exons, die für den Forschungszweck geeignet
sind, lediglich durch Versuch und Irrtum beteiligt ist.
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In 7 ist
der Verlauf einer herkömmlichen
Genanalyse beschrieben. Herkömmlicherweise
werden die interessierenden einzelnen Gene oder Proteine im Allgemeinen
durch Subtraktion oder DD-basierende Klonierung
von einem Gen, Nukleotid- oder Proteinaminosäuresequenzen identifiziert
(Schritt 600), wonach überprüft wird,
welche Funktionen sie haben. Das heißt, dass Exons, die als für den Forschungszweck
geeignet angesehen werden zuvor aus den identifi zierten Nukleotidsequenzen
ausgewählt
werden (Schritt 602), um die entsprechenden Primer zu konstruieren
(Schritt 603). Die Primer werden dann in der PCR (Polymerasekettenreaktion)
verwendet, um die Target-Exons für
die Analyse der Exons (Schritt 605) zu amplifizieren (Schritt 604).
Die PCR ist ein Verfahren, in welchem Primer für beide Enden der Region konstruiert
werden, die zu amplifizieren ist, und Gene durch Temperaturzyklen
logarithmisch amplifiziert werden, in welchen ein hitzestabiles
DNA-Enzym wie Taq-DNA-Polymerase
eingesetzt wird. Primer sind Oligonukleotide mit einer -OH am 3'-Ende,
die für
den Start der DNA-Synthese erforderlich ist.
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Wenn die Exons, die von der Analyse
in Schritt 605 ausgewählt
sind; sich für
den Forschungszweck in einer solchen herkömmlichen Genanalyse als ungeeignet
erweisen, muss der Vorgang (Schritt 606) ab der Exon-Auswahl
in Schritt 602 wiederholt werden, wodurch die Sicherstellung
der zuverlässigen
Auswahl von Exons, die für
den Forschungszweck geeignet sind, äußerst wichtig ist. Bei der
Analyse von Unterschieden im Gengehalt, die zwischen normalen Individuen
und Patienten auftreten, die an einer bestimmten Krankheit (wie Krebs)
leiden, werden beispielsweise Exons, die das Forschungsziel sind,
Exons sein, die zur Krankheit führen,
wobei es extrem schwierig ist, zu bestimmen, welche Exons die in
Frage kommenden Exons sind, weshalb es bisher keine andere Möglichkeit
der Analyse von Exon-Kandidaten als das zuvor beschriebene Versuch-und-Irrtum-Verfahren zur Bestimmung
solcher Exons gab.
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In dem Artikel "OSP: A Computer Program
for Choosing PCR and DNA Sequencing Primers", von L. Hillier und
P. Green, PCR Methods and Applications, Bd. 1, Nr. 2, November 1991,
124–128,
ist ein Computerprogramm offenbart, in welchem der Nutzer Bedingungen
für die
Länge von
Primer und amplifizierten Produkten, % (G + C), (absolute oder relative)
Schmelztemperaturen und Primer-3'-Nukleotide festlegen kann. Primersequenzkandidaten
werden gegen eine potenzielle Basenpaarung mit einer Vielzahl von
bei der Reaktion vorhandenen Sequenzen durchmustert. Primer, die
alle Bedingungen erfüllen,
werden von einer vom Benutzer definierbaren gewichteten Summe von
Parametern in eine Rangfolge gebracht, um für jeden Primer eine "kombinierte
Punktzahl" zu ergeben.
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Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe
zugrunde, ein Verfahren für
eine effizientere Konstruktion von Primern für verschiedene interessierende
Gene bereitzustellen, was in der Vergangenheit aufgrund der extremen
Schwierigkeiten, die bei der Spezifizierung erwünschter Exons auftreten, wie
weiter oben beschrieben, ein ineffizientes Unternehmen war.
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Insbesondere liegt der Erfindung
als eine Aufgabe zugrunde, ein Verfahren mit hohem Durchsatz für die funktionelle
genetische Analyse bereitzustellen, das sich völlig von herkömmlichen
Verfahren unterscheidet, indem eine "Bioinformatik" bei der funktionellen
genetischen Analyse angewendet wird, die nur die getrennte Anwendung
von erforderlichenfalls beispielsweise verschiedenen herkömmlichen
Datenbanken, Primer-Konstruktionsprogrammen und Primer-Detektionsprogrammen
umfasst.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wurde ein
Schema entworfen, das den herkömmlichen
Verfahren der Genanalyse diametral entgegengesetzt ist. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren
ist in 8 veranschaulicht.
Das heißt,
bei herkömmlichen
Verfahren erfolgt die Genanalyse durch ein Schema, in welchem das
Exon, welches das Target der Forschung ist, zunächst ermittelt wird, und dem
Exon entsprechende Primer konstruiert werden. Im Gegensatz dazu
ist von den Erfindern ein Schema entworfen worden, in welchem eine
Vielzahl von Primern für
voneinander verschiedene Exons durch Bioinformatik aus Nukleotidsequenzdaten,
die beispielsweise in öffentlichen
Datenbanken zusammengefasst sind (Schritt 700) zunächst konstruiert
wird (Schritt 701) und dann DNA-Fragmente, die unter Verwendung
dieser Primer durch PCR amplifiziert worden sind, analysiert werden.
Dieses Schema bestimmt, welche Exons durch welche Primer zuvor amplifiziert
werden (Schritt 702), um die Analyse der durch PCR amplifizierten
DNA-Fragmente leichter zu machen, was in einer effizienteren Analyse
resultiert. So werden beispielsweise bei der Analyse von Unterschieden
im Gengehalt, die zwischen normalen Individuen und Patienten auftreten,
die an einer bestimmten Krankheit (wie Krebs) leiden, genomische
DNAs, die aus Zellen verschiedener Individuen extrahiert worden
sind, als Templat verwendet, um die PCR unter Verwendung einer Vielzahl
von Primern für
voneinander verschiedene Exons durchzuführen, wobei Exons, von welchen
angenommen wird, dass sie mit der Krankheit verknüpft sind,
basierend auf Primertypen mit Unterschieden in Nukleotidsequenzen
und der Länge
oder Anwesenheit/Abwesenheit amplifizierter Fragmente ermittelt
werden. Somit wird bei dem erfindungsgemäßen Genanalyseverfahren die
PCR unter Verwendung von Primern für voneinander verschiedene
Exons durchgeführt,
wobei Exons, die für
den Forschungszweck geeignet sind, anschließend bestimmt und analysiert
werden.
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Bei diesem Typ einer Genanalyse ist
es notwendig, Primer für
so viele wie mögliche
Exons herzustellen. Bisher sind riesige Datenmengen für genomische
DNA-Nukleotidsequenzen und cDNA-Nukleotidsequenzen (siehe 1) zusammengetragen worden.
Von den Erfindern ist ein Primer-Konstruktionssystem entworfen worden,
in welchem ein Computer zur Verarbeitung der Daten zu den DNA-Nukleotidsequenzen,
die aus Datenbanken erhalten werden, einschließlich einer Vielzahl unterschiedlicher
DNA-Nukleotidsequenzen, verwendet werden kann, sodass eine Vielzahl
von Primer für
voneinander verschiedene DNAs konstruiert wird, wobei auch festgestellt
worden ist, dass die Genanalyse effizienter durch Korrelation der
entworfenen Primerdaten mit den Gendaten der DNA-Fragmente, die
durch PCR unter Verwendung dieser Primer amplifiziert worden sind,
durchgeführt
werden kann.
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Die Erfindung wurde basierend auf
diesen Feststellungen durchgeführt.
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Entsprechend dem ersten erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein Primer-Konstruktionssystem bereitgestellt, umfassend
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- – einen
Empfänger
zum Erhalt von Daten über
eine Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen von einer ersten Datenbank,
die Daten über
eine Vielzahl verschiedener DNA-Nukleotidsequenzen enthält; und
- – eine
Steuerungseinheit zur Steuerung des Systems, wobei die Steuerungseinheit
steuert:
- – Extraktionsmittel
zum Extrahieren einer Vielzahl von Teilsequenzen, die bestimmten
Basenlängen-Extraktionsbedingungen
entsprechen, aus der Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen, die auf
Daten basieren, die über
den Empfänger
erhalten wurden;
- – Detektionsmittel
zur Detektion bestimmter Bedingungen, die mit den Positionen der
Vielzahl von Teilsequenzen im Zusammenhang stehen, und von Bedingungen
für ihre
Abwesenheit in anderen DNA-Nukleotidsequenzen als der Vielzahl von
DNA-Nukleotidsequenzen;
- – ein
erstes Selektionsmittel zur Selektion einer Vielzahl von Teilsequenzen,
die diesen Bedingungen entsprechen, aus einer Vielzahl von Teilsequenzen,
die auf den Resultaten des Detektionsmittels basieren; und
- – Bestimmungsmittel
zur Bestimmung der Nukleotidsequenzen einer Vielzahl von Primerpaaren,
die spezifisch an die Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen, die auf
den Resultaten des ersten Selektionsmittels basieren, hybridisieren
können.
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Entsprechend dem zweiten erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein Speichermedium bereitgestellt, das darauf ein Programm
aufgezeichnet aufweist, das mit einer Steuerungseinheit in einem
Computer ausführbar ist,
der die Steuerungseinheit und einen Datenspeicher über eine
Vielzahl von verschiedenen DNA-Nukleotidsequenzen aufweist, wobei
das Programm Instruktionen zum Lesen von Daten über eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen
in diesem Speicher, zur Extraktion einer Vielzahl von Teilsequenzen,
die eine vorgeschriebene Basenlänge
haben, aus den Nukleotidsequenzen, die auf Daten der Vielzahl von
gelesenen DNA-Nukleotidsequenzen basieren, zur Detektion bestimmter
Bedingungen, die mit den Positionen der Vielzahl von Teilsequenzen
im Zusammenhang stehen, und Bedingungen ihrer Abwesenheit in anderen
DNA-Nukleotidsequenzen als der Vielzahl von DNA-Sequenzen, zur Selektion
einer Vielzahl von Teilsequenzen, die diesen Bedingungen entsprechen,
und zur Bestimmung der Nukleotidsequenzen einer Vielzahl von Primerpaaren,
die spezifisch an die Vielzahl von DNA-Sequenzen, die auf der selektierten
Vielzahl von Teilsequenzen basieren, hybridisieren können, umfasst.
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Entsprechend dem dritten erfindungsgemäßen Merkmal
wird ein Verfahren zum Konstruieren von Primern bereitgestellt,
umfassend. die Stufen:
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- – Entnehmen
der Daten über
eine Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen aus einer Datenbank, die
eine Vielzahl verschiedener DNA-Nukleotidsequenzen enthält;
- – Extrahieren
einer Vielzahl von Teilsequenzen, die eine bestimmte Basenlänge haben,
aus der Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen, die auf den oben erhaltenen
Nukleotidsequenzdaten basieren;
- – Detektieren
bestimmter Bedingungen, die mit den Positionen der Vielzahl von
Teilsequenzen im Zusammenhang stehen, und Bedingungen ihrer Abwesenheit
in anderen DNA-Nukleotidsequenzen als der Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen;
- – Selektieren
einer Vielzahl von Teilsequenzen, die den Bedingungen entsprechen,
aus der Vielzahl von Teilsequenzen, die auf den Detektionsresultaten
basieren; und
- – Bestimmen
der Nukleotidsequenzen einer Vielzahl von Primerpaaren, die spezifisch
an die Vielzahl von DNA-Nukleotidsequenzen, die auf der selektierten
Vielzahl von Teilsequenzen basieren, hybridisieren können.
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Die Erfindung wird anschließend anhand
von Beispielen unter Bezugnahme auf die im Anhang befindlichen Zeichnungen
näher erläutert, wobei
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1 Veränderungen
in der Anzahl von bei GenBank registrierten Nukleotidsequenzen,
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2 ein
Blockdiagramm, das ein Beispiel für die Struktur des erfindungsgemäßen Primer-Konstruktionssystems
darstellt,
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3 ein
Fließdiagramm,
das die Konstruktion einer Datenbank unter Verwendung einer öffentlichen Datenbank
darstellt,
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4 ein
Blockdiagramm, das ein Beispiel für die Struktur eines Primer-Konstruktionsprogramms
darstellt,
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5 ein
Fließdiagramm,
das ein Beispiel eines Verfahrens unter Anwendung des in 4 dargestellten Programms
veranschaulicht,
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6 Exon-Sequenzen
von Sequenzen, die aus der Sequenzdatenbank für Chromosom 21 ausgewählt wurden,
und Teilsequenzen, die unter bestimmten Extraktionsbedingungen aus
diesen Exon-Sequenzen extrahiert wurden,
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7 ein
herkömmliches
Verfahren zur DNA-Analyse und
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8 das
erfindungsgemäße Verfahren
zur DNA-Analyse
zeigt.
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2 zeigt
ein Blockdiagramm, das ein Beispiel für die Struktur des erfindungsgemäßen Primer-Konstruktionssystems
darstellt. Das in 2 veranschaulichte
Primer-Konstruktionssystem umfasst CPU 201, ROM 202,
RAM 203, Eingabe 204, Sender/Empfänger 205,
Anzeige 206, Festplatte (HDD) 207 und CD-ROM-Laufwerk 208.
Anstelle der CD-ROM 209 kann eine beschreibbare CD-R oder
CD-RW als Speichermedium verwendet werden. In diesen Fällen wird
anstelle des CD-ROM-Laufwerks 208 ein CD-R- oder CD-RW-Laufwerk verwendet.
DVD, ZiP, MO, PD und entsprechende Laufwerke für diese Medien können auch als
Medien für
die Speicherung des großen
Umfangs an primerbezogenen Daten anstelle der CD-ROM 209 verwendet
werden.
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Die CPU 201 führt das
weiter unten beschriebene Primer-Konstruktionsverfahren durch und
steuert das Primer-Konstruktionssystem als Ganzes entsprechend den
Programmen, die auf dem ROM 202, RAM 203 oder
der Festplatte (HDD) 207 gespeichert sind. ROM 202 speichert
die Programme oder dergleichen, die Befehle für den Vorgang geben, der für den Ablauf
des Primer-Konstruktionssystems erforderlich ist. RAM 203 speichert
temporär
Daten, die für
den Ablauf des Primer-Konstruktionsverfahrens erforderlich sind.
Die Eingabe 204 ist eine Tastatur, eine Computermaus oder
dergleichen und wird benutzt, um die für den Ablauf des Primer-Konstruktionsverfahrens
erforderlichen Bedingungen einzugeben. Der Sender/Empfänger 205 überträgt Daten
zu und von öffentlichen
Datenbanken 210 oder dergleichen durch Kommunikationsleitungen,
basierend auf den Befehlen der CPU 201. Das Display 206 zeigt
DNA-Nukleotidsequenzen,
die von Datenbanken erhalten worden sind, verschiedene Bedingungseingaben
von der Eingabe 204 und konstruierte Primer-Nukleotidsequenzen
und dergleichen an, basierend auf den Befehlen von der CPU 201.
Die Festplatte (HDD) 207 speichert Datenbanken und dergleichen,
die eine Vielzahl verschiedener DNA-Nukleotidsequenzen umfassen,
und das Primer-Konstruktionsprogramm und liest die gespeicherten
Programme, Daten und der gleichen, basierend auf den Befehlen von
der CPU 201, und speichert sie beispielsweise im RAM 203.
Das CD-ROM-Laufwerk 208 liest Programme, Daten und dergleichen
von Datenbanken, die eine Vielzahl verschiedener DNA-Nukleotidsequenzen
umfassen, und das Primer-Konstruktionsprogramm, das in der CD-ROM 209 gespeichert
ist, basierend auf den Befehlen von der CPU 201, und speichert
sie beispielsweise im RAM 203.
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Im erfindungsgemäßen Primer-Konstruktionssystem
empfängt
der Empfänger
DNA-Nukleotidsequenzen von einer Datenbank, die eine Vielzahl verschiedener
DNA-Nukleotidsequenzen umfasst.
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In dem in 2 dargestellten Primer-Konstruktionssystem
können
die DNA-Nukleotidsequenzen, die beispielsweise in einer öffentlichen
Datenbank 210 (einer ersten Datenbank) enthalten sind,
vom Sender/Empfänger 205 durch
Kommunikationsleitungen empfangen und können diese DNA-Nukleotidsequenzen
im RAM 203 gespeichert werden. Spezielle Beispiele für eine öffentliche
Datenbank 210 umfassen Datenbanken, die über das
Internet (www (world wide web)) genutzt werden können. Speziellere Beispiele
umfassen GenBank (Nukleinsäurenukleotidsequenz-(einschließlich DDBJ-)Datenbank,
aufgestellt von NCBI (USA), National Genetic Research Institute),
EMBL (Nukleinsäurenukleotidsequenz-Datenbank,
aufgestellt von EBI (Europa)), nr-nt (Nukleinsäurenukleotidsequenz-Datenbank,
aufgestellt von GenBank und EMBL), GENOME (KEGG-Genomkarten, aufgestellt
von Kyoto University Chemical Research Institute), GENES (KEGG-Genkataloge,
aufgestellt von Kyoto University Chemical Research Institute), CHR21
(Sequenzkarte für
Chromosom 21, aufgestellt von HGC), JST (JST-Humangenomsequenzierungsdatenbank,
aufgestellt von Japan Science and Technology Corporation), BodyMap
(humane Genexpressionsdatenbank, aufgestellt von Osaka University),
GENOTK (humane cDNA-Datenbank, aufgestellt von Otsuka Pharmaceutical
Co. Ltd., HGC) und MBGD (Mikroorganismengenom-Datenbank, aufgestellt
von HGC). Nukleotidsequenzen, die von einer öffentlichen Datenbank 210 empfangen
werden, können
entweder cDNA-Nukleotidsequenzen oder genomische DNA-Nukleotidsequenzen
oder Teilsequenzen davon sein. Wenn die Nukleotidsequenzen, die
von einer öffentlichen
Datenbank 210 erhalten werden, cDNA-Nukleotidsequenzen
sind, werden die cDNA-Nukleotidsequenzen,
die von dem Sender/Empfänger 205 empfangen
werden, ohne Veränderung
im RAM 203 gespeichert. Wenn die Nukleotidsequenzen, die
von einer öffentlichen
Datenbank 210 erhalten werden, genomische DNA-Nukleotidsequenzen
sind, werden die genomischen DNA-Nukleotidsequenzen von einem Exon-Vorhersageprogramm verarbeitet,
das im ROM 202, der Festplatte (HDD) 207 oder
der CD-ROM 209 gespeichert ist und die Exon-Nukleotidsequenzen
vorhersagt, basierend auf den genomischen DNA-Nukleotidsequenzen,
wonach die vorhergesagten Exon-Nukleotidsequenzen im RAM 203 gespeichert
werden. Als Exon-Vorhersageprogramm kann ein bereits zur Verfügung stehendes
Exon-Vorhersageprogramm
wie GENSCAN, GRAIL und ER (Exon Recognizer) angewendet werden.
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In dem in 2 dargestellten Primer-Konstruktionssystem
können
DNA-Nukleotidsequenzen, die in einer Datenbank enthalten sind, die
beispielsweise auf der Festplatte (HDD) 207 oder der CD- ROM 209 gespeichert
ist, gelesen, basierend auf den Befehlen von der CPU 201,
und im RAM 203 gespeichert werden. Ein spezielles Beispiel
einer Datenbank, die auf der Festplatte 207 oder der CD-ROM 209 gespeichert
ist, ist eine unter Verwendung einer öffentlichen Datenbank aufgebaute
lokale Datenbank.
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3 ist
ein Fließdiagramm,
das die Konstruktion einer Datenbank unter Verwendung einer öffentlichen
Datenbank veranschaulicht.
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cDNA-Sequenzen 302, die
in einer öffentlichen
Datenbank 301 (einer ersten Datenbank) enthalten sind,
und Exon-Sequenzen 305, die erhalten werden, wenn genomische
DNA-Sequenzen 303, die in einer öffentlichen Datenbank 301 enthalten
sind, von dem Exon-Vorhersageprogramm 304 verarbeitet werden,
können
auf der Festplatte oder einem anderen aufzeichnungsfähigen Speichermedium
durch eine Sequenz-Eingabeschnittstelle 306 gespeichert
werden, um eine Datenbank 307 (eine zweite Datenbank) zu
konstruieren. Bei der Konstruktion der Datenbank können die
cDNA-Nukleotidsequenzen oder die Exon-Nukleotidsequenzen in geeignete
Längen
(wie 1 kb) geteilt und in einem Speichermedium gespeichert werden.
Zur Verfügung stehende
Exon-Vorhersageprogramme wie GENSCAN, GRAIL und ER (Exon Recognizer)
können
als Exon-Vorhersageprogramm angewendet werden, wobei diese Programme über das
Internet genutzt werden können.
Die auf diese Weise aufgebaute Datenbank 307 enthält eine
Vielzahl verschiedener DNA-Nukleotidsequenzen.
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Die CPU 201 liefert die
von der Datenbank erhaltenen DNA-Nukleotidsequenzen an das Display 206 und
steuert den Vorgang für
die Konstruktion von Primern, die in der Lage sind, spezifisch an
die DNA zu hybridisieren, die von der Datenbank erhalten wurde (anschließend als
"Primer-Konstruktionsvorgang" bezeichnet). Im erfindungsgemäßen Primer-Konstruktionssystem
wird, nachdem die DNA-Nukleotidsequenzen vom Empfänger empfangen
worden sind, der Primer-Konstruktionsvorgang durch einen die Fragmentlänge begrenzenden
Vorgang, einen Teilsequenzextraktionsvorgang, einen Teilsequenzdetektionsvorgang,
einen Teilsequenzselektionsvorgang und einen die Primersequenz bestimmenden
Vorgang durchgeführt.
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4 zeigt
ein Blockdiagramm, das ein Beispiel für die Struktur eines Primer-Konstruktionsprogramms
darstellt.
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Die CPU 201 liefert die
DNA-Nukleotidsequenzen, die von der Datenbank empfangen worden sind,
an die Eingabe 401 als Nukleotidsequenzinformationen der
DNA, die als Templat (anschließend
als "Templat-DNA" bezeichnet) für
die zu konstruierenden Primer dient. Die Eingabe 401 liefert
eine Templat-DNA-Sequenz A1 an einen die Fragmentlänge begrenzenden
Vorgang 402. Der die Fragmentlänge begrenzende Vorgang 402 modifiziert
die Templat-DNA-Sequenz A1 auf eine Länge, die für eine Amplifizierung geeignet
ist, in welcher die konstruierten Primer verwendet werden, und liefert
sie dann an einen Teilsequenzextraktionsvorgang 403. Eine
Teilsequenz mit vorgeschriebener Basenlänge (wie 20 bis 28 Basen) wird
aus der Templat-DNA-Sequenz durch den Teilsequenzextraktionsvorgang 403 extrahiert,
und die extrahierte Teilsequenz A2 (eine erste Teilse quenz)
wird an den Teilsequenzdetektionsvorgang 405 geliefert.
Der Teilsequenzdetektionsvorgang 405 bestimmt, ob gegebenenfalls
die extrahierte Teilsequenz A2 bestimmte Detektionsbedingungen erfüllt (wie
GC-Gehalt: das Verhältnis
der Summe aus Cytosin- und Guaningehalt zur Summe aus Adenin- und Thymingehalt
in doppelsträngigen
DNA-Molekülen;
oder Tm: die Temperatur, bei welcher der doppelsträngige Teil
von DNA- oder RNA-Molekülen
zu einzelnen Strängen
denaturiert wird und in einem Doppelstrang/Einzelstrang-Verhältnis von
1 : 1 resultiert). Die Detektionsbedingungen können, falls gewünscht, ausgewählt werden.
Spezielle Beispiele für
solche Detektionsbedingungen umfassen Bedingungen, unter welchen
der GC-Gehalt 50 bis 60% beträgt
und die Tm zwischen 50 und 80°C
liegt und |Tm| weniger als 20°C
beträgt.
Der Teilsequenzdetektionsvorgang 405 liefert die Teilsequenz A3 (eine
zweite Teilsequenz), welche die vorgeschriebenen Detektionsbedingungen
erfüllt,
an einen Datenbankkonstruktionsvorgang 407 (ein zweites
Selektionsmittel). Dabei kann der Teilsequenzdetektionsvorgang 405 auch
nach der Eingabe 401 durchgeführt werden, um GC-Gehalt, Tm
oder dergleichen für
die Templat-DNA-Sequenz A1 zu detektieren, die der Eingabe 401 zur
Verfügung
gestellt wird, wodurch es den Teilsequenzen erlaubt wird, bestimmte
festgelegte Bedingungen zu erfüllen,
die dem Fragmentlängen-Begrenzungsvorgang 402 (ein
zweites Selektionsmittel) zur Verfügung gestellt werden.
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Der Datenbankkonstruktionsvorgang 407 konstruiert
eine Datenbank 408, welche die Teilsequenz A3 umfasst,
welche die vorgeschriebenen Detektionsbedingungen erfüllt. Aus
den in der Datenbank 408 enthaltenen Teilsequenzen wählt ein
5'-Teil sequenzselektionsvorgang 409 Teilsequenzen die sich
am nächsten
zum 5'-Ende befinden, unter den Teilsequenzen aus, die von der einen
Templat-DNA-Sequenz A1 abgeleitet sind. Aus den in der
Datenbank 408 enthaltenen Teilsequenzen wählt ein
3'-Teilsequenzselektionsvorgang 410 Teilsequenzen, die
sich am nächsten
zum 3'-Ende befinden,
unter den Teilsequenzen aus, die von einer Templat-DNA-Sequenz A1 abgeleitet
sind. Die Teilsequenzen A4, die von dem 5'-Teilsequenzselektionsvorgang 409 ausgewählt sind,
und die Teilsequenz A5, die von dem 3'-Teilsequenzselektionsvorgang 410 ausgewählt ist,
werden einem Teilsequenzanalysevorgang 413 zur Verfügung gestellt.
Der Teilsequenzanalysevorgang 413 analysiert, ob gegebenenfalls
die zur Verfügung
gestellten Teilsequenzen A4 oder A5 in DNA-Nukleotidsequenzen
vorhanden sind, die nicht die Templat-DNA sind. Um festzustellen,
ob gegebenenfalls die zur Verfügung
gestellten Teilsequenzen in DNA-Nukleotidsequenzen vorhanden sind,
die nicht die Templat-DNA sind, analysiert der Teilsequenzanalysevorgang 413 Daten,
die in öffentlichen
Datenbanken und dergleichen vorhanden sind, durch ein Homologie-Screening-Programm. So kann
beispielsweise BLAST oder FASTA als Homologie-Screening-Programm
angewendet werden. Ein Teilsequenzselektionsvorgang 414 wählt Teilsequenzen
aus, die nicht in DNA-Nukleotidsequenzen vorhanden sind, die nicht
die Templat-DNA sind, und stellt die ausgewählte Teilsequenz A6 (die
dritte Teilsequenz) einem Primersequenzbestimmungsvorgang 415 (einem ersten
Selektionsmittel) zur Verfügung.
Der Primersequenzbestimmungsvorgang 415 bestimmt die Nukleotidsequenz
von Primern basierend auf den zur Verfügung gestellten Teilsequenzen.
So bestimmt beispielsweise der Primersequenzbestimmungsvorgang 415 die
Nukleotidsequenz, die zu der Teilsequenz des 5'-Endes komplementär ist, die
als Nukleotidsequenz einer Primervorstufe zur Verfügung gestellt
worden ist, und auch die Nukleotidsequenz, die der Teilsequenz des
3'-Endes komplementär
ist, die als Nukleotidsequenz eines reverse-Primers zur Verfügung gestellt
worden ist.
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Auf diese Weise können Primer, die in der Lage
sind, spezifisch an die Templat-DNA zu hybridisieren, konstruiert
werden.
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5 zeigt
ein Fließdiagramm,
das ein Beispiel eines Vorgangs darstellt, in welchem das in 4 veranschaulichte Programm
angewendet wird.
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Die als Templat dienende Nukleotidsequenz
wird zunächst
aus der Datenbank 307 gelesen, und das Programm wird gestartet.
Eine Teilsequenz A2 mit vorgeschriebener Basenlänge (wie
20 bis 28 Basen) wird von dem Teilsequenzextraktionsvorgang 403 (Schritt 501)
aus jeder Templat-DNA-Sequenz A1 extrahiert, die durch
den Fragmentlängenbegrenzer 402 auf
eine Länge
modifiziert worden ist, die amplifiziert werden kann (Schritt 500).
Der Teilsequenzselektionsvorgang 405 bestimmt, ob gegebenenfalls
der GC-Gehalt der
extrahierten Teilsequenz A2 innerhalb eines vorgeschriebenen
Bereichs (wie 50 bis 60%) (Schritt 502) liegt. Liegt der
GC-Gehalt der extrahierten
Teilsequenz A2 nicht innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs
(50 bis 60%), wird eine andere Teilsequenz A2 von dem Teilsequenzextraktionsvorgang 403 (Schritt 501)
extrahiert. Wenn der GC-Gehalt der extrahierten Teilsequenz A2 innerhalb
des vorgeschriebenen Bereichs (wie 50 bis 60%) liegt, wird anschließend ermittelt,
ob gegebenenfalls die Tm innerhalb eines vorgeschriebenen Bereichs
(wie 50 bis 80°C)
(Schritt 503) liegt. Liegt die Tm der extrahierten Teilsequenz A2 nicht
innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs (wie 50 bis 80°C), wird
eine weitere Teilsequenz A2 von dem Teilsequenzextraktionsvorgang 403 (Schritt 501)
extrahiert. Liegt die Tm innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs
(wie 50 bis 80°C),
wird anschließend
bestimmt, ob gegebenenfalls |Tm| innerhalb eines vorgeschriebenen
Bereichs (wie unter 20°C) (Schritt 504)
liegt. Liegt die |Tm| der extrahierten Teilsequenz A2 nicht
innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs (wie unter 20°C), wird
eine weitere Teilsequenz A2 von dem Teilsequenzextraktionsvorgang 403 (Schritt 501)
extrahiert. Liegt die |Tm| innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs
(wie unter 20°C),
wird die Teilsequenz in einem wiederbeschreibbaren Speichermedium
wie der Festplatte oder der CD-ROM von dem Datenbankkonstruktionsvorgang 407 (Schritt 505)
aufgezeichnet. Die Schritte 501 bis 505 werden
für alle
Teilsequenzen wiederholt, die aus der Templat-DNA-Sequenz extrahiert
werden können,
um eine Datenbank von Teilsequenzen A3 zu konstruieren,
welche die vorgeschriebenen Extraktionsbedingungen (wie eine Basenlänge von
20 bis 28 Basen, ein GC-Gehalt von zwischen 50 und 60%, eine Tm
von zwischen 50 und 80°C
und eine |Tm| von unter 20°C)
(Schritt 505) (ein zweites Selektionsmittel)) erfüllen. Aus
den Teilsequenzen, die in der Datenbank enthalten sind, die konstruiert
worden ist, wählt
der 5'-Teilsequenzselektionsvorgang 409 Teilsequenzen aus,
die sich am nächsten
am 5'-Ende befinden (Schritt 506). Außerdem wählt aus den Teilsequenzen,
die in der Datenbank enthalten sind, die konstruiert worden ist,
der 3'-Teilsequenzselektionsvorgang 410 Teilsequenzen aus, die
sich am nächsten
am 3'-Ende (Schritt 507) befinden. Die Teilsequenz A4,
die von dem 5'-Teilsequenzselektionsvorgang 409 ausgewählt worden
ist, und die Teilsequenz A5, die von dem 3'-Teilsequenzselektionsvorgang 410 ausgewählt worden
ist, werden von dem Teilsequenzanalysevorgang 413 analysiert,
um zu bestimmen, ob sie gegebenenfalls in DNA-Nukleotidsequenzen
vorhanden sind, die nicht die Templat-DNA sind (Schritt 508).
Wenn die Teilsequenz A4, die von dem 5'-Teilsequenzselektionsvorgang 409 ausgewählt worden
ist, in einer DNA-Nukleotidsequenz vorhanden ist, die nicht die
Templat-DNA ist, wird anschließend
die Teilsequenz, die sich am zweitnächsten am 5'-Ende befindet,
anschließend
aus den Teilsequenzen ausgewählt,
die in der Datenbank enthalten sind, die konstruiert worden ist
(Schritt 506). Wenn die Teilsequenz A5, die von
dem 3'-Teilsequenzselektionsvorgang 410 ausgewählt worden
ist, in einer DNA-Nukleotidsequenz vorhanden ist, die nicht die
Templat-DNA ist,
wird anschließend
die Teilsequenz, die sich am zweitnächsten am 3'-Ende befindet,
aus den Teilsequenzen ausgewählt,
die in der Datenbank enthalten sind, die konstruiert worden ist
(Schritt 507). Die Schritte 506 bis 508 werden
wiederholt, bis eine Teilsequenz, die nicht in einer DNA-Nukleotidsequenz
vorhanden ist, die nicht die Templat-DNA ist, ausgewählt ist
(ein erstes Selektionsmittel). Teilsequenzen, die nicht in DNA-Nukleotidsequenzen
vorhanden sind, die nicht die Templat-DNA sind, werden von dem Teilsequenzselektionsvorgang 414 ausgewählt, und
die ausgewählten
Teilsequenzen A6 werden dem Primer-Sequenzbestimmungsvorgang 415 zur
Verfügung
gestellt. Primer, die in der Lage sind, spezifisch an die Templat-DNA
zu hybridisieren, werden von dem Primer-Sequenzbestimmungsvorgang 415 konstruiert,
der auf Teilsequen zen basiert, die nicht in DNA-Nukleotidsequenzen
vorhanden sind, die nicht die Templat-DNA sind (Schritt 509).
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Die Primer, die durch das erfindungsgemäße Primer-Konstruktionssystem
konstruiert worden sind, können
entsprechend ihren Nukleotidsequenzen chemisch durch ein übliches
Verfahren synthetisiert werden. Dabei ermöglicht das erfindungsgemäße Primer-Konstruktionssystem
die effiziente Konstruktion einer Vielzahl von Primern, die in der
Lage sind, an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren.
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In der erfindungsgemäßen Ausführungsform
wurden Teilsequenzen, die sich am nächsten am 5'- oder 3'-Ende
befinden, nach Detektion von Tm oder dergleichen ausgewählt und
wurden Sequenzen, die als solche analysiert wurden, die nicht irgendwo
enthalten sind, außer
in der Templat-DNA, als Primersequenzen bestimmt, wobei die Reihenfolge
von Detektion, Selektion und Analyse sich verändern lässt. Wenn Exons in ihrer Gesamtheit
analysiert werden sollen oder wenn Exon-Intron-Verknüpfungen
analysiert werden sollen, ist die Aufgabe der Primerkonstruktion
nicht auf Exon-Bereiche beschränkt
und es können
die Teilsequenzen für
Introns auch als Templat-DNAs verwendet werden.
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Bei der DNA-Analyse kann eine Vielzahl
von Primern, die in der Lage sind, spezifisch an voneinander verschiedene
DNAs zu hybridisieren, verwendet werden. So kann beispielsweise
eine Probe-DNA als Templat verwendet werden, die PCR kann unter
Verwendung einer Vielzahl von Primern durchgeführt werden, die in der Lage
sind, spezi fisch an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren,
und die Proben-DNA kann unter Verwendung von den Primertypen, welche
die PCR-amplifizierten Fragmente ergeben, als Marker analysiert
werden. So kann beispielsweise bei der Analyse von Unterschieden
im Gengehalt zwischen normalen Individuen und Patienten, die an
einer bestimmten Krankheit (wie Krebs) leiden, genomische DNA, die
aus Zellen von Personen extrahiert worden ist, als Templat verwendet
werden, die PCR kann unter Verwendung einer Vielzahl von Primern
durchgeführt
werden, die in der Lage sind, spezifisch an voneinander verschiedene
DNAs zu hybridisieren, und DNA-Bereiche (wie Exons), die potenziell
mit der Krankheit verknüpft
sind, können
bestimmt werden, basierend auf Primertypen mit Unterschieden in
der Nukleotidsequenz und der Länge
oder der Anwesenheit/Abwesenheit von amplifizierten Fragmenten zwischen
normalen Individuen und Patienten. Durch die DNA-Analyse, die so
eine Vielzahl von Primern verwendet, die in der Lage sind, spezifisch
an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren, wird ein Screening
mit hohem Durchsatz ermöglicht.
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Bei einer DNA-Analyse, an welcher
die Verwendung einer Vielzahl von Primern beteiligt ist, die in
der Lage sind, spezifisch an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren,
ist es wichtig, die Daten der Primer mit den genetischen Daten der
durch PCR unter Verwendung der Primer amplifizierten DNA-Fragmente
zu korrelieren. Insbesondere ist es von Bedeutung, die genetischen
Daten der DNA-Fragmente,
die unter Verwendung der Primer amplifiziert worden sind, bezogen
auf die Daten der Primer, welche die durch PCR amplifizierten Fragmente
ergeben, zu bestimmen. Somit ist es wün schenswert, ein computerlesbares
Speichermedium zu verwenden, in welchem die Daten der Vielzahl von
Primern, die in der Lage sind, spezifisch an voneinander verschiedene
DNAs zu hybridisieren, und die genetischen Daten der durch PCR unter
Verwendung dieser Primer amplifizierten DNA-Fragmente aufgezeichnet
werden. In dem Speichermedium kann ein Programm für die Anzeige
der genetischen Daten der DNA-Fragmente, die durch PCR unter Verwendung
dieser Primer amplifiziert worden sind, basierend auf den Daten
der Primereingabe in einen Computer aufgezeichnet sein. Das Programm
kann auch in einem anderen Speichermedium aufgezeichnet sein.
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Die Primerdaten umfassen Primer-Nukleotidsequenzen,
Daten, welche den Primer charakterisieren (wie identifizierender
Name) oder dergleichen. Die genetischen Daten der DNA-Fragmente
umfassen DNA-Fragmentnukleotidsequenzen, Daten, die mit der Funktion
der Proteine verknüpft
sind, die durch die DNA-Fragmente kodiert werden (unabhängig davon,
ob die Funktionen aufgeklärt
worden sind, und welche Funktionen aufgeklärt worden sind) oder dergleichen.
Speichermedien umfassen CD-ROM, Festplatte, ROM, RAM, DVD und CD-R/RW.
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Diese DNA-Analyse kann unter Verwendung
eines DNA-Analysekits durchgeführt
werden, der eine Vielzahl von Primern, die in der Lage sind, spezifisch
an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren, und das zuvor
genannte Speichermedium umfasst. Bei der zuvor beschriebenen DNA-Analyse
kann ein PCR-Amplifizierungskit, der eine Vielzahl von Primern und
ein computerlesbares Speichermedium umfasst, verwendet werden. Jede
der zuvor beschriebenen Vielfalten von Primern ist in einer Vielfalt
von Behältern
in einem solchen PCR-Amplifizierungskit enthalten, wobei ID-Codes,
mit welchen die Primer versehen werden, die in den Behältern enthalten
sind, auf dieser Vielfalt von Behältern angegeben sind, und eine
Tabelle, welche die ID-Codes dieser Vielfalt von Primern entweder
mit Name, Molekülformel
oder Sequenzdaten für
die oben genannte Vielfalt von Primern verknüpft, in dem oben genannten
Speichermedium aufgezeichnet ist. Als die Behälter können Titerplatten mit einer
Vielzahl von Vertiefungen wie weiter unter beschrieben verwendet
werden.
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Die DNA kann unter Verwendung dieses
DNA-Analysekits beispielsweise auf folgende Art und Weise analysiert
werden. Jedem Primer wird als Primer charakterisierende Daten ein
identifizierender Name (ID-Code), beispielsweise B1, B2, B3 bis
Z7, Z8, Z9, gegeben und "B5" wird als Primerangabe in die Eingabe 204 eingegeben,
wenn der durch PCR amplifizierte Fragmente ergebende Primer B5 ist,
während
PCR mit den Primern durchgeführt
wird. Die CPU 201 bestimmt die genetischen Daten der DNA-Fragmente,
die durch PCR unter Verwendung des Primers B5 amplifiziert worden
sind, basierend auf den Eingangs-Primer-Daten entsprechend dem Programm,
das in ROM 202, RAM 203, Festplatte 207 oder
CD-ROM 209 gespeichert ist, und zeigt auf dem Display 206 an.
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Für
eine effiziente Analyse großer
Mengen von Probe-DNA in der DNA-Analyse ist es möglich, Titerplatten mit einer
Vielzahl von Vertiefungen zu verwenden, welche Platten sind, die
in einigen der Vertiefungen Lösungen
enthalten, welche die Vielzahl von Primern enthalten, die in der
Lage sind, spezifisch an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren.
Solche Titerplatten können
verwendet werden, um die PCR alle auf einmal unter Verwendung einer
Vielzahl von Primern für
Probe-DNAs durchzuführen,
wodurch es für
die Probe-DNAs möglich
wird, sie effizient zu analysieren und große Mengen an Probe-DNA zu analysieren.
PCR, in welcher solche Titerplatten verwendet werden, kann mit kommerziell
erhältlichen
automatischen Geräten
wie automatischen Reaktionsrobotern durchgeführt werden.
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Die Anzahl der Plattenvertiefungen
und Anzahl und Typ der in den Platten enthaltenen Primer sind nicht
besonders beschränkt.
Die Platten können
Vertiefungen haben, die keine Lösungen
mit Primern enthalten, oder alle Vertiefungen können Primer enthaltende Lösungen enthalten.
Jede Vertiefung kann Lösungen mit
einem Primertyp oder Lösungen
mit zwei oder mehr Primertypen enthalten. Obwohl unterschiedliche
Vertiefungen üblicherweise
Lösungen
mit unterschiedlichen Primertypen enthalten, können unterschiedliche Vertiefungen
auch Lösungen
mit denselben Primertypen enthalten.
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Für
eine umfassende DNA-Analyse sollten insgesamt 75 oder mehr Lösungstypen
pro Platte enthalten sein. Für
eine noch höhere
Analyseneffizienz sollten 80% oder mehr aller Vertiefungen unterschiedliche
Lösungen
enthalten.
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Als Platten mit einer Vielzahl von
Vertiefungen können
kommerziell erhältliche
96-Loch-Platten, 384-Loch-Platten und dergleichen verwendet werden.
In diesen Fällen
kann die PCR für
große
Mengen an Probe-DNAs mit jeder Platte mit 76 oder 307 Arten von
Lösungen
mit Primern durchgeführt
werden.
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Die Zusammensetzung der die Primer
enthaltenden Lösungen
ist nicht besonders beschränkt,
vorausgesetzt, dass die PCR in den Lösungen durchgeführt werden
kann. Da die PCR-Reaktionslösung üblicherweise
HaO, PCR-Puffer, MgCl2, dNTP-Gemisch, Taq-Polymerase
und dergleichen zusätzlich
zu Primern und Templat-DNA enthält,
können
die die Primer enthaltenden Lösungen
eins oder mehr davon enthalten.
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Die Primerkonzentration in der Lösung kann
wie gewünscht
gewählt
werden, liegt jedoch vorzugsweise zwischen 10 und 100 pmol/μl. Herkömmlicherweise
ist die Konzentration hoch, etwa ein Mikromol/ml, und wird vor Verwendung
verdünnt,
wenn jedoch die Konzentration etwa 10 bis 100 pmol/μl von Anfang
an beträgt, kann
sie sofort benutzt werden. Die Lösung
sollte auch keine Enzyme (wie DNase) enthalten, welche die Primer
abbauen.
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Die Platten können auch Deckel, Filme oder
dergleichen umfassen, um die Vertiefungen abzudecken, um zu verhindern,
dass die Primerlösungen
in den Vertiefungen sich untereinander während der Verteilung vermischen.
Wenn der Film ein solcher ist, dass er von einer von einem Roboter
betätigten
Flüssigkeitskapillare
zerrissen werden kann, besteht ein Vorteil darin, dass er auf dem
Roboter, so wie er ist, befestigt werden kann.
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Erste Ausführungsform
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Eine relativ neue Sequenz, die noch
nicht viel analysiert worden ist, wurde aus der Sequenzdatenbank für das Chromosom
21 ausgewählt,
die öffentlich
im www offenbart ist (ERI Chromosome 21 Sequence Database: http://www.eri.uchsc.edu/chr21/c2lindex.html).
Die Verarbeitung dieser Sequenz durch zur Verfügung stehende Exon-Vorhersageprogramme
(Programm A und B) resultierte in der Vorhersage von vier Sequenzen (Exon
1: SEQ ID Nr. 1; Exon 2: SEQ ID Nr. 2; Exon 3: SEQ ID Nr. 3; Exon
4: SEQ ID Nr. 4) als Exon-Nukleotidsequenzen.
Das zur Vorhersage der Exons verwendete Gerät war ein SUN Ultra 60 (2 GB
Speicher), und die Vorhersagezeit betrug etwa 5 Minuten pro Sequenz
mit Programm A (Mailserver) und etwa 10 Minuten mit Programm B (lokaler
Server).
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Teilsequenzen, die den folgenden
Extraktionsbedingungen entsprachen, wurden aus jeder der vorhergesagten
Exon-Nukleotidsequenzen extrahiert:
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- (1) Basenlänge:
20 bis 28 bps,
- (2) GC-Gehalt: 50 bis 60%,
- (3) Tm: 50 bis 80°C,
|TM|: unter 20°C
und
- (4) befanden sich so nah wie möglich am 5'- oder 3'-Ende.
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In der Datenbank GenBank wurde mit
den extrahierten Teilsequenzen als Anfrage eine Blast-Suche durchgeführt, und
es wurde ein Identitätswert
von 50% oder niedriger ausgewählt,
um auf Teilsequenzen mit hoher Spezifität zu durchmustern. Ist ein
Screening von Teilsequenzen mit noch höherer Spezifität gewünscht, kann
der Identitätswert
niedriger angesetzt werden (wie 30% oder darunter), und wenn andere
Bedingungen zu Lasten eines bestimmten Spezifitätsgrades bevorzugt werden,
kann ein höherer
Wert (wie 70% oder darüber)
eingestellt werden.
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Im Ergebnis wurden die in SEQ ID
Nr. 5 und 6 angegebenen Teilsequenzen aus Exon 1 (SEQ ID Nr. 1)
extrahiert, die in SEQ ID Nr. 7 und 8 angegebenen Teilsequenzen
wurden aus Exon 2 (SEQ ID Nr. 2) extrahiert, die in SEQ ID Nr. 9
und 10 angegebenen Teilsequenzen wurden aus Exon 3 (SEQ ID Nr. 3)
extrahiert und die in SEQ ID Nr. 11 und 12 angegebenen Teilsequenzen
wurden aus Exon 4 (SEQ ID Nr. 4) (6)
extrahiert.
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Zweite Ausführungsform
-
Es wurde die Zeit berechnet, die
erforderlich war, um die folgenden Muster I bis III eintausend Mal durchzuführen. Es
wurde ein Computer SUN Ultra 60 (2 GB Speicher) eingesetzt, auf
welchem die erforderlichen Programme für jedes der Muster liefen.
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Muster I
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Es wurde nur eine Primer-Konstruktion
durchgeführt.
Muster I umfasste den Ablauf eines Vorgangs zur Extraktion von Teilsequenzen
aus der vorher festgelegten Templat-DNA-Sequenz A1, basierend
auf einem Primer-Konstruktionsprogramm, das dem Prozessor 403 für die Teilsequenzextraktion
entsprach. Die Teilsequenzextraktionsbedingungen waren wie folgt:
-
- (1) Basenlänge:
20 bis 28 bps,
- (2) GC-Gehalt: 50 bis 60%,
- (3) Tm: 50 bis 80°C,
|TM|: unter 20°C
und
- (4) befanden sich so nah wie möglich am 5'- oder 3'-Ende.
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Muster II
-
Für
Muster II wurden Exons durchmustert und anschließend Primer konstruiert. Für Muster
II wurden Exons durchmustert, basierend auf ausgewählten Bedingungen
aus der vorher aufgestellten Exon-Datenbank 307, die Templat-DNA-Sequenz A1 wurde
durch die Eingabe 401 auf den Prozessor 403 für die Teilsequenzextration übertragen
und der Vorgang zur Extraktion von Teilsequenzen wurde basierend
auf dem Primer-Konstruktionsprogramm durchgeführt, das dem Prozessor 403 für die Teilsequenzextraktion
entsprach. Die Exon-Screening-Bedingungen sind weiter unten angegeben.
Die Bedingungen der Teilsequenzextraktion waren dieselben wie für Muster
I.
-
- (1) Exon-Länge:
300 bps oder weniger
- (2) Exons, vorhergesagt von einem Exon-Vorhersageprogramm
- (3) gefunden in der EST-Datenbank und Exprimierung bestätigt
- (4) unbekannte Funktion (nicht in der Proteindatenbank gefunden)
- (5) SNP-Potenzial (Abweichung in EST-Datenbank).
-
Muster III
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Nach der Exon-Vorhersage wurden Exons
durchmustert und anschließend
Primer konstruiert. Für Muster
III wurden Exons unter Verwendung des Programms, das dem Exon-Vorhersageprogramm 304 entsprach,
aus der genomischen DNA-Sequenz 303 vorhergesagt, die sich
ergebenden Exon-Sequenzen 305 wurden in einer Datenbank 307 durch
eine Sequenzeingabeschnittstelle 306 zusammengefasst, Exons
wurden in der Exon-Datenbank 307 auf der Basis des Satzes
an Bedingungen durchmustert, die Templat-DNA-Sequenz A1 wurde durch die
Eingabe 401 in den Prozessor 403 für die Teilsequenzextraktion übertragen
und der Vorgang zur Extraktion von Teilsequenzen wurde vom Primer-Konstruktionsprogramm
durchgeführt,
das dem Prozessor 403 für
die Teilsequenzextraktion entsprach. Die Exon-Durchmusterungsbedingungen
waren dieselben wie für
Muster II. Die Bedingungen für
die Teilsequenzextraktion waren dieselben wie für Muster I.
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In Tabelle 1 sind die Ergebnisse
der Berechnungen für
die Zeit gezeigt, die für
die jeweils eintausendfache Durchführung der Muster I bis Muster
III erforderlich war. In Tabelle 1 bedeutet "T1" die Zeit (Minuten), die
für die
Exon-Vorhersage erforderlich war, "T2" bedeutet die Zeit (Minuten),
die für
die Exon-Durchmusterung erforderlich war, und "T3" bedeutet die
Zeit (Minuten), die für
die Primer-Konstruktion erforderlich war.
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Die Ergebnisse von Tabelle 1 zeigen,
dass das erfindungsgemäße Primer-Konstruktionssystem
zur Konstruktion von etwa 5 000 Primersätzen pro Tag durch parallele
und verteilte Computer angewendet werden kann, was bedeutet, dass
etwa 150 000 Primer pro Jahr zufriedenstellend hergestellt werden
können.
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Das erfindungsgemäße Primer-Konstruktionssystem
erlaubt es, dass eine Vielzahl von Primern effizient hergestellt
wird, die in der frage sind, spezifisch an voneinander verschiedene
DNAs zu hybridisieren. Die Vielzahl von Primern, die in der Lage
sind, spezifisch an voneinander verschiedene DNAs zu hybridisieren, kann
für die
DNA-Analyse verwendet
werden, was es erlaubt, dass große Mengen an Probe-DNAs auf
einmal effizient analysiert werden können. Es ist besonders nützlich für ein Screening
mit hohem Durchsatz. Bei der DNA-Analyse kann ein computerlesbares
Speichermedium, in welchem Daten für die Vielzahl von Primern,
die in der Lage sind, spezi fisch an voneinander verschiedene DNAs
zu hybridisieren, und genetische Daten für DNA-Fragmente, die unter
Verwendung dieser Primer durch PCR amplifiziert worden sind, gespeichert
sind, verwendet werden, um eine solche DNA-Analyse zu erleichtern.
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