DE60000796T2 - Purification of lipstatin - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Lipstatin. Genauer betrifft diese Erfindung ein Verfahren, bei dem eine flüssig-flüssig Extraktion in Form einer Doppelstrom-Extraktion mit einer Rückextraktion in Form einer Gegenstrom-Extraktion kombiniert wird, um Lipstatin aus rohem Lipstatin in besonders hoher Ausbeute und Reinheit zu isolieren.The present invention relates to a process for purifying lipstatin. More specifically, this invention relates to a process in which a liquid-liquid extraction in the form of a double-flow extraction is combined with a back extraction in the form of a counter-flow extraction in order to isolate lipstatin from crude lipstatin in particularly high yield and purity.
Lipstatin ist als wichtigstes Zwischenprodukt bei der Herstellung von Tetrahydrolipstatin (THL, Orlistat) von großer Bedeutung, das hilfreich ist bei der Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten, die mit Fettleibigkeit in Verbindung stehen.Lipstatin is of great importance as the key intermediate in the production of tetrahydrolipstatin (THL, orlistat), which is helpful in the prevention and treatment of obesity-related diseases.
Lipstatin, ein Fermentationsverfahren für seine Herstellung, ein Verfahren für seine Isolierung aus Mikroorganismen und ein Verfahren für seine Hydrierung zu Tetrahydrolipstatin sind bekannt und zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben.Lipstatin, a fermentation process for its production, a process for its isolation from microorganisms and a process for its hydrogenation to tetrahydrolipstatin are known and described, for example, in U.S. Patent No. 4,598,089.
Lipstatin wird durch folgende Formel veranschaulicht: Lipstatin is illustrated by the following formula:
Ein Verfahren zur Herstellung von rohem Lipstatin wurde auch in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 96106598 beschrieben. Dieses Verfahren umfasst die aerobe Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Aktinomyzetes, zum Beispiel Streptomyces toxytricini, wobei Lipstatin in wässrigem Medium hergestellt wird, das im Wesentlichen frei ist von Fetten und Ölen und das geeignete Kohlenstoff und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, solange, bis die anfängliche Wachstumsphase im Wesentlichen beendet ist und genügend Zellmasse hergestellt wurde. Dann wird Linolsäure zusammen mit einem Antioxidationsmittel und gegebenenfalls zusammen mit Caprylsäure und N-Formyl-L-leucin oder bevorzugt L-Leucin zum Nährmedium gegeben. Nachdem die Fermentation abgeschlossen ist, wird das Fermentationsnährmedium extrahiert. Das hergestellte rohe Lipstatin kann weiter angereichert und gereinigt werden, zum Beispiel durch chromatographische Verfahren, wie in U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben.A process for the preparation of crude lipstatin has also been described in European Patent Application No. 96106598. This process comprises the aerobic cultivation of a microorganism of the species Actinomycetes, for example Streptomyces toxytricini, to produce lipstatin in an aqueous medium which is substantially free from fats and oils and which contains suitable carbon and nitrogen sources and inorganic salts, until the initial growth phase has substantially ended and sufficient Cell mass has been produced. Linoleic acid is then added to the nutrient medium together with an antioxidant and optionally together with caprylic acid and N-formyl-L-leucine or preferably L-leucine. After the fermentation is complete, the fermentation medium is extracted. The crude lipstatin produced can be further enriched and purified, for example by chromatographic methods as described in US Patent No. 4,598,089.
Vorschriften für mehrstufige chromatographische Verfahren oder flüssig-flüssig Extraktionen, um Lipstatin anzureichern, in Kombination mit einer mehrstufigen Chromatographie, um reines Lipstatin zu erhalten, kennzeichnen den Stand der Technik bei den Verfahren zur Reinigung von rohem Lipstatin. Diese Verfahren werden normalerweise bei der Isolierung von Fermentationsmetaboliten im Labormaßstab angewendet. Jedoch sind diese Verfahren im Allgemeinen nicht für ein wissenschaftliches Verfahren im großem Maßstab geeignet.Protocols for multi-step chromatographic procedures or liquid-liquid extractions to enrich lipstatin, combined with multi-step chromatography to obtain pure lipstatin, characterize the state of the art in the methods for the purification of crude lipstatin. These methods are usually applied in the isolation of fermentation metabolites on a laboratory scale. However, these methods are generally not suitable for a large-scale scientific procedure.
Versuche, rohes Lipstatin durch Destillation zu reinigen, schlugen fehl. Lipstatin ist für einige Stunden bei 60ºC stabil, aber wegen seines niedrigen Dampfdrucks (7 · 10&supmin;&sup7; mbar) ist eine Vakuumdestillation (< 2 mbar) bei dieser Temperatur nicht durchführbar. Bei höherer Temperatur zersetzt sich Lipstatin unter Abgabe von Kohlendioxid.Attempts to purify crude lipstatin by distillation failed. Lipstatin is stable for several hours at 60ºC, but due to its low vapor pressure (7 x 10⁻⁷ mbar) vacuum distillation (< 2 mbar) is not feasible at this temperature. At higher temperatures, lipstatin decomposes releasing carbon dioxide.
Rohes Lipstatin kann auch durch Kristallisierung von Lipstatin bei Temperaturen unter -20ºC gereinigt werden. Jedoch ist dafür eine teure technische Ausrüstung zur Niedrigtemperatur-Kristallisierung notwendig und die Ausbeute dieser Kristallisierung hängt stark von der Qualität des rohen Lipstatins ab. Insbesondere bei rohem Lipstatin von niedriger Qualität ist die erhaltene Ausbeute von Lipstatin bei Kristallisierung niedrig.Crude lipstatin can also be purified by crystallizing lipstatin at temperatures below -20ºC. However, this requires expensive low-temperature crystallization equipment and the yield of this crystallization depends heavily on the quality of the crude lipstatin. In particular, for low-quality crude lipstatin, the yield of lipstatin obtained upon crystallization is low.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues, einfaches und nicht teures Verfahren zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin in hoher Ausbeute und Reinheit bereit, sogar bei niedriger Qualität des Rohmaterials.The present invention provides a novel, simple and inexpensive process for purifying lipstatin from crude lipstatin in high yield and purity, even with low quality raw material.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin umfasst eineThe process of the present invention for purifying lipstatin from crude lipstatin comprises a
a) flüssig-flüssig Extraktion von Lipstatin aus einem nicht-polaren Lösungsmittel, ausgewählt aus einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, in ein polares Lösungsmittel, ausgewählt aus einer Carbonsäure, einem Alkohol, einem O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycol, einem Diol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, gefolgt vona) liquid-liquid extraction of lipstatin from a non-polar solvent selected from an aliphatic or aromatic hydrocarbon into a polar solvent, selected from a carboxylic acid, an alcohol, an O-monosubstituted mono- or oligoethylene glycol, a diol or a dipolar aprotic solvent, followed by
b) Verdünnen der polaren Lösungsmittelphase mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses und Rückextraktion von Lipstatin in ein frisches, nicht-polares Lösungsmittel.b) Dilute the polar solvent phase with water or change the phase ratio and back-extract lipstatin into a fresh, non-polar solvent.
Die folgenden Definitionen werden angegeben, um die Bedeutung und den Umfang der verschiedenen Ausdrücke, die hier zur Beschreibung der Erfindung verwendet werden, zu veranschaulichen und zu definieren.The following definitions are provided to illustrate and define the meaning and scope of the various terms used herein to describe the invention.
Der Ausdruck 'Doppelstrom-Extraktion' bedeutet eine Gegenstrom-Extraktion unter Verwendung von zwei Lösungsmitteln. Die Extraktion wird wie in der folgenden Abbildung gezeigt durchgeführt: The term 'double-flow extraction' means a countercurrent extraction using two solvents. The extraction is carried out as shown in the following figure:
Zwei Lösungsmittel, deren gegenseitige Löslichkeit ineinander gering ist, werden am Kopf und am Boden der Extraktionseinheit eingefüllt. Das aufzutrennende Gemisch (Beschickung) kann irgendwo eingefüllt werden, außer in Kombination mit dem Waschlösungsmittel, bevorzugt in der Mitte der Extraktionseinheit. In der vorstehend aufgeführten Abbildung wird die Extraktion in der Form durchgeführt, dass das Extraktionslösungsmittel bzw. der Extrakt das Lösungsmittel mit der höheren Dichte (schwere Phase) und das Waschlösungsmittel bzw. das Raffinat das Lösungsmittel mit der niedrigeren Dichte (leichte Phase) enthalten.Two solvents, the mutual solubility of which is low, are introduced at the top and bottom of the extraction unit. The mixture to be separated (feed) can be introduced anywhere except in combination with the washing solvent, preferably in the middle of the extraction unit. In the figure above, the extraction is carried out in such a way that the extraction solvent or the extract with the higher density (heavy phase) and the washing solvent or the raffinate contains the solvent with the lower density (light phase).
Der Ausdruck 'Gegenstrom-Extraktion' bedeutet, dass der zu extrahierende Stoff (Beschickung) zusammen mit einem der verwendeten Lösungsmittel zugegeben wird. In diesem Fall ist die Abtrennung von Verunreinigungen von der zu reinigenden Verbindung nicht so effektiv, wie im Falle einer Doppelstrom-Extraktion, da der Waschbereich weggelassen wird.The term 'countercurrent extraction' means that the substance to be extracted (feed) is added together with one of the solvents used. In this case, the separation of impurities from the compound to be purified is not as effective as in the case of double-current extraction, since the washing section is omitted.
Die Gegenstrom-Extraktion wird wie in der folgenden Abbildung gezeigt durchgeführt: Countercurrent extraction is performed as shown in the following figure:
Ein Lösungsmittel, zusammen mit der Beschickung, und ein anderes Lösungsmittel, mit geringer gegenseitiger Löslichkeit ineinander, werden am Kopf und am Boden der Extraktionseinheit eingefüllt. An einem Ausgang verlässt das Extraktionslösungsmittel, das mit dem gewünschten Stoff angereichert ist, die Säule (Extrakt). Am anderen Ausgang verlässt das Lösungsmittel, das zum Einfüllen der Beschickung verwendet wurde und das an gewünschtem Stoff (Raffinat) verarmt ist, die Säule. In der vorstehend aufgeführten Abbildung ist die Extraktion in der Form dargestellt, dass die Beschickung bzw. das Raffinat das Lösungsmittel mit der höheren Dichte (schwere Phase) und das für die Extraktion verwendete Lösungsmittel bzw. der Extrakt das Lösungsmittel mit der niedrigeren Dichte (leichte Phase) enthalten.A solvent, together with the feed, and another solvent, with low mutual solubility in each other, are introduced at the top and bottom of the extraction unit. At one exit, the extraction solvent, enriched in the desired substance (extract), leaves the column. At the other exit, the solvent used to introduce the feed and depleted in the desired substance (raffinate) leaves the column. In the figure above, the extraction is represented in such a way that the feed or raffinate contains the solvent with the higher density (heavy phase) and the solvent or extract used for extraction contains the solvent with the lower density (light phase).
Der Ausdruck 'rohes Lipstatin' bedeutet das Rohprodukt, das Lipstatin und Verunreinigungen enthält und das aus einem Fermentationsverfahren nach Abtrennen der Zellmasse, Extrahieren und Aufkonzentrieren erhalten wird.The term ‘crude lipstatin’ means the crude product containing lipstatin and impurities obtained from a fermentation process after separation of the cell mass, extraction and concentration.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem zwei flüssig-flüssig Extraktionen kombiniert werden, um Lipstatin aus rohem Lipstatin in hoher Reinheit und in praktisch quantitativer Ausbeute zu isolieren.The present invention relates to a process in which two liquid-liquid extractions are combined to isolate lipstatin from crude lipstatin in high purity and in practically quantitative yield.
Im Allgemeinen umfasst das Verfahren zur Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin eine flüssig-flüssig Extraktion von Lipstatin aus einem nicht-polaren Lösungsmittel, ausgewählt aus einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, in ein polares Lösungsmittel, ausgewählt aus einer Carbonsäure, einem Alkohol, einem O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycol, einem Diol oder einem dipolaren, aprotischen Lösungsmittel, gefolgt von Verdünnen der polaren Lösungsmittelphase mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses und Rückextraktion von Lipstatin in ein frisches, nicht-polares Lösungsmittel.In general, the process for purifying lipstatin from crude lipstatin comprises a liquid-liquid extraction of lipstatin from a non-polar solvent selected from an aliphatic or aromatic hydrocarbon into a polar solvent selected from a carboxylic acid, an alcohol, an O-monosubstituted mono- or oligoethylene glycol, a diol or a dipolar aprotic solvent, followed by diluting the polar solvent phase with water or changing the phase ratio and back-extraction of lipstatin into a fresh non-polar solvent.
Die flüssig-flüssig Extraktionen werden in den folgenden Lösungsmittelsystemen durchgeführt: Das nicht-polare Lösungsmittel wird ausgewählt aus einem aliphatischen oder einem aromatischen Kohlenwasserstoff. Bevorzugte aliphatische Kohlenwasserstoffe sind C&sub5;-C&sub8; aliphatische Kohlenwasserstoffe; mehr bevorzugt sind C&sub6;-C&sub7; aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Hexan oder Heptan. Aromatische Kohlenwasserstoffe können ausgewählt sein aus Benzol, gegebenenfalls substituiert mit 1 bis 3 Methylgruppen. Bevorzugte aromatische Kohlenwasserstoffe sind Benzol und Toluol.The liquid-liquid extractions are carried out in the following solvent systems: The non-polar solvent is selected from an aliphatic or an aromatic hydrocarbon. Preferred aliphatic hydrocarbons are C₅-C₈ aliphatic hydrocarbons; more preferred are C₆-C₇ aliphatic hydrocarbons, such as hexane or heptane. Aromatic hydrocarbons can be selected from benzene, optionally substituted with 1 to 3 methyl groups. Preferred aromatic hydrocarbons are benzene and toluene.
Das polare Lösungsmittel kann ausgewählt sein aus Carbonsäuren, zum Beispiel Ameisensäure oder C&sub1;-C&sub3; Alkylcarbonsäuren, wie Essigsäure oder Propionsäure, oder C&sub1;-C&sub3; Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, oder O-monosubstituierten Mono- oder Oligoethylenglycolen, wie Ethylenglycolmonomethylether oder C&sub2;-C&sub3; Diolen, wie Ethandiol oder 1,3-Propandiol, oder Furfuryl- oder Tetrahydrofurfurylalkohol. Ein dipolares aprotisches Lösungsmittel umfasst Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Sulfolan, Nitromethan usw. Bevorzugte polare Lösungsmittel sind in Wasser lösliche organische Carbonsäuren, Alkohole oder O-monosubstituierte Mono- oder Polyethylenglycole, zum Beispiel Essigsäure, Methanol oder Ethylenglycolmonomethylether, besonders bevorzugt ist Essigsäure.The polar solvent can be selected from carboxylic acids, for example formic acid or C₁-C₃ alkylcarboxylic acids such as acetic acid or propionic acid, or C₁-C₃ alcohols such as methanol, ethanol, propanol, or O-monosubstituted mono- or oligoethylene glycols such as ethylene glycol monomethyl ether or C₂-C₃ diols such as ethanediol or 1,3-propanediol, or furfuryl or tetrahydrofurfuryl alcohol. A dipolar aprotic solvent includes solvents such as dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, sulfolane, nitromethane, etc. Preferred polar solvents are water-soluble organic carboxylic acids, alcohols or O-monosubstituted mono- or polyethylene glycols, for example acetic acid, methanol or ethylene glycol monomethyl ether, particularly preferred is acetic acid.
Das polare Lösungsmittel kann entweder direkt verwendet werden, oder als ein Gemisch mit Wasser.The polar solvent can be used either directly or as a mixture with water.
Im ersten Extraktionsschritt werden die nicht-polaren Verunreinigungen und im zweiten Extraktionsschritt die polaren Verunreinigungen aus rohem Lipstatin entfernt. Eine Extraktion von Lipstatin in ein polares Lösungsmittel hat die Entfernung von nicht-polaren Verunreinigungen und eine Extraktion von Lipstatin in ein nicht-polares Lösungsmittel hat die Entfernung von polaren Verunreinigungen zur Folge.In the first extraction step, the non-polar impurities and in the second extraction step, the polar impurities are removed from crude lipstatin. Extraction of lipstatin into a polar solvent results in the removal of non-polar impurities and extraction of lipstatin into a non-polar solvent results in the removal of polar impurities.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die gleichen Lösungsmittel in beiden Extraktionen verwendet. Der ersten Extraktion folgt ein zweiter Schritt, umfassend Verdünnen des polaren Lösungsmittels mit Wasser oder Ändern des Phasenverhältnisses, um die Verteilung von Lipstatin zu verändern.In a preferred embodiment, the same solvents are used in both extractions. The first extraction is followed by a second step comprising diluting the polar solvent with water or changing the phase ratio to alter the distribution of lipstatin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erste Extraktion in einer Art und Weise durchgeführt, dass Lipstatin in ein polares Lösungsmittel extrahiert wird, gefolgt von Rückextraktion von Lipstatin aus diesem polaren Lösungsmittel mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, bevorzugt mit dem gleichen nicht-polaren Lösungsmittel, das im ersten Extraktionsschritt verwendet wurde.In a further preferred embodiment, the first extraction is carried out in a manner that lipstatin is extracted into a polar solvent, followed by back-extraction of lipstatin from this polar solvent with a non-polar solvent, preferably with the same non-polar solvent that was used in the first extraction step.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die flüssig-flüssig Extraktion des ersten Schritts dadurch gekennzeichnet, dass das polare Lösungsmittel etwa 1 bis etwa 20% Wasser, mehr bevorzugt etwa 5% Wasser enthält.In a preferred embodiment, the liquid-liquid extraction of the first step is characterized in that the polar solvent contains about 1 to about 20% water, more preferably about 5% water.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das nicht-polare Lösungsmittel ein aliphatischer Kohlenwasserstoff. Besonders bevorzugt ist Heptan.In a further preferred embodiment, the non-polar solvent is an aliphatic hydrocarbon. Heptane is particularly preferred.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die flüssig-flüssig Extraktion des ersten Schritts als Doppelstrom-Extraktion durchgeführt und Lipstatin wird in das polare Lösungsmittel extrahiert. Die Beschickung ist rohes Lipstatin, das durch eines der verwendeten Lösungsmittel verdünnt werden kann. Lipstatin wird in die polare (schwere) Phase extrahiert; nicht-polare Verunreinigungen, wie Fettsäuren oder Glyceride verbleiben in der nicht-polaren (leichten) Phase. Da die Verteilungskoeffizienten von Lipstatin und den Verunreinigungen von den Konzentrationen abhängen, müssen das Phasenverhältnis der beiden Lösungsmittel, die Anzahl der theoretischen Stufen des Extraktionssystems und das Verhältnis von Beschickung zu den Lösungsmitteln in einer geeigneten Weise angepasst werden (Lo, TC, Bairds, MHI, Hafez, M, Hanson, C (1983): Handbook of solvent extraction. Wiley, New York). Die Abhängigkeit des Verteilungskoeffizienten von der Konzentration variiert stark mit der Art des polaren Lösungsmittels, das in diesem Extraktionssystem verwendet wird. Mit wässriger Essigsäure erreicht man sehr gute Ergebnisse, wobei hohe Konzentrationen und deshalb ein hoher Durchsatz und ein Minimum an verwendetem Lösungsmittel erreicht werden können.In the most preferred embodiment of the present invention, the liquid-liquid extraction of the first step is carried out as a double-flow extraction and lipstatin is extracted into the polar solvent. The feed is crude lipstatin, which can be diluted by any of the solvents used. Lipstatin is extracted into the polar (heavy) phase; non-polar impurities such as fatty acids or glycerides remain in the non-polar (light) phase. Since the distribution coefficients of lipstatin and the impurities depend on the concentrations, the phase ratio of the two solvents, the number of theoretical stages of the extraction system and the ratio of feed to solvents must be adjusted in an appropriate manner (Lo, TC, Bairds, MHI, Hafez, M, Hanson, C (1983): Handbook of solvent extraction. Wiley, New York). The dependence of the partition coefficient on concentration varies greatly with the type of polar solvent used in the extraction system. Very good results are obtained with aqueous acetic acid, whereby high concentrations and therefore high throughput and a minimum of solvent used can be achieved.
Die Extraktion kann entweder unter Verwendung einer kontinuierlichen Extraktionseinrichtung, wie eines Mischer-Abscheider-Systems, oder einer Extraktionssäule, wie einer Extraktionsvorrichtung mit Pulsationsboden oder einer Kolonne mit Rührvorrichtung, durchgeführt werden.The extraction can be carried out using either a continuous extraction device, such as a mixer-separator system, or an extraction column, such as a pulsated bottom extraction device or a column with agitation device.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das polare Lösungsmittel vor der Rückextraktion (der zweite Schritt der Reinigung) durch Zugabe von Wasser auf ungefähr 70% bis 90%, bevorzugt auf etwa 80% verdünnt.In a preferred embodiment, the polar solvent is diluted to about 70% to 90%, preferably to about 80%, by addition of water prior to back extraction (the second step of purification).
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Rückextraktion im zweiten Reinigungsschritt als Gegenstrom-Extraktion durchgeführt und Lipstatin wird in ein nicht-polares Lösungsmittel extrahiert. In diesem Fall kann der Extrakt der ersten Extraktion direkt verwendet werden. Im Gegensatz zu einer Doppelstrom-Extraktion, bei der eine konzentrierte Lipstatin-Beschickung erforderlich ist, ist in diesem Fall, in dem die zweite Extraktion als eine Gegenstrom-Extraktion als ein kontinuierliches Verfahren durchgeführt wird, kein Aufkonzentrieren von Lipstatin nach der ersten Extraktion notwendig. Lipstatin wird in die nicht-polare (leichte) Phase extrahiert und die polaren Verunreinigungen verbleiben in der polaren (schweren) Phase.In the most preferred embodiment of the present invention, the back extraction in the second purification step is carried out as a countercurrent extraction and lipstatin is extracted into a non-polar solvent. In this case, the extract from the first extraction can be used directly. In contrast to a double-current extraction, where a concentrated lipstatin feed is required, in this case, where the second extraction is carried out as a countercurrent extraction as a continuous process, no concentration of lipstatin after the first extraction is necessary. Lipstatin is extracted into the non-polar (light) phase and the polar impurities remain in the polar (heavy) phase.
Während der Fermentation werden mehrere Aminosäureanaloga von Lipstatin gebildet. Lipstatin selber enthält N-Formyl-(S)-leucin als eine Seitenkette, wogegen die Nebenprodukte andere N-Formyl-Aminosäuren enthalten. Eines dieser Nebenprodukte ist das methionin-analoge Lipstatin. Rohes Lipstatin enthält, relativ zu Lipstatin, bis zu 3% dieses Nebenproduktes. Bei der Reinigung von Lipstatin ist es von großer Bedeutung, diese Verunreinigung zu entfernen.During fermentation, several amino acid analogues of lipstatin are formed. Lipstatin itself contains N-formyl-(S)-leucine as a side chain, whereas the byproducts contain other N-formyl amino acids. One of these byproducts is the methionine analogue lipstatin. Crude lipstatin contains up to 3% of this byproduct relative to lipstatin. When purifying lipstatin, it is of great importance to remove this impurity.
Ansonsten würde durch diese Schwefel enthaltende Verbindung eine später durchgeführte Hydrierung gehemmt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Reinigung von rohem Lipstatin weiter verbessert, wenn das methionin-analoge Lipstatin in rohem Lipstatin vor der Extraktion oxidiert wird. Es ist nicht möglich das methionin-analoge Lipstatin direkt durch Reinigung über Kristallisierung oder Extraktion aus Lipstatin zu entfernen, außer nach einer Oxidation zum entsprechenden Sulfoxid oder Sulfon. Diese Oxidation kann über ein herkömmliches Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel über die Verwendung von Peressigsäure in Essigsäure. Das methionin-analoge Lipstatin kann entweder zum Sulfoxid oder zum Sulfon oxidiert werden: Otherwise, this sulfur-containing compound would inhibit a subsequent hydrogenation. According to the present invention, the purification of crude lipstatin is further improved if the methionine analogue lipstatin in crude lipstatin is oxidized before extraction. It is not possible to remove the methionine analogue lipstatin directly from lipstatin by purification via crystallization or extraction, except after oxidation to the corresponding sulfoxide or sulfone. This oxidation can be carried out by a conventional method, for example by using peracetic acid in acetic acid. The methionine analogue lipstatin can be oxidized to either the sulfoxide or the sulfone:
Das Oxidationsmittel wird in äquimolarer Menge, oder in einer Menge von bis zu 1,5 Äquivalenten zu methionin-analogem Lipstatin verwendet, wenn das Sulfoxid benötigt wird oder es wird in der doppelten Menge verwendet, wenn das Sulfon benötigt wird. Ein größerer Überschuss sollte vermieden werden, um Lipstatin vor oxidativem Abbau zu schützen. Die Oxidation wird bei 0º bis 50ºC durchgeführt, bevorzugt bei Raumtemperatur; die Umsetzung ist in wenigen Minuten abgeschlossen. Das bei der Oxidation verwendete Lösungsmittel ist nicht kritisch und bevorzugt wird auch bei der Oxidation eines der Lösungsmittel verwendet, die während des Extraktions-Reinigungsverfahrens verwendet werden. Das methionin-analoge Lipstatin kann entweder im rohen Lipstatin oder nach dem ersten Extraktions-Reinigungsschritt oxidiert werden. Bevorzugt wird die Oxidation mit rohem Lipstatin in einer Heptanlösung von hoher Konzentration durchgeführt und das dabei erhaltene Gemisch wird als Beschickung für den ersten Extraktions-Reinigungsschritt verwendet. Das oxidierte methionin-analoge Lipstatin ist eine polare Verunreinigung und wird während der zweiten Extraktion entfernt, wobei es in der polaren Phase verbleibt.The oxidizing agent is used in an equimolar amount, or in an amount of up to 1.5 equivalents to methionine analogue lipstatin when the sulfoxide is required, or it is used in twice the amount when the sulfone is required. A greater excess should be avoided to protect lipstatin from oxidative degradation. The oxidation is carried out at 0º to 50ºC, preferably at room temperature; the reaction is complete in a few minutes. The solvent used in the oxidation is not critical and preferably one of the solvents used during the extraction-purification process is also used in the oxidation. The methionine analogue lipstatin can be oxidized either in the crude lipstatin or after the first extraction-purification step. Preferably, the oxidation is carried out with crude lipstatin in a high concentration heptane solution and the resulting mixture is used as feed for the first extraction-purification step. The oxidized methionine analogue lipstatin is a polar impurity and is removed during the second extraction, remaining in the polar phase.
Gemäß dem Unterschied zwischen den Verteilungskoeffizienten von Lipstatin und oxidiertem methionin-analogem Lipstatin ist es ausreichend, dass der zweite Extraktionsschritt als eine Gegenstrom-Extraktion durchgeführt wird, bei der der Extrakt aus dem ersten Extraktionsschritt direkt nach der Zugabe von Wasser verwendet wird, wenn bei der Reinigung durch Extraktion das System 'wässrige Essigsäure/Heptan' verwendet wird. Deshalb wird in der am meisten bevorzugten Ausführungsform eine Reinigung von Lipstatin aus rohem Lipstatin durch Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan, gefolgt von Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure und Gegenstrom- Extraktion der Lösung mit Heptan erreicht. Gereinigtes Lipstatin kann dann aus Heptan durch Aufkonzentrieren oder Kristallisierung isoliert werden. Dieses bevorzugte Verfahren ist in der folgenden Figur veranschaulicht: According to the difference between the partition coefficients of lipstatin and oxidized methionine analogue lipstatin, it is sufficient that the second extraction step is carried out as a countercurrent extraction using the extract from the first extraction step directly after the addition of water when the 'aqueous acetic acid/heptane' system is used in the purification by extraction. Therefore, in the most preferred embodiment, purification of lipstatin from crude lipstatin is achieved by double-current extraction of crude lipstatin in about 95% acetic acid/heptane, followed by dilution of the lipstatin solution with water to about 80% acetic acid and countercurrent extraction of the solution with heptane. Purified lipstatin can then be isolated from heptane by concentration or crystallization. This preferred method is illustrated in the following figure:
Wie vorstehend ausgedrückt, kann Lipstatin, das über jedes der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt worden sein kann, durch Hydrierung in Tetrahydrolipstatin (Orlistat) umgewandelt werden. Die Hydrierung von Lipstatin kann gemäß Verfahren durchgeführt werden, die an sich bekannt sind, zum Beispiel, in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie im U.S. Patent Nr. 4,598,089 beschrieben. Beispiele für Katalysatoren, die verwendet werden können, sind Palladium/Kohle, Platinoxid, Palladium und dergleichen. Das Lösungsmittel, das zur Hydrierung verwendet wird, ist nicht kritisch. Das am stärksten bevorzugte Lösungsmittel ist jenes, das im letzten Extraktionsschritt verwendet wurde. In diesem Fall wird der Lipstatin enthaltende Extrakt direkt oder nach Aufkonzentrieren zur Hydrierung verwendet.As stated above, lipstatin, which may have been prepared by any of the methods described above, can be converted into tetrahydrolipstatin (orlistat) by hydrogenation. The hydrogenation of lipstatin can be carried out according to the method which are known per se, for example, in the presence of a suitable catalyst as described in US Patent No. 4,598,089. Examples of catalysts that can be used are palladium/carbon, platinum oxide, palladium and the like. The solvent used for hydrogenation is not critical. The most preferred solvent is that used in the last extraction step. In this case, the extract containing lipstatin is used for hydrogenation directly or after concentration.
Andere geeignete Lösungsmittel sind zum Beispiel niedere Alkohole, wie zum Beispiel Methanol und Ethanol, Ether, wie tert.-Butylmethylether oder Tetrahydrofuran, Essigsäure oder halogenierte Lösungsmittel, wie Dichlormethan. Die Hydrierung wird bevorzugt bei niedrigen Wasserstoffdrucken und bei Raumtemperatur durchgeführt. Dem entsprechend umfasst die vorliegende Erfindung auch die vorstehend aufgeführten Extraktionsverfahren, gefolgt von der Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin. Bevorzugt wird die Umsetzung mit einem Hydrierkatalysator, der ein Edelmetall enthält, bei 25ºC bei niedrigem Wasserstoffdruck, zum Beispiel 0,5 bis 5 bar, durchgeführt.Other suitable solvents are, for example, lower alcohols, such as methanol and ethanol, ethers, such as tert-butyl methyl ether or tetrahydrofuran, acetic acid or halogenated solvents, such as dichloromethane. The hydrogenation is preferably carried out at low hydrogen pressures and at room temperature. Accordingly, the present invention also includes the extraction processes listed above, followed by the hydrogenation of lipstatin to tetrahydrolipstatin. The reaction is preferably carried out with a hydrogenation catalyst containing a noble metal at 25°C at low hydrogen pressure, for example 0.5 to 5 bar.
Tetrahydrolipstatin kann durch Kristallisierung gereinigt und isoliert werden. Bevorzugt wird ein nicht-polares Lösungsmittel, wie Hexan oder Heptan, zur Hydrierung und Kristallisierung verwendet.Tetrahydrolipstatin can be purified and isolated by crystallization. Preferably, a non-polar solvent such as hexane or heptane is used for hydrogenation and crystallization.
Zusammengefasst bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren, wie vorstehend definiert, umfassendIn summary, the present invention relates to a method as defined above, comprising
a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatina) Oxidation of methionine analogue lipstatin
b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;b) double-stream extraction of crude lipstatin in approximately 95% acetic acid/heptane;
c) Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure; undc) Dilute the lipstatin solution with water to about 80% acetic acid; and
d) Gegenstrom-Extraktion dieser Lösung mit Heptan.d) Countercurrent extraction of this solution with heptane.
Nach diesem Verfahren kann eine Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin durchgeführt werden, gegebenenfalls gefolgt von Kristallisierung von Tetrahydrolipstatin.According to this process, hydrogenation of lipstatin to tetrahydrolipstatin can be carried out, optionally followed by crystallization of tetrahydrolipstatin.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung von Tetrahydrolipstatin, umfassendThe present invention also includes a process for producing tetrahydrolipstatin, comprising
a) Oxidation von methionin-analogem Lipstatina) Oxidation of methionine analogue lipstatin
b) Doppelstrom-Extraktion von rohem Lipstatin in etwa 95% Essigsäure/Heptan;b) double-stream extraction of crude lipstatin in approximately 95% acetic acid/heptane;
c) Verdünnen der Lipstatinlösung mit Wasser auf etwa 80% Essigsäure; undc) Dilute the lipstatin solution with water to about 80% acetic acid; and
d) Gegenstrom-Extraktion dieser Lösung mit Heptan, gefolgt vond) Countercurrent extraction of this solution with heptane, followed by
e) Hydrierung von Lipstatin zu Tetrahydrolipstatin.e) Hydrogenation of lipstatin to tetrahydrolipstatin.
Außerdem bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der vorstehend aufgeführten Verfahren zur Herstellung von Lipstatin und Tetrahydrolipstatin.The invention also relates to the use of the above-mentioned processes for the preparation of lipstatin and tetrahydrolipstatin.
Die folgenden Beispiele sollen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen, es ist aber nicht beabsichtigt mit diesen Beispielen den Bereich der Erfindung einzuschränken.The following examples are intended to illustrate preferred embodiments of the invention, but these examples are not intended to limit the scope of the invention.
Rohes Lipstatin aus einer Fermentation wurde nach der Abtrennung der Biomasse und nach der Extraktion aufkonzentriert. Das verwendete Material enthielt 58% (w/w) Lipstatin (HPLC- Analyse) und 0,9% (w/w) methionin-analoges Lipstatin (¹H-NMR-Analyse).Crude lipstatin from a fermentation was concentrated after separation of the biomass and after extraction. The material used contained 58% (w/w) lipstatin (HPLC analysis) and 0.9% (w/w) methionine analogue lipstatin (1H NMR analysis).
a. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: 55,7 g rohes Lipstatin werden mit 77 ml Heptan verdünnt. 212 ul einer 37%igen Lösung von Peressigsäure in Essigsäure wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt.a. Oxidation of methionine analogue lipstatin: 55.7 g of crude lipstatin are diluted with 77 mL of heptane. 212 μL of a 37% solution of peracetic acid in acetic acid were added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
b. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: Zur Simulierung einer Extraktionsvorrichtung mit 7 Trennstufen wurden 7 Scheidetrichter verwendet.b. Double-stream extraction with heptane/95% aqueous acetic acid: 7 separatory funnels were used to simulate an extraction device with 7 separation stages.
Das Gemisch das aus dem Oxidationsverfahren, das in a beschrieben wird, erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt und der vierte Scheidetrichter (sf-4, 4th separatory funnel) wurde mit jedem Anteil beschickt. Beginnend mit der sf-4-Beschickung, wurden 50 ml Heptan und 100 ml 95%ige wässrige Essigsäure zugegeben, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrige Essigsäure von 1/2. Das Gemisch wurde geschüttelt und die Phasen voneinander getrennt. Die obere Phase wurde in den nächsten und die untere Phase in den vorherigen Scheidetrichter überführt. Am Anfang wurden frische Lösungsmittel verwendet, die Schritt für Schritt mit den Phasen aus dem vorherigen und dem nächsten Scheidetrichter ersetzt wurden. Als alle Scheidetrichter auf diese Art und Weise gefüllt worden waren, wurde Heptan nur in den ersten Scheidetrichter und wässrige Essigsäure nur in den siebten Scheidetrichter gegeben. Der Lipstatin enthaltende Extrakt wurde gesammelt. Im Raffinat wurde das Lipstatin über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seinen Gehalt unter einem Gramm pro Liter zu halten, und um das vorher berechnete Phasenverhältnis und die Konzentration zu überwachen.The mixture obtained from the oxidation process described in a was divided into 6 portions and the fourth separatory funnel (sf-4) was charged with each portion. Starting with the sf-4 feed, 50 mL of heptane and 100 mL of 95% aqueous acetic acid were added, which is equivalent to a phase ratio of heptane/aqueous acetic acid of 1/2. The mixture was shaken and the phases separated. The upper phase was transferred to the next and the lower phase to the previous separatory funnel. Fresh solvents were used at the beginning, which were mixed step by step with the phases from the previous and the next. Separatory funnels were replaced. When all the separatory funnels had been filled in this manner, heptane was added only to the first separatory funnel and aqueous acetic acid was added only to the seventh separatory funnel. The extract containing lipstatin was collected. In the raffinate, the lipstatin was controlled by thin layer chromatography to keep its content below one gram per liter and to monitor the previously calculated phase ratio and concentration.
Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange beide, unbeladene Lösungsmittel zugefügt, bis das ganze Lipstatin aus dem System ausgewaschen war. Die folgende Abbildung veranschaulicht diese Extraktion: Once all the crude lipstatin had been charged, both unloaded solvents were added until all the lipstatin was washed out of the system. The following figure illustrates this extraction:
Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 600 ml aufkonzentriert. Der Wassergehalt, bestimmt nach dem Karl-Fischer- Verfahren, war 3,5%.The extract was concentrated to a volume of about 600 ml by distilling off solvent under reduced pressure. The water content, determined by the Karl Fischer method, was 3.5%.
c. Gegenstrom-Extraktion: Zur Simulierung einer Extraktionsvorrichtung mit 7 Trennstufen wurden wieder 7 Scheidetrichter verwendet.c. Countercurrent extraction: To simulate an extraction device with 7 separation stages, 7 separating funnels were again used.
Der Extrakt, der in b. (600 ml) erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt (jeweils 100 ml) und jeder Anteil wurde zusammen mit 30 ml Wasser in den siebten Scheidetrichter eingefüllt. 130 ml Heptan wurden in den ersten Scheidetrichter gegeben. Die Extraktion wurde als Simulierung eines kontinuierlichen Verfahrens, ähnlich wie unter Punkt b) durch Überführung der oberen Phase in den folgenden und der unteren Phase in den vorherigen Scheidetrichter, durchgeführt. Im Raffinat wurde das Lipstatin über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seinen Gehalt unter einem Gramm pro Liter zu halten, und um das vorher berechnete Phasenverhältnis und die Konzentration zu überwachen. Als mit der ganzen Extraktlösung aus dem ersten Extraktionsschritt beschickt worden war, wurden solange beide Lösungsmittel zugefügt, bis das ganze Lipstatin aus dem System ausgewaschen war. Die folgende Abbildung veranschaulicht diese Extraktion: The extract obtained in b. (600 ml) was divided into 6 portions (100 ml each) and each portion was added to the seventh separatory funnel together with 30 ml of water. 130 ml of heptane was added to the first separatory funnel. The extraction was carried out simulating a continuous process, similar to point b) by transferring the upper phase into the following and the lower phase into the previous separatory funnel. In the raffinate, the lipstatin was controlled by thin layer chromatography to keep its content below one gram per liter and to monitor the previously calculated phase ratio and concentration. Once all the extract solution from the first extraction step had been charged, both solvents were added until all the lipstatin was washed out of the system. The following figure illustrates this extraction:
Das gereinigte Lipstatin in Heptan (Extrakt) wurde gesammelt und unter verringertem Druck auf ein Volumen von 250 ml aufkonzentriert. Diese Lösung enthielt 35,3 g gereinigtes Lipstatin mit einer Reinheit von 90% (w/w) (HPLC). Dies ist gleichbedeutend mit 98% Ausbeute, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, in Bezug auf Lipstatin im Rohprodukt.The purified lipstatin in heptane (extract) was collected and concentrated under reduced pressure to a volume of 250 mL. This solution contained 35.3 g of purified lipstatin with a purity of 90% (w/w) (HPLC). This is equivalent to 98% yield calculated on the content of lipstatin in the purified product, with respect to lipstatin in the crude product.
d. Hydrierung: Die 250-ml-Lösung von gereinigtem Lipstatin wurde in einem Edelstahlautoklaven bei 25ºC, bei einem Druck von 5 bar, für insgesamt 6 Stunden, mit 3,5 g 5% Palladium auf Aktivkohle hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in 700 ml Heptan aufgelöst und das Tetrahydrolipstatin wurde bei 0ºC kristallisiert. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem Heptan gewaschen und im Vakuum bei 25ºC getrocknet. 28 g Tetrahydrolipstatin von 96%iger (w/w) Reinheit (HPLC) wurden erhalten. Dies ist gleichbedeutend mit 85% Ausbeute, bezogen auf Lipstatin im gereinigten Produkt. Die Reinheit von Tetrahydrolipstatin, nach Umkristallisierung in Hexan, war 97% (w/w, bestimmt über HPLC).d. Hydrogenation: The 250 ml solution of purified lipstatin was hydrogenated in a stainless steel autoclave at 25ºC, at a pressure of 5 bar, for a total of 6 hours, with 3.5 g of 5% palladium on charcoal. The catalyst was filtered off and the filtrate evaporated. The residue was dissolved in 700 ml of heptane and the tetrahydrolipstatin was crystallized at 0ºC. The product was filtered off, washed with cold heptane and dried in vacuo at 25ºC. 28 g of tetrahydrolipstatin of 96% (w/w) purity (HPLC) were obtained. This corresponds to 85% yield based on lipstatin in purified product. The purity of tetrahydrolipstatin, after recrystallization from hexane, was 97% (w/w, determined by HPLC).
Ein siebenstufiges Mischer-Abscheider-System wurde zur kontinuierlichen Extraktion mit den selben Lösungsmitteln, die in Beispiel 1 verwendet wurden, verwendet.A seven-stage mixer-separator system was used for continuous extraction with the same solvents used in Example 1.
Das verwendete aufkonzentrierte, rohe Lipstatin hatte eine Reinheit von 65% (w/w) und enthielt 0,14% (w/w) methionin-analoges Lipstatin.The concentrated crude lipstatin used had a purity of 65% (w/w) and contained 0.14% (w/w) methionine analogue lipstatin.
a. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: 100 kg rohes Lipstatin wurden mit 100 kg Heptan verdünnt und diese Lösung wurde als Beschickung verwendet. Der Mischer-Abscheider wurde mit Heptan und 95%iger wässriger Essigsäure in einem Phasenverhältnis von 1/2 (v/v) gefüllt. Zur Reinigung durch Extraktion wurde mit 37,5 Liter Heptan pro Stunde, 75 Liter 95%ige wässrige Essigsäure pro Stunde und 15 Liter Lösung von rohem Lipstatin pro Stunde beschickt. Heptan wurde in den ersten, die Lipstatinlösung in den vierten und die wässrige Essigsäure in den siebten Mischer gegeben. Der Lipstatin enthaltende Extrakt und das die nicht-polaren Verunreinigungen enthaltende Raffinat wurden gesammelt. Der Gehalt von Lipstatin im Raffinat wurde über Dünnschichtchromatographie kontrolliert, um seine Menge unter einem Gramm pro Liter zu halten. Nach der Beschickung mit dem ganzen rohen Lipstatin, wurde mit der Beschickung mit den beiden Lösungsmitteln fortgefahren, bis alles Lipstatin ausgewaschen war. Eine Probe des Extrakts (untere Phase) wurde aufkonzentriert und hatte eine Reinheit an Lipstatin von 71% (w/w). Insgesamt wurden 1500 kg Extrakt erhalten, wobei der Wassergehalt 4,6% (Karl-Fischer-Verfahren) war.a. Double-flow extraction with heptane/95% aqueous acetic acid: 100 kg of crude lipstatin was diluted with 100 kg of heptane and this solution was used as feed. The mixer-separator was filled with heptane and 95% aqueous acetic acid in a phase ratio of 1/2 (v/v). For purification by extraction, 37.5 liters of heptane per hour, 75 liters of 95% aqueous acetic acid per hour and 15 liters of crude lipstatin solution per hour were fed. Heptane was added to the first mixer, the lipstatin solution to the fourth and the aqueous acetic acid to the seventh. The extract containing lipstatin and the raffinate containing the non-polar impurities were collected. The content of lipstatin in the raffinate was controlled by thin layer chromatography to keep its amount below one gram per liter. After charging all the crude lipstatin, charging with the two solvents was continued until all the lipstatin was washed out. A sample of the extract (lower phase) was concentrated and had a purity of lipstatin of 71% (w/w). A total of 1500 kg of extract was obtained, with a water content of 4.6% (Karl Fischer method).
b. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: Zur Extraktlösung der vorherigen Extraktion wurden 60 ml einer Lösung von 37%iger Peressigsäure in Essigsäure zugegeben und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.b. Oxidation of methionine analogue lipstatin: 60 ml of a solution of 37% peracetic acid in acetic acid was added to the extract solution of the previous extraction and the mixture was stirred for 30 minutes at room temperature.
c. Gegenstrom-Extraktion: 280 Liter Wasser wurden zugegeben, um einen Wassergehalt von 20% einzustellen. Um eine ölige Phase von Lipstatin nach der Zugabe von Wasser abzutrennen, wurde diese Lösung mit 600 Liter Heptan extrahiert. Dieser Extrakt wurde abgetrennt und später zur Heptanphase der kontinuierlichen Extraktion zugegeben.c. Countercurrent extraction: 280 liters of water were added to adjust the water content to 20%. To separate an oily phase of lipstatin after the addition of water, this solution was extracted with 600 liters of heptane. This extract was separated and later added to the heptane phase of the continuous extraction.
Für die später durchgeführte kontinuierliche Extraktion der verbleibenden Lösung von Lipstatin in wässriger Essigsäure wurde der selbe Mischer-Abscheider verwendet wie bei der ersten Extraktion. Die kontinuierliche Extraktion wurde durch Beschickung des ersten Mischers mit 50 Liter Heptan pro Stunde und durch Beschickung des siebten Mischers mit 50 Liter Lösung von Lipstatin in wässriger Essigsäure pro Stunde durchgeführt. Der Heptanextrakt wurde zu dem vorher erhaltenen Extrakt gegeben und diese Lösung wurde auf ein Volumen von ungefähr 1000 Liter, durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck, aufkonzentriert. Eine Probe wurde bis zur Trockene aufkonzentriert, wobei Lipstatin mit 86% (w/w) Reinheit erhalten wurde.For the subsequent continuous extraction of the remaining solution of lipstatin in aqueous acetic acid, the same mixer-separator was used as for the first extraction. The continuous extraction was carried out by feeding the first mixer with 50 liters of heptane per hour and by feeding the seventh mixer with 50 liters of solution of lipstatin in aqueous acetic acid per hour. The heptane extract was added to the previously obtained extract and this solution was concentrated to a volume of approximately 1000 liters by distilling off solvent under reduced pressure. A sample was concentrated to dryness to obtain lipstatin with 86% (w/w) purity.
d. Hydrierung: Die erhaltene Lösung wurde in drei Chargen von gleicher Größe hydriert. Die Hydrierung wurde in einem Rührhydrierkessel mit Glasfutter durchgeführt. Für eine Charge wurden 2 kg 5% Palladium auf Aktivkohle verwendet. Die Hydrierung war nach einer Stunde abgeschlossen; Der Wasserstoffdruck erreichte 5 bar. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels aufkonzentriert. Eine getrocknete Probe des Produkts enthielt 90% (w/w) Tetrahydrolipstatin (die Qualität ist höher, als die von gereinigtem Lipstatin, da Lipstatin 'umwandelbare' Nebenprodukte von Isomeren mit verschiedenen Stellungen von C=C Doppelbindungen oder mit nur einer C=C Doppelbindung enthält, die nach der Hydrierung auch in Tetrahydrolipstatin umgewandelt sind). 600 kg Heptan wurden zugefügt und Tetrahydrolipstatin wurde bei 0ºC kristallisiert. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem Heptan gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet.d. Hydrogenation: The obtained solution was hydrogenated in three batches of equal size. The hydrogenation was carried out in a stirred hydrogenation vessel with glass lining. For one batch 2 kg of 5% palladium on activated carbon were used. The hydrogenation was completed after one hour; the hydrogen pressure reached 5 bar. The catalyst was filtered off and the filtrate was concentrated by distilling off the solvent. A dried sample of the product contained 90% (w/w) tetrahydrolipstatin (the quality is higher than that of purified lipstatin because lipstatin contains ‘convertible’ by-products of isomers with different positions of C=C double bonds or with only one C=C double bond, which are also converted to tetrahydrolipstatin after hydrogenation). 600 kg of heptane were added and tetrahydrolipstatin was crystallized at 0ºC. The product was filtered off, washed with cold heptane and dried under reduced pressure.
In einer Charge erhielt man 17 kg Tetrahydrolipstatin mit 97%iger (w/w) Reinheit. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 76% von Tetrahydrolipstatin, bezogen auf Lipstatin in rohem Lipstatin.In one batch, 17 kg of tetrahydrolipstatin with 97% (w/w) purity was obtained. This corresponds to a yield of 76% of tetrahydrolipstatin based on lipstatin in crude lipstatin.
Rohes Lipstatin aus einer Fermentation wurde nach der Abtrennung der Biomasse und nach der Extraktion aufkonzentriert. Das Material enthielt 62% (w/w) Lipstatin und 0,1% (w/w) methionin-analoges Lipstatin.Crude lipstatin from a fermentation was concentrated after separation of the biomass and after extraction. The material contained 62% (w/w) lipstatin and 0.1% (w/w) methionine analogue lipstatin.
a. Oxidation von methionin-analogem Lipstatin: 53 g rohes Lipstatin wurden mit 75 ml Heptan verdünnt. 24 ul einer 37%igen Lösung von Peressigsäure in Essigsäure wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt.a. Oxidation of methionine analogue lipstatin: 53 g of crude lipstatin was diluted with 75 mL of heptane. 24 μL of a 37% solution of peracetic acid in acetic acid was added and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
b. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/10% wässrigem Methanol: Das selbe System, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestehend aus sieben Scheidtrichtern, wurde zur Simulierung einer kontinuierlichen Extraktion verwendet. Das Gemisch das aus dem Oxidationsverfahren, das in a beschrieben wird, erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt und der vierte Scheidetrichter wurde mit jedem Anteil beschickt. 100 ml Heptan wurden in den ersten und 10 ml 10%iges wässriges Methanol wurden in den siebten Scheidetrichter eingefüllt, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrigem Methanol von 10/1. Der Extrakt (obere Phase, Lipstatin in Heptan) wurde gesammelt. Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange die beiden, frischen Lösungsmittel zugegeben, bis das ganze Lipstatin ausgewaschen war. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels unter verringertem Druck auf ein Volumen von 110 ml aufkonzentriert.b. Double-flow extraction with heptane/10% aqueous methanol: The same system as described in Example 1, consisting of seven separatory funnels, was used to simulate a continuous extraction. The mixture obtained from the oxidation process described in a was divided into 6 portions and the fourth separatory funnel was charged with each portion. 100 mL of heptane was charged into the first and 10 mL of 10% aqueous methanol was charged into the seventh separatory funnel, which is equivalent to a phase ratio of heptane/aqueous methanol of 10/1. The extract (upper phase, lipstatin in heptane) was collected. When all the crude lipstatin had been charged, the two fresh solvents were added until all the lipstatin had been washed out. The extract was concentrated to a volume of 110 ml by distilling off the solvent under reduced pressure.
c. Zusätzliche Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/10% wässrigem Methanol: Die Lösung, die aus der vorstehenden Extraktion erhalten wurde, wurde in 6 Anteile aufgeteilt. Mit dem selben System von sieben Scheidetrichtern, wie zuvor verwendet, wurde die selbe Art der Extraktion durchgeführt, aber mit einem unterschiedlichen Phasenverhältnis. Jeder Anteil der Beschickung wurde in den vierten Scheidetrichter eingefüllt. 100 ml Heptan wurden in den ersten und 100 ml 10%iges wässriges Methanol wurden in den siebten Scheidetrichter eingefüllt, was gleichbedeutend ist mit einem Phasenverhältnis von Heptan/wässrigem Methanol von 1/1. Der Extrakt (untere Phase, Lipstatin in wässrigem Methanol) wurde gesammelt. Als mit dem ganzen rohen Lipstatin beschickt worden war, wurden solange die beiden, frischen Lösungsmittel zugegeben, bis das ganze Lipstatin ausgewaschen war. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel unter verringertem Druck auf ein Volumen von 250 ml aufkonzentriert.c. Additional double-flow extraction with heptane/10% aqueous methanol: The solution obtained from the above extraction was divided into 6 portions. Using the same system of seven separatory funnels as previously used, the same type of extraction was performed, but with a different phase ratio. Each portion of the feed was charged into the fourth separatory funnel. 100 mL of heptane was charged into the first and 100 mL of 10% aqueous methanol was charged into the seventh separatory funnel, which is equivalent to a heptane/aqueous methanol phase ratio of 1/1. The extract (lower phase, lipstatin in aqueous methanol) was collected. When all the crude lipstatin had been charged, the two fresh solvents were added until all the lipstatin was washed out. The extract was concentrated to a volume of 250 ml by distilling off solvent under reduced pressure.
d. Chargenweises Extrahieren von Lipstatin in Heptan: Wasser wurde zur Extraktlösung, die aus c) erhalten wurde, zugefügt, um einen Wassergehalt von 50% einzustellen. Das Gemisch wurde zweimal mit jeweils 600 ml Heptan extrahiert. Der Extrakt wurde durch Abdestillieren von Lösungsmittel aufkonzentriert. Es wurden 34 g Lipstatin mit 86%iger (w/w) Reinheit erhalten. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 89%, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, bezogen auf Lipstatin im Rohprodukt.d. Batch extraction of lipstatin in heptane: Water was added to the extract solution obtained from c) to adjust the water content to 50%. The mixture was extracted twice with 600 ml of heptane each time. The extract was concentrated by distilling off solvent. 34 g of lipstatin with 86% (w/w) purity was obtained. This is equivalent to a yield of 89% calculated on the content of lipstatin in the purified product based on lipstatin in the crude product.
e. Hydrierung: Die Hydrierung und die Kristallisierung wurden ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Tetrahydrolipstatin wurde mit 97%iger Reinheit (w/w) in einer Ausbeute, bezogen auf Lipstatin im gereinigten Produkt, von 90% erhalten.e. Hydrogenation: Hydrogenation and crystallization were carried out similarly to Example 1. Tetrahydrolipstatin was obtained with 97% purity (w/w) in a yield of 90% based on lipstatin in the purified product.
Unter Verwendung des selben Aufbaus einer siebenstufigen Extraktion, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde rohes Lipstatin, aus der selben Charge wie in Beispiel 3, gereinigt. Alternativ dazu wurden 10%iger wässriger Ethylenglycolmonomethylether und Heptan als Lösungsmittel verwendet. Die Konzentrationen und Phasenverhältnisse blieben, verglichen mit Beispiel 3, unverändert. Eine Probe von Lipstatin nach der Reinigung hatte einen Gehalt von 80% (w/w). Die Hydrierung und die Kristallisierung von Tetryhydrolipstatin wurden, wie in den früheren Beispielen beschrieben, durchgeführt. Tetrahydrolipstatin wurde mit einer Reinheit von 96% (w/w) erhalten.Using the same seven-step extraction setup as described in Example 3, crude lipstatin was purified from the same batch as in Example 3. Alternatively, 10% aqueous ethylene glycol monomethyl ether and heptane were used as solvents. The concentrations and phase ratios remained unchanged compared to Example 3. A sample of lipstatin after purification had a purity of 80% (w/w). Hydrogenation and crystallization of tetrahydrolipstatin were carried out as described in the previous examples. Tetrahydrolipstatin was obtained with a purity of 96% (w/w).
Rohes Lipstatin mit einem Gehalt von 55% (w/w) Lipstatin und 0,6% (w/w) methioninanalogem Lipstatin wurde an einer Rühr-Kuehni-Säule gereinigt.Crude lipstatin containing 55% (w/w) lipstatin and 0.6% (w/w) methionine analogue lipstatin was purified on a stirred Kuehni column.
a. Doppelstrom-Extraktion mit Heptan/95% wässrige Essigsäure: Für diese Extraktion wurde eine Kuehni-Säule E60 mit den folgenden Ausmaßen verwendet: Säulen I.D.: 6 cm, Säulenhöhe: 180 cm, Anzahl der wirklichen Stufen: 50, freie Querschnittsfläche der Leitplatten: 10%. Die Säule wurde mit 130 Umdrehungen pro Minute gerührt. Der Einlass am Kopf der Säule wurde mit 4,01/h frischer, 95%iger wässriger Essigsäure, als disperse Phase, beschickt. Der Einlass am Boden der Säule wurde mit 1,751/h frischem Heptan, als kontinuierliche Phase, beschickt. Die 27. wirkliche Stufe (gezählt ausgehend vom Boden) der Säule wurde mit 0,775 kg /h einer Lösung von 40% (w/w) rohem Lipstatin in Heptan beschickt. Im Gleichgewicht wurde eine Ausbeute von > 99% in der Extraktphase am Auslass am Boden der Säule und eine Reinheit von Lipstatin von 70% (w/w) erreicht. Der Gehalt an methionin-analogem Lipstatin war 0,6% (w/w).a. Double-stream extraction with heptane/95% aqueous acetic acid: For this extraction, a Kuehni E60 column was used with the following dimensions: column I.D.: 6 cm, column height: 180 cm, number of real stages: 50, free cross-sectional area of the baffles: 10%. The column was stirred at 130 rpm. The inlet at the top of the column was fed with 4.0 l/h of fresh 95% aqueous acetic acid, as the disperse phase. The inlet at the bottom of the column was fed with 1.75 l/h of fresh heptane, as the continuous phase. The 27th real stage (counting from the bottom) of the column was fed with 0.775 kg /h of a solution of 40% (w/w) crude lipstatin in heptane. At equilibrium, a yield of > 99% in the extract phase at the outlet at the bottom of the column and a purity of lipstatin of 70% (w/w) was achieved. The content of methionine analogue lipstatin was 0.6% (w/w).
b. Oxidation mit Peressigsäure: Das methionin-analoge Lipstatin im 95%igen wässrigen Essigsäureextrakt wurde durch Zugabe einer äquimolaren Menge von 37%iger Peressigsäure oxidiert.b. Oxidation with peracetic acid: The methionine analogue lipstatin in the 95% aqueous acetic acid extract was oxidized by adding an equimolar amount of 37% peracetic acid.
c. Gegenstrom-Extraktion mit Heptan/75% wässrige Essigsäure: Für diese Extraktion wurde eine Kuehni-Säule mit den selben Ausmaßen, wie unter Punkt a) beschrieben, verwendet. Die Säule wurde mit 205 Umdrehungen pro Minute gerührt. Der Einlass am Kopf der Säule wurde mit 8,6 l/h Lipstatinextrakt in 95%iger wässriger Essigsäure (Vereinigung von einigen, angesammelten Extraktionschargen, mit einer Reinheit von 68% (w/w) Lipstatin, hergestellt gemäß Punkt a)), als disperse Phase, beschickt. Die 47. wirkliche Stufe (gezählt ausgehend vom Boden) der Säule wurde mit 2,1 l/h frischem, deionisiertem Wasser beschickt. Der Einlass am Boden der Säule wurde mit 6,0 l/h frischem Heptan, als kontinuierliche Phase, beschickt. Im Gleichgewicht wurde eine Ausbeute von 97% in der Extraktphase am Auslass am Kopf der Säule und eine Reinheit von Lipstatin von 88% (w/w) erreicht. Dies ist gleichbedeutend mit einer Ausbeute von 96-97%, berechnet auf den Gehalt von Lipstatin im gereinigten Produkt, bezogen auf Lipstatin im Rohprodukt.c. Countercurrent extraction with heptane/75% aqueous acetic acid: For this extraction, a Kuehni column with the same dimensions as described in point a) was used. The column was stirred at 205 rpm. The inlet at the top of the column was fed with 8.6 l/h of lipstatin extract in 95% aqueous acetic acid (combination of some accumulated extraction batches with a purity of 68% (w/w) lipstatin, prepared according to point a)) as disperse phase. The 47th real stage (counted from the bottom) of the column was fed with 2.1 l/h of fresh deionized water. The inlet at the bottom of the column was fed with 6.0 l/h of fresh heptane as continuous phase. At equilibrium, a yield of 97% in the extract phase at the outlet at the top of the column and a purity of lipstatin of 88% (w/w) was achieved. This is equivalent to a yield of 96-97% calculated on the content of lipstatin in the purified product, based on lipstatin in the crude product.
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