DE4447015A1 - Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren - Google Patents
Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von RibonukleinsäurenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und ggf. Langzeitlagerung von
Ribonukleinsäuren, welche aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien isoliert
werden. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, medizinisch
analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung.
Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekularbiologie, Biochemie,
Gentechnik, Medizin, Veterinärmedizin und alle angrenzenden Gebiete.
Üblicherweise werden Ribonukleinsäuren aus Zellen und Geweben dadurch
gewonnen, daß die Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und
reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von
proteinabbauenden Enzymen aufgeschlossen, die austretenden Ribonukleinsäuren
über Phenol-Chloroform-Extraktionsschritte oder durch Ultrazentrifugation gereinigt
und die Ribonukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der
wäßrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T.,1989, CSH, "Molecular Cloning").
Verschiedene alternative Verfahren zur Isolierung von Ribonkleinsäuren aus
unterschiedlichen Ausgangsmaterialien ermöglichen zwar eine Reduzierung der sehr
zeit- und arbeitsaufwendigen Präparationsmethoden (Chomcynski, P. und Sacchi, N.,
1987, Anal. Biochem. 162: 156-159; Meier, R., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 2340-
2351), sind aber weiterhin auf die Durchführung einer finalen Ethanol- oder
Isopropanolpräzipitation angewiesen. Eine solche Präzipitation ist zeitaufwendig und
mit Verlusten an den zu isolierenden Ribonukleinsäuren verbunden.
Notwendige Präzipitationsschritte sind ferner gerade dann nicht mehr problemlos
realisierbar, wenn Ribonukleinsäuren aus kleinsten Mengen an Ausgangsmaterialien
isoliert werden sollen.
Weiterhin ist es von Vorteil, Verfahren zur Isolierung von Ribonukleinsäuren zu
besitzen, welche es gestatten, einen großen Probenumfang sehr schnell sowie
parallel zu bearbeiten. Herkömmlich genutzte Verfahren werden einer solchen
Zielstellung nur ungenügend gerecht.
In der Patentanmeldung P 4422044.8 wurde vorgeschlagen, Nukleinsäuren durch
Lyse biologischer Materialien, Inkubation mit einem nichtporösen, hochdispersen
SiO₂-Träger, Abtrennung des Trägers mit den gebundenen Nukleinsäuren und
Ablösung mit einem Puffer geringer Salzkonzentration zu gewinnen. Als chaotrope
Salze werden Natriumjodid bzw. Guanidinthiocyanat mit molaren Konzentrationen
< 5M eingesetzt. Dieses Verfahren ist in der vorliegenden Form nur für die Isolierung
von Desoxyribonukleinsäuren, nicht aber Ribonukleinsäuren geeignet. Die
verwendeten chaotropen Salze, als Hauptbestandteile der verwendeten Puffer,
bewirken eine Bindung von Desoxyribonukleinsäuremolekülen an das
Trägermaterial, nicht aber von Ribonukleinsäuren.
Ferner werden Ribonukleinsäuren sehr schnell von RNAsen abgebaut und sind
damit sehr viel instabiler als Desoxyribonukleinsäuren.
Die Erfindung hat das Ziel, eine Isolierung und ggf. Lagerung von
Ribonukleinsäuren aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien zu erreichen.
Dabei soll das Verfahren sehr einfach handhabbar sein, nur geringe apparative
Ausrüstung benötigen, unter bestimmten Bedingungen auf die Verwendung einer
Phenol- Chloroform- Extraktion verzichten sowie generell keine Ethanolpräzipitation
benötigen und damit mit einem sehr geringen zeitlichen Aufwand realisierbar sein,
was gestatten soll, einen großen Probenumfang parallel zu bearbeiten.
Ferner sollte die sehr einfache Durchführbarkeit es gestatten, die doch prinzipiell
komplizierte Methode der Isolierung von Ribonukleinsäure auch in medizinischen
Diagnostik-Einrichtungen durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die
Unteransprüche 2-10 sind Vorzugsvarianten.
Die Isolierung von Ribonukleinsäueren aus kleinsten Mengen an
Ausgangsmaterialien ist dadurch gekennzeichnet, daß die Ribonukleinsäuren
enthaltenden Ausgangsmaterialien lysiert, das Lysat mit einem nichtporösen,
hochdispersen SiO₂-Träger inkubiert, der Träger mit den gebundenen Nukleinsäuren
abgetrennt und mit Pufferlösung gewaschen und nachfolgend die Nukleinsäuren mit
einem Puffer geringer Salzkonzentration vom Träger abgelöst werden. Dabei erfolgt
die Isolierung der Ribonukleinsäuren in diesem Falle vollständig ohne eine
Verwendung von Phenol und Chloroform.
Die Fixierung der Nukleinsäuren erfolgt an der Oberfläche von hochdispersen und
nichtporösen Feststoffpartikeln, vorzugsweise mit einem Partikeldurchmesser von 40
nm, bei einer aktiven Oberfläche von ca. 50 m²/g unter Anwesenheit eines speziell
verwendeten Puffers aus einem chaotropen Salz hoher Ionenstärke.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren das chaotrope Salz, Litiumchlorid, enthaltende
Puffer, vermittelt überraschender Weise eine sehr viel größere Bindungsaffinität
von Ribonukleinsäuremolekülen an das Trägermaterial als von
Desoxyribonukleinsäuremolekülen. Am effektivsten sind molare Konzentrationen
von < 8. Dabei wird durch den verwendeten Puffer sowohl die Lyse des
Ausgangsmaterials als auch die Bindung an den Träger realisiert, wobei weiterhin
ein Schutz der zu isolierenden Ribonukleinsäuren gegenüber einem nukleolytischen
Abbau durch endogene und exogene Ribonukleasen erreicht wird. Somit kann das zu
isolierende Material auch stabil unter zugegebenen Puffer ohne die Gefahr einer
Degradierung der zu isolierenden Ribonukleinsäuren gelagert werden. Damit ist die
Möglichkeit gegeben, Ribonukleinsäure-enthaltende Probematerialien unter
Feldbedingungen wie auch nach einer Entnahme aus Patienten stabil aufzubewahren.
Ferner erfolgt sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der
austretenden Ribonukleinsäuren an den Träger im gleichen Reaktionsgefäß.
Im Falle der Isolierung von Ribonukleinsäuren aus größeren Mengen an
Ausgangsmaterialien erfolgt die Lyse des Ausgangsmaterials in einem Puffer,
welcher aus einer Lösung von saurem Phenol sowie Guanidinthiocyanat besteht.
Die Verwendung von saurem Phenol/Guanidinthiocyanat zur Isolierung von
Ribonukleinsäuren dient der Reduzierung von kontaminierenden chromosomalen
Desoxyribonukleinsäuren in der finalen Ribonukleinsäurepräparation.
Einige kommerziell angebotene Systeme zur Isolierung von Ribonukleinsäuren
verwenden ebenfalls ähnliche Pufferzusammensetzungen. Jedoch kann keines dieser
Systeme auf eine Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation der isolierten
Ribonukleinsäuren verzichten. Damit verbunden sind die schon aufgeführten
erheblichen Nachteile eines solchen notwendigen Präzipitationsschrittes.
Weiterhin ist auch das schon beschriebene Problem einer Langzeitlagerung der
Ribonukleinsäuren nicht zufriedenstellend gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Ribonukleinsäuren aus größeren
Mengen an Ausgangsmaterialien kombiniert die Verwendung der sauren
Phenol-Guanidinthiocyanat-Methode mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an der
Oberfläche von hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikeln, vorzugsweise mit
einem Partikeldurchmesser von 40 nm, bei einer aktiven Oberfläche von ca. 50 m²/g.
Dazu wird nach erfolgter Lyse des Ausgangsmaterials mittels einer Lösung aus
saurem Phenol/Guanidinthiocyanat, Chloroform zugesetzt, und die entstehende
wäßrige Phase nach Überführung in ein neues Reaktionsgefäß mit Trägermaterial
versetzt. Das in dieser wäßrigen Phase enthaltene chaotrope Salz Guanidinthiocyanat
aus dem Lysepuffer vermittelt damit wiederum auch gleichzeitig neben der Lyse des
Ausgangsmaterials die Bindung der Ribonukleinsäuren an das Trägermaterial.
Eine Modifikation dieses Verfahrens beinhaltet die Zugabe einer hochmolaren
Litiumchloridlösung zum wäßrigen Überstand, welches noch eine Erhöhung der
Ausbeute an den zu isolierenden Ribonukleinsäuren ermöglicht.
Damit verbindet dieses erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung eines
monophasischen Puffers aus saurem Phenol/Guanidinthiocyanat mit der Bindung der
Ribonukleinsäuren an ein Trägermaterial.
Das Verfahren zeichnet sich durch eine drastische Reduzierung kontaminierender
Anteile chromosomaler Desoxyribonukleinsäuremoleküle aus, ist sehr einfach in der
Handhabung und zeitlich sehr schnell realisierbar, da durch die Bindung der
Ribonukleinsäuren an das verwendete Trägermaterial eine Ethanol- oder
Isopropanolpräzipitation nicht mehr notwendig ist. Ferner können die am Träger
gebundenen Ribonukleinsäuren auch lange Zeit stabil gelagert werden.
Bisher ist noch kein methodisches Verfahren beschrieben worden, welches eine saure
Phenol/Guanidinthiocyanat-Methode mit der Bindung der Ribonukleinsäuren an
Trägermaterialien kombiniert.
Für die beiden erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten zur Isolierung von
Ribonukleinsäuren aus quantitativ unterschiedlichen Mengen an
Ausgangsmaterialien gilt ferner, daß die trägergebundenen Ribonukleinsäueren mit
einem Waschpuffer (50mM NaCl; 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; 70%v/v Ethanol)
mehrmals gewaschen werden. Eine solche Waschpufferzusammensetzung erlaubt ein
sehr intensives Waschen ohne Verlust an gebundenen Ribonukleinsäuren.
Das erfindungsgemäße Verfahren benötigt keine Ethanolpräzipitation. Die Elution der
Ribonukleinsäuren erfolgt in einem RNAse freien Elutionspuffer (10mM Tris HCl;
1mM EDTA) bzw. in DEPC behandeltem Aqua Bidestilata bei einer Temperatur von
vorzugsweise 52°C innerhalb von 5 Minuten. Die trägerfixierten Ribonukleinsäuren
können in dieser Form auch lange Zeit stabil gelagert werden.
Die sehr einfache und nur wenige experimentelle Schritte umfassenden Verfahren
sind in idealster Weise für eine Anwendung in medizinischen Diagnostik-
Laboratorien geeignet und stehen in diesem Zusammenhang auch Anwendern zur
Verfügung, welche nicht über spezielle molekularbiologisch-biochemische
Kenntnisse verfügen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist u. a. die Voraussetzung gegeben,
Ribonukleinsäuren für die Diagnostik viraler Erkrankungen (virale Hepatiden; HIV-
Infektionen u. a.) sehr schnell zu isolieren, eine prognostische Vorhersage bestimmter
Tumorerkrankungen anhand exprimierter Markersequenzen zu treffen und maligne
transformierte Zellen z. B. im Knochenmark von Patienten, bei denen ein Verdacht
auf Mikrometastasierung nach erfolgter Tumoroperation besteht, zu detektieren. Da
ein solcher Nachweis mit hochsensiblen molekularbiologischen Methoden (z.B RT-
PCR, quantifizierte RT-PCR) erfolgen muß, ist es ferner sehr bedeutend, über
Methoden zu verfügen, welche aus kleinsten Mengen an Biopsiematerialien (z. B. nur
einige 100 Zellen, < 1 m/g Gewebematerial, < 50 µl Blutserum) Ribonukleinsäuren
isoliert, wobei das entsprechende Patientenmaterial sofort nach dessen Gewinnung
mit Lysepuffer versetzt und somit dem abbauenden Wirken sowohl endogener als
auch exogener Ribonukleasen entzogen wird, da ansonsten eine Aussage über die
quantitative Expression regulierter DNA-Sequenzen mittels quantitativer RT-PCR
nicht mehr realistisch ist.
Als sehr wichtig erscheint auch der Umstand, daß mittels den erfindungsgemäßen
Verfahrensvarianten die isolierten Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen
Eigenschaften am verwendeten Trägermaterial gebunden und über lange Zeiträume
gelagert werden können. Damit ist die Möglichkeit gegeben, neben einer umfänglich
großen Probenaufbereitung die isolierten Ribonukleinsäuren für eine spätere
Untersuchung zur Verfügung zu haben. Die trägerfixierten Nukleinsäuren können
dann ohne großen zeitlichen Aufwand vom Trägermaterial eluiert werden und stehen
sofort einer weiteren Verwendung zur Verfügung. Damit ist es nicht mehr wie bei
herkömmlichen Verfahren notwendig, isolierte Ribonukleinsäuren unter Ethanol bei
-80°C zu lagern, um sie dann durch eine erneute Ethanolpräzipitation wieder zu
gewinnen. Alle zur Zeit verwendeten Methoden zur Isolierung und Lagerung von
Ribonukleinsäuren sind auf eine solche Prozedur angewiesen.
Mit den erfindungsgemäßen Methoden ist somit vor allem für klinische Anwender
ein methodisches Instrumentarium verfügbar, welches es gestattet, neben der
parallelen Isolierung von Ribonukleinsäuren sowohl aus großen Probenumfängen als
auch aus kleinsten Mengen an Ausgangsmaterial, die isolierten Ribonukleinsäuren
über lange Zeiträume stabil zu lagern und im Bedarfsfall ohne Durchführung von
Präzipitationen sehr schnell zur Verfügung zu haben.
Die isolierten Nukleinsäuren sollen neben einer Anwendung im Bereich der
klinischen Diagnostik auch einem breiten Spektrum unterschiedlicher Anwendungen
in der biochemischen oder molekularbiologischen Forschung wie z. B. RT-PCR,
Hybridisierungen, mRNS-Isolierung oder RNAse Protection Assays, zugänglich sein.
Das für beide beschriebenen Verfahrensvarianten verwendete Trägermaterial besitzt
eine Reihe von Vorteilen. So besitzt es eine wesentlich kleinere Korngröße als von
anderen Autoren verwendete Materialien zur Fixierung von Nukleinsäuren. Es setzt
sich unter Einfluß der Schwerkraft nicht ab und verbleibt damit in Suspension. Dies
ist von nicht unerheblichem Einfluß auf das RNA-Bindungsvermögen je Zeiteinheit.
Eine hohe Bindungskapazität sowie Rückgewinnungseffizienz fixierter
Ribonukleinsäuren wird zudem durch die sehr große spezifische Oberfläche der
Trägerpartikel erreicht. Weiterhin wirkt sich die direkte Exponierung trägerfixierter
Ribonukleinsäuren auf der Oberfläche der SiO₂-Partikel günstig auf die Reinigung
der Ribonukleinsäuren von Proteinen, Salzen und anderen möglichen
Kontaminationen aus, was in diesem Zusammenhang auch einen wesentlichen
Vorteil vor allem gegenüber verwendeten porösen Trägermaterialien bedeutet.
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren besteht die Möglichkeit der Isolierung von
Ribonukleinsäuren aus bakteriellen Lysaten, aus Zellkulturen, intakten oder
gefrorenen Gewebeproben, Gewebeschnitten, Spermien, Körperflüssigkeiten,
Pflanzenzellen, Hefezellen sowie die direkte Isolierung viraler Ribonukleinsäuren aus
verschiedensten Ausgangsmaterialien, wie Blutserum, Blutplasma, Vollblut, Urin,
Zellkulturüberstand u. a..
Die erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten erlauben die Isolierung von
Ribonukleinsäuren mit einem extrem geringen zeitlichen sowie apparativen
Aufwand.
Die verwendeten Lysepuffer verbinden ferner die Lyse des Ausgangsmaterials und
die Inaktivierung endogener Ribonukleasen mit der Bindung der Ribonukleinsäuren
an das verwendete Trägermaterial.
Es sind keine zeitaufwendige Proteinase-Verdauung oder aufwendige Ultr
azentrifugationsschritte sowie Ethanolpräzipitationen notwendig.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Isolierung von
Ribonukleinsäuren in Abhängigkeit vom verwendeten Ausgangsmaterial und dessen
Menge innerhalb von ca. 0,5-1,5 Stunden. Der geringe zeitliche Aufwand von
solchen Präparationsmethoden stellt für eine Vielzahl von potentiellen Anwendern
von Methoden zur Isolierung von Ribonukleinsäuren eine enorm wichtige Größe dar
und bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Verfahren. Die
beschriebene Kombination von Lyse und Bindungsreaktion gestattet es darüber
hinaus, auch Ribonukleinsäuren aus Frischpräparaten unter Feldbedingungen (z. B.
bei Expeditionen) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen unter Lysepuffer
zu lagern und zu transportieren und die Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer
biologischen Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.
Die Erfindung soll nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Das Gewebe wird mittels eines Scalpells oder anderer Verfahren mechanisch
zerkleinert, in einem 1,5 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 500 µl Lysepuffer (4M
Guanidinthiocyanat; Phenol, pH 4.0; 2M Natriumacetat; 0,6% w/v Sarcosyl; 10mM
DTT) versetzt und unter zeitweiligem kurzen Vortexen bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach erfolgter sichtbarer Lyse des Gewebematerials werden in das gleiche
Reaktionsgefäß 100 µl Chloroform zugegeben und der Ansatz für 5 Minuten auf Eis
inkubiert und anschließend auf einer Tischzentrifuge für 5 Minuten zentrifugiert. Die
entstandene wäßrige Phase wird vorsichtig in ein neues Reaktionsgefäß überführt,
mit 500 µl 10 M Litiumchlorid, sowie Trägersuspension versetzt und für 5 Minuten
auf Eis inkubiert. Nach einer kurzen Zentrifugation wird das Trägerpellet zweimal
mit Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70%v/v Ethanol)
gewaschen. Die Elution der trägerfixierten Ribonukleinsäure erfolgt durch Zugabe
von 100 µl DEPC Wasser oder RNAse freiem TE Puffer bei einer Inkubation bei
52°C für 5 Minuten. Der Ribonukleinsäure enthaltende Überstand wird nach kurzer
Zentrifugation zur Pelletierung der Trägerpartikel in ein neues Reaktionsgefäß
überführt und steht nun für weitere Verwendungen zur Verfügung.
Die Hybridomazellsuspension, welche sich in den Löchern einer Mikrotiterplatte
Platte befindet, wird mit 200 µl Lysepuffer (10M Litiumchlorid, 10mM DTT, 1%
Triton X-100) versetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wird die Zellysesuspension in ein Eppendorf Reaktionsgefäß überführt
und mit 300 µl Lysepuffer sowie Trägersuspension versetzt, der Ansatz wird dann für
5 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend für 20 Sekunden in einer
Tischzentrifuge zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wird das Pellet
zweimal wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und abschließend in einem
Volumen von 20-30 µl DEPC Wasser oder RNAse freiem TE-Puffer eluiert.
Die nach der Bindung an das Trägermaterial fixierten Ribonukleinsäuren werden
nach dem letzten Waschschritt im Eppendorf-Reaktionsgefäß in einer
Vakuumzentrifuge getrocknet und das Reaktionsgefäß anschließend verschlossen bei
4°C aufbewahrt. Die Elution der Ribonukleinsäuren erfolgt nach der Lagerung
wiederum durch Zugabe von DEPC Wasser bzw. RNAse freiem TE-Puffer bei 52°C.
Claims (10)
1. Verfahren zur schnellen Isolierung und ggf. Lagerung von Ribonukleinsäuren
durch Lyse von Ribonukleinsäuren enthaltenden Materialien, Inkubation
mit einem nichtporösen, hochdispersen SiO₂-Träger, Abtrennung des Trägers
und Ablösung der Ribonukleinsäuren mit einem Puffer
geringer Salzkonzentration dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse mit Puffern,
die chaotrope Salze hoher Ionenstärke enthalten, durchgeführt und
nachfolgend die Inkubation mit dem SiO₂-Träger, ggf. nach Phasentrennung
nach Zusatz eines organischen Lösungsmittels, im gleichen
Medium durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotrope Salze
Guanidinthiocyanat, Guanidinnydrochlorid oder Litiumchlorid eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Ionenstärke < 4 molar ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse mit saurem
Phenol/Guanidinthiocyanat durchgeführt wird und nachfolgend durch Zusatz von
Chloroform eine Phasentrennung erfolgt, wonach die resultierende
wäßrige Phase anschließend mit dem SiO₂-Träger inkubiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse mit
10 molarem Litiumchlorid durchgeführt wird, wonach die Lyse und Bindung
der Ribonukleinsäuren an den SiO²-Träger im selben Reaktionsgefäß erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die
trägerfixierten Nukleinsäuren mit einem Waschpuffer, vorzugsweise bestehend
aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70%v/v Ethanol,
gewaschen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierten
Nukleinsäuren vorzugsweise mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration
(10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) bei einer Temperatur von 48-56°C, vorzugsweise
52°C, eluiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß es als
batch- Verfahren durchgeführt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß es
als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.
10. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-9, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus hochdispersen, nichtporösen SiO₂-Partikeln mit einer
Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche
von 50-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g, besteht.
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