DE4442460C1

DE4442460C1 - Enzyme assay for e.g. bone-specific alkaline phosphatase

Info

Publication number: DE4442460C1
Application number: DE19944442460
Authority: DE
Inventors: Barbara Dr Thomas; Oliver Boick
Original assignee: BRAHMS Diagnostica GmbH
Current assignee: BRAHMS Diagnostica GmbH
Priority date: 1994-11-29
Filing date: 1994-11-29
Publication date: 1996-03-07
Anticipated expiration: 2014-11-30

Abstract

Selective enzyme (I) assay on a biological sample comprises:(1) pptn. of (I) with a lectin (II);(2) sepg. the (I)-(II) ppte. by centrifugation;(3) redissolving or resuspending the pellet in a second liq. phase, and(4) conventional measurement of the enzyme content bound in the ppte. and/or present in the supernatant from step (2). The new feature is that the pellet is transferred to the second liq. phase by dissolving it in a suitable buffer by shaking briefly in the presence of an added solubilisation acid, i.e. a particulate inert solid.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Bestim mung des Gehalts eines Enzyms in einer biologischen Probe, und insbesondere zur selektiven Bestimmung des Isoenzyms knochenspezifische alkalische Phosphatase (BAP) in einer biologischen Flüssigkeit.The invention relates to a method for selective determination determination of the content of an enzyme in a biological sample, and in particular for the selective determination of the isoenzyme Bone-specific alkaline phosphatase (BAP) in one biological fluid.

Zur Bestimmung des Gehalts eines bestimmten Enzyms in einer biologischen Probe kann man so vorgehen, daß man die Enzym aktivität in der fraglichen Probe durch Umsetzung mit einem geeigneten Substrat bestimmt, das bei seiner enzymatischen Umwandlung z. B. eine Farbreaktion zeigt, die gemessen werden und mit der Enzymaktivität in der fraglichen Probe korre liert werden kann. Die Messung der Enzymaktivität erfolgt dabei in der Regel als kinetische Messung durch Messen einer Meßreihe.To determine the content of a particular enzyme in a biological sample one can proceed so that the enzyme activity in the sample in question by implementation with a suitable substrate, which determines its enzymatic Conversion z. B. shows a color reaction that are measured and correct with the enzyme activity in the sample in question can be lated. The enzyme activity is measured usually as a kinetic measurement by measuring one Series of measurements.

Wenn die biologische Probe Bestandteile enthält, die eine direkte Bestimmung der Enzymaktivität in der genannten Probe nicht ohne weiteres möglich machen, ist es erforderlich, das zu bestimmende Enzym abzutrennen. Das gleiche gilt auch für den Fall, daß nur der Gehalt eines bestimmten Isoenzyms in einer biologischen Probe bestimmt werden soll, die gleich zeitig andere Isoenzymformen des gleichen Grundenzyms ent hält. Da die einzelnen Isoenzymformen bei ihrer Umsetzung mit einem Substrat alle die gleiche oder nahezu gleiche enzymatische Wirkung entfalten, kann bei einer Bestimmung der Enzymaktivität in der Gesamtprobe nur die Summe der Aktivität aller darin enthaltenen Isoenzyme bestimmt werden. Will man den Gehalt eines bestimmten Isoenzyms anhand seiner Enzymaktivität bestimmen, muß man es vom Rest der Original probe abtrennen. Um dann seinen Gehalt in der Originalprobe zu ermitteln, kann man dann entweder die Enzymaktivität des abgetrennten Isoenzyms feststellen, oder man ermittelt diesen Gehalt anhand einer Differenzmessung, indem man einmal die Enzymaktivität der gesamtem Probe mißt, und dann die restliche Enzymaktivität nach Abtrennung des zu bestim menden Isoenzyms. Die Ermittlung des Gehalts des gesuchten Isoenzyms durch die letztgenannte Differenzbildungsmethode hat den Nachteil, daß zwei getrennte Messungen durchgeführt werden müssen, was aufwendig ist und mit dem doppelten Risiko einer Meßwertverfälschung durch Meßfehler belastet ist. Die Bestimmung des Gehalts des gesuchten Isoenzyms in der abgetrennten Fraktion ist nur möglich, wenn bei der Abtrennung die Enzymaktivität nicht verlorengegangen ist und das abgetrennte Isoenzym in einer Form vorliegt, die eine reproduzierbare Messung seiner Enzymaktivität erlaubt.If the biological sample contains components that direct determination of the enzyme activity in the sample mentioned not easily possible, it is necessary that to separate the enzyme to be determined. The same applies to the case that only the content of a certain isoenzyme in a biological sample to be determined, the same other isoenzyme forms of the same basic enzyme holds. Because the individual isoenzyme forms in their implementation with a substrate all the same or almost the same Enzymatic effect can develop in one determination the enzyme activity in the total sample only the sum of the Activity of all isoenzymes contained therein can be determined. If you want the content of a particular isoenzyme based on its To determine enzyme activity, you have to distinguish it from the rest of the original detach sample. Then his salary in the original sample to determine, you can then either the enzyme activity of determine separated isoenzyme, or one determines this salary based on a difference measurement by once measuring the enzyme activity of the entire sample, and then the remaining enzyme activity after separation of the determin isoenzyme. Determining the salary of the wanted Isoenzyme by the latter difference formation method has the disadvantage that two separate measurements are carried out have to be what is complex and with double Risk of measurement falsification due to measurement errors is. The determination of the content of the isoenzyme sought in the separated fraction is only possible if the Separation the enzyme activity has not been lost and the separated isoenzyme is in a form that is one reproducible measurement of its enzyme activity allowed.

Ein Beispiel für einen Fall, bei dem die Bestimmung bestimm ter Isoenzymformen für die klinischen Diagnose eine hohe Bedeutung aufweist, ist die Bestimmung der Isoenzymformen der alkalischen Phosphatase (AP). Alkalische Phophatase kommt in bis zu fünf organspezifischen Isoenzymformen vor, von denen für die klinische Diagnose die knochenspezifische alkalische Phosphatase (bone-specific alkaline phosphatase, BAP) und die leberspezifische alkalische Phosphatase (liver specific alkaline phosphatase, LAP) besonders wichtig sind. Mit verschiedenen physiologischen Zuständen (u. a. dem Le bensalter) sind dabei verschiedene Spiegel der einzelnen Isoenzyme im Serum oder Plasma eines Patienten verbunden, und die selektive Messung von knochenspezifischer alkali scher Phosphatase (BAP) gestattet beispielsweise Rückschlüs se auf bestimmte Knochenerkrankungen, die von einer Erhöhung des Gehalts an BAP im Serum oder Plasma eines Patienten begleitet sind. Derartige Erkrankungen sind beispielsweise das Paget-Syndrom oder maligne Knochentumoren. Das schwie rigste diagnostische Problem in der Bestimmung der BAP ist dabei deren Unterscheidung von leberspezifischer alkalischer Phosphatase (LAP). Beide Ispenzyme sind Produkte des glei chen Gens und unterscheiden sich aufgrund unterschiedlicher post-translationaler Veränderungen beispielsweise beim Glykosilierungsmuster relativ geringfügig (vgl. Moss, D.W. und King, E.J., Biochem. J. 84: 192-195 (1962); Seargeant, L.E. und Stinson, R.A., Nature 281: 152-154 (1979); Stinson, R.A. und Seargeant, L.E., Clin. Chim. Acta 110: 261-272 (1981); Moss, D.W., Prog. Clin. Biol. Res. 166: 79-86 (1984). Zur selektiven Messung von BAP neben LAP wurden unterschiedliche diagnostische Bestimmungsverfahren entwic kelt.An example of a case where the determination determines ter isoenzyme forms for clinical diagnosis a high What is important is the determination of the isoenzyme forms alkaline phosphatase (AP). Alkaline phosphatase occurs in up to five organ-specific isoenzyme forms, of which for clinical diagnosis the bone specific alkaline phosphatase (bone-specific alkaline phosphatase, BAP) and the liver-specific alkaline phosphatase (liver specific alkaline phosphatase, LAP) are particularly important. With various physiological conditions (including the Le bensalter) are different mirrors of the individual Isoenzymes linked in a patient's serum or plasma, and the selective measurement of bone-specific alkali sher phosphatase (BAP) allows conclusions to be drawn, for example se on certain bone disorders from an increase the level of BAP in a patient's serum or plasma are accompanied. Such diseases are, for example Paget's syndrome or malignant bone tumors. That didn't matter is the most rigorous diagnostic problem in determining BAP thereby distinguishing them from liver-specific alkaline Phosphatase (LAP). Both Ispenzymes are products of the same Chen gene and differ due to different post-translational changes, for example in Glycosylation pattern relatively minor (see Moss, D.W. and King, E.J., Biochem. J. 84: 192-195 (1962); Seargeant, L.E. and Stinson, R.A., Nature 281: 152-154 (1979); Stinson, R.A. and Seargeant, L.E., Clin. Chim. Acta 110: 261-272 (1981); Moss, D.W., Prog. Clin. Biol. Res. 166: 79-86 (1984). For the selective measurement of BAP in addition to LAP develop different diagnostic methods celt.

Eines der Verfahren beruht auf der unterschiedlichen Hitze desaktivierbarkeit der beiden Isoenzyme. Durch Erhitzen der Probe wird die wärmeempfindlichere LAP schrittweise inakti viert, und der Anteil an BAP wird aus dem beobachteten kinetischen Desaktivierungsverhalten ermittelt (MOSS, D.W. und Witbe L.G., Lin. Chim. Acta 61, 73 bis 71 (1975). Das Verfahren ist aufwendig und für die klinische Routine diagnose schlecht geeignet.One of the methods is based on the different heat deactivation of the two isoenzymes. By heating the The heat-sensitive LAP becomes gradually inactive fourth, and the proportion of BAP is observed from the kinetic deactivation behavior determined (MOSS, D.W. and Witbe L.G., Lin. Chim. Acta 61, 73-71 (1975). The The procedure is complex and for routine clinical use diagnosis poorly suited.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von BAP neben LAP beruht auf der gelelektrophoretischen Trennung der beiden Isoenzyme unter geeigneten Bedingungen (Onica, D. et al., Clinica Chimica Acta 155: 285-294 (1986); van Hoof, V.O., Clin. Chem. 34: 1857-1862 (1988); Crofton, P., Clin. Chem. 38: 663-670 (1992); Chamberlain, B.R., et al., Clinica Chimica Acta 208: 219-224 (1992)).Another method for determining BAP in addition to LAP is based on the gel electrophoretic separation of the two Isoenzymes under suitable conditions (Onica, D. et al., Clinica Chimica Acta 155: 285-294 (1986); van Hoof, V.O., Clin. Chem. 34: 1857-1862 (1988); Crofton, P., Clin. Chem. 38: 663-670 (1992); Chamberlain, B.R., et al., Clinica Chimica Acta 208: 219-224 (1992)).

Ein weiteres Verfahren beruht auf der Bestimmung von BAP mit Hilfe eines Paars spezifischer monoklonaler Antikörper und ist beschrieben in der EP-A-0 381 450.Another method is based on the determination of BAP With the help of a pair of specific monoclonal antibodies and is described in EP-A-0 381 450.

Ein weiteres in Form eines Testkits (ISO-ALP, Boehringer Mannheim) in die klinische Diagnose eingeführtes Verfahren ist das Verfahren gemäß WO 84/02720 bzw. Clin. Chim. 39/4, 648-652 (1993). Bei diesem Verfahren wird die unterschiedli che Fällbarkeit von BAP und LAP mit Hilfe von Lektinen, die N-Acetylglucosamin-Reste zu binden vermögen, insbesondere von Lektin aus Weizenkeimen ausgenutzt. Mit Hilfe von Lektin aus Weizenkeimen (wheat germ lectin oder agglutinin, WGA), das sich spezifisch an die Kohlenhydratreste der BAP bindet, läßt sich BAP durch Fällung selektiv von LAP trennen. Man geht bei dem beschriebenen Bestimmungsverfahren so vor, daß man zuerst auf an sich bekannte Weise die Gesamtaktivität der alkalischen Phosphatase in einer Probe ermittelt (Ver wendung eines p-Nitrophenylphosphatsubstrats und eines Diethanolaminpuffers und kinetische Reihenmessung gemäß der optimierten Standardmethode der Deutschen Gesellschaft für klinische Chemie (1972)), daß man anschließend die Probe mit einer Lösung des Lektins versetzt und nach einer vorgegebe nen Inkubationszeit die Mischung zentrifugiert. Eine neuer liche Bestimmung der Aktivität der alkalischen Phosphatase im nach dem Zentrifugieren erhaltenen Überstand liefert einen zweiten Wert, und aus der Differenz der beiden Werte für die Gesamtaktivität und die Restaktivität wird die in der Originalprobe vorhandene Aktivität an BAP errechnet.Another in the form of a test kit (ISO-ALP, Boehringer Mannheim) procedure introduced in clinical diagnosis is the method according to WO 84/02720 or Clin. Chim. 39/4, 648-652 (1993). In this process, the differenti che fallability of BAP and LAP with the help of lectins that Able to bind N-acetylglucosamine residues, in particular used by lectin from wheat germ. With the help of lectin from wheat germ lectin or agglutinin (WGA), that binds specifically to the carbohydrate residues in the BAP, BAP can be selectively separated from LAP by precipitation. Man proceeds in the determination method described so that one first of all the total activity in a manner known per se the alkaline phosphatase in a sample (Ver using a p-nitrophenyl phosphate substrate and one Diethanolamine buffers and kinetic series measurement according to the optimized standard method of the German society for clinical chemistry (1972)) that the sample with added a solution of the lectin and after a given the mixture is centrifuged. A new one determination of the activity of alkaline phosphatase in the supernatant obtained after centrifugation a second value, and the difference between the two values for the total activity and the residual activity, the in existing activity at BAP is calculated from the original sample.

Das beschriebene Verfahren geht zurück auf eine Original arbeit von Rosalki S.B. und Ying Foo, A., in Clin. Chem. 30/7, 1182-1186 (1984), in der die selektive Fällbarkeit der knochenspezifischen alkalischen Phosphatase (BAP) mit Hilfe des Lektins aus Weizenkeimen erstmals beschrieben ist. In der genannten Originalarbeit bzw. gemäß WO 84/02720 wird dabei so vorgegangen, daß man nach der Lektin-Fällung und dem Abzentrifugieren des gebildeten Niederschlags aus Lektin und BAP die Aktivität der alkalischen Phosphate einmal im Zentrifugationsüberstand bestimmt, und zum anderen im Zen trigufationspellet, das man dazu in einer Kochsalzlösung resuspendierte bzw. in einer Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltenden Kochsalzlösung solubilisierte. Die in den einzelnen Fraktionen erhaltenen Aktivitäten wurden mit der separat gemessenen Gesamtaktivität in der Probe verglichen. Die Autoren der genannten Veröffentlichung schlossen aus ihren Ergebnissen, daß sich durch Lektin-Fällung etwa 80% der in der Probe vorhandenen BAP fällen läßt, was sie durch eine Korrektur des für die Aktivität im Niederschlag erhal tenen Werts mit dem Faktor 1,25 berücksichtigten. Die ge nannte Arbeit enthält keinerlei Angaben zu den beim Resus pendieren bzw. bei der Solubilisation des Niederschlags angewandten Bedingungen.The process described goes back to an original work by Rosalki S.B. and Ying Foo, A., in Clin. Chem. 30/7, 1182-1186 (1984), in which the selective fallibility of the bone specific alkaline phosphatase (BAP) with the help of lectins from wheat germ is described for the first time. In the mentioned original work or according to WO 84/02720 proceeded so that after the lectin precipitation and centrifuging off the precipitate formed from lectin and BAP the activity of the alkaline phosphates once a day Centrifugation supernatant determined, and secondly in Zen trigufationspellet, which you do this in a saline solution resuspended or in a sodium dodecyl sulfate (SDS) containing saline solution. The in the Activities obtained from individual groups were carried out with the separately measured total activity in the sample. The authors of the above publication excluded their results that about 80% of lectin precipitation of the BAP present in the sample drops what it passes through a correction for the activity in the precipitation value taken into account with a factor of 1.25. The ge The work mentioned does not contain any information on the resus commute or when solubilizing the precipitation applied conditions.

Aufbauend auf der genannten Originalarbeit wurden von Behr, W. und Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986) die Möglichkeiten der Bestimmung von BAP unter Ausnutzung der Lektin-Fällung weiter untersucht. Die Autoren bestimmten BAP anhand der Differenz der Aktivität von AP in der Gesamt mischung und im Überstand nach der Lektin-Fällung. Zur Überprüfung ihrer Ergebnisse führten sie ferner Wiederfinde- Versuche durch, bei denen die Summe der Aktivität im Über stand und im Niederschlag mit der gemessenen Gesamtaktivität verglichen wurde. Die Autoren erhielten eine gute Überein stimmung der erhaltenen Meßergebnisse mit denen von alterna tiven Bestimmungsverfahren und erhielten auch gute Ergeb nisse für die Wiederfindung, kommen jedoch zu dem Schluß, daß eine Bestimmung von BAP durch Differenzmessung im oben beschriebenen Sinne das einfachste und vorteilhafteste Verfahren darstellt, da es schwierig ist, nach der Fällung und nach dem Zentrifugieren den Überstand quantitativ zu entfernen und den Niederschlag zu resuspendieren. Eine unvollständige Resuspendierung würde zu niedrige Werte für die gemessene BAP-Aktivität liefern und wird als nur schwer erkennbar angesehen. Diese Befunde erklären, warum auch in dem in Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) beschriebenen Test kit das Verfahren der Differenzmessung zur Bestimmung von BAP angewandt wird, obwohl es die bereits eingangs erwähnten Nachteile einer Mehrfachbestimmung (erhöhter Arbeitsaufwand, Fehlermöglichkeiten) aufweist.Building on the original work mentioned, Behr, W. and Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986) taking advantage of the possibilities of determining BAP the lectin precipitation is further investigated. The authors determined BAP based on the difference in the activity of AP in the total mix and in the supernatant after lectin precipitation. For Reviewing their results also led them to recovery Trials where the sum of activity in excess stood and in the precipitation with the total activity measured was compared. The authors got a good agreement agreement of the measurement results obtained with those of alterna tive determination procedures and also received good results recovery, but conclude that a determination of BAP by difference measurement in the above described the simplest and most advantageous sense Process represents since it is difficult after the precipitation and quantitatively add the supernatant after centrifugation remove and resuspend the precipitate. A incomplete resuspension would result in values that are too low provide the measured BAP activity and is considered difficult seen recognizable. These findings explain why in the one in Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) kit the method of difference measurement to determine BAP is applied, although it is the one already mentioned Disadvantages of multiple determination (increased workload, Errors).

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die klinische Routinediagnostik geeignetes einfaches und zuverlässiges Verfahren zur selektiven Bestimmung des Gehalts eines Enzyms, insbesondere des Gehalts an knochen spezifischer alkalischer Phosphatase, in einer biologischen Probe zu schaffen, das nicht als Doppelbestimmung durchge führt werden muß und trotzdem alle Anforderungen an die erforderliche Zuverlässigkeit und Präzision erfüllt.The present invention is based on the object simple and suitable for routine clinical diagnosis reliable method for the selective determination of the Content of an enzyme, especially the content of bone specific alkaline phosphatase, in a biological To create a sample that is not a double determination must be carried out and still all requirements of the required reliability and precision.

Diese Aufgabe wird in allgemeinerer Form durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 bzw. ein Verfahren zur Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase gemäß Patentan spruch 8 gelöst.This task is done in a more general way through a process according to claim 1 or a method for determining bone-specific alkaline phosphatase according to Patentan saying 8 solved.

Vorteilhafte Ausgestaltungen derartiger Verfahren ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 7 sowie den nachfolgenden detaillierten Erläuterungen zur vorliegenden Erfindung.Advantageous refinements of such methods result deriving from subclaims 2 to 7 and the following detailed explanations of the present invention.

Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bestätigung der Feststellung der Autoren Behr, W. und Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986), daß es nicht ohne weiteres möglich ist, die von den Autoren empfohlene und im Testkit gemäß Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) umgesetzte aufwendige Differenzmessung durch die direkte Messung der Aktivität an alkalischer Phosphatase in der Lektin-Fällung zu ersetzen. Nach der Fällung von BAP durch Zusatz einer Lösung des Fällmittels und anschließendes Zentrifugieren wird der gebildete Niederschlag in Form eines außerordent lich harten und festen Pellets erhalten, das sich nach seiner Trennung vom Überstand nur mit viel Geduld wieder vollständig in eine Lösung oder Suspension überführen läßt. Wenn man versucht, das Pellet, wie in der Laborpraxis üblich, nach Zugabe der Pufferlösung mit dem Spatel auf zulockern und in einem Vibrationsmischer (Vortexer) zu resuspendieren, sind erhebliche Behandlungszeiten nötig, bis eine dem Anschein nach vollständige Resuspendierung/Auflö sung erreicht ist. Bestimmt man dann in der erhaltenen flüssigen Phase die Aktivität der alkalischen Phosphatase und vergleicht den erhaltenen Wert mit den nach anderen Verfahren erhaltenen Ergebnissen, so stellt man eine erheb liche Streuung der Meßwerte fest, die offensichtlich darauf zurückgehen, daß auf die beschriebene Weise keine vollstän dige und reproduzierbare Überführung des Fällungsnieder schlags/Zentrifugationspellets in die flüssige Phase möglich ist.The starting point of the present invention is the confirmation the statement by the authors Behr, W. and Barnert, J. in Clin. Chem. 32/10, 1960-1966 (1986) that it is not without is also possible, the recommended by the authors and in Test kit according to Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993) elaborate difference measurement by direct measurement of the Alkaline phosphatase activity in lectin precipitation to replace. After the precipitation of BAP by adding a Solution of the precipitant and subsequent centrifugation the precipitate formed is extraordinary get hard and solid pellets that its separation from the supernatant only with patience can be completely converted into a solution or suspension. If you try the pellet, as in laboratory practice usual, after adding the buffer solution with the spatula loosen and in a vibration mixer (vortex) resuspend, considerable treatment times are necessary until an apparently complete resuspension / dissolution solution is reached. Then you determine in the received liquid phase the activity of alkaline phosphatase and compares the value obtained with the others Results obtained from the process, so one makes a significant scatter of the measured values, which are obviously on it decline that in the manner described none complete nige and reproducible transfer of the precipitator Impact / centrifugation pellets possible in the liquid phase is.

Die vorliegende Erfindung beruht nunmehr darauf, daß erkannt wurde, daß diese irreproduzierbaren Ergebnisse bei dem Versuch der Wiederauflösung des Niederschlags nicht dadurch vermieden werden müssen, daß man eine Differenzmessung durchführt, sondern daß es möglich ist, auf eine einfach durchführende und auch für die klinische Routinediagnostik geeignete Weise eine schnelle, zuverlässige und quantitative Überführung des Niederschlags in die flüssige Phase zu erreichen, in der dann die Messung der Aktivität der kno chenspezifischen alkalischen Phosphatase durch eine einfache Direktmessung zuverlässig möglich ist.The present invention is based on the fact that recognized was that these irreproducible results in the Attempt to redissolve the precipitate is not thereby must be avoided that a differential measurement performs, but that it is possible on a simple performing and also for routine clinical diagnostics appropriate way a fast, reliable and quantitative Conversion of the precipitation into the liquid phase reach, in which then measuring the activity of the kno simple alkaline phosphatase Direct measurement is reliably possible.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß es durch Zusatz einer Solubilisationshilfe in Form eines teilchenförmigen inerten Feststoffs (eines sandartigen oder körnigen Materi als) einer geeigneten Dichte, Teilchengröße und Oberflächen beschaffenheit möglich ist, das aus dem Niederschlag der Lektin-Fällung beim Zentrifugieren gebildete Pellet zuver lässig und reproduzierbar in einer Lösung eines für die Messung der Enzymaktivität geeigneten Puffers aufzulösen. The invention is based on the knowledge that it can be added a solubilization aid in the form of a particulate inert solid (a sand-like or granular material as) a suitable density, particle size and surface texture is possible, which from the precipitation of the Lectin precipitation pellet formed during centrifugation casual and reproducible in a solution one for the Measurement of the enzyme activity to dissolve suitable buffers.

Der Zusatz eines inerten teilchenförmigen Materials (Sandes) zur Verbesserung der Resuspendierung bzw. Resolubilisierung eines Zentrifugationspellets stellte keine in der allgemei nen Laborpraxis übliche Arbeitsweise dar, und es war nicht möglich, in der Literatur oder in der Praxis einen Hinweis auf die Verwendung einer derartigen Solubilisationshilfe zur Auflösung von Pellets, die beim Abzentrifugieren von Nieder schlägen erhalten werden, zu finden. Da das Problem der Wiederauflösung/Resuspendierung von Pellets in der Labor praxis, insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Chemie, Biochemie, Biotechnologie oder Biologie, immer wieder auf tritt und die Verwendung einer Solubilisationshilfe im Sinne der vorliegenden Erfindung in den meisten Fällen mit Vor teilen verbunden ist, wird in der vorliegenden Anmeldung gleichzeitig eine praktische Verfahrensführung mit erhebli cher allgemeiner Bedeutung ohne Beschränkung auf irgendwel che besonderen Materialien beschrieben. Besondere, direkt in der klinischen Routinediagnostik nutzbare Vorteile werden jedoch bei der Isoenzymbestimmung und insbesondere bei der Bestimmung von BAP erhalten, da die eingeführten aufwendigen Bestimmungsverfahren vereinfacht werden können.The addition of an inert particulate material (sand) to improve resuspension or resolubilization a centrifugation pellet generally did not It was common practice in laboratory practice, and it wasn't possible, a reference in the literature or in practice on the use of such a solubilization aid Dissolving pellets when centrifuging low punches are received to find. Because the problem of Redissolution / resuspension of pellets in the laboratory practice, especially in the field of clinical chemistry, Biochemistry, biotechnology or biology, keep coming up occurs and the use of a solubilization aid in the sense of the present invention in most cases with pre share is connected in the present application at the same time a practical procedure with erhebli general meaning without limitation to any special materials described. Special, right in benefits in routine clinical diagnostics however in the determination of isoenzymes and in particular in the Determination of BAP obtained, since the introduced elaborate Determination procedures can be simplified.

Die der Probe zugesetzte Solubilisationshilfe läßt sich in allgemeiner Form als inerter, sauberer Sand beschreiben, der die Eigenschaften aufweisen muß, dichter als Wasser zu sein (Quarzglas bzw. Quarz haben Dichten zwischen 2 und 2,65 g/cm³), so daß ein schnelles Absetzen in einer wäßrigen Flüssigkeit erhalten wird, eine Teilchengröße aufzuweisen, die einerseits beim Schütteln eine intensive Bewegung der Teilchen ermöglicht, andererseits nicht zu zu leichten Teilchen führt, die ineffektiv sind und sogar in Schwebe bleiben, (eine geeignete Korngröße eines Sandes oder ähn lichen inerten Feststoffs liegt im Bereich von 0,1 bis 1,0 mm), inert zu sein und keine stark absorbierende oder poröse Oberfläche aufzuweisen, die eine Messung durch Adsorptionseffekte stören könnte. The solubilization aid added to the sample can be in describe the general form as inert, clean sand, which must have the properties of being denser than water (Quartz glass or quartz have densities between 2 and 2.65 g / cm³), so that rapid settling in an aqueous Liquid is obtained to have a particle size which, on the one hand, causes an intensive movement of the Particle allows, on the other hand not too light Leads to particles that are ineffective and even floating remain, (a suitable grain size of a sand or similar Lichen inert solid is in the range of 0.1 to 1.0 mm) to be inert and not highly absorbent or porous Surface to be measured by Adsorption effects could interfere.

Diese Anforderungen sind von einer Großzahl feinteiliger inerter fester körniger oder sandartiger Materialien zu erfüllen. Gibt man ein Probenröhren mit einem Lösungspuffer und der beschriebenen Solubilisationshilfe in einen Vibra tionsmischer (Vortexer), können auch sehr feste Pellets schnell und problemlos vollständig und reproduzierbar in die Flüssigphase überführt werden. Die unlöslich inerte Solubi lisationshilfe sinkt schnell und von selbst auf den Boden des Teströhrchens, und es kommt somit zu keiner Vermischung und keiner Veränderung der Konzentration oder des Volumens der zu vermessenden Probe. Insbesondere kommt es auch zu keiner Trübung der Testlösung, die bei der späteren Messung der optischen Dichte nach Umsetzung der BAP mit dem Substrat der Enzymreaktion stören könnte.A large number of these requirements are more finely divided inert solid granular or sand-like materials fulfill. Give a sample tube with a solution buffer and the described solubilization aid in a vibra tion mixer (vortexer), can also be very solid pellets quickly and easily completely and reproducibly in the Liquid phase are transferred. The insoluble inert Solubi lization aid sinks quickly and automatically to the floor of the test tube, and there is therefore no mixing and no change in concentration or volume the sample to be measured. In particular, it also happens no turbidity of the test solution during the later measurement the optical density after implementation of the BAP with the substrate could interfere with the enzyme reaction.

Zur Bestimmung der Enzymaktivität der durch Lektin-Fällung abgetrennten BAP kann ein Aliquot der beim Auflösen des Pellets nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Flüssigkeit vermessen werden. Durch Vergleich des für die Enzymaktivität erhaltenen Meßwerts mit den Werten einer Standardkurve ist eine direkte Auswertung des Meßergebnisses ohne Notwendigkeit einer kinetische Messung der Enzymaktivi tät und ohne Messung der gesamten Enzymaktivität in der Ausgangsprobe möglich. Die Standardkurve wird unter Ver wendung von Standardproben erstellt, die dem Reagentiensatz beigegeben werden.To determine the enzyme activity of lectin precipitation separated BAP can be an aliquot of the dissolving of the Pellets obtained by the process according to the invention Liquid to be measured. By comparing that for the Enzyme activity obtained with the values of a The standard curve is a direct evaluation of the measurement result without the need for a kinetic measurement of enzyme activity and without measuring the total enzyme activity in the Initial sample possible. The standard curve is shown under Ver Standard samples created using the reagent kit be added.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand ihrer Anwendung auf die Bestimmung von knochenspezifischer alkali scher Phosphatase (BAP) unter Bezugnahme auf Figuren und unter vergleichender Bewertung der erhaltenen Meßergebnisse noch näher erläutert. In the following, the present invention is based on its Application to the determination of bone-specific alkali sher phosphatase (BAP) with reference to figures and with comparative evaluation of the measurement results obtained explained in more detail.

Es zeigen:Show it:

Fig. 1 eine typische Standardkurve des erfindungsgemäßen Verfahrens; FIG. 1 shows a typical standard curve of the method according to the invention;

Fig. 2 eine graphische Darstellung mit den Ergebnisse eines Intraassayvergleichs mit 20 Patientenseren; Figure 2 is a graph showing the results of an intra-assay comparison with 20 patient sera.

Fig. 3 eine graphische Darstellung der nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren gemessenen BAP-Werte bei verschiedenen Kollektiven von Testpersonen; Figure 3 is a graph of measured according to the method to the invention OF INVENTION BAP values at different cohorts of subjects.

Fig. 4 eine Korrelation der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Meßwerte mit denen des kom merziellen ISO-ALP-Assays; und4 shows a correlation of the measured values obtained by the inventive process with those of the com mercial ISO ALP assays. and

Fig. 5 eine Korrelation der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Meßwerte mit denen des kom merziellen Tandem-R Ostase-Assays. Fig. 5 shows a correlation of the measured values obtained by the method according to the invention with those of the commercial Tandem-R Ostase assay.

Application example Test procedure for the determination of BAP in a human serum

Komponenten des erfindungsgemäßen Assays zur BAP-Bestimmung:
Fällungsreagenz:Components of the assay for BAP determination according to the invention:
Precipitation reagent:

Fällungsreagenz: 0,5 mg/ml Lektin aus Weizenkeimen (WGA) in 100 mM Tris Puffer (Lektin von Sigma Katalog-Nr.: L 9640)Precipitation reagent: 0.5 mg / ml lectin from wheat germ (WGA) in 100 mM Tris buffer (lectin from Sigma catalog no .: L 9640)

Solubilisationshilfe: feinkörniger Feststoff (Quarzsand, Sand o. ä.) mit einer Korngröße im Bereich von 0,1 bis 1,0 mm. Erforderlichenfalls wird ein Ausgangsmaterial durch Absieben auf eine geeignete Korngröße gebracht. Zu kleine Körner stören, da sie als Schwebteilchen in der nach Auflö sung des Pellets erhaltenen flüssigen Phase schwimmen wür den, größere Körner sind aufgrund ihrer schlechteren Beweglichkeit beim Lösen der Niederschläge weniger effektiv. Vor der Verwendung wird der Sand mit sauberem Wasser (destilliertes oder entionisiertes Wasser, durch Revers osmose gereinigtes Wasser) gewaschen und getrocknet. Pro Teströhrchen können Mengen im Bereich von etwa 10 bis 30 mg eingesetzt werden, wobei die Menge nicht kritisch ist.Solubilization aid: fine-grained solid (quartz sand, Sand or similar) with a grain size in the range of 0.1 to 1.0 mm. If necessary, a raw material is through Sieving brought to a suitable grain size. To small Grains interfere as they float in the after dissolving Solution of the pellet liquid phase obtained float larger grains are due to their poorer ones Mobility less effective in removing the precipitates. Before use, the sand is cleaned with clean water (distilled or deionized water, by reverse osmosis purified water) washed and dried. Per Test tubes can range in amounts from about 10 to 30 mg be used, the amount is not critical.

Lösungspuffer: 1 M DiethanolaminpufferSolution buffer: 1 M diethanolamine buffer

Standards: humane knochenspezifische alkalische Phosphatase (Calzyme Katalog-Nr.: 124A0001) in 1 M Diethanolaminpuffer. Die Enzymaktivität wird nach einer Standardmethode bei 37°C bestimmt (optimierte Standardmethode der Deutschen Gesell schaft für klinische Chemie, 1972). Durch Verdünnen werden Standards mit einem Gehalt an BAP von 37,5; 75; 150; 300; 600 und 1200 mU/ml hergestellt.Standards: human bone-specific alkaline phosphatase (Calzyme catalog no .: 124A0001) in 1 M diethanolamine buffer. Enzyme activity is measured using a standard method at 37 ° C determined (optimized standard method of the Deutsche Gesell Society for Clinical Chemistry, 1972). By thinning Standards with a BAP content of 37.5; 75; 150; 300; 600 and 1200 mU / ml.

Substratlösung zur Bestimmung der Enzymaktivität: 1 mg/ml p- Nitrophenylphosphat in 1 M Diethanolaminpuffer.Substrate solution for determining enzyme activity: 1 mg / ml p- Nitrophenyl phosphate in 1 M diethanolamine buffer.

A: Sample preparation

1. 50 µl of a sample (serum or plasma, where - as is known to the person skilled in the art - none in the BAP determination EDTA plasma may be used) in a test tube (Round bottom tube 5 ml) pipetted.
2. Then 200 µl precipitation reagent (lectin) pipetted.
3. The reaction mixture is shaken briefly and then 30 Incubated for minutes at room temperature.
4. After the intended incubation period, the tubes Centrifuged at 2000 × g for 10 minutes, and the supernatants are decanted.
5. Approx. 20 mg are added to the pellet remaining in the tube Solubilization aid (corresponding to a deleted full small spatula) and 250 µl of solution buffer.
6. Then the tubes are shaken, namely either individually for 1 to 2 seconds on a vibration mixer (vortexer) or all tubes together in the stand on an orbital shaker for about 5 minutes.

B: Sample measurement

1. 20 µl standard or prepared sample (as under A described) are each in a cavity Pipetted microtiter plate.
2. 150 μl of substrate solution are added to each cavity, and it is incubated for 10 minutes at room temperature.
3. Then the reaction is stopped with 100 µl each solution (2M NaOH) stopped and at 405 nm in a plate measured photometer.

Eine Standardkurve, wie sie bei der beschriebenen Vorgehens weise für die Standardreagentien erhalten wird, ist in Fig. 1 gezeigt. Der für die Probe ermittelte Wert für die opti sche Dichte kann auf der Standardkurve aufgesucht werden und direkt als Enzymaktivität (mU BAP/ml) abgelesen werden.A standard curve, as is obtained for the standard reagents in the procedure described, is shown in FIG. 1. The value for the optical density determined for the sample can be found on the standard curve and read off directly as enzyme activity (mU BAP / ml).

Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden auf die beschriebene Weise erhaltene Werte Auswertungstests unterzogen.To check the reliability of the invention Process values were obtained in the manner described Subjected to evaluation tests.

precision

Die bei der Bestimmung der Präzision des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 2 darge stellt. Dabei wurde auf der x-Achse die BAP-Konzentration und auf der y-Achse der dazugehörende Variationskoeffizient (VK) aufgetragen. Der VK wurde in einem Intraassayvergleich ermittelt, wobei die gleichen Proben 20mal in einem Assay lauf getestet wurden. Die Assaypräzision liegt für alle BAP- Werte unter 10%.The results obtained in determining the precision of the method according to the invention are shown in Fig. 2 Darge. The BAP concentration was plotted on the x-axis and the associated coefficient of variation (CV) on the y-axis. The VK was determined in an intra-assay comparison, with the same samples being tested 20 times in an assay run. Assay precision is below 10% for all BAP values.

Frequency distribution

Die Häufigkeitsverteilung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten BAP-Werte für verschiedene Kollektive ist in Fig. 3 dargestellt. Gesunde Erwachsene (Alter <20 Jahre; n = 99), Schwangere (n = 7) und Patienten mit Leber erkrankungen (n = 6) zeigen keine signifikanten Unterschiede der Meßergebnisse. Die erhaltenen Meßwerte liegen alle im Normalbereich unter 80 mU/ml. Erwartungsgemäß zeigen jedoch Kinder während der Wachstumsphase (bis 15 Jahre; n = 27) deutlich erhöhte BAP-Werte.The frequency distribution of the BAP values determined by the method according to the invention for different collectives is shown in FIG. 3. Healthy adults (age <20 years; n = 99), pregnant women (n = 7) and patients with liver diseases (n = 6) show no significant differences in the measurement results. The measured values obtained are all in the normal range below 80 mU / ml. As expected, however, children show significantly increased BAP values during the growth phase (up to 15 years; n = 27).

correlation

Zur Bewertung der Zuverlässigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Meßergebnisse für 40 Seren mit Meßwerten vergli chen, die für die gleichen Seren unter Verwendung beste hender Verfahren zur Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 sowie in den Fig. 4 und 5 dargestellt.To evaluate the reliability of the method according to the invention, the measurement results obtained with the method according to the invention for 40 sera were compared with measured values which were obtained for the same sera using the best existing methods for determining bone-specific alkaline phosphatase. The results are shown in Table 1 and in FIGS. 4 and 5.

In Tabelle 1 betreffen die Spalten a und b die Ergebnisse von Bestimmungen nach Verfahren des Standes der Technik, die nachfolgend noch genauer erläutert werden. Unter c werden die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Werte angeführt. Die Meßergebnisse für a und c sind in mU/ml angegeben, und die für b in mg/l. In Table 1, columns a and b relate to the results of provisions according to methods of the prior art, the are explained in more detail below. Under c the values determined by the method according to the invention cited. The measurement results for a and c are in mU / ml specified, and those for b in mg / l.

Die Vergleichsverfahren a und b waren:The comparison methods a and b were:

a) Determination method using the commercial available test kits ISO-ALP from Boehringer Mannheim (Cat.-No .: 1065769), which is also the basis of the publication in Clin. Chem. 39/4, 648-652 (1993).
b) Immunological determination method of BAP under Ver application of two monoclonal antibodies, one of which is immobilized on a solid phase and the other than Tracer is used. The test is commercially available under the Name Tandem-R Ostase from Hybritech (cat. No .: 3040) available.

In den Fig. 4 und 5 sind die Korrelationen des erfin dungsgemäßen Verfahrens zu den Verfahren des Standes der Technik graphisch dargestellt. Sie zeigen eine gute Überein stimmung mit Korrelationsfaktoren von r = 0,938 (Fig. 4) und r = 0,90 (Fig. 5).In Figs. 4 and 5 of the correlations to the invention OF INVENTION method are shown graphically on the procedures of the prior art. They show a good agreement with correlation factors of r = 0.938 ( FIG. 4) and r = 0.90 ( FIG. 5).

Comparison test

Die Wichtigkeit der Verwendung einer Solubilisationshilfe zeigte sich bei dem Versuch, ein Verfahren, das dem erfin dungsgemäßen Verfahren entspricht, ohne Zusatz der Solubili sationshilfe durchzuführen. 35 Seren wurden mit und ohne Zusatz der Solubilisationshilfe vermessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Den Ergebnissen ist sofort zu entnehmen, daß eine direkte Messung der Enzym aktivität der mit Lektin-Fällung ausgefällten BAP nur unter Verwendung der Solubilisationshilfe möglich ist. Ohne Solu bilisationshilfe wird auch bei längerem Schütteln nur eine teilweise und von Probe zu Probe unterschiedliche Auflösung erhalten (35 bis 100% der mit Solubilisationshilfe erhalte nen Werte). Diese Ergebnisse zeigen, daß die scheinbar einfache praktische Maßnahme des Zusatzes einer feinkörnigen inerten Solubilisationshilfe einen hohen Einfluß auf die erhaltenen Meßergebnisse ausübt und letztlich erst eine direkte Messung der Enzymaktivität der ausgefällten BAP durch Wiederauflösung eines Pellets möglich macht.The importance of using a solubilization aid was shown when trying to find a method that invented the corresponds method according to the invention, without the addition of the Solubili to perform aid. 35 sera were with and without Measure the addition of the solubilization aid. The received Results are summarized in Table 2. The results it can be seen immediately that a direct measurement of the enzyme activity of the BAP precipitated with lectin precipitation only under Use of the solubilization aid is possible. Without solu Bilization aid is only one even with long shaking partially and different resolution from sample to sample received (35 to 100% of those obtained with solubilization aid values). These results show that the apparently simple practical measure of adding a fine-grained inert solubilization aid have a high impact on the obtained measurement results and ultimately only one direct measurement of the enzyme activity of the precipitated BAP by redissolving a pellet.

Es ist dem Fachmann sofort klar, daß die Vorteile des erfin dungsgemäßen Verfahrens nicht nur bei der Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase genutzt werden können, sondern in allen Fällen, in denen eine direkte Bestimmung in einer durch Fällung aus einer Reaktionslösung und Zentrifugieren als schwer lösliches Pellet erhaltenen festen Phase wünschenswert ist und gegenüber der üblichen Bestimmung durch Differenzmessung Vorteile bietet. Denkbare Anwendungsgebiete sind Enzymbestimmungen, insbesondere selektive Isoenzymbestimmungen, andere mögliche Anwendungs gebiete ergeben sich für den mit einer speziellen Problem stellung befaßten Fachmann jedoch ohne weiteres von selbst. It is immediately clear to the person skilled in the art that the advantages of the invent method according to the invention not only in the determination of bone-specific alkaline phosphatase can be used can, but in all cases where a direct Determination in a by precipitation from a reaction solution and centrifugation obtained as a poorly soluble pellet solid phase is desirable and compared to the usual Determination by differential measurement offers advantages. Conceivable Areas of application are enzyme determinations, in particular selective isoenzyme determinations, other possible application areas arise for those with a special problem position concerned expert, however, by itself.

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

Claims

1. A method for the selective determination of the content of an enzyme in a biological sample, in which (i) the enzyme to be determined is precipitated by reaction with a lectin, (ii) the lectin-enzyme precipitate is separated from the liquid phase by centrifuged and a first liquid phase as a supernatant is separated from the lectin-enzyme precipitate obtained in the centrifugation pellet, (iii) subsequently the centrifugation pellet is converted into a second liquid phase by resuspending or resolving, and then (iv) the bound and / or the enzyme content in the supernatant in the liquid phases was determined in a manner known per se, characterized in that the centrifugation pellet was transferred into the second liquid phase by being in the presence of an added solubilization aid in the form of a particulate inert solid with brief shaking in a solution of a suitable buffer.

2. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme to be determined is selectively precipitable with lectin Isoenzyme.

3. The method according to claim 2, characterized in that the isoenzyme to be determined is bone-specific alkaline Phosphatase (BAP) is in a biological fluid is determined, the other organ-specific isoenzyme forms contains the alkaline phosphatase (AP), whereby the Bone-specific alkaline phosphatase (BAP) selective using lectin from wheat germ (WGA; wheat germ lectin) fails.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized characterized in that as a particulate inert solid a granular sand with particles with diameters in the Range from 0.1 to 1 mm used.

5. The method according to claim 4, characterized in that you use washed quartz sand or other sand, by grinding a glass or other oxide kerami material with a density of more than 1.5 g / cm² as well as sieving and washing if necessary has been.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized in that the short-term shaking as a Shake individual test tubes for a period of 1 up to 10 s on a vibration mixer.

7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized characterized that the short-term shaking as Schüt a rack with a set of test tubes for one Period of 2 to 7 minutes on an orbital shaker leads.

8. A method for determining bone-specific alkaline phosphatase (BAP) in a biological liquid which additionally contains other isoenzyme forms of alkaline phosphatase (AP), in which

- a sample of the biological fluid is mixed with a solution of lectin from wheat germ,
centrifuged the liquid mixture obtained to separate the precipitate formed below, forming a pellet,
separates the supernatant liquid phase from the pellet,
- Adds a buffer-containing aqueous solution and a solubilization aid in the form of a sand-like inert solid to the pellet,
- The heterogeneous mixture obtained for resuspending or dissolving the pellet briefly shakes, and for determining the content of bone-specific alkaline phosphatase (BAP) in the biological sample, the measurable phosphatase activity in the liquid phase obtained by dissolving the pellet is determined and the measured value obtained taking into account evaluates the dilution parameters selected during the determination using a standard calibration curve.