DE4441197C1 - Schizosaccharomyces pombe expression plasmids - Google Patents

Schizosaccharomyces pombe expression plasmids

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Abstract

Yeast expression plasmids contg. DNA coding for a fusion protein comprising a polypeptide (I) and a Schizosaccharomyces pombe signal peptide are new. Also claimed are S. pombe cells contg. a plasmid as above. The signal peptide is encoded by a DNA sequence shown in the specification. (I) is (a) an HPV E6 or E7 protein, esp. from HPV 11, HPV 16 or HPV 18, or (b) a fusion protein comprising an HPV protein and an antibody binding region. Plasmids pREP3-L20 spI HPV-16 E7 (DSM 9532) and pREP3-L20 spI HPV-16 E7 tag (DSM 9531) are specifically claimed.

Description

Die Erfindung betrifft Hefe-Expressionsplasmide und solche enthaltende Hefezellen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden in Hefe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsplasmide.The invention relates to yeast expression plasmids and yeast cells containing them. The invention further relates to a method for producing polypeptides in yeast using the expression plasmids according to the invention.

Es ist bekannt, Hefezellen, z. B. solche des Stammes Schizosaccharomyces Pombe, zur Expression von Polypeptiden zu verwenden. Die exprimierten Polypeptide werden aber in der Regel nicht in das Medium sekretiert, sondern lagern sich in den Hefezellen an. Zur Isolierung der Polypeptide müssen daher die Hefezellen aufgeschlossen und die erhaltenen Zelltrümmer und Hefeproteine abgetrennt werden. Dies stellt einen zeitlich und finanziell großen Aufwand dar.It is known to use yeast cells, e.g. B. those of the Schizosaccharomyces Pombe strain, to use for expression of polypeptides. The expressed polypeptides are usually not secreted into the medium, but are stored in the yeast cells. The yeast cells must therefore be isolated to isolate the polypeptides disrupted and the cell debris and yeast proteins obtained separated will. This represents a time and financial expense.

EP-A-0 362 179 beschreibt Methoden zum Herstellen von heterologen Polypepti­ den in Saccharomyces, wobei ein transformierter Saccharomyces-Stamm in einem geeigneten Medium kultiviert wird. Der Saccharomyces-Stamm ist dabei mit einem Plasmid transformiert, das einen Promotor und/oder eine Signalsequenz von Candida enthält. Weiter enthält das Plasmid in geeigneter Orientierung zum Signal­ peptid ein heterologes Strukturgen, das für ein Polypeptid kodiert, wobei das Genprodukt als Hybrid- oder Fusionsprotein ins Medium abgeschieden wird.EP-A-0 362 179 describes methods for producing heterologous polypeptides that in Saccharomyces, with a transformed Saccharomyces strain in one suitable medium is cultivated. The Saccharomyces strain is with one Plasmid that transforms a promoter and / or a signal sequence of Contains candida. The plasmid also contains a suitable orientation to the signal peptide is a heterologous structural gene that codes for a polypeptide, the Gene product is deposited into the medium as a hybrid or fusion protein.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem ein Polypeptid in Hefezellen exprimiert werden kann, ohne daß vorstehende Nachteile auftreten.The present invention is therefore based on the object of providing a means with which a polypeptide can be expressed in yeast cells without above disadvantages occur.

Erfindungsgemäß wird dies durch ein Hefe-Expressionsplasmid gemäß Anspruch 1 erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.According to the invention, this is done by a yeast expression plasmid achieved according to claim 1. Beneficial Refinements result from the subclaims.

Mit einem solchen Hefe-Expressionsplasmid wird in dieses enthaltenden Hefezellen das Polypeptid in Form eines Fusionspolypeptids exprimiert. Dieses enthält ein Hefe-Signalpeptid, wodurch das Fusionspolypeptid aus den Hefezellen heraustrans­ portiert wird. Hierbei wird das Hefe-Signalpeptid abgespalten, wodurch im Medium nur das Polypeptid angereichert wird.Such a yeast expression plasmid contains yeast cells in it the polypeptide is expressed in the form of a fusion polypeptide. This contains a Yeast signal peptide, whereby the fusion polypeptide is transferred out of the yeast cells is ported. Here, the yeast signal peptide is split off, resulting in the medium only the polypeptide is enriched.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Hefe-Expressionsplasmids kann jeglicher zur Expression in Hefe geeignete Vektor verwendet werden. Dem Fachmann sind solche Vektoren bekannt. Beispielsweise wird er auf pREP3-L20 zurückgreifen. Dieser Vektor leitet sich von pREP3 (vgl. Maundrell, K., Gene 123 (1993), S. 127- 130) ab, enthält aber nachstehende "Multiple Cloning Site" (MCS):Any one can produce a yeast expression plasmid according to the invention Vector suitable for expression in yeast can be used. The specialist are such vectors are known. For example, he will use pREP3-L20. This vector is derived from pREP3 (cf. Maundrell, K., Gene 123 (1993), p. 127- 130), but contains the following "Multiple Cloning Site" (MCS):

In einem vorstehenden Vektor wird eine DNA inseriert, die für ein ein von Schizosaccharomyes Pombe stammendes Signalpeptid und ein Polypeptid umfassendes Fusionspolypeptid codiert. Die Insertion erfolgt derart, daß das Fusionspolypeptid in Hefezellen exprimiert werden kann. Dem Fachmann sind hierfür geeignete Verfahren und Bedingungen bekannt. Insbesondere achtet er darauf, daß jeweils am 5′-Ende der für das Hefe-Signalpeptid und der für das Polypeptid codierenden DNA ein ATG-Codon vorliegt. Auch kann es von Vorteil sein, wenn das 3′-Ende der für das Hefe-Signalpeptid codierenden DNA unmittelbar, d. h. ohne über zusätzliche Codons, an das ATG-Codon der für das Polypeptid codierenden DNA grenzt. Günstig kann es ferner sein, die für das Hefe-Signalpeptid codierende DNA zunächst mit der für das Polypeptid codie­ renden DNA zu verknüpfen und dann das Ligationsprodukt in den Vektor zu inserieren. Andererseits liefert die getrennte Insertion der beiden DNAs, d. h. wenn nur die für das Hefe-Signalpeptid codierende DNA inseriert wird, einen neuen vorteilhaften Expressionsvektor für Hefen. Ein solcher Vektor ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.In a vector above, a DNA is inserted which is for a signal peptide derived from Schizosaccharomyes Pombe and encoding a fusion polypeptide comprising a polypeptide. The insertion takes place in such a way that the fusion polypeptide can be expressed in yeast cells. Suitable methods and conditions for this are known to the person skilled in the art. In particular, he makes sure that at the 5'-end for the yeast signal peptide and the DNA encoding the polypeptide has an ATG codon. Also it may be advantageous if the 3'-end of the coding for the yeast signal peptide DNA immediately, i.e. H. without the additional codons, to the ATG codon for the DNA encoding the polypeptide. It can also be favorable for DNA encoding the yeast signal peptide initially with the coding for the polypeptide DNA to link and then the ligation product into the vector advertise. On the other hand, the separate insertion of the two DNAs, i.e. H. if only the DNA coding for the yeast signal peptide is inserted, a new one advantageous expression vector for yeast. Such a vector is also an object of the present invention.

Der vorstehende Ausdruck "Hefe-Signalpeptid" betrifft ein aus Saccharomyces Pombe stammendes Signalpeptid. Seine DNA kann die in Fig. 1 angegebene Sequenz aufweisen. Günstig kann es sein, diese Sequenz durch ein oder mehrere Nukleotide, z. B. in Form von Addition, Deletion und/oder Substitution von Nukleotiden, zu modifizieren. Eine solche Modifikation kann z. B. darauf ab­ zielen, daß das 3′-Ende der für das Hefe-Signalpeptid codierenden DNA unmittelbar an das ATG-Codon der für das Polypeptid codierenden DNA grenzt.The above term "yeast signal peptide" refers to a signal peptide derived from Saccharomyces Pombe. Its DNA can have the sequence given in FIG. 1. It can be advantageous to sequence this sequence with one or more nucleotides, e.g. B. in the form of addition, deletion and / or substitution of nucleotides. Such a modification can e.g. B. aim that the 3'-end of the DNA coding for the yeast signal peptide directly borders on the ATG codon of the DNA coding for the polypeptide.

Ferner betrifft der vorstehende Ausdruck "Polypeptid" ein Polypeptid jeglicher Art, das in Hefen exprimiert werden kann. Vorzugsweise ist dies ein nicht von Hefen stammendes Polypeptid. Beispiele hierfür sind Proteine oder Teile davon von hu­ manen Papillomviren (HPV). Von diesen sind die frühen, ein Kernsignal aufweisen­ den Proteine E6 und E7 von HPV 11, HPV 16 und HPV 18 besonders zu erwäh­ nen.Furthermore, the above term “polypeptide” relates to a polypeptide of any kind, that can be expressed in yeast. Preferably this is not a yeast derived polypeptide. Examples of this are proteins or parts thereof from hu  manen papillomavirus (HPV). Of these, the early ones have a core signal the proteins E6 and E7 of HPV 11, HPV 16 and HPV 18 are particularly worth mentioning nen.

In bevorzugter Ausführungsform umfaßt das durch ein erfindungsgemäßes Ex­ pressionsplasmid codierte Fusionspolypepfid ein von Schizosaccharnmyces Pombe stammendes Signalpeptid mit der DNA-Sequenz von Fig. 1, und ein E7- Protein von HPV 16. Ein solches Expressionsplasmid enthält den Vektor pREP3 L20 und wird mit pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 bezeichnet. Es wurde bei der DSM am 28. 10. 1994 unter DSM 9532 hinterlegt. Die Herstellung von pREP3-L20 spI- HPV 16 E7 wird in Fig. 2 gezeigt.In a preferred embodiment, the fusion polypeptide encoded by an expression plasmid according to the invention comprises a signal peptide from Schizosaccharnmyces Pombe with the DNA sequence of FIG. 1 and an E7 protein from HPV 16. Such an expression plasmid contains the vector pREP3 L20 and is treated with pREP3- L20 spI-HPV 16 E7 designated. It was deposited with the DSM on October 28, 1994 under DSM 9532. The preparation of pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 is shown in Fig. 2.

Desweiteren weist der Ausdruck "Polypeptid" darauf hin, daß ein solches auch das Produkt einer Fusion aus zwei oder mehreren Polypeptiden sein kann. Eines oder mehrere dieser Polypeptide enthalten günstigerweise eine Region, die leicht von einem Antikörper gebunden werden kann.Furthermore, the term "polypeptide" indicates that such a May be the product of a fusion of two or more polypeptides. One or several of these polypeptides conveniently contain a region that is slightly different from can be bound to an antibody.

In bevorzugter Ausführungsform umfaßt das durch ein erfindungsgemäßes Ex­ pressionsplasmid codierte Fusionspolypeptid ein von Saccharomyces Pombe stammendes Signalpeptid mit der DNA-Sequenz von Fig. 1, ein E7- Protein von HPV 16 und ein tag Polypeptid. Letzteres Polypeptid umfaßt 11 Amino­ säuren des C-Terminus von SV40t-Antigen. Es weist eine Region auf, die von dem allgemein erhältlichen Antikörper MAK tag (KT3) gebunden wird. Ein für vorstehen­ des Fusionspolypeptid codierendes Expressionsplasmid enthält den Vektor pREP3- L20 und wird mit pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag bezeichnet. Es wurde bei der DSM am 28. 10. 1994 unter DSM 9531 hinterlegt. Die Herstellung von pREP3- L20 spI-HPV 16 E7 tag wird in Fig. 3 gezeigt.In a preferred embodiment, the fusion polypeptide encoded by an expression plasmid according to the invention comprises a signal peptide from Saccharomyces Pombe with the DNA sequence of FIG. 1, an E7 protein from HPV 16 and a tag polypeptide. The latter polypeptide comprises 11 amino acids of the C-terminus of SV40t antigen. It has a region that is bound by the commonly available antibody MAK tag (KT3). An expression plasmid coding for the above of the fusion polypeptide contains the vector pREP3-L20 and is designated pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag. It was deposited with the DSM on October 28, 1994 under DSM 9531. The production of pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag is shown in FIG. 3.

Die erfindungsgemäßen Expressionsplasmide zeichnen sich dadurch aus, daß die von den Hefezellen exprimierten Polypeptide in das Medium sekretiert werden. Die Polypeptide können dann leicht von den Hefezellen durch übliche Verfahren, wie Zentrifugation, getrennt und nachfolgend gereinigt werden. Dies gilt umso mehr, wenn die Polypeptide eine Region enthalten, die leicht von einem Antikörper gebunden werden kann. Über diese Region können die Polypeptide durch einen entsprechenden Antikörper gefangen werden, der z. B. an einem Säulenmaterial fixiert ist. Durch nachfolgende Elution werden die Polypeptide in gereinigter Form erhalten.The expression plasmids according to the invention are characterized in that the polypeptides expressed by the yeast cells are secreted into the medium. The Polypeptides can then be easily removed from the yeast cells by conventional methods such as Centrifugation, separated and subsequently cleaned. This is all the more true  if the polypeptides contain a region that is easily from an antibody can be bound. The polypeptides can be corresponding antibodies are caught, the z. B. on a column material is fixed. The polypeptides are purified by subsequent elution receive.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Hefezellen des Stammes Schizosaccharomyces Pombe, die ein erfindungsgemäßes Expres­ sionsplasmid, z. B. pREP3 L20 spI-HPV 16 E7 oder pREP3 L20 spI-HPV 16 E7 tag enthalten.The present invention also relates to yeast cells of the strain Schizosaccharomyces Pombe, which is an express according to the invention sionsplasmid, e.g. B. pREP3 L20 spI-HPV 16 E7 or pREP3 L20 spI-HPV 16 E7 day contain.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her­ stellung von Polypeptiden, das folgende Verfahrensschritte umfaßt:Another object of the present invention is a process for the manufacture Provision of polypeptides, which comprises the following process steps:

  • (a) Transformation von Hefezellen des Stammes Schizosaccharo­ myces Pombe, mit einem vorstehenden Expressionsplasmid,(a) Transformation of yeast cells from the Schizosaccharo strain myces pombe, with an above expression plasmid,
  • (b) Kultivierung der transformierten Hefezellen von Schritt (a), wodurch ein Fusionspolypeptid exprimiert wird, und(b) culturing the transformed yeast cells from step (a), whereby a Fusion polypeptide is expressed, and
  • (c) Abtrennung des im Zellüberstand vorliegenden Polypeptids und gegebenen­ falls weitere Reinigung des Polypeptids.(c) separation of the polypeptide present in the cell supernatant and given if further purification of the polypeptide.

Zur Durchführung vorstehender Verfahren sind dem Fachmann geeignete Materia­ lien und Bedingungen bekannt. Ergänzend wird auf Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory mannual (1982), Cold Spring Harbor, New York, verwiesen.The person skilled in the art is suitable for carrying out the above processes lien and conditions known. In addition, Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory mannual (1982), Cold Spring Harbor, New York.

Kurze Beschreibung der ZeichnungBrief description of the drawing

Fig. 1 zeigt die für ein Signalpeptid von Schizosaccharomyces Pombe codie­ rende DNA, Fig. 1 shows the codie for a signal peptide of Schizosaccharomyces pombe DNA Rende,

Fig. 2 zeigt das Expressionsplasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 sowie seine Herstellung, Fig. 2, the expression pREP3-L20 SPI shows HPV 16 E7 as well as its manufacture,

Fig. 3 zeigt das Expressionsplasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag sowie seine Herstellung, und Fig. 3 shows the expression plasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag and its preparation, and

Fig. 4 zeigt die für das Polypeptid tag codierende DNA sowie schematisch die für HPV 16 E7 tag codierende DNA. Fig. 4 shows the DNA coding for the polypeptide tag and schematically the DNA coding for HPV 16 E7 tag.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.

Beispiel 1example 1 Herstellung des Expressionsplasmids pREP3-L20 spI-HPV 16 E7Production of the expression plasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7

Die Herstellung dieses Expressionsplasmids ist schematisch in Fig. 2 dargestellt.The production of this expression plasmid is shown schematically in FIG. 2.

Es wird eine einzelsträngige (ss) für spI (vgl. Fig. 1) codierende DNA synthetisiert. Mit dem Klenow-Fragment wird diese DNA doppelsträngig gemacht (dsDNA spI) und anschließend mit den Restriktionsenzymen BamHI und NsiI nachgeschnitten. Es wird ein BamHI-NsiI DNA-Fragment erhalten.A single-stranded (ss) coding for spI (see FIG. 1) is synthesized. This DNA is made double-stranded with the Klenow fragment (dsDNA spI) and then cut with the restriction enzymes BamHI and NsiI. A BamHI-NsiI DNA fragment is obtained.

Ferner wird mit einem üblichen PCR-Verfahren die für das Protein E7 von HPV 16 codierende DNA (HPV 16 E7) amplifiziert. Die so erhaltene DNA wird mit den Restriktionsenzymen NsiI und SalI nachgeschnitten. Es wird ein NsiI-SalI DNA- Fragment erhalten.Furthermore, with a conventional PCR method, the protein E7 from HPV 16 coding DNA (HPV 16 E7) amplified. The DNA obtained in this way is compared with the Restriction enzymes NsiI and SalI cut. It becomes an NsiI-SalI DNA Received fragment.

Vorstehende DNA-Fragmente werden mit dem BamHI-SalI gespaltenen Vektor Bluescript in eine Ligasereaktion eingesetzt: Es wird das Plasmid Bluescript spI HPV 16 E7 erhalten. Dieses Plasmid wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten und das spI und HPV 16 E7 enthaltende DNA-Fragment wird isoliert. Dieses Fragment wird zusammen mit dem BamHI und SalI gespaltenen Vektor pREP3-L20 (vgl. vorstehende in eine Ligasereaktion eingesetzt. Es wird das Ex­ pressionsplasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 erhalten. The above DNA fragments are digested with the BamHI-SalI vector Bluescript used in a ligase reaction: The plasmid Bluescript spI HPV 16 E7 received. This plasmid is used with the restriction enzymes BamHI and Cleave SalI and isolate the DNA fragment containing spI and HPV 16 E7. This fragment is cut together with the BamHI and SalI vector pREP3-L20 (cf. above used in a ligase reaction. The Ex pressure plasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 obtained.  

Beispiel 2Example 2 Herstellung des Expressionsplasmids pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tagProduction of the expression plasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 day

Die Herstellung dieses Expressionsplasmids ist schematisch in Fig. 3 dargestellt.The production of this expression plasmid is shown schematically in FIG. 3.

Analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wird das Plasmid Bluescript HPV 16 E7 tag hergestellt. Aus diesem wird nach Spaltung mit den Restriktions­ enzymen NsiI und SalI das für HPV 16 E7 tag codierende DNA-Fragment (vgl. Fig. 4) isoliert. Dieses DNA-Fragment wird in das Plasmid Bluescript spI HPV 16 E7 (vgl. Beispiel 1) inseriert, nachdem dieses mit NsiI und SalI gespalten und die für HPV 16 E7-codierenden DNA entfernt worden sind. Es wird das Plasmid Bluescript spI-HPV 16 E7 tag erhalten. Dieses Plasmid wird mit den Restriktions­ enzymen SpeI und XhoI gespalten und das spI-HPV 16 E7 tag-Fragment wird in den entsprechend gespaltenen Vektor pREP3-L20 (vgl. vorstehend) inseriert. Es wird das Expressionsplasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 tag erhalten.The plasmid Bluescript HPV 16 E7 tag is produced analogously to the method described in Example 1. After cleavage with the restriction enzymes NsiI and SalI, the DNA fragment coding for HPV 16 E7 tag (cf. FIG. 4) is isolated from this. This DNA fragment is inserted into the plasmid Bluescript spI HPV 16 E7 (cf. Example 1) after it has been cleaved with NsiI and SalI and the DNA coding for HPV 16 E7 has been removed. The plasmid Bluescript spI-HPV 16 E7 day is obtained. This plasmid is cleaved with the restriction enzymes SpeI and XhoI and the spI-HPV 16 E7 tag fragment is inserted into the correspondingly cleaved vector pREP3-L20 (see above). The expression plasmid pREP3-L20 spI-HPV 16 E7 day is obtained.

Beispiel 3Example 3 Expression des Proteins E7 von HPV 16 (HPV 16 E7)Expression of the protein E7 from HPV 16 (HPV 16 E7)

(a) Das Expressionsplasmid pREP3-L20 spI HPV-16 E7 wird zur Transformation von Hefezellen des Stammes Schizosaccharomyces Pombe LEU 1.32 ver­ wendet. Diese Hefezellen können kein Leucin herstellen. Dieser Mangel wird aber durch vorstehendes Expressionsplasmid überwunden, da dieses auch für Leucin codiert. Es findet eine Selektion in einem Leucin-Mangelmedium statt.(a) The expression plasmid pREP3-L20 spI HPV-16 E7 becomes the transformation of yeast cells from the strain Schizosaccharomyces Pombe LEU 1.32 ver turns. These yeast cells cannot produce leucine. This shortage will but overcome by the above expression plasmid, since this too encoded for leucine. A selection is made in a leucine deficient medium instead of.

Transformierte Hefezellen werden kultiviert, wodurch die Expression des durch das Expressionsplasmid codierten Fusionspolypeptids stattfindet. Die Hefezellen werden zentrifugiert und das Polypeptid HPV 16 E7 wird im Zellüberstand nachgewiesen. Transformed yeast cells are cultivated, whereby the expression of the fusion polypeptide encoded by the expression plasmid. The Yeast cells are centrifuged and the polypeptide HPV 16 E7 is in the Cell supernatant detected.  

Der Nachweis erfolgt durch Dot-blot-Analyse des Zellüberstands mittels des monoklonalen gegen HPV 16 E7 gerichteten Antikörpers Mab HPV 16 E7 IV.The detection is carried out by dot blot analysis of the cell supernatant using the monoclonal anti-HPV 16 E7 antibody Mab HPV 16 E7 IV.

Ferner findet ein Nachweis von intra- und extrazellulärem HPV 16 E7 in einem Western-Blot statt. Als Antikörper wird vorstehend genannter ver­ wendet.There is also evidence of intra- and extracellular HPV 16 E7 in a Western blot. As an antibody, the above ver turns.

Es zeigt sich, daß das Polypeptid HPV 16 E7 in den Zellüberstand sekretiert wird.It is shown that the HPV 16 E7 polypeptide secretes into the cell supernatant becomes.

(b) Analog zu vorstehendem Verfahren von (a) werden Hefezellen des Stammes Schizosaccharomyces Pombe LEU 1.32 mit dem Expressionsplasmid pREP3- L20 spI-HPV 16 E7 tag transformiert und die Expression des Polypeptids HPV 16 E7 tag wird mit dem gegen tag gerichteten monoklonalen Antikörper Mab tag (KT3) nachgewiesen.(b) Analogous to the above method of (a), yeast cells of the strain Schizosaccharomyces Pombe LEU 1.32 with the expression plasmid pREP3- L20 spI-HPV 16 E7 tag transformed and expression of the polypeptide HPV 16 E7 tag with the anti-tag monoclonal antibody Mab day (KT3) detected.

Es zeigt sich, daß das Polypeptid HPV 16 E7 tag in den Zellüberstand sekre­ tiert wird.It turns out that the polypeptide HPV 16 E7 tag secrete in the cell supernatant is tiert.

Die in den Beispielen beschriebenen Verfahren und Materialien sind dem Fachmann bekannt. Ergänzend wird auf Maniatis et al., vorstehend angege­ ben, verwiesen.The methods and materials described in the examples are the same Known specialist. In addition, reference is made to Maniatis et al., Above ben, referred.

Claims (12)

1. Hefe-Expressionsplasmid mit einer DNA, die für ein ein von Schizosaccharo­ myces Pombe stammendes Signalpeptid und ein Polypeptid umfassendes Fusionspolypeptid codiert.1. Yeast expression plasmid with a DNA that is a one of Schizosaccharo myces Pombe-derived signal peptide and a polypeptide Fusion polypeptide encoded. 2. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid jenes von Fig. 1 ist, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses An­ spruchs ist.2. yeast expression plasmid according to claim 1, characterized in that the signal peptide is that of Fig. 1, wherein Fig. 1 is part of this claim. 3. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid nicht von einer Hefe stammt.3. yeast expression plasmid according to claim 1 or 2, characterized in that the polypeptide is not from a yeast. 4. Hefe-Expressionsplasmid nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Polypeptid von einem humanpathogenen Papillomvirus (HPV) stammt.4. yeast expression plasmid according to any one of claims 1-3, characterized records that the polypeptide is from a human pathogenic papilloma virus (HPV) originates. 5. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein HPV E6- oder HPV E7-Protein ist.5. yeast expression plasmid according to claim 4, characterized in that the polypeptide is an HPV E6 or HPV E7 protein. 6. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das E6- und E7-Protein von HPV 11, HPV 16 und HPV 18 stammt.6. yeast expression plasmid according to claim 5, characterized in that the E6 and E7 proteins are derived from HPV 11, HPV 16 and HPV 18. 7. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 6, hinterlegt bei der DSM unter DSM 9532.7. yeast expression plasmid according to claim 6, deposited with the DSM under DSM 9532. 8. Hefe-Expressionsplasmid nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Polypeptid mit einem weiteren Polypeptid fusioniert ist.8. yeast expression plasmid according to any one of claims 1-6, characterized records that the polypeptide is fused to another polypeptide. 9. Hefe-Expressionsplasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere Polypeptid eine Antikörper-Bindungsregion umfaßt.9. yeast expression plasmid according to claim 8, characterized in that  the further polypeptide comprises an antibody binding region. 10. Expressionsplasmid nach Anspruch 9, hinterlegt bei der DSM unter DSM 9531.10. Expression plasmid according to claim 9, deposited with the DSM under DSM 9531. 11. Hefezellen vom Stamm Schizosaccharomyces Pombe, enthaltend den Vektor nach einem der Ansprüche 1-10.11. Yeast cells from the Schizosaccharomyces Pombe strain, containing the Vector according to one of claims 1-10. 12. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:
  • (a) Transformation von Hefezellen vom Stamm Schizosaccharomyces Pombe mit dem Expressionsplasmid nach einem der Ansprüche 1-10,
  • (b) Kultivierung der transformierten Hefezellen von Schritt (a), wodurch das Fusionspolypeptid exprimiert wird, und
  • (c) Abtrennung des im Zellüberstand vorliegenden Polypeptids und ggfs. weitere Reinigung des Polypeptids.
12. A process for the preparation of polypeptides, comprising the following process steps:
  • (a) transformation of yeast cells from the Schizosaccharomyces Pombe strain with the expression plasmid according to any one of claims 1-10,
  • (b) culturing the transformed yeast cells from step (a), thereby expressing the fusion polypeptide, and
  • (c) separation of the polypeptide present in the cell supernatant and, if necessary, further purification of the polypeptide.
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