DE4425382A1 - Rapid detection of live bacterial vaccine - Google Patents

Rapid detection of live bacterial vaccine

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Abstract

A method for the diagnostic detection of live bacterial vaccines in human or veterinary medicine involves genetically labelling a bacterial strain suitable for use as live vaccine with luciferase gene (LFG) and identifying the labelled strain by detection of bacterial light prodn. Also claimed are a live bacterial vaccine obtd. as described above; and a Salmonella bacterial strain (specifically a strain of S. typhimurium), in which the bacterial genome contains recombined LFG, so that the strain has bacterial light-producing properties and a living vaccine can be optically differentiated from wild-type.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum diagnostischen Nachweis bakterieiler Lebendvaccinen in der Human- und Veterinärmedizin und die Verwendung gentechnisch markierter Bakterienstämme als Lebendvaccine.The invention relates to a method for the diagnostic detection of bacteria Live vaccines in human and veterinary medicine and the use of genetic engineering labeled bacterial strains as live vaccines.

Nach dem Stand der Technik ist es bekannt, bakterielle Lebendimpfstoffe zur Immunprophylaxe in der Human- und Veterinärmedizin einzusetzen. Beispiele hierfür sind verschiedene in Deutschland zugelassenen Salmonella-Lebendvaccinen, die in der Landwirtschaft zum Schutz der Tierbestände vor Salmonellosen angewandt werden.It is known in the prior art to use bacterial live vaccines Use immunoprophylaxis in human and veterinary medicine. Examples of this are various Salmonella live vaccines approved in Germany, which are used in the Agriculture to protect livestock from salmonellosis.

Eine Grundvoraussetzung für den Einsatz von Lebendvaccinen stellt ihre sichere Nachweisbarkeit und Abgrenzbarkeit vom Wildtyp dar. Gegenwärtig erfolgt die Detektion über den phänotypischen Nachweis der attenuierenden Marker, z. B. Auxotrophien oder Resistenzen. Zusätzliche Markierungen werden bekanntermaßen nicht mehr vorgenommen. A basic requirement for the use of live vaccines is their safe Detectability and delimitation from the wild type Detection via the phenotypic detection of the attenuating markers, e.g. B. Auxotrophies or resistance. Additional markings are known to be no longer made.  

Im Fall von Auxotrophien erfolgt die Prüfung nach selektiver Kultivierung und Reinigung einer Einzelkolonie auf einem Spezialnähmedium (Diagnostikum), auf dem der Impfstamm entsprechend seiner Auxotrophien nicht wachsen darf. Ein solcher Nachweis stellt hohe Anforderungen an die Reinkultur und ist dementsprechend arbeitsaufwendig, langwierig (ca. 2 Wochen bis zur Verdachtsdiagnose) und teuer. Da man häufig mit Mischkulturen von Wildtyp und Impfstamm zu rechnen hat, beispielsweise bei Salmonellen in der Geflügelhaltung, müssen außerdem möglichst viele Einzelkolonien geprüft werden, um eine ausreichend sichere Aussage zum Vorkommen des Impfstammes in einer Salmonella typhimurium-haltigen Probe treffen zu können. Im Fall von Resistenzmarkern müssen in der Routinediagnostik ständig entsprechende Selektivplatten in ausreichender Zahl parallel beimpft und mitkultiviert werden, um den positiven oder negativen Nachweis des Impfstammes zu führen. Da die Auswertung dieser Planen durch resistente Spontanmutanten aus anderen Bakteriengattungen erschwert werden kann, bedarf eine Verdachtskolonie einer weiteren Charakterisierung und Bestätigung als "Salmonella-Impfstamm". Das bedeutet, daß auch hier nur die Einzelkolonie-Reinigung und Charakterisierung die endgültige Diagnose ermöglicht.In the case of auxotrophies, the test is carried out after selective cultivation and Cleaning a single colony on a special sewing medium (diagnostic agent) on which the vaccine strain must not grow according to its auxotrophies. Such a Proof places high demands on the pure culture and is accordingly labor-intensive, lengthy (approx. 2 weeks until suspected diagnosis) and expensive. There one often has to expect mixed cultures of wild type and vaccine strain, For example, with salmonella in poultry farming, as many as possible Individual colonies are checked to make a sufficiently reliable statement about the occurrence of the vaccine strain in a sample containing Salmonella typhimurium. In the case of resistance markers, routine diagnostics must constantly do the same A sufficient number of selective plates are inoculated in parallel and cultured in order to to provide positive or negative proof of the vaccine strain. Because the evaluation this planning by resistant spontaneous mutants from other bacterial genera a suspect colony needs further characterization and confirmation as "Salmonella vaccine strain". That means that only here Single colony cleaning and characterization enables the final diagnosis.

Eine Möglichkeit der Bereitstellung bakterieller Lebendimpfstoffe ist die gentechnische Veränderung entsprechender Bakterienstämme. Dabei ist zu beachten, daß ein gentechnisch veränderter Lebendimpfstoff allen Kriterien des deutschen Genteclinikgesetzes genügen muß und gegebenenfalls entsprechenden internationalen Anforderungen.Genetic engineering is one way of providing live bacterial vaccines Change corresponding bacterial strains. It should be noted that a genetically modified live vaccine meets all criteria of the German Genteclinikgesetzes must meet and if necessary corresponding international Conditions.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Nachweisverfahren für bakterielle Lebendvaccinen bereitzustellen, bei dem Zeit-, Material- und Kostenaufwand drastisch reduziert sind.The object of the present invention is to provide a detection method for bacterial To provide live vaccines drastically in the time, material and cost are reduced.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens der eingangs genannten Art, bei dem der als Lebendimpfstoff geeignete Bakterienstamm mit Luciferase-Genen gentechnisch markiert wird, und die Identifizierung des derart markierten Bakterienstamms durch den Nachweis der bakteriellen Lichtproduktion erfolgt.One solution to this problem is to provide an initial method mentioned type, in which the bacterial strain suitable as a live vaccine with Luciferase genes are genetically labeled, and the identification of such marked bacterial strain by demonstrating the bacterial light production he follows.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet überraschend viele Vorteile: Es ermöglicht eine schnelle, einfache und sichere - weil "positive"- Identifikation des Impfstammes bereits nach dem ersten Kultivierungsschrift. Bakterien-Reinkulturen sind nicht mehr erforderlich. Die markierten Bakterien sind aufgrund ihrer Lichtproduktion mit bloßem Auge auf jeder routinemäßig angelegten Selektionsplatte nachweisbar. Der Befund "Impfstamm" erfolgt gleichzeitig mit dem bakteriologischen Befund "Salmonellae" nach 34 Tagen Arbeitsaufwand. Ein zusätzliches Diagnostikum ist nicht notwendig. Die bakteriologische Routinediagnostik auf Salmonellen in den Untersuchungsämtern muß weder methodisch noch apparativ verändert werden. Auch die bisher bestehende Notwendigkeit einer Bestätigung des Testergebnisses durch den Impfstamm-Hersteller entfällt. The method according to the invention offers surprisingly many advantages: it enables one quick, easy and safe - because "positive" - identification of the vaccine strain already after the first cultivation script. Pure bacterial cultures are no longer required. The marked bacteria are bare due to their light production Eye detectable on every routine selection plate. The result "Vaccine strain" follows simultaneously with the bacteriological finding "Salmonellae" 34 days of work. An additional diagnostic is not necessary. The bacteriological routine diagnostics for Salmonella in the examination offices must be changed neither methodically nor apparatus. Even the existing one Need for confirmation of the test result by the vaccine strain manufacturer not applicable.  

Das lux-System eignet sich besonders deshalb als Nachweismittel, weilThe lux system is particularly suitable as a means of proof because

  • - dieses System unter natürlichen Bedingungen ein selten vorkommendes Ereignis ist (d. h. es treten keine background-Effekte auf),- this system is a rare event under natural conditions (i.e. there are no background effects),
  • - die Messung von Licht schnell und sensitiv und der Einsatz von Luminometern eine gut etablierte, preiswerte Technik ist, und- The measurement of light quickly and sensitively and the use of luminometers one is well-established, inexpensive technology, and
  • - der Nachweis einer luminiszierenden Kultur auf einem Nährboden mit bloßem Auge möglich ist.- the detection of a luminous culture on a nutrient medium with the naked eye is possible.

Die gentechnische Markierung kann sowohl mit eukaryontischen als auch mit prokaryontischen Luciferas-Genen durchgeführt werden.Genetic engineering can be used with both eukaryotic and prokaryotic Luciferas genes are carried out.

Bei einer bevorzugten Variante der Erfindung erfolgt die gentechnische Markierung mit Luciferas-Genen durch Rekombination eines lux-Operons von Vibrio fischeri und/oder Vibrio harveyi und/oder Photobacterium phosphoreum und/oder Photobacterium leiognathi und/oder Xenorhabdus luminescens in das Bakteriengenom.In a preferred variant of the invention, genetic labeling is carried out with Luciferas genes by recombination of a lux operon from Vibrio fischeri and / or Vibrio harveyi and / or Photobacterium phosphoreum and / or Photobacterium leiognathi and / or Xenorhabdus luminescens in the bacterial genome.

Die bakterielle Lichtproduktion wird vorzugsweise mit Hilfe von Photometer(n), insbesondere Luminometer(n) nachgewiesen.Bacterial light production is preferably carried out with the help of photometer (s), especially luminometer (s) detected.

Das zur Rekombination verwendete lux-Operon kann auf gentechnischem Weg durch Klonierung oder auch durch chemische Synthese bereitgestellt werden. The lux operon used for recombination can be genetically engineered Cloning or chemical synthesis can be provided.  

In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird das lux-Operon in dem Vektor pMMB 190, ATCC 37807, vorzugsweise am Restriktionsort SalI, oder in dem Vektor pMMB 207, vorzugsweise am Restriktionsort BamHI-SalI, ligiert, in dem Bakterium Escherichia coli, vorzugsweise Stamm E.coli K12, kloniert und mit Hilfe des Plasmids pRK, ATCC 37159 oder eines anderen Hilfsvektors in die als Lebendvaccine geeignete(n) Bakterienzelle(n) transferiert.In a particularly preferred method variant, the lux operon is in the vector pMMB 190, ATCC 37807, preferably at the restriction site SalI, or in the vector pMMB 207, preferably ligated at the BamHI-SalI restriction site, in the bacterium Escherichia coli, preferably strain E. coli K12, cloned and using the plasmid pRK, ATCC 37159 or another auxiliary vector in the as live vaccine suitable bacterial cell (s) transferred.

Bei einer anderen Verfahrensvariante wird das lux-Operon durch homologe Rekombination in das Impfstamm-Chromosom eingebaut.In another process variant, the lux operon is replaced by homolog Recombination built into the vaccine strain chromosome.

Ebensogut kann der Einbau in das Impfstamm-Chromosom mittels eines Transposon Vektors oder mittels eines Phagen erfolgen.Installation in the vaccine strain chromosome by means of a transposon can just as well Vector or by means of a phage.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die verschiedensten bakteriellen Lebendvaccinen markierbar und über ihre Lichtproduktion nachweisbar.With the method according to the invention the most diverse bacterial Live vaccines can be marked and detected via their light production.

Eine besonders einfach zu gewinnende bakterielle Lebendvaccine zeichnet sich dadurch aus, daß das Bakteriengenom ein rekombiniertes lux-Operon enthält, das vorzugsweise aus Vibrio fischeri und/oder Vibrio harveyi und/oder Photobacterium phosphoreum und/oder Photobacterium leiognathi und/oder Xenorhabdus luminescens stammt. A particularly easy to obtain live bacterial vaccine is characterized by this from that the bacterial genome contains a recombined lux operon, which preferably from Vibrio fischeri and / or Vibrio harveyi and / or Photobacterium phosphoreum and / or Photobacterium leiognathi and / or Xenorhabdus luminescens.  

Ein zur Bekämpfung der Salmonellose besonders geeigneter Lebendimpfstoff wird mit dem Salmonella typhimurium-Bakterienstamm bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Bakteriengenom rekombinierte Luciferase-Gene enthält, die dem Bakterienstamm die Eigenschaft der bakteriellen Lichtproduktion geben und damit die Lebendvaccine vom Wildtyp optisch unterscheidbar machen.A live vaccine that is particularly suitable for combating salmonellosis is included in the the Salmonella typhimurium bacterial strain, which is characterized by is that the bacterial genome contains recombined luciferase genes, which the Bacterial strain give the property of bacterial light production and thus the Make live vaccines of wild type visually distinguishable.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments.

Beispiel 1example 1

Zur Bekämpfung von Salmonellosen bei Hühnern und Tauben sind in Deutschland die Lebendimpfstoffe Salmonella typhimurium (Zoosaloral HR, Deutsches Tierärzteblatt, Dez. 1992; Zoosaloral T, DT, Februar, 1993) und Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vacRT) zugelassen. Der Nachweis von Salmonella typhimurium (Zoosaloral HR) erfolgt bisher anhand der stammeigenen Auxotrophien, der von Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vacRT ) anhand der stammspezifischen Resistenzen.In Germany, the live vaccines Salmonella typhimurium (Zoosaloral H R , Deutsches Tierärzteblatt, December 1992; Zoosaloral T, DT, February, 1993) and Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vac R T) are approved for combating salmonella in chickens and pigeons. So far, detection of Salmonella typhimurium (Zoosaloral HR) has been based on the strain's own auxotrophies, and that of Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vac R T) on the basis of strain-specific resistance.

In beide Impfstämme wurde das lux-Operon aus Vibrio fischeri wie im folgenden beschrieben rekombiniert. The lux operon from Vibrio fischeri was used in both vaccine strains as follows described recombined.  

Die Methodik der Klonierung des lux-Operons aus Vibrio fischeri sowie die Charakterisierung der Gene gehört zum Stand der Technik. Bereits 1982 wurde ein lux- Operon aus Vibrio harveyi isoliert und in E.coli kloniert (Belas et al., 1982, Bacterial bioluminescence: isolation and expression of the luciferase genes from Vibrio harveyi. Science 128, 791-793). Weitere lux-Operon-Isolierungen sind für Photobacterium phosporeum, Photobacterium leiognathi und Xenorhabdus luminescens beschrieben (zur Übersicht siehe Meighen, 1991, Molecular Biology of Bacterial Bioluminescence. Mikrobiol. Rev.55, 123-142).The method of cloning the lux operon from Vibrio fischeri and the Characterization of the genes is part of the prior art. Already in 1982 a lux Operon isolated from Vibrio harveyi and cloned into E. coli (Belas et al., 1982, Bacterial bioluminescence: isolation and expression of the luciferase genes from Vibrio harveyi. Science 128, 791-793). Further lux operon isolations are for Photobacterium phosporeum, Photobacterium leiognathi and Xenorhabdus luminescens (for For an overview, see Meighen, 1991, Molecular Biology of Bacterial Bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142).

Ein ca. 9 kb SalI-Fragment mit dem kompletten lux-Operon aus Vibrio fischeri wird mit den bekannten Methoden in den SalI-Ort des Plasmids pMMB 190, ATCC 37807, ligiert und in E. coli K12 kloniert. Die Selektion erfolgt auf Ap-Resistenz und "Leuchten". Die Übertragung des Konstrukts auf den einen bzw. anderen Impfstamm erfolgt durch ein triparentales Mating mit dem Helferplasmid pRK, 2013 ATCC 37159. Die Isolierung leuchtender Salmonellen erfolgt fürAn approx. 9 kb SalI fragment with the complete lux operon from Vibrio fischeri is included the known methods in the SalI site of the plasmid pMMB 190, ATCC 37807, ligated and cloned in E. coli K12. The selection is made for Ap resistance and "To shine". The transfer of the construct to one or the other vaccine strain is performed by triparental mating with the helper plasmid pRK, 2013 ATCC 37159. The isolation of glowing salmonella is done for

  • - den Salmonella typhimurium Impfstamm (Zoosaloral HR) nach Revitalisierung in Peptonwasser und zweimaliger Selektivanreicherung in RVS auf antibiotikahaltigen Selektivagarplatten (XLD, BPLA mit Ampicillin),- the Salmonella typhimurium vaccine strain (Zoosaloral H R ) after revitalization in peptone water and double selective enrichment in RVS on selective agar plates containing antibiotics (XLD, BPLA with ampicillin),
  • - den Salmonella typhimurium - Impfstamm TAD Salmonella vacR T nach Kultivierung auf antibiotikahaltigen Selektivagarplatten (XLD mit Rifampicin, Nalidixinsäure und Ampicillin).- the Salmonella typhimurium vaccine strain TAD Salmonella vac R T after cultivation on selective agar plates containing antibiotics (XLD with rifampicin, nalidixic acid and ampicillin).

Leuchtende Kolonien sind mit bloßem Auge in der Dunkelkammer leicht zu identifizieren.Glowing colonies are easily closed to the naked eye in the darkroom identify.

Beispiel 2Example 2

Zur Markierung der beiden Impfstämme Salmonella typhimurium (Zoosaloral HR) und Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vacRT) wird ein promotorloses BglII-SalI-Fragment aus dem lux-Operon von Vibrio fischeri in das Plasmid pMMB 207, ATCC 37809, BamHI-SalI ligiert. In diesem Konstrukt stehen die Gene luxAB unter der Kontrolle des tac-Promotors von pMMB 207. Der Promotor ist IPTG-induzierbar. Aufgrund des Fehlens von luxC und eines Teils von luxD ist für die bakterielle Lichtproduktion die exogene Zugabe eines Aldehyds notwendig.To label the two vaccine strains Salmonella typhimurium (Zoosaloral H R ) and Salmonella typhimurium (TAD Salmonella vac R T), a promoterless BglII-SalI fragment from the lux operon from Vibrio fischeri is inserted into the plasmid pMMB 207, ATCC 37809, BamHI-SalI ligated. In this construct, the luxAB genes are under the control of the pMMB 207 tac promoter. The promoter is IPTG-inducible. Due to the lack of luxC and part of luxD, the exogenous addition of an aldehyde is necessary for bacterial light production.

Die Übertragung des rekombinierten Plasmids in einen der beiden Vaccine-Stämme erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.Transfer of the recombined plasmid into one of the two vaccine strains takes place as described in Example 1.

Zur Induzierung der Lichtproduktion wird IPTO (0.2-0.4 mM) und Aldehyd (10%ige Nonanal-, Decanal- oder Dodecanal-Lösung) zum Medium gegeben. Aufgrund der besonders intensiven Lichtproduktion ist Nonanal als Substrat bevorzugt. Schon innerhalb weniger Sekunden nach der Substratzugabe können die Kolonien in der Dunkelkammer eindeutig identifiziert werden. To induce light production, IPTO (0.2-0.4 mM) and aldehyde (10% Nonanal, decanal or dodecanal solution) added to the medium. Due to the particularly intensive light production is preferred as a substrate. Within a few seconds of adding the substrate, the colonies in the Darkroom can be clearly identified.  

Sowohl die gemäß Beispiel 1 als auch die gemäß Beispiel 2 markierten Lebendimpfstoffe sind in routinemäßig auf Salmonellen zu untersuchenden Hühner- bzw. Tauben- Kotproben eindeutig zu identifizieren.Both the live vaccines labeled according to Example 1 and those labeled according to Example 2 are routinely examined in chicken or pigeon Clearly identify faecal samples.

Eine Überprüfung der Stabilität der rekombinanten Plasmide in Form einer 10-maligen Subkultivierung im Flüssigmedium ohne Antibiotikazusatz ergab einen Plasmidverlust in 8 von 2500 Kolonien (0,3%).A review of the stability of the recombinant plasmids in the form of a 10-fold Subcultivation in liquid medium without antibiotic addition resulted in a plasmid loss in 8 out of 2500 colonies (0.3%).

Claims (18)

1. Verfahren zum diagnostischen Nachweis bakterieller Lebendvaccinen in der Human- und Veterinärmedizin, dadurch gekennzeichnet, daß der als Lebendimpfstoff geeignete Bakterienstamm mit Luciferas-Genen gentechnisch markiert wird, und daß die Identifizierung des derart markierten Bakterienstamms durch den Nachweis der bakteriellen Lichtproduktion erfolgt.1. A method for the diagnostic detection of live bacterial vaccines in human and veterinary medicine, characterized in that the bacterial strain suitable as a live vaccine is genetically marked with Luciferas genes, and that the bacterial strain thus marked is identified by detecting the bacterial light production. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Markierung mit eukaryontischen Luciferas-Genen erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that that the genetic labeling is done with eukaryotic Luciferas genes. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Markierung mit prokaryontischen Luciferas-Genen erfolgt. 3. The method according to claim 1, characterized in that genetic labeling is done with prokaryotic Luciferas genes.   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Markierung mit Luciferas-Genen durch Rekombination eines lux-Operons von Vibrio fischeri und/oder Vibrio harveyi und/oder Photobacterium phosphoreum und/oder Photobacterium leiognathi und/oder Xenorhabdus luminescens in das Bakteriengenom erfolgt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that genetic labeling with Luciferas genes by recombination a lux operon by Vibrio fischeri and / or Vibrio harveyi and / or Photobacterium phosphoreum and / or Photobacterium leiognathi and / or Xenorhabdus luminescens occurs in the bacterial genome. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der bakteriellen Lichtproduktion mit Hilfe von Photometer(n), insbesondere Luminometer(n) erfolgt.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the detection of bacterial light production with the help of photometer (s), especially luminometer (s). 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß das zur Rekombination verwendete lux-Operon kloniert ist.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized that the lux operon used for recombination is cloned. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß das zur Rekombination verwendete lux-Operon chemisch synthetisiert ist.7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized that the lux operon used for recombination is chemically synthesized. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das lux-Operon in dem Vektor pMMB 190 ATCC 37807 oder dem Vektor pMMB 207 ATCC 37809 ligiert ist, daß die Klonierung dieses Vektors in dem Bakterium Escherichia coli, vorzugsweise Stamm E.coli K12, erfolgt, und daß der Transfer des lux-Operon-haltigen Vektors aus E.coli in die als Lebendvaccine geeignete(n) Bakterienzelle(n) mittels des Plasmids pRK 2013 ATCC 37159 oder eines anderen Hilfsvektors erfolgt.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the lux operon in the vector pMMB 190 ATCC 37807 or the vector pMMB 207 ATCC 37809 that the cloning of this vector in the  Bacterium Escherichia coli, preferably strain E. coli K12, and that the Transfer of the lux operon-containing vector from E.coli to the live vaccine suitable bacterial cell (s) using the plasmid pRK 2013 ATCC 37159 or another auxiliary vector. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Einbau des lux-Operons in das Impfstamm-Chromosom durch homologe Rekombination erfolgt.9. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the Incorporation of the lux operon into the vaccine strain chromosome by homologous Recombination occurs. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Einbau des lux-Operons in das Impfstamm-Chromosom mittels eines Transposon Vektors erfolgt.10. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the Installation of the lux operon in the vaccine strain chromosome using a transposon Vector. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Einbau des lux-Operons in das Impfstamm-Chromosom mittels eines Phagens erfolgt. 11. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the Incorporation of the lux operon into the vaccine strain chromosome using a phage he follows.   12. Bakterielle Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt ist.12. Bacterial live vaccines, characterized in that they are by the method is made according to claim 1. 13. Bakterielle Lebendvaccine, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakteriengenom rekombinierte Luciferase-Gene enthält, die dem Bakterienstamm die Eigenschaft der bakteriellen Lichtproduktion geben und damit die Lebendvaccine vom Wildtyp optisch unterscheidbar machen.13. Bacterial live vaccine, characterized in that the bacterial genome contains recombined luciferase genes that confer the property of the bacterial strain give bacterial light production and thus the live vaccines of the wild type make it optically distinguishable. 14. Bakterielle Lebendvaccine nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakteriengenom ein rekombiniertes lux-Operon, vorzugsweise aus Vibrio fischeri und/oder Vibrio harveyi und/oder Photobacterium phosphoreum und/oder Photobacterium leiognathi und/oder Xenorhabdus luminescens enthält.14. Bacterial live vaccine according to claim 13, characterized in that the Bacterial genome is a recombined lux operon, preferably from Vibrio fischeri and / or Vibrio harveyi and / or Photobacterium phosphoreum and / or Contains Photobacterium leiognathi and / or Xenorhabdus luminescens. 15. Salmonella spp. - Bakterienstamm, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakteriengenom rekombinierte Luciferase-Gene enthält, die dem Bakterienstamm die Eigenschaft der bakteriellen Lichtproduktion geben und damit die Lebendvaccine vom Wildtyp optisch unterscheidbar machen. 15. Salmonella spp. - Bacterial strain, characterized in that the Bacterial genome contains recombined luciferase genes belonging to the bacterial strain give the property of bacterial light production and thus the Make live vaccines of wild type visually distinguishable.   16. Verwendung eines Salmonella spp. - Bakterienstamms nach Anspruch 15 als Lebendimpfstoff, vorzugsweise für Vögel, insbesondere für Hühner und Tauben.16. Use of a Salmonella spp. - Bacterial strain according to claim 15 as Live vaccine, preferably for birds, especially for chickens and pigeons. 17. Salmonella typhimurium - Bakterienstamm, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakteriengenom rekombinierte Luciferase-Gene enthält, die dem Bakterienstamm die Eigenschaft der bakteriellen Lichtproduktion geben und damit die Lebendvaccine vom Wildtyp optisch unterscheidbar machen.17. Salmonella typhimurium - bacterial strain, characterized in that the Bacterial genome contains recombined luciferase genes belonging to the bacterial strain give the property of bacterial light production and thus the Make live vaccines of wild type visually distinguishable. 18. Verwendung eines Salmonella typhimurium - Bakterienstamms nach Anspruch 17 als Lebendimpfstoffe vorzugsweise für Vögel, insbesondere für Hühner und Tauben.18. Use of a Salmonella typhimurium bacterial strain according to claim 17 as live vaccines, preferably for birds, especially for chickens and pigeons.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG165992A1 (en) * 2002-06-05 2010-11-29 Genelux Corp Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861709A (en) * 1985-05-31 1989-08-29 Technicon Research A.G. Detection and/or identification of microorganisms in a test sample using bioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
DE3833628A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-12 Genlux Forschungsgesellschaft METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING TOXIC SUBSTANCES USING CLONED MICROORGANISMS
WO1990015873A1 (en) * 1989-06-19 1990-12-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Vector-mediated genomic insertion and expression of dna in bcg

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861709A (en) * 1985-05-31 1989-08-29 Technicon Research A.G. Detection and/or identification of microorganisms in a test sample using bioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
DE3833628A1 (en) * 1988-10-03 1990-04-12 Genlux Forschungsgesellschaft METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING TOXIC SUBSTANCES USING CLONED MICROORGANISMS
WO1990015873A1 (en) * 1989-06-19 1990-12-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Vector-mediated genomic insertion and expression of dna in bcg

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CA 107:148677z *
CA 121:247074k *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG165992A1 (en) * 2002-06-05 2010-11-29 Genelux Corp Light emitting microorganisms and cells for diagnosis and therapy of diseases associated with wounded or inflamed tissue

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