DE4400638C1

DE4400638C1 - Simple recovery of alpha-foetoprotein from embryonal tissue

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Publication number: DE4400638C1
Application number: DE19944400638
Authority: DE
Original assignee: Eftag Entstaubung Foerdertech
Current assignee: Eftag Entstaubung Foerdertech
Priority date: 1994-01-12
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2014-01-13

Abstract

Recovery of alpha -foetoprotein (I) comprises: (1) homogenising embryonic tissue; (2) sepn. of sediment from the homogenate; (3) treating the sediment-free product with CHCl3; (4) chromatography of the CHCl3-treated material using immobilised antibodies (Ab1) against (I); and (5) chromatography of the prod. using immobilised antibodies (Ab2) against human serum proteins.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein aus embryonalem Gewebe. Hierbei han delt es sich um ein Verfahren aus dem Bereich der Biotech nologie, insbesondere um ein Verfahren zur Gewinnung bio chemischer Präparate aus dem Blut des Menschen.The invention relates to a method for extraction of alpha-fetoprotein from embryonic tissue. Here han it is a process from the field of biotech nology, in particular a method for obtaining bio chemical preparations from human blood.

Alpha-Fetoprotein wird für wissenschaftliche Forschungs- und Entwicklungsarbeiten auf dem Gebiet des Gesundheits wesens und der Molekularbiologie verwendet.Alpha-fetoprotein is used for scientific research and development work in the field of health essence and molecular biology used.

Bei einem bekannten Verfahren zur Gewinnung von alpha-Feto protein dient als Ausgangsprodukt das Serum des Nabelschnur blutes. Bei diesem bekannten Verfahren wird das Ausgangs produkt aufeinanderfolgend chromatographischen Reinigungs schritten mit einigen Adsorbenzien unterzogen, bis das Ziel produkt, nämlich alpha-Fetoprotein, erreicht ist.In a known method for obtaining alpha-feto Protein is the starting product of the serum of the umbilical cord blood. In this known method, the output product successively chromatographic cleaning struggled with some adsorbents until the target product, namely alpha-fetoprotein, is reached.

Nachteilhaft an diesem bekannten Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein ist der niedrige Gehalt des Zielproduktes, der etwa zwischen 20 und 50 Mikrogramm/ml liegt, und der hohe Gehalt von Beimengeneiweißen, wobei darauf hinzuweisen ist, daß sämtliche Eiweiße als Seren anzusehen sind, im Aus gangsprodukt; aus diesen Gründen ist es erforderlich, große Volumina des Ausgangsproduktes zu verarbeiten, was in einem hohen Arbeitsaufwand für die Durchführung des Ver fahrens sowie in einem niedrigen Ausbringen des Zielprodukts resultiert.A disadvantage of this known method for the extraction of alpha-fetoprotein is the low content of the target product, which is between 20 and 50 micrograms / ml, and the high one Content of protein in the mixture, whereby it should be noted that all proteins are to be regarded as serums, in the off gear product; for these reasons it is necessary to be large Volumes of the starting product to process what in a high workload for the implementation of Ver driving as well as in a low output of the target product results.

Des weiteren ist ein Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fe toprotein bekannt, bei dem das Gewebe bösartiger Geschwulste des Menschen als Ausgangsprodukt dient. Zur Erlangung des Zielprodukts werden aufeinanderfolgend chromatographische Reinigungsvorgänge mit einigen Adsorbenzien durchgeführt.Furthermore, there is a method for obtaining alpha-Fe known toprotein, in which the tissue of malignant tumors of human beings serves as the starting product. To obtain the Target products become chromatographic successively Cleaning operations performed with some adsorbents.

Nachteilhaft an diesem bekannten Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein sind der vergleichsweise schwierige Zu gang zu den Ausgangsprodukten sowie die Risiken, die damit einhergehen, daß das Gewebe bösartiger Geschwulste verar beitet wird.A disadvantage of this known method for the extraction of Alpha-fetoprotein are the comparatively difficult to gear to the starting products as well as the risks involved that the tissue of malignant tumors processed is being processed.

Es ist bereits ein Verfahren zur Gewinnung von alpha-Feto protein bekannt, bei dem als Ausgangsprodukt embryonales Ge webe von Zwölfwochenembryonen verwendet wird, das bei Schwangerschaftsunterbrechungen anfällt. Zur Durchführung dieses Verfahrens zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein wer den die anfallenden Embryonen gesammelt, wird das embryona le Gewebe etwa mit 5 000 U/min zentrifugiert, wird die über dem sich absetzenden bzw. abgesetzten Sediment anfallende Phase, der sog. Supernatant, gesammelt, wird der Superna tant durch Zentrifugieren bei ca. 12 000 U/min geklärt, wird das geklärte Zwischenprodukt durch Chromatographie mit DE- Zellulose gereinigt, wird das bei diesem chromatographischen Reinigungsvorgang entstehende Zwischenprodukt durch eine Chromatographie mit Sephadex G-100 weiter gereinigt, wird das so erhaltene Zwischenprodukt durch eine Rechromatographie mit Sephadex G-100 einem weiteren Reinigungsvorgang unterzo gen und das so entstehende Zwischenprodukt einer Endreini gung durch eine Chromatographie mit DE-Zellulose unterzogen, an deren Ende das Zielprodukt steht.It is already a process for extracting alpha feto protein known, in which embryonic Ge weave of twelve-week embryos is used in Interruptions to pregnancy occur. To carry out this process for obtaining alpha-fetoprotein who The embryos collected are the embryos If the tissue is centrifuged at about 5,000 rpm, the over the sediment that settles or settles Phase, the so-called supernatant, becomes the superna is clarified by centrifuging at approx. 12,000 rpm the clarified intermediate by chromatography with DE- Purified cellulose, this becomes chromatographic Intermediate product resulting from the cleaning process Chromatography with Sephadex G-100 is further purified the intermediate product thus obtained by rechromatography with Sephadex G-100 undergo another cleaning process gene and the resulting intermediate product of a final cleaning subjected to chromatography with DE cellulose, at the end is the target product.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist der vergleichsweise ge ringe Gehalt des Zielproduktes am Ausgangsstoff, das niedri ge Ausbringen des Zielproduktes aufgrund der mehrstufigen Reinigung sowie eine vergleichsweise geringe Reinheit des Zielproduktes.The disadvantage of this method is the comparatively ge rings content of the target product in the starting material, the low Deployment of the target product due to the multi-stage Cleaning and a comparatively low purity of the Target product.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein aus embryonalem Gewebe zur Verfügung zu stellen, das einfacher durchführbar ist, das zu einem erhöhten Ausbringen an alpha-Fetoprotein führt und das eine Erhöhung der Reinheit des Zielprodukts zur Folge hat.The invention has for its object a method for Extraction of alpha-fetoprotein from embryonic tissue for To provide that which is easier to do leads to an increased output of alpha-fetoprotein and that increases the purity of the target product Consequence.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das embryonale Gewebe homogenisiert wird, daß von dem homoge nisierten Produkt das Sediment abgesondert wird, daß das vom Sediment befreite Produkt mit Chloroform bearbeitet wird, daß das mit Chloroform bearbeitete Produkt mit immobilisier ten Antikörpern gegen alpha-Fetoprotein chromatographiert wird und daß das so chromatographierte Produkt mit immobi lisierten Antikörpern gegen menschliche Serumeiweiße chro matographiert wird. Mittels dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, mit einer vergleichsweise geringen Anzahl von Verfahrensschritten, die zudem hinsichtlich des für sie erforderlichen Aufwands und ihrer Schwierigkeit reduziert sind, alpha-Fetoprotein mit einem vergleichsweise großen Ausbringen und in hoher Reinheit zu gewinnen.This object is achieved in that the embryonic tissue that is homogenized by the homoge nized product the sediment is secreted that the sediment-free product is processed with chloroform, that the product processed with chloroform with immobilized chromatographed antibodies against alpha-fetoprotein and that the product so chromatographed with immobi antibodies against human serum protein chro is matographed. By means of the method according to the invention it is possible with a comparatively small number of procedural steps that are also relevant to them required effort and their difficulty reduced are, alpha-fetoprotein with a comparatively large Spread and win in high purity.

Für die Homogenisierung des embryonalen Gewebes ist es vor teilhaft, wenn das embryonale Gewebe in Gegenwart einer iso tonischen Natriumchloridlösung homogenisiert wird. Vorteil haft sollte hierbei das Volumen der isotonischen Natrium chloridlösung dem des embryonalen Gewebes entsprechen.It is proposed for the homogenization of the embryonic tissue partial if the embryonic tissue in the presence of an iso tonic sodium chloride solution is homogenized. Advantage the volume of isotonic sodium should be considered chloride solution correspond to that of the embryonic tissue.

Eine weitere Verbesserung des Homogenisierungsvorgangs wird erzielt, wenn dieser außerdem in Gegenwart von Phenylmethyl sulfanildichlorid stattfindet.A further improvement in the homogenization process is achieved if this also in the presence of phenylmethyl sulfanil dichloride takes place.

Zweckmäßigerweise sollte das embryonale Gewebe, die isoto nische Natriumchloridlösung und das Phenylmethylsulfanil dichlorid vor der Homogenisierung in Eis gekühlt und die Homogenisierung derart gekühlt durchgeführt werden. Die Homogenisierung kann mechanisch erfolgen. Conveniently, the embryonic tissue, the isoto African sodium chloride solution and the phenylmethylsulfanil dichloride cooled in ice before homogenization and the Homogenization can be carried out cooled. The Homogenization can be done mechanically.

Mit vergleichsweise geringem Aufwand kann die Absonderung des Sediments vom homogenisierten Produkt durchgeführt wer den, wenn der Absonderungsvorgang mittels einer Zentrifu gierung durchgeführt wird, wobei diese vorteilhaft bei 4 bis 10 Grad C durchgeführt werden kann.The separation can be carried out with comparatively little effort of the sediment from the homogenized product the when the separation process by means of a centrifuge Gation is carried out, which advantageously at 4 to 10 degrees C can be performed.

Die Bearbeitung des vom Sediment befreiten Produkts mit Chloroform sollte vorteilhaft innerhalb von 10 Minuten bis zu 1 Stunde nach der Absonderung des Sediments erfolgen, wo bei besonders gute Ergebnisse dann erzielt werden, wenn dem vom Sediment befreiten Produkt Chloroform in einer Konzen tration zugegeben wird, die geringer ist als 10 Vol.-%.The processing of the product freed from sediment with Chloroform should be beneficial within 10 minutes to 1 hour after the sediment is secreted where with particularly good results can be achieved if the Sediment-free product chloroform in a conc Tration is added, which is less than 10 vol .-%.

Die Bearbeitung des vom Sediment befreiten Produkts mit Chloroform sollte zweckmäßigerweise durch Schüttelung er folgen.The processing of the product freed from sediment with Chloroform should be conveniently shaken consequences.

Für den Bearbeitungsvorgang des vom Sediment befreiten Pro dukts hat sich die Einhaltung der Zimmertemperatur als be sonders vorteilhaft erwiesen.For the processing of the Pro freed from sediment dukt has proven to be the compliance with the room temperature proven particularly advantageous.

Eine sinnvolle Ergänzung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 er gibt sich, wenn das mit Chloroform bearbeitete Produkt binnen 10 Minuten nach der Bearbeitung mit Chloroform zentrifugiert wird, wobei die Zentrifugierung bei etwa 10 000 U/min und bei Zimmertemperatur erfolgen sollte.A sensible addition to the method according to claim 1 he occurs when the product processed with chloroform is within Centrifuged 10 minutes after processing with chloroform with centrifugation at about 10,000 rpm and at Room temperature should be done.

Das mit Chloroform bearbeitete und zentrifugierte Produkt kann zweckmäßigerweise in einer Pufferlösung dialysiert werden, wobei der pH-Wert des Puffers vorteilhaft auf ca. 7 bis 7,5 eingestellt wird.The product processed and centrifuged with chloroform can expediently be dialyzed in a buffer solution the pH value of the buffer advantageously to approx. 7 to 7.5 is set.

Als besonders geeignete immobilisierte Antikörper gegen menschliche Serumeiweiße haben sich Summarimmunoglobuline erwiesen.As a particularly suitable immobilized antibody against human serum proteins have become summar immunoglobulins proven.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein aus embryonalem Gewebe wird das embryonale Gewebe, das aus zwischen der achten und der zwölften Woche abgebrochenen Schwangerschaften stammt, mit dem gleichen Volumen isotonischer Natrium chloridlösung übergossen und eisgekühlt; als Inhibitor der Proteasen wird Phenylmethylsulfanilchlorid hinzuge fügt; unter weiterer Eiskühlung wird diese Mischung me chanisch homogenisiert, wonach das Sediment durch Zentri fugierung abgesondert wird. Der gewonnene Supernatant wird mit Chloroform, dessen Konzentration geringer als 10 Vol.-% ist, bei Zimmertemperatur bearbeitet. Zum Su pernatanten wird Paramethylsulfanilchlorid bis zu einer Endkonzentration von 10 mMol zum Inhibieren der Proteasen hinzugefügt; das Produkt wird an die Chromatographier säule mit immobilisierten Antikörpern gegen alpha-Feto protein aufgetragen. Die Chromatographiersäule wird mit einem Phosphatpuffer gespült, und das entstehende Produkt wird mit einer 0,1 Mol-Lösung der Zitronensäure abgewa schen. Das Eluat wird im Phosphatpuffer dialysiert und durch die Chromatographiersäule mit dem immobilisierten Antiserum gegen menschliche Serumeiweiße durchgelassen. Die so erhaltene Lösung wird in eine Pufferlösung der er forderlichen Zusammensetzung oder Wasser nach einem der bekannten Verfahren, z. B. mit Hilfe der Dialyse, über führt.When carrying out the method according to the invention Extraction of alpha-fetoprotein from embryonic tissue becomes the embryonic tissue that comes out between the eighth and the twelfth week of terminated pregnancies with the same volume of isotonic sodium doused with chloride solution and ice-cooled; as an inhibitor the proteases will add phenylmethylsulfanil chloride adds; with further ice cooling this mixture becomes me mechanically homogenized, after which the sediment by centri joint is separated. The supernatant won with chloroform, the concentration of which is less than 10 vol .-% is processed at room temperature. To su pernatanten becomes up to one paramethylsulfanil chloride Final concentration of 10 mmol to inhibit the proteases added; the product is sent to the chromatograph column with immobilized antibodies against alpha-feto protein applied. The chromatography column is with a phosphate buffer, and the resulting product is washed off with a 0.1 mol solution of citric acid . The eluate is dialyzed in the phosphate buffer and through the chromatography column with the immobilized Antiserum passed against human serum proteins. The solution thus obtained is in a buffer solution required composition or water according to any of the known methods, e.g. B. with the help of dialysis leads.

Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung des derart her gestellten und gereinigten alpha-Fetoproteins wurde nach der Hydrolyse in 6 M HCl mit Hilfe des automatischen Amino säureanalysators durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.Analysis of the amino acid composition of the her prepared and purified alpha-fetoprotein was after hydrolysis in 6 M HCl using the automatic amino acid analyzer performed. The results are in the listed in Table 1 below.

Tabelle 1 Table 1

Aminosäurezusammensetzung des gereinigten alpha- 1-Fetoproteins des Menschen (Mol/Mol von Eiweiß) Amino acid composition of the purified human alpha-1-fetoprotein (mol / mol of protein)

Die elektrophoretische Reinheit des gereinigten alpha-Feto proteins wurde in 12%igem Polyacrylamidgel geprüft. Auf die Straße wurden 15 und 30 Mikrogramm des gereinigten Eiweißes aufgetragen. Nach der Beendigung der Elektrophorese wurde das Polyacrylamidgel mit Kumassi G-250 (0,04%ige Farbstofflösung in 3,5%iger Chlorsäure) im Laufe von 90 Minuten bei einer Temperatur von 22 Grad C gefärbt. Der Farbstoff, der nicht mit dem Eiweiß in Verbindung getreten war, wurde durch 10%ige Essigsäure bei einer Temperatur von 22 Grad C binnen 24 Stunden ausgewaschen. Die Analyse des Elektrophoregramms führte zu der Schlußfolgerung, daß das Endprodukt in einer Einheit von zumindest 95 bis 97% vorlag.The electrophoretic purity of the purified alpha-feto proteins was tested in 12% polyacrylamide gel. On the Street were 15 and 30 micrograms of the purified protein applied. After electrophoresis was completed, the Polyacrylamide gel with Kumassi G-250 (0.04% dye solution in 3.5% chloric acid) within 90 minutes with one Colored temperature of 22 degrees C. The dye that is not with the protein was replaced by 10% Acetic acid at a temperature of 22 degrees C within 24 Washed out for hours. Analysis of the electrophoregram led to the conclusion that the final product in one Unity of at least 95 to 97% was present.

Die immunochemische Reinheit des erfindungsgemäß hergestell ten alpha-Fetoproteins wurde durch eine Immunoelektrophorese in einem 1%igen Agarosengel mit dem Kaninchen-Antiserum ge gen das normale Serum des Menschen geprüft. In die Aus höhlung wurden 10 Mikrogramm des gereinigten Serums des Men schens gelegt. Nach der Elektrophorese und der Immunodif fusion wurde das Agarosengel mit Kumassi R-250 gefärbt. Die Analyse des Immunoelektrophoregramms zeigt nur einen Prä zipitationsbogen mit dem Antiserum gegen alpha-Fetoprotein; ein Präzipitationsbogen mit dem Kaninchen-Antiserum gegen das normale Serum des Menschen wurde nicht entdeckt. Somit weist das erfindungsgemäß hergestellte alpha-Fetoprotein eine große immunochemische Reinheit auf, und es enthält keine Beimen gungen menschlicher Serumeiweiße.The immunochemical purity of the manufactured according to the invention alpha-fetoproteins was determined by immunoelectrophoresis in a 1% agarose gel with the rabbit antiserum tested against normal human serum. In the out 10 micrograms of the purified serum of the men beautifully laid. After electrophoresis and immunodif fusion, the agarose angel was stained with Kumassi R-250. The Analysis of the immunoelectrophoregram shows only one pre zip arch with the antiserum against alpha-fetoprotein; a precipitation sheet with the rabbit antiserum against that normal human serum was not detected. Thus points the alpha-fetoprotein produced according to the invention is a large one immunochemical purity and it contains no additives of human serum proteins.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Ge winnung von alpha-Fetoprotein aus embryonalem Gewebe an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.In the following the method according to the invention becomes Ge Recovery of alpha-fetoprotein from embryonic tissue Hand explained an embodiment.

600 g embryonales Gewebe wird durch Abwaschen sorgfältig von Blut und der Plazenta getrennt. Dazu werden 600 ml iso tonischer Natriumchloridlösung und 150 Mikrogramm Phenyl methylsulfanildichlorid hinzugefügt. Die Mischung wird eisgekühlt, in einen Homogenisator gestellt und unter Eiskühlung sorgfältig homogenisiert.600 g of embryonic tissue is carefully washed off separated from blood and the placenta. 600 ml iso tonic sodium chloride solution and 150 micrograms phenyl methylsulfanil dichloride added. The mixture will iced, placed in a homogenizer and under Ice cooling carefully homogenized.

Die sich ergebende Mischung wird bei 4 Grad C zentrifugiert, das abgesonderte Sediment wird entfernt. Zur verbleibenden Flüssigkeit wird Chloroform in einer Konzentration, die kleiner als 10 Vol.-% ist, hinzugegeben; danach wird die Flüssigkeit binnen einer Stunde bei Zimmertemperatur ge schüttelt; wiederum binnen 10 Minuten wird die geschüttelte Flüssigkeit bei Zimmertemperatur mit 10 000 U/min zentri fugiert. Auf diese Art und Weise werden 1 100 ml eines embryonalen Extraktes mit einem Gehalt von 150 bis 200 Mikrogramm/ml alpha-Fetoprotein erhalten.The resulting mixture is centrifuged at 4 degrees C the separated sediment is removed. To the remaining one Liquid becomes chloroform in a concentration that is less than 10% by volume, added; after that the Liquid within one hour at room temperature shakes; again the shaken is within 10 minutes Centrifuge liquid at room temperature at 10,000 rpm fugated. In this way, 1 100 ml of a embryonic extract with a content of 150 to 200 Microgram / ml alpha-fetoprotein obtained.

Dieser Extrakt wird in 2 Volumina des Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 dialysiert und an die Säule mit den immobilisierten Antikörpern gegen alpha-Fetoprotein, deren Volumen 200 ml beträgt, aufgetragen. Die Säule wird mit 5 Volumina des Phosphatpuffers mit dem pH-Wert von 7,4 mit 1-molarem Natriumchlorid gespült; das Eiweiß wird mit 0,1-molarer Zitronensäure eluiert. Die erhaltene Eiweißlö sung wird sofort in 5 Volumina des Phosphatpuffers dialy siert und durch eine Säule mit immobilisierter Immunoglo bulinfraktion des Summarantiserums gegen das Serum des Menschen, deren Volumen 100 ml beträgt, durchgelassen.This extract is in 2 volumes of the phosphate buffer dialyzed at pH 7.4 and attached to the column the immobilized antibodies against alpha-fetoprotein, whose volume is 200 ml, applied. The pillar will with 5 volumes of the phosphate buffer with the pH of 7.4 rinsed with 1 molar sodium chloride; the protein comes with 0.1 molar citric acid eluted. The protein solution obtained solution is dialy immediately in 5 volumes of the phosphate buffer and through a column with immobilized immunoglo Bulin fraction of the summarantiserum against the serum of the People whose volume is 100 ml let through.

Die gewonnene Lösung des gereinigten alpha-Fetoproteins wird in einem Phosphatpuffer der erforderlichen Zusammen setzung oder in Wasser dialysiert.The solution of the purified alpha-fetoprotein obtained is put together in a phosphate buffer of the required settlement or dialyzed in water.

Das Ausbringen des alpha-Fetoproteins beträgt zumindest 150 g; seine Reinheit beträgt über 95%.The output of the alpha-fetoprotein is at least 150 g; its purity is over 95%.

Mit den vorstehend geschilderten Verfahren zur Gewinnung von alpha-Fetoprotein aus embryonalem Gewebe kann die Zahl der chromatographischen Reinigungsschritte auf zwei reduziert werden; die Reinigungsverluste an alpha-Fetoprotein können von 72% im Stand der Technik bis auf 10% verringert wer den. Die Gewinnung des gewünschten Eiweißes aus dem embryo nalen Gewebe kann bis auf 165 mg erhöht werden. Das Endaus bringen von alpha-Fetoprotein bei der Verarbeitung von 600 g embryonalen Gewebes kann von 24 mg beim Stand der Technik auferfindungsgemäß 150 mg erhöht werden. Die Rein heit des alpha-Fetoproteins kann von 88 bis 92% im Falle des Standes der Technik auf über 95% im Falle der Erfin dung erhöht werden, wobei hierbei als Grundlage die Angaben der Elektrophorese in 12,5%igem Polyacrylamidgel mit der Färbung mit Kumassi G-250 dienen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.With the extraction processes described above of alpha-fetoprotein from embryonic tissue can increase the number of chromatographic purification steps reduced to two become; the cleaning losses of alpha-fetoprotein can from 72% in the prior art to 10% the. Obtaining the desired protein from the embryo nal tissue can be increased to 165 mg. The end bring alpha-fetoprotein when processing 600 g of embryonic tissue can vary from 24 mg at the state of the Technique according to the invention can be increased to 150 mg. The pure Alpha fetoprotein can fall from 88 to 92% in case of the prior art to over 95% in the case of the Erfin dung be increased, based here on the information electrophoresis in 12.5% polyacrylamide gel with the Serve coloring with Kumassi G-250. These results are in Table 2 shown.

Tabelle 2 Table 2

Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik (bei 1200 ml embryonalem Extrakt) Comparison of the method according to the invention with the method according to the prior art (with 1200 ml embryonic extract)

Claims

1. A method for obtaining alpha-fetoprotein from embryonic tissue, characterized
that the embryonic tissue is homogenized,
that the sediment is separated from the homogenized product,
that the sediment-free product is processed with chloroform,
that the product processed with chloroform is tographed with immobilized antibodies against alpha-fetoprotein chroma and
that the chromatographed product is chromatographed with immobilized antibodies against human serum proteins.

2. The method of claim 1, wherein the embryonic tissue homo in the presence of an isotonic sodium chloride solution is genized.

3. The method of claim 2, wherein the volume of iso tonic sodium chloride solution that of the embryonic tissue corresponds.

4. The method of claim 2 or 3, wherein the embryonic Tissue in the presence of phenylmethylsulfanil dichloride homo is genized.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, in which the embryonic tissue, possibly the isotonic sodium chloride solution solution and possibly the Phenylmethylsulfanildichlorid before the Homogenization in ice is cooled and homogenization is carried out so cooled.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the Homogenization takes place mechanically.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the Separation of the sediment by centrifugation is carried out.

8. The method of claim 7, wherein the centrifugation is carried out at 4-10 degrees C.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the Treatment of the sediment-free product with chloro shape within 10 minutes to an hour after the The sediment is secreted.

10. The method according to claim 9, in which for processing the sediment-free product with chloroform the latter in a concentration of less than 10 vol .-% is added.

11. The method according to any one of claims 9 or 10, in which the processing of the product freed from sediment Chloroform is done by shaking.

12. The method according to any one of claims 9 to 11, in which the processing of the product freed from sediment Room temperature is done.

13. The method according to any one of claims 1 to 12, in which the product processed with chloroform within 10 minutes centrifuged after processing with chloroform.

14. The method of claim 13, wherein the centrifugation of the product processed with chloroform at about 10,000 rpm he follows.

15. The method according to claim 13 or 14, wherein the centri Integration of the product processed with chloroform at Zim temperature.

16. The method according to any one of claims 9 to 15, wherein the product processed with chloroform and possibly centrifuged in a dialysis solution is dialyzed.

17. The method of claim 16, wherein the pH of the Buffer is set to approx. 7-7.5.

18. The method according to any one of claims 1 to 17, in which as immobilized antibodies against human serum egg white summar immunoglobolins are used.