DE4345538C2 - Fluoreszenzmikroskop - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.

Ein derartiges Fluoreszenzmikroskop ist aus der US 5 032 720 bekannt. Bei diesem bekannten Fluoreszenzmikroskop wird der Detektionsstrahlengang durch einen Farbteiler aufgeteilt und das wellenlängenabhängig aufgeteilte Licht nachfolgend detektiert. Die wellenlängenabhängige Aufteilung wirkt sich jedoch bei sehr schwachen Fluoreszenzintensitäten nachteilig aus, da die schwache Fluoreszenzstrahlung durch den Farbteiler und die beim Ein- und Austritt aus dem Strahlteiler entstehenden Reflexionen weiter geschwächt wird.

Die vorliegende Erfindung soll ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Laserbeleuchtung schaffen, das einerseits eine Mehrkanaldetektion der Fluoreszenzstrahlung ermöglicht, bei dem aber bei schwachen Fluoreszenzintensitäten keine zusätzliche Schwächung der Fluoreszenz im Detektionsstrahlengang auftritt.

Dieses Ziel wird durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.

Bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikroskop ist der Farbteiler in einem Reflektorschieber aufgenommen, der in einer Schaltstellung leer ist. Dadurch ist es bei sehr schwachen Fluoreszenzen möglich, den Reflektorschieber auf vollen Durchgang zu schalten, so daß keine zusätzliche Abschwächung des schwachen Fluoreszenzlichtes erfolgt.

Für konfokalmikroskopische Fluoreszenzuntersuchungen sollten darüberhinaus in drei zur Fokusebene des Objektivs konfokalen Ebenen jeweils eine Blende angeordnet sein. Diese drei Konfokalebenen sind über Farbteiler mit unterschiedlichen spektralen Transmissionscharakteristiken zueinander parallel geschaltet. Dadurch sind Fluoreszenzuntersuchungen bei drei verschiedenen Wellenlängen simultan möglich. Jede der drei Blenden sollte unabhängig von den anderen zentrierbar und in ihrem Öffnungsdurchmesser variierbar sein. Dadurch ist die Konfokalität der Meßanordnung für jede Wellenlänge separat einstellbar und an die jeweilige Fluoreszenzintensität bei der betreffenden Wellenlänge anpaßbar.

Das Fluoreszenzmikroskop weist vorzugsweise ein Stativ mit einem an seiner Vorderseite angeordneten Beobachtungstubus auf. An einem Schieber oder Revolver sind mehrere Strahlteiler oder Spiegel zur Umlenkung der die Fluoreszenz anregenden Laserstrahlung, in Richtung auf ein Objektiv vorgesehen. Die Einkopplung der Laserstrahlung kann von der der Vorderseite gegenüberliegenden Rückseite in den für konventionelle Auflichtbeleuchtung vorgesehenen Strahlengang erfolgen.

Da die Laserstrahlung auch in den konventionellen Auflichtstrahlengang eingekoppelt wird, bestehen hinsichtlich der Anwendungsmöglichkeiten des Mikroskops keinerlei Einschränkungen. Die Einkopplung der Laserbeleuchtung von der Rückseite des Stativs bewirkt darüber hinaus, daß die Zugänglichkeit des Mikroskoptisches in keiner Weise eingeschränkt wird. Der Raum seitlich des Mikroskopstativs steht voll für die Positionierung von Mikromanipulatoren etc. zur Verfügung. Da für den Auflichtstrahlengang am Mikroskopstativ üblicherweise ohnehin eine Schnittstelle zur Ankopplung der Auflichtbeleuchtung vorgesehen ist, sind keine baulichen Veränderungen am Stativ erforderlich.

Der Schieber oder Revolver des Auflichtreflektors sollte in einer Schaltposition einen Vollspiegel enthalten. Der Vollspiegel lenkt dann das gesamte Laserlicht zum Objektiv um, und das an der Probe reflektierte Licht in den Auflichtstrahlengang zurück. Dadurch wird der Einfall von Laserlicht in den Beobachtungstubus vermieden.

Im folgenden werden Einzelheiten der Erfindung anhand der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 ein Laserscan-Mikroskop inverser Bauart nach der Erfindung in einem die optische Achse des Objektivs enthaltenden Schnitt und

Fig. 2 eine Prinzipskizze des Strahlengangs in dem Mikroskop nach Fig. 1.

Das in der Fig. 1 dargestellte inverse Mikroskop hat ein Stativ (1), an dessen Vorderseite (2) ein Binokulartubus (3) angeordnet ist. Unter dem Objekttisch (6) sind mehrere Objektive (5) an einem Objektivrevolver (4) aufgenommen. Der entlang der optischen Achse (7) des Objektivs (5) verlaufende Beobachtungsstrahlengang wird über einen unterhalb des Objektivs angeordneten Spiegel schräg nach oben zum Okulartubus (3) gelenkt. Zwischen dem Objektiv (5) und dem Spiegel (8) ist der Auflichtreflektorschieber (9) angeordnet. Der bisher beschriebene Aufbau entspricht dem aus der DE 39 38 412 A1 bekannten inversen Mikroskop. Hinsichtlich der weiteren im Beobachtungsstrahlengang angeordneten Komponenten sowie der Ausspiegelung in den Phototubus sei daher ausdrücklich auf diese Offenlegungsschrift verwiesen.

Der Auflichtreflektorschieber (9) hat mindestens drei Schaltstellungen. Eine dieser drei Schaltstellungen ist frei und dient der visuellen Durchlichtmikroskopie. In der zweiten Schaltstellung ist ein 50%-Strahlteiler für die visuelle Auflichtmikroskopie und in der dritten Schaltstellung ein Vollspiegel (10) für die konfokale Mikroskopie vorgesehen. In einer anderen Ausführung für Fluoreszenzanwendungen hat der Reflektor vier Schaltpositionen, von denen eine mit dem Vollspiegel für die konfokale Mikroskopie und zwei weitere mit Fluoreszenz-Filtersätzen bestückt sind. Die vierte Position ist für die visuelle Durchlichtmikroskopie unbestückt oder mit einem weiteren Fluoreszenzfiltersatz ausgerüstet.

Auf der dem Okulartubus (3) abgewandten Rückseite (11) des Mikroskopstatives ist ein Scanmodul (12) angeordnet. Das Laserscanmodul (12), das ein eigenes Gehäuse hat, besteht im wesentlichen aus einer Scaneinheit, z. B. zwei Galvanometerscannern, die den senkrecht zur Zeichenebene einfallenden Laserstrahl in zwei zueinander senkrechten Richtungen ablenkt. Eine hinter der Scaneinheit angeordnete Linse (15) bildet zusammen mit der im Mikroskopstativ angeordneten Tubuslinse (17) ein Relaislinsensystem, das die beiden Scanspiegel (13, 14) in die beleuchtungsseitige Pupille des Objektivs (5) abbildet.

Die Einkopplung des Laserstrahls in das Stativ (1) erfolgt über einen Spiegel (16) durch den im Mikroskopstativ ohnehin vorhandenen Auflichtstrahlengang (18). Da ein solcher Auflichtstrahlengang (18) in der Regel bei sämtlichen Mikroskopstativen ohnehin vorhanden ist, läßt sich damit das Scanmodul (12) leicht an die unterschiedlichsten Mikroskopstative adaptieren.

Zwischen dem Umlenkspiegel (16) und der Einkopplung des Laserstrahls in das Mikroskopstativ (1) ist noch ein Klappspiegel (19) vorgesehen, über den eine hier nicht dargestellte konventionelle Mikroskopleuchte anstelle des Laserstrahls zur visuellen Auflichtmikroskopie in den Auflichtstrahlengang einkoppelbar ist.

Am Reflektorschieber (9) ist die Position des Vollspiegels (10) durch einen Sensor markiert. Dieser Sensor besteht hier speziell aus zwei Magneten (21), die in zwei kleinen Bohrungen im Reflektorschieber (9) aufgenommen sind, und zwei diesen gegenüberstehenden, an der Führung des Reflektorschiebers aufgenommenen Sonden. Stehen sich die Magnete (21) und die Sonden (20) gegenüber, so triggert das dabei entstehende Signal einen hier nicht dargestellten Shutter im Strahlengang des Laserlichts und gibt den Strahlengang frei. Da nur die Schaltstellung des Vollspiegels (10) durch Magnete (21) markiert ist, wird der Laserstrahlengang für jede andere Schaltstellung des Reflektorschiebers (9) oder bei Nichtvorhandensein dieses Schiebers unterbrochen. Eine Schädigung der Augen beim Einblick in den Okulartubus (3) ist dadurch ausgeschlossen. Die Ausführung der Sicherheitseinrichtung mit zwei Magneten erlaubt dabei, den Ausfall eines Sensors festzustellen, so daß auch bei einer Fehlfunktion eines Sensors die Laserstrahlung unterbrochen wird.

Oberhalb des Objekttisches (6) ist an einem um eine horizontale Achse (23) schwenkbaren Arm (22) ein Durchlichtkondensor (24) und darüber ein Klappspiegel (25) angeordnet. Über den Klappspiegel (25) kann wahlweise das Licht einer hier nicht dargestellten, oberhalb der Zeichenebene liegenden konventionellen Durchlichtbeleuchtung eingespiegelt oder für die Scanmikroskopie auf einen unterhalb der Zeichenebene liegenden Detektor ausgespiegelt werden. Das Gehäuse, in dem der Durchlichtkondensor (24) und der Klappspiegel (25) sowie der Detektor und die Durchlichtbeleuchtungseinrichtung angeordnet sind, dient gleichzeitig zum Schutz vor einem unbeabsichtigten Einblick in das aus dem Objektiv (5) austretende Laserlicht. Damit beim Wegklappen des Armes (22) ein solcher unbeabsichtigter Einblick vermieden ist, ist auch hier ein Sensor (26, 27) vorgesehen. Die Signale dieses aus Magneten (26) und Sonden (27) bestehenden Sensors steuern ebenfalls den Shutter im Laserstrahlengang. Die Signale der Sensoren (20, 21) und (26, 27) werden dazu im Sinne einer logischen UND-Schaltung miteinander verknüpft, so daß der Laserstrahlengang nur dann freigegeben ist, wenn beide Sensoren den sicheren Zustand anzeigen.

Wie aus der Fig. 2 hervorgeht, ist das inverse Laserscan- Mikroskop modular aufgebaut. Es besteht aus drei Standardblöcken (A, B und C) sowie im Prinzip beliebig vielen zusätzlichen Lasermodulen (D und E). Das Modul (A) stellt dabei das Mikroskopstativ und das Modul (B) das Scanmodul dar. Die einzelnen optischen Komponenten sind in der Fig. 2 mit denselben Bezugszeichen versehen wie in der Fig. 1. Sämtliche Komponenten sind in der Fig. 2 zur Vereinfachung in einer Ebene dargestellt, obwohl sie im tatsächlich realisierten Mikroskop in unterschiedlichen Ebenen liegen.

Da auf die Komponenten der Module (A und B) bereits im Zusammenhang mit der Fig. 1 eingegangen worden ist, wird auf eine nochmalige Beschreibung dieser Komponenten verzichtet.

An das Scanning-Modul (B) ist das Detektor-Modul (C) angeschlossen. Dieses Detektor-Modul enthält einen Laser (31) mit einem vorgeschalteten Shutter (32). Der Shutter (32) ist über einen Elektromagneten angetrieben. Ein Farbteiler (33) lenkt den aus dem Laser (31) austretenden Laserstrahl auf eine Strahlaufweitung (34, 35). Ein weiterer Farbteiler (36) lenkt den aus der Strahlaufweitung (34, 35) austretenden kollimierten Laserstrahl zur Ablenkeinheit (13, 14). Für die Auflichtmikroskopie kann hier auch ein Neutralteiler oder ein Polarisationsteiler verwendet werden.

Nach Durchlauf der Scaneinrichtung (13, 14) wird der kollimierte Laserstrahl vom Vollspiegel (10) zum Objektiv (5) umgelenkt und von diesem auf das hier nicht dargestellte Präparat fokussiert.

Das durch das Laserlicht im Präparat angeregte Fluoreszenzlicht bzw. das reflektierte Licht durchläuft zwischen dem Objektiv und dem Teiler (36) denselben Strahlengang in entgegengesetzter Richtung. Da sich das Fluoreszenzlicht hinichtlich der Wellenlänge von dem Laserlicht unterscheidet, transmittiert das Fluoreszenzlicht den Farbteiler (36). Über zwei weitere Farbteiler (37, 38) mit unterschiedlichen spektralen Transmissionseigenschaften und einem Vollspiegel (39) wird das Fluoreszenzlicht drei parallelen konfokalen Detektionskanälen zugeführt. Jeder dieser konfokalen Detektionskanäle enthält ein Objektiv (40, 41, 42), eine Konfokalblende (46, 44, 45) sowie einen Photodetektor (47, 48, 49) zur Umwandlung optischer Strahlung in elektrische Signale. Die Konfokalblenden (46, 44, 45) sind dabei jeweils in einer zur Fokusebene des Objektivs (5) konjugierten Ebene angeordnet. Jede dieser Konfokalblenden ist unabhängig von der anderen über entsprechende von außen zugängliche Justierschrauben (nicht dargestellt) zentrierbar sowie bezüglich ihres Öffnungsdurchmessers variierbar. Dadurch ist die Tiefenauflösung der mikroskopischen Abbildung für jede Fluoreszenzwellenlänge separat einstellbar.

Der Teiler (36), der den Beleuchtungsstrahlengang vom Meßstrahlengang trennt sowie die Farbteiler (37, 38) zur Aufteilung des Meßlichtes in die unterschiedlichen Detektionskanäle sind jeweils in hier nicht dargestellten Reflektorschiebern aufgenommen. Durch die unterschiedlichen Kombinationen der Reflektorschieber sind daher die unterschiedlichsten Wellenlängenkombinationen einstellbar und simultan zu registrieren. Die Reflektorschieber, in denen die Farbteiler (37, 38) aufgenommen sind, haben dabei eine leere Schaltstellung. Dadurch ist es möglich, bei Messung sehr schwacher Fluoreszenzen einen Reflektorschieber auf vollen Durchgang zu schalten, so daß keine zusätzliche Abschwächung des ohnehin schon schwachen Fluoreszenzlichtes erfolgt.

Wie des weiteren durch die Module (D und E) angedeutet ist, sind für Anwendungen mit mehreren Anregungswellenlängen im Prinzip beliebig viele zusätzliche externe Laser-Module an das Detektor- Modul (C) ankoppelbar. Jedes dieser zusätzlichen Laser-Module (D und E) besteht im wesentlichen aus einem Laser (61, 51), einem eigenen Shutter (62, 52), gegebenenfalls Filter zur Linienselektion (hier nicht dargestellt) bei Multiline-Lasern und justierbaren Einkoppeloptiken (63, 53). Jede dieser justierbaren Einkoppeloptiken (63, 53) besteht aus zwei justierbaren Spiegeln, von denen hier jedoch lediglich einer dargestellt ist.

Anhand der Figuren ist ein besonders vorteilhaftes Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben. Es sind jedoch auch zahlreiche Variationsmöglichkeiten möglich. Insbesondere können für die Erzeugung der Shuttersignale andere Sensortypen verwendet werden, beispielsweise Mikroschalter oder einfache elektrische Kontakte. Außerdem können auch im Detektormodul (C) mehrere Laser oder mehr als drei parallele Detektionskanäle vorgesehen sein.

Claims (5)

1. Fluoreszenzmikroskop
mit einer Laseranordnung (31, 51, 61) zur Anregung der Fluoreszenz einer zu untersuchenden Probe,
sowie einer das Fluoreszenzlicht registrierenden Detektoranordnung mit mindestens zwei Detektoren (47, 48, 49) in einem Detektionsstrahlengang,
wobei ein Farbstrahlteiler ((37) vorgesehen ist, der das Fluoreszenzlicht wellenlängenabhängig auf die mindestens zwei Detektoren (47, 48, 49) aufteilt,
und mit einem Objektiv (5) zur Fokussierung der anregenden Laserstrahlung und zur Aufnahme des Fluoreszenzlichtes,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Farbstrahlteiler (37) auf einem Reflektorschieber mit einer leeren Schaltstellung aufgenommen ist,
wobei bei in den Detektionstrahlengang eingebrachter leerer Schaltstellung ein Detektor (47) mit dem gesamten Fluoreszenzlicht beaufschlagt wird.

2. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als konfokales Fluoreszenzmikroskop ausgebildet ist.

3. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der Detektoren (47, 48, 49) eine zugehörige, separat zentrierbare Detektorlochblende (44, 45, 46) aufweist.

4. Fluoreszenzmikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektorlochblenden (44, 45, 46) in ihren Öffnungsdurchmessern unabhängig voneinander variierbar sind.

5. Fluoreszenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Stativ (1), einen an der Vorderseite (2) des Stativs angeordneten Okulartubus (3), mehrere in einem Schieber oder Revolver (4) aufgenommene Strahlteiler oder Spiegel zur Umlenkung des von der Laseranordnung bereit gestellten Laserstrahls in Richtung auf das Objektiv aufweist und daß der Laserstrahl von der der Vorderseite (2) gegenüberliegenden Rückseite in den für konventionelle Auflichtbeleuchtung vorgesehenen Strahlengang (18) in das Stativ (1) eingekoppelt ist.