DE4341078A1 - Test for cpd. that inhibits expression of plasminogen activator inhibitor one - Google Patents
Test for cpd. that inhibits expression of plasminogen activator inhibitor oneInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Identi fizierung von Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-(PAI-1)-Senkern.The present invention relates to a test method for identi of plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) counters.
Plasmin wird im Blut aus seiner inaktiven Form, dem Plasminogen, durch proteolytische Aktivierung mittels Plasminogen-Aktivatoren gebildet. Plasmin löst Blutgerinnsel aufgrund seines fibrinolyti schen Potentials. Es zeigte sich, daß die Fähigkeit eines Indivi duums, Blutgerinnsel aufzulösen, bestimmt wird durch das Verhältnis Plasminogen-Aktivator zu Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1. Ein stark zugunsten des Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1 (PAI-1) verschobenes Verhältnis scheint die Ursache für eine Vielzahl schwerwiegender thromboembolischer Erkrankungen zu sein.Plasmin is in the blood from its inactive form, the plasminogen, by proteolytic activation using plasminogen activators educated. Plasmin dissolves blood clots due to its fibrinolyti potential. It was shown that the ability of an individual duums to dissolve blood clots is determined by the Ratio of plasminogen activator to plasminogen activator Inhibitor-1. A strong benefit in favor of the plasminogen activator Inhibitor-1 (PAI-1) shifted ratio appears to be the cause for a variety of serious thromboembolic disorders to be.
Daher ist es wünschenswert, Substanzen auf zufinden, die den Gehalt an PAI-1 im Blut senken.Therefore, it is desirable to find substances that affect the Lower the level of PAI-1 in the blood.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Testverfahren aufzufinden, das die Identifizierung von Substanzen erlaubt, die den PAI-1-Gehalt im Blut senken.The task was therefore to find a test method that the identification of substances that allow the PAI-1 content lower in blood.
Gegenstand der Erfindung ist ein Testverfahren zur Identifizie rung von Substanzen, die die Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1-Expression inhibieren und das die folgenden Schritte umfaßt:The invention relates to a test method for identification Substance that the plasminogen activator Inhibitor-1 expression inhibit and the following steps includes:
-
a) Transfektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor,
der
a₁) die regulatorische Region des Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1-Gens,
a₂) ein Reportergen, funktionell mit der in a₁) beschriebenen regulatorischen Region verknüpft, trägt,a) Transfection of a host cell with a recombinant vector that
a₁) the regulatory region of the plasminogen activator inhibitor 1 gene,
a₂) carries a reporter gene, functionally linked to the regulatory region described in a₁), - b) b₁) Etablieren von Zellen, die den unter Schritt a) beschrie benen Vektor transient enthalten,b) b₁) Establishing cells that described in step a) contain this vector transiently,
oderor
- b₂) Züchten einer Zellinie, die den unter Schritt a) be schriebenen Vektor stabil integriert enthält,b₂) cultivating a cell line that be under step a) contains written vector stably integrated,
- c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,c) Exposure of the cells from step b) to the one to be tested Substance,
- d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).d) Measurement of the expression of the reporter gene in the cells after Step c).
Im ersten Schritt (a) des erfindungsgemäßen Testverfahrens wird ein rekombinanter Vektor hergestellt, der die regulatorische Gen region des PAI-1-Gens trägt. Darunter ist der Sequenzbereich zu verstehen, der den Promotor, den Enhancer sowie gegebenenfalls weitere, die Transkription von PAI-1 positiv oder negativ beein flußende Kontrollsequenzen enthält.In the first step (a) of the test method according to the invention produced a recombinant vector that contains the regulatory gene region of the PAI-1 gene. Below that is the sequence area understand the promoter, enhancer and, if necessary others that affect the transcription of PAI-1 positively or negatively contains flowing control sequences.
Die regulatorische Region von PAI-1 läßt sich beispielsweise aus humaner genomischer DNA oder einer humanen genomischen Genbank isolieren (siehe Beispiel 1). An diese regulatorische Genregion wird ein Reportergen funktionell angeknüpft. Reportergene sind solche Gene, deren exprimiertes Genprodukt ein leicht meß- bzw. quantifizierbares Signal liefert.The regulatory region of PAI-1 can be identified, for example human genomic DNA or a human genomic library isolate (see example 1). To this regulatory gene region a reporter gene is linked functionally. Are reporter genes genes whose expressed gene product is an easily measured or provides quantifiable signal.
In der Regel sind geeignete Reportergene Gene für solche Pro teine, die mit gängigen Methoden nachweisbar sind. Bevorzugt wer den als Reportergene Gene für Enzyme, die eine leicht nachweis bare Reaktion katalysieren, verwendet.As a rule, suitable reporter genes are genes for such professionals stones that can be detected using common methods. Preferred who the as reporter genes for enzymes that are easily detected catalyze bare reaction used.
Besonders geeignete Reportergene sind die Gene für Chloramphen icol-Acetyl-Transferase (CAT) oder Luziferase.Particularly suitable reporter genes are the genes for chloramphes icol acetyl transferase (CAT) or luciferase.
Die funktionelle Verknüpfung von regulatorischer Genregion von PAI-1⁻ und Reportergen bedeutet, daß die Transkription des Repor tergens unter Promotorkontrolle von PAI-1 erfolgt.The functional linkage of the regulatory gene region of PAI-1⁻ and reporter gene means that the transcription of the report tergens under the control of the promoter of PAI-1.
Neben diesen beiden Genbereichen kann der rekombinante Vektor noch weitere Genabschnitte tragen. Insbesondere ist die Verwen dung eines Selektionsmarkers wie die Neomycin-Resistenz (neo®) von Vorteil.In addition to these two gene areas, the recombinant vector carry even more gene segments. In particular, the use a selection marker such as neomycin resistance (neo®) from Advantage.
Die Transformation einer Wirtszelle durch den rekombinanten Ver treter kann durch alle gängigen Transformationsverfahren wie Elektroporation, Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Transfektion erfolgen. Besonders gut geeignet für die Transforma tion ist die Liposomen vermittelte Transfektion. The transformation of a host cell by the recombinant ver can walk through all common transformation processes such as Electroporation, calcium phosphate or liposome mediated Transfection done. Particularly suitable for the transforma tion is the liposome-mediated transfection.
Als Wirtszellen sind eukaryontische Zellinien gut geeignet. Ins besondere HepG2 ATCC Nr. HB 8065.Eukaryotic cell lines are well suited as host cells. Ins special HepG2 ATCC No. HB 8065.
Nachdem die Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor transformiert worden ist, werden in einem weiteren Schritt (b) solche Zellen etabliert, die den Vektor entweder transient oder stabil inte griert enthalten. Unter transienter Expression versteht man eine Expression von nur begrenzter Dauer. Unter stabiler Integration versteht man die Aufnahme des rekombinanten Vektors in das Genom der Wirtszelle.After the host cell is transformed with the recombinant vector in a further step (b), such cells established that the vector is either transient or stable inte free included. Transient expression means one Expression of limited duration. With stable integration one understands the inclusion of the recombinant vector in the genome the host cell.
In einem dritten Schritt (c) werden die im Schritt (b) isolierten Zellen den auf PAI-1-Senkung zu testenden Substanzen ausgesetzt. Dies geschieht dadurch, daß die zu testenden Substanzen üblicher weise in einer Konzentration von 10-3M bis 10-6M dem Zellkulturme dium zugesetzt werden. Die zu testenden Substanzen bleiben in der Regel 2 bis 24 Stunden mit den transformierten Wirtszellen in Kontakt.In a third step (c), the cells isolated in step (b) are exposed to the substances to be tested for PAI-1 reduction. This is done by adding the substances to be tested to the cell culture medium in a concentration of 10 -3 M to 10 -6 M. The substances to be tested usually remain in contact with the transformed host cells for 2 to 24 hours.
Anschließend werden die Zellen lysiert und für die Auswertung der Reportergen-Expression vorbereitet, wie es in Beispiel 4 angege ben ist.The cells are then lysed and used to evaluate the Reporter gene expression prepared as indicated in Example 4 ben is.
Die Expression des Reportergens in einer mit einer zu testenden Substanz behandelten Wirtszelle wird gemessen und verglichen mit einer Kontrolle, d. h. der Expression in Abwesenheit einer zu te stenden Substanz. Durch Vergleich dieser beiden Meßwerte läßt sich sofort eine Aussage darüber machen, ob die zu testende Sub stanz die Reportergenexpression reprimiert.Expression of the reporter gene in one with one to be tested Substance treated host cell is measured and compared to a control, d. H. expression in the absence of one constant substance. By comparing these two measured values immediately make a statement as to whether the sub punch reporter gene expression repressed.
Das erfindungsgemäße Testverfahren hat den Vorteil, das es leicht und schnell auszuwerten ist und somit einen großen Probendurch satz gestattet. Dadurch wird es möglich, ein effektives Massen screening auf Substanzen mit PAI-1-senkender Wirkung durchzufüh ren.The test method according to the invention has the advantage that it is easy and can be evaluated quickly and thus a large sample sentence allowed. This makes it possible to have an effective mass screening for substances with PAI-1-lowering effects ren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veran schaulicht.The invention is further illustrated by the following examples clear.
Ausgehend von der publizierten Sequenz des humanen PAI-1 Promo tors (Standberg, K. et al., Eur. J. Biochem. 176, 609-616 (1988)) wurden zwei PCR-Primer hergestellt (Position 23-43 und Position 929-950 (rev. compl.)). Die hergestellten Primer enthalten zu sätzlich an ihrem 5′-Ende die Erkennungssequenz für das Restrik tionsenzym Not I (GCGGCCGC). Durch PCR-Reaktion unter Standardbe dingungen wurde der von den o.g. Primern gekennzeichnete Pro motorabschnitt aus genomischer DNA von HepG2-Zellen (ATCC HB 8065) amplifiziert.Based on the published sequence of the human PAI-1 promo tors (Standberg, K. et al., Eur. J. Biochem. 176, 609-616 (1988)) two PCR primers were prepared (position 23-43 and position 929-950 (rev. Compl.)). The primers produced contain too additionally at its 5'-end the recognition sequence for the restriction tion enzyme Not I (GCGGCCGC). By PCR reaction under standard conditions conditions was that of the above Pro marked primers Motor section from genomic DNA from HepG2 cells (ATCC HB 8065) amplified.
Ausgehend von dem käuflichen Reporterkonstrukt pMAMneo-luc (Fa. Clontech) wurde eine Enhancer/Promotor-freies Reporterplasmid konstruiert. Dazu wurde der die regulatorischen Sequenzen des RSV-LTRs und des MMTV-LTRs enthaltende Bereich in pMAMneo-luc durch Restriktionsspaltung mit NdeI und NheI deletiert und durch eine Polylinker, der die Erkennungssequenzen für die Restrikti onsenzyme NdeI, MluI, NotI, SpeI und NheI enthält, ersetzt. Das so entstandene Reporterplasmid pneoluc dient somit der Aufnahme regulatorischer Sequenzen in die Polylinkerregion. Das in Bei spiel 1 beschriebene PCR-Produkt des PAI-1-Promotors wurde mit Not I gespalten und in die Not I-Stelle des o.g. Reporterplasmids pneoluc kloniert. Die richtige Orientierung der regulatorischen Region wurde durch Sequenzierung bestätigt.Based on the commercial reporter construct pMAMneo-luc (Fa. Clontech) was an enhancer / promoter-free reporter plasmid constructed. For this purpose, the regulatory sequences of the Area in pMAMneo-luc containing RSV-LTRs and the MMTV-LTR deleted by restriction cleavage with NdeI and NheI and by a polylinker that recognizes the restriction sequences onsenzyme contains NdeI, MluI, NotI, SpeI and NheI. The the resulting reporter plasmid pneoluc is used for uptake regulatory sequences in the polylinker region. The in bei game 1 described PCR product of the PAI-1 promoter was with Not I split and into the Not I position of the above Reporter plasmids pneoluc cloned. The correct orientation of the regulatory Region was confirmed by sequencing.
HepG2-Zellen werden in DMEM/HamF12 (1 : 1)-Medium mit 10% FCS mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen in 10 cm-Petrischalen eingesät und über Nacht inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit 2 µg Vek tor-DNA in 10 µl Transfectam (Promega Nr. E 1231), aufgenommen in insgesamt 2 ml serumfreiem Medium über 6 Stunden. Danach erfolgte ein Überführen in serumhaltiges Medium. Nach weiteren 42 Stunden wurden die Zellen in Selektionsmedium (600 µg/ml G 418-Sulfat, Geneticin) überführt. Stabile Geneticin-resistente Zellklone wur den nach 14-20 Tagen isoliert.HepG2 cells are grown in DMEM / HamF12 (1: 1) medium with 10% FCS a cell density of 1 × 10⁶ cells sown in 10 cm petri dishes and incubated overnight. The transfection was carried out with 2 µg Vek tor DNA in 10 ul Transfectam (Promega No. E 1231), taken in a total of 2 ml of serum-free medium over 6 hours. After that was done transfer into medium containing serum. After another 42 hours the cells were placed in selection medium (600 µg / ml G 418 sulfate, Geneticin) transferred. Stable geneticin-resistant cell clones were isolated after 14-20 days.
Zellen gemäß Bsp. 3 wurden in Mikrotiterplatten (Packard No.) eingesät (1×10⁵ Z/well) und nach 16 h in DMEM/HamF12 (1 : 1)-Medium ohne FCS überführt. Nach zwei Stunden wurden Verdünnungen der zu testenden Substanzen zugegeben. Nicht behandelte Zellen dienten als Negativkontrolle, eine weitere Reihe von Zellen wurden mit EGF (50 ng/mL) behandelt. EGF ist bekanntermaßen in der Lage, die Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-Transkription zu induzieren und diente somit als Positivkontrolle.Cells according to Example 3 were in microtiter plates (Packard No.) sown (1 × 10⁵ Z / well) and after 16 h in DMEM / HamF12 (1: 1) medium transferred without FCS. After two hours, the dilutions became too test substances added. Untreated cells served As a negative control, a further row of cells were identified EGF (50 ng / mL) treated. EGF is known to be able to And induce plasminogen activator inhibitor 1 transcription thus served as a positive control.
Nach 2 bis 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen durch Zugabe von 30 µl/well Lysispuffer (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8; 2mM DTT; 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N′,N′-tetraessigsäure, 10% Glycerol, 1% Triton X-100®) aufgeschlossen (15 min. bei Raumtem peratur). Zu diesem Zellextrakt wurden 50 µl Luciferase Assay Substrate (270 µM Coenzym A, 470 µM Luciferin, 530 µM ATP) zugege ben. Die Messung der Luziferase-Aktivität kann in herkömmlichen Luminometern durchgeführt werden; vorzugsweise erfolgt die Mes sung in einem 2-D-Luminometer der Fa. Hamamatsu.After 2 to 24 hours of incubation, the cells were added of 30 µl / well lysis buffer (25 mM Tris-phosphate, pH 7.8; 2mM DTT; 2 mM 1,2-diaminocyclohexane-N, N, N ′, N′-tetraacetic acid, 10% Glycerol, 1% Triton X-100®) digested (15 min. At room temp temperature). 50 μl of luciferase assay were added to this cell extract Substrates (270 µM coenzyme A, 470 µM luciferin, 530 µM ATP) were added ben. The measurement of luciferase activity can be done in conventional Luminometers are performed; the measurement is preferably carried out solution in a 2-D luminometer from Hamamatsu.
Das Assaysystem gemäß Bsp. 4 wird eingesetzt für ein "random screening" nach Substanzen, die spezifisch die Regulation des Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1-Promotors beeinflussen. Sub stanzen, die im Screening verwendet werden sollen, werden in Konzentrationen von 1-5 nM in DM50 gelöst und in geeigneten Ver dünnungen gemäß Bsp. 4 in Tests eingesetzt. Zu testende Substan zen können sowohl in An- oder Abwesenheit zusätzlicher Induktoren (EGF) eingesetzt werden.The assay system according to Example 4 is used for a "random screening "for substances that specifically regulate the Affect plasminogen activator inhibitor 1 promoter. Sub punches that are to be used in the screening are printed in Concentrations of 1-5 nM dissolved in DM50 and in suitable ver 4 used in tests. Substan to be tested zen can be in the presence or absence of additional inductors (EGF) can be used.
Claims (3)
- a) Transfektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten
Vektor, der
a₁) die regulatorische Region des Plasminogen-Aktivator- Inhibitor-1-Gens,
a₂) ein Reportergen, funktionell mit der in a₁) beschrie benen regulatorischen Region verknüpft, trägt, - b) b₁) Etablieren von Zellen, die den unter Schritt a) beschriebenen Vektor transient enthalten,
- a) Transfection of a host cell with a recombinant vector that
a₁) the regulatory region of the plasminogen activator inhibitor 1 gene,
a₂) carries a reporter gene, functionally linked to the regulatory region described in a₁), - b) b₁) establishing cells which transiently contain the vector described in step a),
- b₂) Züchten einer Zellinie, die den unter Schritt a) be schriebenen Vektor stabil integriert enthält,
- c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,
- d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).
- b₂) culturing a cell line which contains the vector described in step a) stably integrated,
- c) exposure of the cells from step b) to the substance to be tested,
- d) Measurement of the expression of the reporter gene in the cells after step c).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4341078A DE4341078A1 (en) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | Test for cpd. that inhibits expression of plasminogen activator inhibitor one |
Applications Claiming Priority (1)
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| DE4341078A DE4341078A1 (en) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | Test for cpd. that inhibits expression of plasminogen activator inhibitor one |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4341078A1 true DE4341078A1 (en) | 1995-06-08 |
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Family Applications (1)
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| DE4341078A Withdrawn DE4341078A1 (en) | 1993-12-02 | 1993-12-02 | Test for cpd. that inhibits expression of plasminogen activator inhibitor one |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4341078A1 (en) |
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1993
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|---|---|---|---|
| 8130 | Withdrawal |