DE4335273A1

DE4335273A1 - Peptides for tumor therapy

Info

Publication number: DE4335273A1
Application number: DE19934335273
Authority: DE
Inventors: Markus Dr Med Grewe; Jean Dr Med Krutmann
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg; Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 1993-10-15
Filing date: 1993-10-15
Publication date: 1995-04-20
Also published as: AU7852194A; WO1995010533A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt werden können.The present invention relates to peptides used for Treatment of tumor diseases can be used.

Es ist bekannt, daß die Interaktion zwischen Leukozyten und ihren Zielzellen durch spezielle Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Das sogenannte interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1 ist ein Immunoglobulin-ähnliches einkettiges Transmembranmolekül, das funktionell definiert ist, durch seine Fähigkeit als Rezeptor von LFA-1 zu dienen. Das Lymphozytenfunktions-Antigen-1 (LFA-1) findet sich auf der Oberfläche von Leukozyten, insbesondere auf der Oberfläche von Lymphokin-aktivierten Killerzellen. Die durch LFA-1/ICAM-1 vermittelte Adhäsion spielt bei einer Vielzahl von immunologischen Prozessen eine Rolle, z. B. bei der Antigenpräsentation oder der Ausbildung eines entzündlichen Infiltrats in menschlichen Geweben. Weiterhin fungiert ICAM- 1 als ein Rezeptor für bestimmte humanpathogene Viren, z. B. Rhinoviren. Bei in vitro-Versuchen wurde festgestellt, daß die zytotoxische Zerstörung von Tumorzellen, insbesondere Melanomzellen, durch das Binden von LFA-1-Molekülen auf der Oberfläche von Lymphokin-aktivierten Killerzellen an Melanomzellen vermittelt wird, die das ICAM-1-Molekül tragen. Wenn aktivierte Killerzellen an Melanomzellen binden, wird hierdurch die Lyse und somit die Vernichtung der Tumorzellen bewirkt. It is known that the interaction between leukocytes and their target cells through special adhesion molecules is conveyed. The so-called intercellular Adhesion molecule-1 (ICAM-1 is an immunoglobulin-like single chain transmembrane molecule that defines functionally is to act as a receptor for LFA-1. Lymphocyte function antigen-1 (LFA-1) is found on the surface of leukocytes, especially on the Surface of lymphokine activated killer cells. By LFA-1 / ICAM-1 mediated adhesion plays in a variety a role of immunological processes, e.g. B. at the Antigen presentation or the formation of an inflammatory Infiltrates in human tissues. Furthermore, ICAM- 1 as a receptor for certain human pathogenic viruses, e.g. B. Rhinoviruses. In in vitro tests it was found that the cytotoxic destruction of tumor cells, in particular Melanoma cells, by binding LFA-1 molecules on the Surface of lymphokine-activated killer cells Melanoma cells are mediated by the ICAM-1 molecule carry. When activated killer cells on melanoma cells bind, thereby the lysis and thus the destruction of the tumor cells.

Staunton et al. haben in dem Artikel "Primary Structure of ICAM-1 Demonstrates Interaction between Members of the Immunoglobulin and Integrin Supergene Families" (Cell, Vol. 82 [1988], S. 925-933) eine Aminosäuresequenz eines ICAM-1-Moleküls offenbart.Staunton et al. have in the article "Primary Structure of ICAM-1 demonstrates interaction between members of the Immunoglobulin and Integrin Supergene Families "(Cell, Vol. 82 [1988], pp. 925-933) an amino acid sequence of a ICAM-1 molecule disclosed.

Das ICAM-1-Molekül ist normalerweise bei den Zellen membrangebunden. Diese Form wird als mICAM-1 bezeichnet. Daneben gibt es aber auch noch eine lösliche Form dieses Moleküls, die als sICAM-1 bezeichnet wird. Das lösliche Molekül sICAM-1 ist funktionell aktiv, da es an LFA-1 binden kann und es konnte bei in vitro-Versuchen gezeigt werden, daß die durch Lymphokin-aktivierte Killerzellen bewirkte Zytotoxizität gegen Melanomzellen durch sICAM-1 gehemmt werden kann (Becker et al. "Shedding of ICAM-1 from Human Melanoma Cell Lines Induced by IFN-γ and Tumor Necrosis Factor-α", Journal of Immunology, [1991], Vol. 147, S. 4398- 4401).The ICAM-1 molecule is normally in the cells membrane bound. This form is called mICAM-1. In addition, there is also a soluble form of this Molecule called sICAM-1. The soluble Molecule sICAM-1 is functionally active because it binds to LFA-1 can and could be shown in in vitro experiments that caused the killer cells activated by lymphokine Cytotoxicity against melanoma cells inhibited by sICAM-1 (Becker et al. "Shedding of ICAM-1 from Human Melanoma Cell Lines Induced by IFN-γ and Tumor Necrosis Factor-α ", Journal of Immunology, [1991], vol. 147, p. 4398- 4401).

Von Budnik et al. (Exp. Dermatol. 1992, Vol. 1, S. 27-30 "Human Epidermal Keratinocytes are a Source of Soluble ICAM- 1 Molecules") wurde offenbart, daß sowohl maligne wie auch nichtmaligne Keratinozyten (verhornende Zellen der Oberhaut) nach Stimulation mit dem Cytokin-Interferon-γ in der Lage sind, sowohl das membrangebundene mICAM-1 wie auch das lösliche sICAM-1 zu produzieren. Das lösliche sICAM-1 hat ein geringeres Molekulargewicht als das membrangebundene mICAM-1 und entsteht durch proteolytische Abspaltung von mICAM-1. Diese löslichen Moleküle sICAM-1 sind funktionell aktiv, d. h. sie können an LFA-1 binden. Wenn aber die löslichen Moleküle sICAM-1 vorhanden sind und diese an das LFA-1 der Lymphozyten binden, dann ist zu befürchten, daß die Leukozyten durch die lösliche Molekülform blockiert werden und ihre Funktion, nämlich die Zerstörung von Tumorzellen, nicht mehr wahrnehmen können. By Budnik et al. (Exp. Dermatol. 1992, Vol. 1, pp. 27-30 "Human Epidermal Keratinocytes are a Source of Soluble ICAM- 1 Molecules ") was disclosed to be both malignant and non-malignant keratinocytes (keratinizing cells of the epidermis) able after stimulation with the cytokine interferon-γ are both the membrane-bound mICAM-1 and that to produce soluble sICAM-1. The soluble sICAM-1 has a lower molecular weight than the membrane-bound mICAM-1 and arises from proteolytic cleavage of mICAM-1. These sICAM-1 soluble molecules are functional active, d. H. they can bind to LFA-1. But if that soluble molecules sICAM-1 are present and attached to the LFA-1 bind the lymphocytes, then it is feared that the leukocytes are blocked by the soluble molecular form and their function, namely the destruction of Tumor cells can no longer perceive.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel bereitzustellen, die bei der Therapie von Tumorerkrankungen erfolgreich eingesetzt werden können.The object of the present invention is to provide means provide that in the therapy of tumor diseases can be used successfully.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide bei der Tumortherapie vorteilhafterweise eingesetzt werden können, da durch diese Peptide überraschenderweise die Bildung von sICAM-1 gehemmt wird, ohne daß die Expression von membrangebundenem mICAM-1 reduziert wird.In the context of the present invention, it was found that the Peptides according to the invention in tumor therapy can be used advantageously because of this Peptides surprisingly inhibited the formation of sICAM-1 without the expression of membrane-bound mICAM-1 is reduced.

Die erfindungsgemäßen Peptide können die Aminosäuresequenz REVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIM aufweisen. Die Aminosäuresequenz ist in dem 1-Buchstabencode angegeben. Die Bedeutung der jeweiligen Buchstaben ist beispielsweise in Römpps Chemielexikon, 8. Auflage, 1979, Bd. 1, S. 176, wiedergegeben. Im 3-Buchstabencode angegeben lautet die Aminosäuresequenz:
Arg Glu Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met.The peptides according to the invention can have the amino acid sequence REVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIM. The amino acid sequence is given in the 1-letter code. The meaning of the respective letters is given for example in Römpps Chemielexikon, 8th edition, 1979, Vol. 1, p. 176. The amino acid sequence given in the 3-letter code is:
Arg Glu Val Thr Val Asn Val Leu Ser Pro Arg Tyr Glu Ile Val Ile Ile Thr Val Val Ala Ala Ala Val Ile Met.

Die erfindungsgemäßen Peptide können eine Deletion an einem oder beiden Enden der obigen Sequenz aufweisen, wobei jede Deletion bis zu fünf Aminosäuren umfassen kann.The peptides according to the invention can be deleted from a or both ends of the above sequence, each Deletion can include up to five amino acids.

Es ist bei biologischen Systemen häufig so, daß die Moleküle auch dann noch funktionell aktiv sind, wenn einzelne Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Das Ausmaß der zulässigen Abweichung wird angegeben in Homologiewerten. Unter Homologiewerten versteht man den Anteil der Aminosäuren, die bei beiden Sequenzen vorhanden sind. Wenn sich also beispielsweise eine Sequenz von 10 Aminosäuren in drei Aminosäuren unterscheidet und in sieben Aminosäuren übereinstimmt, dann liegt eine Homologie von 70% vor. Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen auch solche Peptide, die eine Homologie von wenigstens 70% zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA aufweisen. Dies bedeutet, daß 30% der Aminosäuren ersetzt sein können durch andere Aminosäuren. Diese Derivate weisen aber noch die erforderliche biologische Aktivität auf.It is often the case with biological systems that the molecules are still functionally active even if individual Amino acids can be replaced by other amino acids. The The extent of the permissible deviation is given in Homology values. One understands homology values Proportion of amino acids present in both sequences are. For example, if a sequence of 10 Amino acids differ in three amino acids and in seven Amino acids matches, then there is a homology of 70% before. The peptides according to the invention also include such Peptides that have at least 70% homology to that Have sequence NVLSPRYEIVIITVVA. This means that 30% of which amino acids can be replaced by others Amino acids. However, these derivatives still have the required biological activity.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Derivate eine Homologie von wenigstens 80% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Homologie von wenigstens 90% zu der Sequenz NVLSPRYEIVIITVVA auf.In a preferred embodiment, the derivatives a homology of at least 80% and in one particular preferred embodiment a homology of at least 90% to the sequence NVLSPRYEIVIITVVA.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind verhältnismäßig kurz. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen sie nicht mehr als 26 Aminosäuren auf und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen sie nicht mehr als 16 Aminosäuren auf. Ganz besonders bevorzugt ist das Peptid mit der Aminosäuresequenz: NVLSPRYEIVIITVVA.The peptides according to the invention are relatively short. In In a preferred embodiment, they have no more than 26 amino acids on and in a particularly preferred Embodiment they have no more than 16 amino acids on. The peptide with is very particularly preferred Amino acid sequence: NVLSPRYEIVIITVVA.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Arzneimittel, die wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten. Diese Arzneimittel sind besonders für die Behandlung von Tumorerkrankungen geeignet. Bei einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Peptide zur Behandlung von Tumorzellen ex vivo eingesetzt werden. Wenn also Patienten, die an einer Tumorerkrankung leiden, Zellen im Rahmen der Therapie entnommen werden, können die erfindungsgemäßen Peptide ex vivo, ggf. zusammen mit IFN-γ zugegeben werden, wodurch die Tumorzellen verstärkt das membrangebundene mICAM exprimieren, aber die Expression von löslichem sICAM reduziert wird. Die aktivierten Lymphocyten können dann die Tumorzellen erkennen und vernichten.The present invention also relates to Medicinal products containing at least one peptide according to one of the Claims 1 to 5 included. These drugs are especially suitable for the treatment of tumor diseases. In a very particularly preferred embodiment, can the peptides according to the invention for the treatment of tumor cells be used ex vivo. So if patients who are on one Tumor disease, cells as part of therapy can be removed, the peptides according to the invention ex in vivo, if necessary together with IFN-γ, whereby the Tumor cells strengthen the membrane-bound mICAM express, but the expression of soluble sICAM is reduced. The activated lymphocytes can then Recognize and destroy tumor cells.

An einem oder beiden Enden können die erfindungsgemäßen Peptide eine Deletion aufweisen, sofern sie länger als 16 Aminosäuren sind. Dies bedeutet, daß die ersten und/oder letzten Aminosäuren deletiert, d. h. entfernt sind. Die Deletion sollte jedoch nicht mehr als fünf Aminosäuren pro Ende betragen. At one or both ends, the inventive Peptides have a deletion if they are longer than 16 amino acids are. This means that the first and / or last amino acids deleted, d. H. are removed. The However, deletion should not exceed five amino acids per End.

Unter Peptid im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein Molekül verstanden, bei dem eine nicht zu große Anzahl von Aminosäuren miteinander verbunden ist. Die Zahl der Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide beträgt höchstens 30, bevorzugterweise nicht mehr als 26 und besonders bevorzugterweise nicht mehr als 16.A peptide in the sense of the present invention is a Understand molecule in which a not too large number of Amino acids are linked together. The number of Amino acids of the peptides according to the invention is at most 30, preferably not more than 26 and especially preferably not more than 16.

Hergestellt werden können die erfindungsgemäßen Peptide nach an sich bekannten Methoden entweder auf synthetischem Wege (beispielsweise Festphasensynthese) oder auf gentechnologischem Weg, bei dem eine für die Aminosäuresequenz des Peptids kodierende DNA-Sequenz in einem geeigneten Vektor eingebaut wird und in einem geeignetem Wirtsystem zur Expression gebracht wird.The peptides according to the invention can be produced known methods either synthetically (e.g. solid phase synthesis) or genetic engineering path, one for the Amino acid sequence of the peptide coding DNA sequence in a suitable vector is installed and in one suitable host system for expression.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.The present invention is illustrated by the following Examples further explained.

example 1

Nach an sich bekannten Methoden wurden normale menschliche Keratinozyten, die von Vorhaut abstammen, kultiviert und unter Verwendung eines definierten Keratinozyten- Wachstumsmediums (KGM, Gibco, Berlin) kultiviert. Die Zellen wurden einschichtig bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre enthaltend 5% CO₂ kultiviert. Zur Stimulierung wurde zunächst das Wachstumsmedium ersetzt und menschliches Interferon-γ zugegeben, um die Expression von ICAM-1 zu stimulieren. Zur Inhibierung der Sekretion von sICAM-1 wurden Proteaseinhibitoren nach einer Inkubierungsperiode mit Interferon-γ zugegeben.According to methods known per se, normal human Foreskin-derived and cultivated keratinocytes using a defined keratinocyte Growth medium (KGM, Gibco, Berlin) cultivated. The cells were single-layered at 37 ° C in a humid atmosphere containing 5% cultivated CO₂. Was used for stimulation first the growth medium replaced and human Interferon-γ added to the expression of ICAM-1 stimulate. To inhibit the secretion of sICAM-1 became protease inhibitors after an incubation period added with interferon-γ.

Für die Versuche wurden chemisch synthetisierte Peptide, die in Wasser auf eine Konzentration von 1 mM verdünnt wurden, zugegeben. Chemically synthesized peptides were used for the experiments were diluted in water to a concentration of 1 mM, admitted.

Example 2 Determination of sICAM-1 using ELISA

Vor der Stimulierung wurden die Zellen in 25 mm Zellkulturplatten (Falcon, Lincoln Park, NJ, USA) mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/Platte ausgesät. Zum Zeitpunkt 0 wurde das Medium ersetzt durch 1,0 ml Medium mit der oder ohne die angegebenen Konzentration von rh IFN-γ (recombinant human interferon-γ) (Genzyme, Boston) und Proteaseinhibitoren. Nach einer Inkubationsperiode von 24 Stunden wurden die Überstände geerntet, für fünf Minuten bei 10.000 × g zentrifugiert, um verbleibende Zellpartikel zu entfernen und bis zur Messung bei -20°C gelagert. Die Menge der sICAM-1-Moleküle innerhalb der zellfreien Überstände wurde bestimmt, indem ein kommerziell erhältliches, hochsensitives (Nachweisgrenze für sICAM-1 : 0,5 ng/ml) Two- Side Capture sICAM-1 ELISA-System verwendet wurde. Die bei diesem sICAM-1 ELISA verwendeten anti-sICAM-1-monoklonalen Antikörper erkennen spezifisch den extrazellulären Bereich.Before stimulation, the cells were placed in 25 mm Cell culture plates (Falcon, Lincoln Park, NJ, USA) with one Seed density of 2.5 × 10⁵ cells / plate. At time 0 the medium was replaced by 1.0 ml medium with the or without the specified concentration of rh IFN-γ (recombinant human interferon-γ) (Genzyme, Boston) and Protease inhibitors. After an incubation period of 24 The supernatants were harvested for hours, at five minutes Centrifuged 10,000 × g to remove remaining cell particles Remove and store at -20 ° C until measurement. The amount of the sICAM-1 molecules within the cell-free supernatants was determined by using a commercially available highly sensitive (detection limit for sICAM-1: 0.5 ng / ml) Side capture sICAM-1 ELISA system was used. The at anti-sICAM-1 monoclonal used in this sICAM-1 ELISA Antibodies specifically recognize the extracellular area.

Die sICAM-1 ELISAs wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Löchern gemäß den Instruktionen des Herstellers (Bender MedSystems, Wien) durchgeführt, wobei jeweils 100 µl unverdünnter Überstand pro Probe verwendet wurde. Die Platten wurden auf einem Titertec Multiscan MCC bei 450 nm ausgewertet. Die Konzentrationen an sICAM-1 wurden mit einer Eichkurve berechnet, die mit Standardverdünnungen von sICAM- 1-Konzentrationen von 0 bis 10 ng/ml erstellt wurde.The sICAM-1 ELISAs were in microtiter plates with 96 Holes according to the manufacturer's instructions (Bender MedSystems, Vienna), whereby 100 µl each undiluted supernatant was used per sample. The Plates were made on a Titertec Multiscan MCC at 450 nm evaluated. The concentrations of sICAM-1 were compared with a Calibration curve calculated using standard dilutions of sICAM 1 concentrations of 0 to 10 ng / ml was created.

Example 3 Analysis of ICAM-1 expression by SDS gel electrophoresis and western blot

Für die Western blot-Analyse wurden die Zellen in 10 cm Petrischalen kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und bei 10.000 × g 10 Minuten zentrifugiert, um irgendwelche Zellpartikel zu entfernen. Dann wurden die Überstände 25- fach mit Hilfe eines Centricon-30-Konzentrierers (Amicon, USA) konzentriert.For Western blot analysis, the cells were 10 cm Cultivated petri dishes. The supernatants were collected and Centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes to remove any Remove cell particles. Then the supernatants were 25- with the help of a Centricon 30 concentrator (Amicon, USA) concentrated.

Um Lysate von den Zellen herzustellen, wurden die Zellen dreimal mit kaltem PBS-Puffer gewaschen, von den Kulturgefäßen abgekratzt und in 1,0 ml kaltem Lysepuffer resuspendiert. Der Lysepuffer enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 2 mM EGTA; 1% Triton; 1 µg/ml Aprotinin; 0,5 mM PMSF; 20 mM Jodacetamid; 10 mM Benzamidin und 50 mM ε-Aminocapronsäure. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für zweimal 10 Minuten bei 4°C entfernt. Der Proteingehalt einer jeden Probe wurde mit der Methode von Bradford bestimmt. SDS-Gelelektrophorese wurde nach der Methode von Laemmli (Laemmli, Nature [1970], 227, 680) durchgeführt. Hierzu wurden 10 µg Protein in Beladungspuffer (80 mM Tri-HCl pH 6,8; 10% Glycerin; 2% SDS und 0,02% Bromphenolblau) suspendiert und anschließend bei 95°C für fünf Minuten erhitzt. Die Elektrophorese wurde auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel unter nichtreduzierenden Bedingungen durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die der Größe nach aufgetrennten Proteine auf eine Polyvinylidendifluoridmembran in einem Transferpuffer (25 mM Tris; 150 mM Glycin und 10% Methanol) elektrotransferiert (Towbin et al. PNAS [1979] Vol. 76, S. 4350).To make lysates from the cells, the cells were washed three times with cold PBS buffer, of which Culture vessels scraped off and in 1.0 ml of cold lysis buffer resuspended. The lysis buffer contained 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl; 2mM EDTA; 2mM EGTA; 1% triton; 1 µg / ml Aprotinin; 0.5 mM PMSF; 20 mM iodoacetamide; 10 mM benzamidine and 50 mM ε-aminocaproic acid. The insoluble material was by centrifugation at 10,000 x g for two 10 minutes removed at 4 ° C. The protein content of each sample was determined using the Bradford method. SDS gel electrophoresis was carried out according to the method of Laemmli (Laemmli, Nature [1970], 227, 680). For this purpose, 10 µg protein in Loading buffer (80 mM Tri-HCl pH 6.8; 10% glycerin; 2% SDS and 0.02% bromophenol blue) suspended and then heated at 95 ° C for five minutes. The electrophoresis was on an 8% SDS polyacrylamide gel with non-reducing Conditions carried out. After electrophoresis, the proteins separated according to size Polyvinylidene difluoride membrane in a transfer buffer (25 mM Tris; 150 mM glycine and 10% methanol) (Towbin et al. PNAS [1979] Vol. 76, p. 4350).

Die Western blot-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung des ECL-Western blot-Analysesystems von Amersham. Nach der Übertragung wurden bei der Membran unspezifische Bindungen in einer Lösung von 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 0,05% Tween-20 und 5% entfettete Trockenmilch für 60 Minuten blockiert. Die Membran mit den aufgetrennten Proteinen wurde dann für 60 Minuten bei Raumtemperatur mit dem ersten monoklonalen Antikörper (Klon 15.2, Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1 : 500 in der Blockierungslösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran viermal für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,05% Tween-20 gewaschen und dann für 60 Minuten mit einer 1 : 300 Lösung eines zweiten Antikörpers (Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Anti-Maus IgG-Antikörper [Schaf, Amersham]) in Blockierungslösung inkubiert, viermal wie oben beschrieben gewaschen und nach den Angaben des Herstellers der Farbentwicklungsreaktion unterzogen.Western blot analysis was performed using the Amersham ECL Western blot analysis system. After Transmission was unspecific binding in the membrane in a solution of 0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5); 0.05% Tween-20 and 5% defatted dry milk for Blocked for 60 minutes. The membrane with the separated Proteins were then mixed for 60 minutes at room temperature the first monoclonal antibody (clone 15.2, Boehringer Mannheim) in a dilution of 1: 500 in the Blocking solution incubated. Then the membrane four times for 10 minutes at room temperature in 150 mM NaCl, Washed 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 0.05% Tween-20 and then for 60 minutes with a 1: 300 solution of a second Antibody (horseradish-peroxidase-conjugated anti-mouse IgG antibody [sheep, Amersham]) in blocking solution incubated, washed four times as described above and after the manufacturer of the color development reaction subjected.

Example 4 Immunofluorescence flow cytometry

Die gesammelten und gewaschenen Zellen wurden mit einer 1 : 40 Verdünnung des monoklonalen Antikörpers 84H10 (Dianova) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Dann wurden die Zellen dreimal in PBS-Puffer, der 0,05% Natriumazid enthielt, resuspendiert und mit einer 1 : 20 Verdünnung eines Ziegen- Anti-Maus-Antikörpers (FITC-Fab₂) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen dreimal gewaschen und unmittelbar anschließend mit einem FACScan-Gerät (Becton Dickinson, USA) analysiert. Vor der Analyse wurden die Zellen routinemäßig mit Propidiumiodid angefärbt, um tote Zellen auszuschließen. Üblicherweise wurden 5.000 Zellen pro Probe überprüft. In der graphischen Darstellung ist die Fluoreszenzintensität gegenüber der Zellzahl angegeben.The collected and washed cells were run at 1:40 Dilution of 84H10 monoclonal antibody (Dianova) for Incubated for 30 minutes at 4 ° C. Then the cells were three times in PBS buffer containing 0.05% sodium azide resuspended and with a 1:20 dilution of a goat Anti-mouse antibody (FITC-Fab₂) for 30 minutes at 4 ° C incubated. The cells were then washed three times and immediately afterwards with a FACScan device (Becton Dickinson, USA). Before the analysis, the Cells routinely stained with propidium iodide to kill Exclude cells. Usually 5,000 cells per Sample checked. In the graphical representation is the Fluorescence intensity given against the cell number.

Die Ergebnisse der Beispiele sind in den Figuren zusammengefaßt.The results of the examples are in the figures summarized.

Fig. 1 stellt eine schematische Darstellung der Anordnung der verschiedenen getesteten Oligopeptide innerhalb des ICAM-Moleküls dar. Obwohl verschiedene Peptide untersucht wurden (Peptide 1-6), stellte sich überraschenderweise nur das Peptid 3 als wirksam bei der Blockierung der Produktion von löslichen sICAM-Molekülen heraus. Das Peptid 3 hat die Aminosäuresequenz NVLSPRYEIVIITVVA. Das erfindungsgemäße Peptid umspannt einen membrannahen extrazellulären Anteil und einen intramembranären Anteil des membranständigen ICAM- 1 Moleküls. Fig. 1 shows a schematic representation of the arrangement of the various tested oligopeptides within the ICAM molecule. While various peptides were examined (peptides 1-6), surprisingly turned only peptide 3 as effective in blocking the production of soluble SICAM Molecules out. Peptide 3 has the amino acid sequence NVLSPRYEIVIITVVA. The peptide according to the invention spans a membrane-near extracellular portion and an intramembrane portion of the membrane-bound ICAM-1 molecule.

Fig. 2 zeigt, daß das erfindungsgemäße Peptid 3 dosisabhängig und spezifisch die Bildung von löslichem sICAM-1 hemmt. Dies ist auf der linken Hälfte der Fig. 2 dargestellt. Die Expression von membranständigen ICAM-1- Molekülen wird aber durch das erfindungsgemäße Peptid nicht gehemmt. Dies ist in der rechten Hälfte der Fig. 2 dargestellt. Die Produktion der löslichen sICAM-1-Moleküle wurde mittels des ELISA-Tests (Beispiel 2) ermittelt. Die Expression von mICAM-1 wurde mittels der FACS-Analyse (Beispiel 4) bestimmt. Fig. Shows that peptide 3 of the present invention dose-dependent and specific to the formation of soluble sICAM-1 inhibits the second This is shown on the left half of FIG. 2. The expression of membrane-bound ICAM-1 molecules is not inhibited by the peptide according to the invention. This is shown in the right half of FIG. 2. The production of the soluble sICAM-1 molecules was determined using the ELISA test (Example 2). The expression of mICAM-1 was determined by means of the FACS analysis (example 4).

Fig. 3 zeigt, daß nur das erfindungsgemäße Peptid, das in der Darstellung als Peptid 3 bezeichnet wurde, in der Lage ist, die Produktion von löslichen siCAM-1-Molekülen signifikant zu inhibieren. Die anderen Peptide zeigen keine oder nur eine äußerst geringe Inhibierung der Bildung von sICAM-1. FIG. 3 shows that only the peptide according to the invention, which has been designated as peptide 3 in the illustration, is able to significantly inhibit the production of soluble siCAM-1 molecules. The other peptides show little or no inhibition of sICAM-1 formation.

Claims

1. Peptide, characterized in that it has the amino acid sequence REVTVNVLSPRYEIVIITVVAAAVIM, which can have a deletion of up to five amino acids at one or both ends of the sequence and derivatives thereof which have at least 70% homology to the sequence NVLSPRYEIVIITVVA.

2. Peptide according to claim 1, characterized in that it has no more than 26 amino acids.

3. Peptide according to claim 1 or 2, characterized in that that the derivatives of the sequence NVLSPRYEIVIITVVA a Have at least 80% homology.

4. Peptide according to claim 3, characterized in that the Derivatives to the sequence NVLSPRYEIVIITVVA a homology of have at least 90%.

5. peptide, characterized in that it is the sequence NVLSPRYEIVIITVVA has.

6. Medicinal product, characterized in that it is at least contains a peptide according to any one of claims 1 to 5.

7. medicines for the treatment of tumor diseases, characterized in that there is at least one peptide after contains one of claims 1 to 5.

8. Medicament according to claim 7, characterized in that it is ex vivo in the treatment of tumor diseases is used.

9. Use of a peptide according to one of claims 1 to for the treatment of tumor diseases.