1. Bezeichnung der Erfindung1. Name of the invention
Verfahren zur selektiven Bekämpfung von
Listeria monocytogenes in Lebensmitteln durch
Phagolysine aus ListeriaphagenSelective control procedures
Listeria monocytogenes in food
Phagolysins from Listeriaphagen
2. Gebiet der Erfindung2. Field of the Invention
Ein bekanntes Problem der Lebensmittelhygiene ist der
Befall verschiedenster Lebensmittel mit dem humanpathogenen
Bakterium Listeria monocytogenes. Wenn immungeschwächte
Personen (Kranke oder alte Personen, schwangere Frauen)
infiziert werden, können ernsthafte Erkrankungen mit Todes
folge resultieren.A well-known problem of food hygiene is that
Infestation of various foods with the human pathogenic
Listeria monocytogenes bacterium. If immunodeficient
People (sick or elderly, pregnant women)
serious diseases can result in death
result result.
3. Stand der Technik3. State of the art
Als Gegenmaßnahme wurde vorgeschlagen, dem Lebensmittel
Lysozym aus Hühnereiklar (Zeitschrift "Applied and Environ
mental Microbiology", Jahrgang 55, 1989, Seiten 631-638) oder
von anderen Bakterien gebildete Bakteriozine (Zeitschrift
"Applied and Environmental Microbiology", Jahrgang 54, 1988,
Seiten 2349-2353) zur Bekämpfung oder Inhibition von Listerien
in Lebensmitteln zu verwenden. Alle bisher vorgeschlagenen
Verfahren sind jedoch fehlgeschlagen, weil die Zusatzstoffe
biologischer oder chemischer Natur den Nachteil aufweisen, daß
nicht nur Listeria, sondern auch viele oder sogar alle anderen
Bakterien in den behandelten Produkten geschädigt oder getötet
werden. Dies ist besonders nachteilig bei mit Starterkulturen
hergestellten Lebensmitteln wie Käse oder Dauerfleischwaren;
gerade diese sind aber besonders Listerien-gefährdet. Das im
folgenden beschriebene Verfahren weist diese Nachteile nicht
auf.As a countermeasure, it has been suggested the food
Chicken egg lysozyme (magazine "Applied and Environ
mental microbiology ", year 55, 1989, pages 631-638) or
bacteriocins produced by other bacteria (magazine
"Applied and Environmental Microbiology", year 54, 1988,
Pages 2349-2353) for the control or inhibition of Listeria
to use in food. All previously proposed
However, procedures have failed because of the additives
biological or chemical nature have the disadvantage that
not only Listeria, but also many or even everyone else
Bacteria in the treated products are damaged or killed
become. This is particularly disadvantageous when using starter cultures
manufactured foods such as cheese or permeate;
but these are particularly vulnerable to Listeria. That in
The following described method does not have these disadvantages
on.
4. Beschreibung der Erfindung4. Description of the invention
Insgesamt wurden zahlreiche Listeriaphagen beschrieben,
darunter zahlreiche eigene Isolate, insbesondere der einzige
virulente Listeriaphage A511 mit außerordentlich weitem Wirts
bereich aus meinem Labor. Listeriaphagen injizieren ihre DNA in
Listeria-Wirtszellen. Um nach Abschluß der Infektion die in
der Wirtszelle neugebildeten Listeriaphagen freizusetzen, wird
als finales Genprodukt während der Expression der späten
Phagengene ein zellwandlytisches Enzym (Phagolysin) gebildet.
Die Phagolysine von Listeriaphagen sind spezifisch aktiv gegen
Zellwände von Bakterien der Gattung Listeria, wie in ent
sprechenden Versuchen nachgewiesen wurde. Auch die externe
Zugabe gereinigter Lysozyme in geringsten Konzentrationen zu
Listeria führt zu deren Lyse und damit zum Zelltod (bakterio
zide Wirkung). Die diesen Experimenten zugrundeliegende Präpa
ration und Charakterisierung von Phagolysin aus Listeriaphagen
sowie die begonnene Charakterisierung der zugehörenden
Listeriaphagengenome wurde noch nirgendwo publiziert.In total, numerous Listeriaphagen have been described,
including numerous own isolates, especially the only one
virulent Listeriaphage A511 with extraordinarily wide host
area from my laboratory. Listeriaphagen inject their DNA into
Listeria host cells. To complete the infection after the infection
to release the newly formed Listeriaphagen to the host cell
as the final gene product during the expression of the late
Phage genes formed a cell wall lytic enzyme (phagolysin).
The Listeriaphagen phagolysins are specifically active against
Cell walls of bacteria of the genus Listeria, as in ent
speaking experiments has been demonstrated. Even the external one
Add purified lysozyme in very low concentrations
Listeria leads to their lysis and thus to cell death (bacterio
zide effect). The preparation on which these experiments are based
ration and characterization of phagolysin from Listeriaphagen
as well as the started characterization of the associated
Listeriaphagengenome has not been published anywhere.
Durch die Zugabe, Beimischung, Oberflächenbehandlung zu,
in und von Lebensmitteln sowie in Lebensmittelproduktionsan
lagen mittels der spezifisch wirksamen Phagolysine läßt sich
eine selektive Eliminierung von Listerien erreichen, ohne
andere (erwünschte) Organismen zu beeinträchtigen. Desweiteren
kann eine andere Wirkung/Aktivität der Lysine in irgendeiner
Weise ausgeschlossen werden. Damit sind Phagolysine als Lebens
mittelzusatzstoffe qualifiziert. Das Phagolysin kann in einer
standardisierten Form in die Rohstoffe gefährdeter Lebensmittel
eingebracht, vor oder während gegebener Produktionsschritte dem
Lebensmittel oder der Anlage zugesetzt, dem fertigen Endprodukt
beigemischt oder aufgetragen werden, um eine Kontamination der
abgegebenen Lebensmittel mit humanpathogenen Listerien zu
bekämpfen.By adding, adding, surface treatment to,
in and of food as well as in food production
was by means of the specifically effective phagolysins
achieve selective elimination of listeria without
to affect other (desired) organisms. Furthermore
may have another effect / activity of lysine in any
Way to be excluded. So that phagolysins are as life
qualified additives. The phagolysin can be in one
standardized form in the raw materials of endangered food
introduced before or during given production steps
Food or plant added, the finished end product
added or applied to contaminate the
dispensed food with human pathogenic listeria
fight.
5. Herstellung der Phagolysinpräparate5. Production of the phagolysin preparations
Die biochemische Isolation wurde bis zur Reinheit durch
geführt und das Phagolysin in o.a. Weise getestet. Aus mit
Listeriaphagen infizierten Listeriazellen läßt sich mit dem
getesteten Verfahren Phagolysin gewinnen. Ebenfalls kann mit
diesen Verfahren Phagolysin aus rekombinanten, das Phagolysin-
Gen enthaltenden Escherichia coli-Stämmen präpariert werden.
Dazu werden die phagolysin-codierenden Gene aus den Genomen der
Listeriaphagen isoliert und in Expressionsvektoren in dem
Bakterium Escherichia coli subkloniert. Die
Synthese von Proteinen mittels solcher Expressionvektoren kann in
hoher Ausbeute in E. coli durchgeführt werden.
The biochemical isolation was through to purity
led and the phagolysin in o.a. Way tested. Off with
Listeria cells infected with Listeria can be diagnosed with the
method tested to obtain phagolysin. You can also use
this process phagolysin from recombinant, the phagolysin
Genes containing Escherichia coli strains can be prepared.
For this purpose, the genes encoding the phagolysin from the genomes of
Listeriaphagen isolated and in expression vectors in the
Escherichia coli bacterium subcloned. The
Synthesis of proteins using such expression vectors can be found in
high yield in E. coli.
6. Gewerbliche Nutzung6. Commercial use
Produktion und Verkauf von Phagolysin-Präparaten an
Lebensmittelhersteller. Bisher gibt es keine Alternative zu
diesem Verfahren zur selektiven Bekämpfung von Listerien in
Lebensmitteln.Production and sale of phagolysin preparations
Food manufacturers. So far there is no alternative to
this procedure for selective control of Listeria in
Food.
7. Ausführungsbeispiel7th embodiment
Zur Herstellung von Weichkäsen des Typs "Rotschmiere
käse", welcher oft mit Listerien kontaminiert ist, wird
Kesselmilch zur Milchsäurebildung und Dicklegung mit
Säuerungskulturen versetzt. Durch die schon hier erfolgende
Zugabe von Phagolysinen können die schon in der Milch oder der
Starterkultur vorhandenen Listerien entfernt werden. Im
weiteren Verlauf der Käseherstellung wird wiederholt eine
Oberflächen-Rotschmierekultur auf die Käse aufgebracht, welche
mit Listerien kontaminiert sein kann. Eine gleichzeitige
Applikation der Phagolysine zu diesem Zeitpunkt unterbindet
wirkungsvoll die Entwicklung der pathogenen Organismen. Häufig
erfolgen die Kontaminationen auch durch mangelhafte Lagerungs-
und Reifungsbedingungen, wobei Listerien auf die Käse gelangen.
Das Vorhandensein von Phagolysinen auf den Käseoberflächen
würde diesen Rekontaminationen jedoch entgegenwirken. Da die
Enzyme ein sehr spezifisches, ausschließlich gegen Listerien
gerichtetes Aktivitätsspektrum aufweisen und keine Fremd
aktivitäten haben, ist die Entwicklung der gewünschten Rot
schmiereflora nicht gehindert. Die Aufnahme der Phagolysine
durch den Verzehr der Käse ist deshalb ebenfalls völlig
unbedenklich.For the production of soft cheese of the type "red smear
cheese ", which is often contaminated with listeria
Kettle milk for lactic acid formation and thickening with
Acidification cultures offset. Because of the already happening here
The addition of phagolysins can already in the milk or the
Starter culture existing listeria can be removed. in the
A further course of cheese making is repeated
Surface red smear culture applied to the cheese, which
may be contaminated with listeria. A simultaneous
Application of the phagolysins is prevented at this time
effective the development of pathogenic organisms. Frequently
the contamination is also due to poor storage
and ripening conditions, with listeria getting on the cheese.
The presence of phagolysins on the cheese surfaces
would counteract this recontamination. Since the
Enzymes a very specific, only against Listeria
have a directed activity spectrum and no foreign
have activities is the development of the desired red
smear flora not hindered. The uptake of phagolysins
by eating the cheese is therefore also complete
harmless.