DE4322342A1 - Method for the differential diagnosis of carcinoma of the prostate - Google Patents

Method for the differential diagnosis of carcinoma of the prostate

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Abstract

This invention relates to a method for detecting prostate-specific antigen (PSA) and the complex of prostate-specific antigen and alpha 1-antichymotrypsin in the serum of patients and to its use as screening method for the differential diagnosis of carcinoma of the prostate (CaP) and benign prostate hyperplasia (BPH).

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis des Pro­ stata-spezifischen Antigens (PSA) und des Komplexes aus Pro­ stata-spezifischem Antigen und α1-Antichymotrypsin im Serum von Patienten und dessen Anwendung als Screening-Verfahren zur Differentialdiagnostik des Prostata-Karzinoms (CaP) und der benignen Prostata-Hyperplasie (BPH)This invention relates to a method for detecting the pro stata-specific antigen (PSA) and the complex from Pro stata-specific antigen and α1-antichymotrypsin in serum of patients and their use as a screening method for differential diagnosis of prostate carcinoma (CaP) and benign prostatic hyperplasia (BPH)

Das Prostata-spezifische Antigen (PSA) bezeichnet eine organ­ spezifische Serin-Protease (MW von etwa 34 KD), die bei Nor­ malpersonen in den Prostata-Drüsenepithelzellen und der Sa­ menflüssigkeit detektiert werden kann. Vornehmlich bei älte­ ren Männern (< 50 Jahre) kommt es gehäuft zu Prostata-beding­ ten Erkrankungen wie Prostatitis, Hyperplasie und Ausbildung von Malignomen. In diesen Fällen besteht die Möglichkeit des Übertritts von PSA ins Blut und somit die serologische Nach­ weisbarkeit. Die Halbwertszeit von PSA im Serum schwankt in­ dividuell, beträgt aber in der Regel einige Tage. PSA wird durch Serum-Inhibitoren biologisch neutralisiert, kann aber mit geeigneten, immunologischen Reagenzien weiter nachgewie­ sen werden.The prostate-specific antigen (PSA) denotes an organ specific serine protease (MW of approximately 34 KD), which is described in Nor painting persons in the prostate gland epithelial cells and the Sa menic fluid can be detected. Mainly in the cold Men (<50 years) often have prostate-related conditions diseases such as prostatitis, hyperplasia and training of malignancies. In these cases there is the possibility of Transfer of PSA into the blood and thus the serological aftermath detectability. The serum half-life of PSA varies in individual, but is usually a few days. PSA will biologically neutralized by serum inhibitors, but can with suitable, immunological reagents will be.

Die höchste Affinität zum PSA zeigt der Inhibitor α1-Anti- Chymotrypsin (ACT); andere Inhibitoren, wie α1-Antitrypsin (AT) oder α2-Makroglobulin (A2M), spielen eine geringere Rolle. Diese Inhibitoren zählen zu den Akut-Phase-Proteinen, die verstärkt im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen im Serum vorkommen. The inhibitor α1-anti- Chymotrypsin (ACT); other inhibitors, such as α1-antitrypsin (AT) or α2-macroglobulin (A2M), play a lower Role. These inhibitors are among the acute phase proteins, which intensifies in connection with inflammatory processes in the Serum.  

Das Auftreten von PSA im Serum geht mit einem akuten Entzün­ dungsprozeß einher. Dies gilt insbesondere bei der Entwick­ lung des Prostata-Karzinoms und dem Entstehen von Metastasen; vgl. Stenman et al., Cancer Research 51(1991), 222-226. Daher können im Vergleich zu benignen Hyperplasien signifikant hö­ here Anteile von PSA/ACT-Komplexen immunologisch nachgewiesen werden.The appearance of PSA in the serum is accompanied by acute inflammation development process. This applies particularly to developers prostate carcinoma and metastasis; see. Stenman et al., Cancer Research 51: 222-226 (1991). Therefore can significantly higher than benign hyperplasias Proportions of PSA / ACT complexes immunologically detected become.

Ein immunometrisches Nachweis Verfahren von PSA Im Serum ba­ siert auf dem Einsatz von polyklonalen Antiseren. Damit ver­ bunden sind eine Vielzahl von Meßproblemen, wie nicht aus­ reichender Sensitivität, der Anfälligkeit gegenüber Serum­ störgrößen und somit einer großen Ergebnisunsicherheit.An immunometric detection method of PSA in serum ba is based on the use of polyclonal antisera. So ver A large number of measurement problems are bound up, as they are not sufficient sensitivity, susceptibility to serum disturbances and thus a great uncertainty of results.

Ein weiteres Verfahren benutzt zwei monoklonale Antikörper in der sogenannten "Sandwich"-Anwendung (US-Patent 4 376 110) ein Antikörper fungiert als Fänger und wird zu diesem Zweck chemisch an eine feste Phase gekoppelt; der zweite Antikörper ist markiert mit einem Enzym und wird in gelöster Form dem Nachweisansatz zugesetzt. Das PSA wird nun von dem Festphase- gebundenen Antikörper in der zu untersuchenden Lösung erkannt und adsorbiert. Der der Lösung zugesetzte zweite markierte Antikörper bindet an das adsorbierte PSA. Durch die Markie­ rung mit dem Enzym ist die Signalentwicklung möglich und pho­ tometrisch auswertbar. Mit diesem Verfahren wurde aufgrund experimenteller klinischer Daten ein kritischer Grenzwert ("cut-off") von 4 ng PSA/ml Serum ermittelt; oberhalb dieses "cut-off" nahm die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens eines CaP zu. Allerdings können auch 1% gesunde Probanden höhere PSA-Werte aufweisen. Zudem haben mehr als 20% BPH-Patienten PSA-Werte oberhalb von 4 ng/ml Serum.Another method uses two monoclonal antibodies in the so-called "sandwich" application (US Patent 4,376,110) an antibody acts as a catcher and is used for this purpose chemically coupled to a solid phase; the second antibody is labeled with an enzyme and is dissolved in it Detection approach added. The PSA is now bound antibody detected in the solution to be examined and adsorbed. The second one added to the solution marked Antibody binds to the adsorbed PSA. Through the marquee signal development is possible with the enzyme and pho can be evaluated geometrically. With this procedure was due experimental clinical data a critical limit ("cut-off") of 4 ng PSA / ml serum determined; above this "cut-off" took the likelihood of having one CaP too. However, 1% healthy subjects can also be higher Have PSA values. In addition, more than 20% have BPH patients PSA values above 4 ng / ml serum.

Um die Anzahl der "Falsch-Positiven"-Karzinom Patienten (d. h. BPH-Patienten) unter 5% zu drücken, müßte der "cut-off" auf 10,4 ng/ml heraufgesetzt werden. Dieses verschlechtert aller­ dings die Treffsicherheit bezüglich der Karzinomdiagnose: es werden nur noch 67% der Patienten mit Karzinomen richtig ein­ gestuft.By the number of "false positives" carcinoma patients (i.e. BPH patients) below 5%, the "cut-off" would have to 10.4 ng / ml can be increased. This worsens everyone However, the accuracy of the cancer diagnosis: it  only 67% of patients with carcinomas are properly diagnosed graded.

Eine Tumordiagnostik kann aber nur dann den Therapieerfolg ermöglichen, wenn ein organbegrenztes CaP (Stadium A bis B) sicher erkannt wird. Diese Phase zeichnet sich durch zunächst niedrige PSA-Serumwerte aus, die bei progredientem Verlauf stark ansteigen können. Patienten mit einem CaP im Stadium A zeigen bei 37% der Fälle PSA-Serumwerte bis zu 4 ng/ml (dem "cut-off" der im Handel erhältlichen PSA-Nachweisverfahren). Demnach sind 29% der Stadium B-Patienten unauffällig sowie 19% im Stadium C und 12% im Stadium D (Myrtle, J.F. et al, in: Advances in Cancer Diagnostics. San Diego: Hybritech, 1986; 1-9). Diese Problematik wird noch deutlicher und ent­ sprechend bestätigt durch die Untersuchung von Babaian et al. (Cancer 67 : 2200-2206, 1991)
Das diagnostische Fenster des Überlappungsbereiches zwischen 95% der BPH-Patienten und 70-90% der CaP-Patienten im Stadium A/B liegt bei PSA-Serumwerten von 2-25 ng/ml. Sowohl CaP als auch BPH können einen klinisch unauffälligen, auch subjektiv beschwerdefreien Verlauf im Anfangsstadium haben. Damit be­ kommt das Screening nach erhöhten Serumwerten eine zusätzli­ che Bedeutung (Labrie F. et al, J. Urol. 147 : 846-852, 1992; Stamey T.A., J. Urol. 147 : 830-832, 1992). Zur Verbesserung der Diagnosesicherheit in diesen Niedrig-PSA-Konzentrations­ bereichen wurden einige differentialdiagnostische Erweiterun­ gen vorgeschlagen. Da Prostata-Symptome erst mit dem 6. Lebensjahrzehnt signifikant auftreten, erscheint eine Indi­ zierung des PSA-Serumgehalts über das Alter des Patienten sinnvoll. Zudem ergibt sich eine Korrelation zwischen Pro­ stata-Größe und dem möglichen Konzentrationsbereich an Serum- PSA (Benson M.C. et al, J. Urol. 147 : 817-821, 1992). Meßme­ thodisch findet hier die "Digitale rektale Untersuchung (DRE)" (Brawer M.K. et al, J. Urol. 147 : 841-845, 1992) und "Transrektale Ultrasonographie (TRUS)" Anwendung (Babalan R.J. et al, J. Urol. 147 : 837-840, 1992). Zur Absicherung der serologischen Befundung wird eine Immunhistologische Gewebs­ untersuchung vorgenommen.However, tumor diagnosis can only make therapy successful if an organ-limited CaP (stage A to B) is reliably detected. This phase is characterized by initially low PSA serum values, which can increase sharply with a progressive course. Patients with a CaP in stage A show PSA serum values up to 4 ng / ml in 37% of the cases (the "cut-off" of the commercially available PSA detection methods). Accordingly, 29% of stage B patients are normal, 19% in stage C and 12% in stage D (Myrtle, JF et al, in: Advances in Cancer Diagnostics. San Diego: Hybritech, 1986; 1-9). This problem is confirmed even more clearly and accordingly by the study by Babaian et al. (Cancer 67: 2200-2206, 1991)
The diagnostic window of the overlap area between 95% of BPH patients and 70-90% of CaP patients in stage A / B is PSA serum values of 2-25 ng / ml. Both CaP and BPH can have a clinically normal, subjectively symptom-free course in the early stages. Screening for increased serum values is thus of additional importance (Labrie F. et al, J. Urol. 147: 846-852, 1992; Stamey TA, J. Urol. 147: 830-832, 1992). In order to improve the diagnostic certainty in these low PSA concentration ranges, some differential diagnostic extensions have been proposed. Since prostate symptoms only appear significantly after the 6th decade of life, indexing the PSA serum content over the age of the patient seems reasonable. There is also a correlation between prostate size and the possible concentration range of serum PSA (Benson MC et al, J. Urol. 147: 817-821, 1992). The "digital rectal examination (DRE)" (Brawer MK et al, J. Urol. 147: 841-845, 1992) and "transrectal ultrasonography (TRUS)" (Babalan RJ et al, J. Urol. 147: 837-840, 1992). An immunohistological tissue examination is carried out to confirm the serological findings.

Wie vorstehend aufgeführt, zählt ACT zu der Gruppe der soge­ nannten Akut-Phase-Proteinen, die u. a. durch die Leber gebil­ det werden, wenn eine akute Entzündung vorliegt. Die Verhält­ nisse im Serum einer Normalperson sind in der Regel geprägt durch ein "inhibitorisches Übergewicht". Im Falle der Entzün­ dung wird der Spiegel an Inhibitoren deutlich angehoben und fällt nur allmählich auf das ursprüngliche Niveau zurück. Hierbei verhalten die einzelnen Inhibitoren sich unterschied­ lich.As mentioned above, ACT belongs to the group of so-called called acute phase proteins, which u. a. born through the liver be detected if there is acute inflammation. The ratio nisse in the serum of a normal person are usually characterized by an "inhibitory overweight". In the case of inflammation the level of inhibitors is significantly increased and only gradually falls back to the original level. The individual inhibitors behave differently Lich.

Der Entzündungsverlauf bei benignen Hyperplasien und der Ent­ wicklung von Karzinomen der Prostata oder bei der Ausbildung von CaP-Metastasen ist in Intensität und Auswirkung auf das den Tumor umgebende Gewebe verschieden. Während die meisten benignen Wucherungen mit niedrigen Zellteilungsraten im Rah­ men der histologischen Strukturen eher langsam auswachsen, kann die Proliferationsrate der malignen Tumorzellen des Kar­ zinoms sprungartig ansteigen. Eine schnelle, histologisch un­ geordnete Zellvermehrung führt zu entsprechenden aggressiven Verdrängungsreaktionen auf das umliegende Normalgewebe. Die­ ses wird durch die Wucherung geschädigt und es entstehen lokale Entzündungsherde.The course of inflammation in benign hyperplasia and the Ent development of carcinomas of the prostate or during training of CaP metastases is in intensity and impact on that tissues surrounding the tumor differ. While most denominate growths with low cell division rates in the frame the histological structures tend to grow slowly, the proliferation rate of the malignant tumor cells of the Kar zinoms rise suddenly. A quick, histologically un orderly cell proliferation leads to corresponding aggressive Displacement reactions to the surrounding normal tissue. The It is damaged by the growth and it arises local focus of inflammation.

Im Rahmen dieser entzündlichen Prozesse gelangt PSA aus dem eigentlich abgeschlossenen Organ- und Drüsenbereich in den Blutkreislauf. Die aufgrund der Entzündung entstehenden Mediatoren initiieren eine Signalkette, die zur Anhebung des Spiegels an Akut-Phase-Proteinen führt, zu denen, wie vorste­ hend aufgeführt, auch das ACT zählt.As part of these inflammatory processes, PPE comes from the actually closed organ and glandular area in the Blood flow. The resulting from the inflammation Mediators initiate a signal chain that is used to raise the The level of acute phase proteins leads to those as before listed, the ACT also counts.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß erhebliche Kor­ relationsprobleme zwischen nach im Stand der Technik bekann­ ten Verfahren erhaltenen PSA-Meßwerten und der Diagnosesi­ cherheit bei der Abgrenzung des Prostata-Karzinoms gegenüber der BPH bestehen.In summary, it can be stated that considerable Cor relations problems between according to the state of the art th method obtained PSA measured values and the Diagnosesi  certainty in the differentiation of prostate carcinoma the BPH exist.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbes­ sertes Verfahren zum Nachweis von PSA und PSA/ACT-Komplex im Serum von Patienten bereitzustellen, um eine frühzeitige Dia­ gnose des Prostata-Karzinoms und der benignen Hyperplasie mit hoher Treffsicherheit zu ermöglichen.Thus, the invention has for its object a verbes special method for the detection of PSA and PSA / ACT complex in Provide serum from patients for early dia diagnosis of prostate carcinoma and benign hyperplasia to enable high accuracy.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Bereitstellung eines immunologischen Verfahrens zum Nachweis von PSA und PSA/ACT- Komplex im Serum von Patienten gelöst, das sowohl quantita­ tive als auch qualitative Meßwerte in bezug auf die Korrela­ tion von PSA-Serumwerten und der Befundung von malignen Ge­ webswucherungen erlaubt.This object is achieved by providing a immunological method for the detection of PSA and PSA / ACT- Complex dissolved in the serum of patients, both quantita tive as well as qualitative measured values in relation to the correla tion of PSA serum values and the diagnosis of malignant Ge web growth allowed.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die nachfolgenden Schritte:An embodiment of the method according to the invention comprises the following steps:

  • (1) Bindung von im Serum enthaltenem PSA und PSA/ACT-Kom­ plex an mindestens einen für PSA- und PSA/ACT-Komplex­ spezifischen immobilisierten Antikörper (AK) unter Bil­ dung eines AK/PSA-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT- Komplexes,(1) Binding of PSA and PSA / ACT Com Contained in Serum plex to at least one for PSA and PSA / ACT complex specific immobilized antibody (AK) under Bil formation of an AK / PSA complex and / or an AK / PSA / ACT Complex,
  • (2) Bindung eines markierten PSA-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK) an den AK/PSA-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/mAK-Kom­ plexes und/oder eines AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes,(2) Binding of a labeled PSA-specific monoclonal Antibody (MAK) to the AK / PSA complex and / or to the AK / PSA / ACT complex to form an AK / PSA / mAK com plexes and / or an AK / PSA / ACT / mAK complex,
  • (3) Detektion des AK/PSA/mAK-Komplexes und/oder des AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes über die Markierung des PSA- spezifischen monoklonalen Antikörpers,(3) Detection of the AK / PSA / mAK complex and / or the AK / PSA / ACT / mAK complex via the labeling of the PSA specific monoclonal antibody,
  • (4) Bindung eines markierten ACT-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK′) an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bil­ dung eines AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes, und(4) Binding of a labeled ACT-specific monoclonal Antibody (mAK ′) to the AK / PSA / ACT complex under Bil formation of an AK / PSA / ACT / mAK ′ complex, and
  • (5) Detektion des AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes über die Markierung des ACT-spezifischen monoklonalen Antikör­ pers.(5) Detection of the AK / PSA / ACT / mAK ′ complex via the Labeling of the ACT-specific monoclonal antibody pers.

In dieser Ausführungsform können die Markierungen der Anti­ körper gleich oder unterschiedlich sein.In this embodiment, the markings of the anti body be the same or different.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt die nachfolgenden Schritte:Another embodiment of the method according to the invention includes the following steps:

  • (1) Bindung von im Serum enthaltenem PSA und PSA/ACT-Kom­ plex an mindestens einen für PSA- und PSA/ACT-Komplex­ spezifischen immobilisierten Antikörper (AK) unter Bil­ dung eines AK/PSA-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT- Komplexes,(1) Binding of PSA and PSA / ACT Com Contained in Serum plex to at least one for PSA and PSA / ACT complex specific immobilized antibody (AK) under Bil formation of an AK / PSA complex and / or an AK / PSA / ACT Complex,
  • (2) Bindung eines markierten PSA-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK) an den AK/PSA-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/mAK-Kom­ plexes und/oder eines AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes,(2) Binding of a labeled PSA-specific monoclonal Antibody (MAK) to the AK / PSA complex and / or to the AK / PSA / ACT complex to form an AK / PSA / mAK com plexes and / or an AK / PSA / ACT / mAK complex,
  • (3) Bindung eines markierten ACT-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK′) an den AK/PSA/ACT-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT/mAK-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT/ mAK/mAK′-Komplexes, und(3) Binding of a labeled ACT-specific monoclonal Antibody (mAK ′) to the AK / PSA / ACT complex and / or to the AK / PSA / ACT / mAK complex to form a AK / PSA / ACT / mAK′-complex and / or an AK / PSA / ACT / mAK / mAK′-complex, and
  • (4) Detektion der AK/PSA/mAK-, AK/PSA/ACT/mAK-, AK/PSA/ ACT/mAK′- und/oder AK/PSA/ACT/mAK/mAK′-Komplexe über die Markierungen der monoklonalen Antikörper.(4) Detection of AK / PSA / mAK, AK / PSA / ACT / mAK, AK / PSA / ACT / mAK′- and / or AK / PSA / ACT / mAK / mAK′-complexes the labels of the monoclonal antibodies.

Die Schritte (2) und (3) dieser Ausführungsform können gleichzeitig oder sequentiell ausgeführt werden, wobei die Markierung bei gleichzeitiger Detektion in Schritt (4) unter­ schiedlich sind und bei sequentieller Detektion in Schritt (4) gleich oder unterschiedlich sind.Steps (2) and (3) of this embodiment can run simultaneously or sequentially, with the Marking with simultaneous detection in step (4) below are different and with sequential detection in step (4) are the same or different.

Der Begriff "im Serum von Patienten" bedeutet die bevorzugte Probennahme für eine PSA-Konzentrationsermittlung. Andere Körperflüssigkeiten wie Blutplasma, Urin und Spermien-Ejaku­ late könnten auch zu Untersuchungen herangezogen werden. The term "in patient serum" means the preferred one Sampling for a PSA concentration determination. Other Body fluids such as blood plasma, urine and sperm ejacu late could also be used for investigations.  

Der Begriff "immobilisierte Antikörper" bedeutet, daß der An­ tikörper an eine feste Phase gekoppelt wird. Feste Phasen können sein: Polystyrole, Polyamine und andere im Stand der Technik bekannte Trägermatrizes, die für ELISA geeignet sind; Agarose- und andere im Stand der Technik bekannte Poly­ saccharid-Partikel; Glas und Folien mit chemisch aktivierba­ ren Gruppen. Abhängig vom Trägermaterial kann die Immobili­ sierung der Antikörper an die feste Phase chemisch-kovalent, physikalisch-chemisch-adsorbtiv, über spezielle radikalische oder Redox-Vorgänge, indirekt immunologisch oder über Avidin- Biotin-Vermittlung erfolgen. Dabei kann der Antikörper mono- oder polyklonal sein. Vorzugsweise wird ein monoklonaler An­ tikörper verwendet.The term "immobilized antibodies" means that the An antibody is coupled to a fixed phase. Fixed phases can be: polystyrenes, polyamines and others in the state of the art Technically known carrier matrices that are suitable for ELISA are; Agarose and other poly known in the art saccharide particles; Glass and foils with chemically activatable groups. Depending on the carrier material, the Immobili the antibodies are chemically-covalently attached to the solid phase, physico-chemical-adsorbent, via special radicals or redox processes, indirectly immunologically or via avidin Biotin mediation take place. The antibody can or be polyclonal. A monoclonal type is preferred antibody used.

Der Begriff "Markierung" oder "markierter Antikörper" bedeu­ tet, daß der Antikörper mit einem nachweisfähigen Molekül chemisch verknüpft wird. Als nachweisfähige Moleküle können dienen: Enzyme wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, Galak­ tosidase, Glukosidase und einer nachgeschalteten Signalent­ wicklung mit dem Enzym-spezifischen Substrat ("enzymatisches System"); Photonen-abhängige oder sensitive Moleküle wie Fluoreszenz- oder Lumineszenz-vermittelnde Substanzen, wie beispielsweise Fluoreszein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3 oder Cy5, Luminol und deren Analoge ("Fluoreszenz- und Lumines­ zenzsystem"); Moleküle, die die Möglichkeit der kaskadenarti­ gen Verstärkung bieten wie im Biotin/Avidin (Streptavidin) - System, im Digitoxin/Antidigitoxin-System, im Peroxi­ dase/Antiperoxidase-System und im alkalische Phospha­ tase/Antialkalische Phosphatase-System ("System für kaska­ denartige Signalverstärkung") interne und externe Markierun­ gen mit Radioisotopen wie ¹³¹Jod oder ¹⁴C.The term "label" or "labeled antibody" means tet that the antibody with a detectable molecule is chemically linked. As detectable molecules can serve: enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, galac tosidase, glucosidase and a downstream signal ent development with the enzyme-specific substrate ("enzymatic System "); photon-dependent or sensitive molecules such as Fluorescence or luminescence mediating substances, such as for example fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3 or Cy5, luminol and their analogues ("Fluorescence and Lumines zenzsystem "); Molecules that have the possibility of cascading offer reinforcement as in biotin / avidin (streptavidin) - System, in the digitoxin / antidigitoxin system, in the peroxi dase / antiperoxidase system and in alkaline phospha tase / anti-alkaline phosphatase system ("system for kaska such signal amplification ") internal and external marking gene with radioisotopes such as ¹³¹ iodine or ¹⁴C.

Der Begriff "spezifischer Antikörper" bedeutet, daß die Affi­ nitätskonstante der Antigen-Antikörper-Reaktion vorzugsweise oberhalb von 10⁷/mol liegt. The term "specific antibody" means that the Affi nity constant of the antigen-antibody reaction is preferred is above 10⁷ / mol.  

Das allgemeine Prinzip der Festphasen-Immunometrie besteht darin, mit Hilfe geeigneter markierter Antikörper die Mengen an antigenen Analyten zu detektieren, die durch den immobili­ sierten Antikörper adsorbiert worden sind.The general principle of solid phase immunometry is therein, using suitable labeled antibodies, the amounts to detect antigenic analytes by the immobili based antibodies have been adsorbed.

In der Regel wird das Verfahren an einer mitgeführten Stan­ dardreihe mit bekannten Mengen an Analyten relativiert. Somit sind Proben mit unbekannten Konzentrationen zu vermessen. Die Arbeit mit monoklonalen Antikörpern sowohl als Fänger als auch als Detektor ermöglicht die äquimolare Zuordnung eines jeden Individuellen Antikörpermoleküls zu einem Molekül des antigenen Analyten. Zudem entgeht man weitestgehend der Ge­ fahr durch Kreuzreaktionen mit Strukturanalogen zu falsch­ positiven Ergebnissen zu kommen, die bei der Anwendung von polyklonalen Antiseren verstärkt zu befürchten sind.As a rule, the procedure is carried out on a Stan dard series relativized with known amounts of analytes. Consequently samples with unknown concentrations have to be measured. The Work with monoclonal antibodies both as a catcher and the equimolar assignment of a each individual antibody molecule to a molecule of the antigenic analyte. In addition, one largely escapes the Ge drive too wrong due to cross-reactions with structural analogues to get positive results when using polyclonal antisera are to be feared.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin­ dung werden drei monoklonale Antikörper verwendet, die es er­ möglichen, die absolute Menge an PSA festzustellen, und die Aussage zu treffen, welcher Anteil an PSA mit dem Inhibitor ACT komplexartig vorliegt.In a preferred embodiment of the present invention three monoclonal antibodies are used possible to determine the absolute amount of PSA, and the Make a statement about what proportion of PSA with the inhibitor ACT is complex.

Hierzu wird in jedem Fall die gleiche Standardkurve verwen­ det. Der erste monoklonale Antikörper erkennt das PSA sowohl in der freien als auch mit ACT komplexartig-veränderten Form. Er adsorbiert als immobilisierter Fänger alle für die analy­ tische Fragestellung relevanten PSA-Moleküle aus einer vor­ liegenden Probe. Die Gesamtmenge an gebundenem PSA wird mit dem zweiten monoklonalen Antikörper, der mit einer Markierung versehen ist, nachgewiesen und gemäß der Markierung quantifi­ ziert. Die gebundenen Moleküle eines Ansatzes werden an­ schließend ausgewertet.The same standard curve is always used for this det. The first monoclonal antibody recognizes both the PSA in the free as well as complex-modified form with ACT. As an immobilized catcher, it adsorbs all for analysis relevant question from a PSA molecule lying sample. The total amount of PSA bound is included the second monoclonal antibody with a label is provided, proven and quantifi graces. The bound molecules of an approach are on finally evaluated.

Die Ermittlung, welcher Anteil des gebundenen PSA mit dem Akut-Phase-Protein ACT Komplexe eingegangen ist, wird mit dem dritten monoklonalen Antikörper durchgeführt, der ebenfalls mit einer Markierung versehen ist. Dieser zeigt eine hohe ACT-spezifische Immunreaktivität und weist keine Kreuzreak­ tion mit PSA auf.The determination of the proportion of the bound PPE with the Acute-phase ACT complexes are dealt with using the third monoclonal antibody carried out also is provided with a marking. This shows a high  ACT-specific immunoreactivity and has no cross-crack tion with PSA.

Falls ACT in einer relevanten Probe vorkommt, kann es erfin­ dungsgemäß nur erfaßt werden, wenn es komplexartig mit PSA verbunden ist, das über den immobilisierten PSA-spezifischen Fängerantikörper an der festen Phase adsorbiert wurde. Somit können mit der gleichen Immun-adsorbierenden Phase die ge­ samten PSA-Moleküle, als auch die vorhandenen ACT-Moleküle ausgewertet werden. Die Relativierung erfolgt gemäß der Mar­ kierung über die gleiche Standardkurve. Diese Auswertung zeigt, wieviele Moleküle - solitär oder komplexartig vorlie­ gend - vom Fängerantikörper in der Probe festgehalten worden sind.If ACT occurs in a relevant sample, it can be invented According to the invention can only be recorded if it is complex with PSA is connected via the immobilized PSA-specific Catcher antibody was adsorbed on the solid phase. Consequently can with the same immune adsorbing phase the ge entire PSA molecules, as well as the existing ACT molecules be evaluated. The relativization takes place according to the Mar over the same standard curve. This evaluation shows how many molecules - solitary or complex gend - was captured by the capture antibody in the sample are.

Die zu untersuchenden Proben werden vorzugsweise in getrenn­ ten Reaktionsgefäßen für die jeweiligen Nachweisantikörper (anti-PSA und anti-ACT) zur Adsorption an dem immobilisierten Fängerantikörper überführt.The samples to be examined are preferably separated reaction vessels for the respective detection antibodies (anti-PSA and anti-ACT) for adsorption on the immobilized Captive antibody transferred.

Sind die Nachweisantikörper unterschiedlich markiert, können die zu untersuchenden Proben auch in einem Reaktionsgefäß zum Ansatz kommen. Aufgrund unterschiedlicher Markierung ist die Auftrennung der verschiedenen Signale und damit eine ge­ trennte Quantifizierung der Mengen an PSA und ACT möglich.If the detection antibodies are marked differently, you can the samples to be examined also in a reaction vessel Approach come. Due to different marking, the Separation of the various signals and thus a ge separate quantification of the amounts of PSA and ACT possible.

Der Meßwert für das Gesamt-PSA und der Meßwert für die vor­ handene Menge ACT wird zueinander in Beziehung gestellt. Der Anteil an ACT zu PSA kann maximal in einem Verhältnis von 1 : 1 vorliegen. In diesen Fällen ergibt sich eine gleich große Signalstärke über den ACT-Nachweisantikörper wie über den PSA-Nachweisantikörper. Bei einer geringeren Signalstärke des ACT-Nachweises gegenüber dem PSA-Nachweis liegt das PSA nur zum Teil mit ACT komplexiert vor. Das Verhältnis ergibt sich direkt über die Relativierung an der Standardkurve, wobei die Menge an PSA, die über den anti-PSA-Nachweisantikörper ermit­ telt wird, als 100%-Wert definiert wird. Die Menge an PSA, die indirekt über den Nachweis von ACT dargestellt wird, zeigt die Teilmenge des Gesamt-PSA an, die komplexiert vor­ liegt.The measured value for the total PSA and the measured value for the front existing ACT is related to each other. Of the The maximum share of ACT to PSA is 1: 1 available. In these cases the result is the same Signal strength via the ACT detection antibody as via the PSA detection antibody. With a lower signal strength of the ACT proof against PSA proof is only the PSA partly complexed with ACT. The relationship results directly over the relativization on the standard curve, whereby the Amount of PSA detected by the anti-PSA detection antibody is defined as a 100% value. The amount of PPE  which is represented indirectly through the detection of ACT, shows the subset of the total PSA that complexed before lies.

Die Einführung des Verhältnisses PSA zu PSA/ACT in die Diffe­ rentialdiagnostik des Prostata-Karzinoms und der benignen Hyperplasie hat eine verbesserte Auflösung der Korrelation von PSA-Serumwerten und der Befundung von malignen Gewebswu­ cherungen zur Folge. Dies betrifft insbesondere die frühen Stadien einer möglichen Karzinomentwicklung, die durch zunächst relativ niedrige PSA-Serumwerte bei entsprechenden Patienten geprägt sind. Wenn PSA in hohem Maße mit ACT kom­ plexiert ist, dann liegt im Zusammenhang mit dem Übergang von PSA Ins Blut eine entsprechend signifikante Entzündungsreak­ tion vor. Je stärker diese Entzündung ausgeprägt ist, desto höher ist der Serumspiegel an Akut-Phase-Proteinen, insbeson­ dere an ACT. Somit korreliert ein hohes Verhältnis an PSA:ACT mit einer hohen Inzidenz von malignen Prostata-Wucherungen. Bei niedrigem Verhältnis kann eine gutartige hyperplastische Gewebsveränderung angenommen werden.The introduction of the PSA to PSA / ACT ratio in the Diffe differential diagnosis of prostate carcinoma and benign Hyperplasia has an improved correlation resolution of PSA serum values and the diagnosis of malignant tissue swu backups. This particularly affects the early ones Stages of a possible carcinogenesis caused by initially relatively low PSA serum values with corresponding Patients are shaped. If PSA to a large extent with ACT com is plexed, then is related to the transition from PSA into the blood is a correspondingly significant inflammatory craze tion before. The more severe this inflammation, the more the serum level of acute phase proteins is higher, in particular another to ACT. Thus a high ratio of PSA: ACT correlates with a high incidence of malignant prostate growth. At low ratios, a benign hyperplastic Tissue change can be accepted.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsge­ mäße Verfahren mit dem PSA- und PSA/ACT-Komplex-spezifischen monoklonalen Antikörper (PSA 5/26, DSM ACC2128; Datum der Ersthinterlegung 25.05.1993), dem PSA-spezifischen monoklona­ len Antikörper (PSA 17C2, DSM ACC2129; Datum der Ersthinter­ legung 25.05.1993) und dem ACT-spezifischen monoklonalen An­ tikörper (ACT 1/11, DSM ACC2132; Datum der Ersthinterlegung 18.06.1993) durchgeführt.In a preferred embodiment, the fiction moderate procedures with the PSA and PSA / ACT complex-specific monoclonal antibody (PSA 5/26, DSM ACC2128; date of First deposit 25.05.1993), the PSA-specific monoclonal len antibody (PSA 17C2, DSM ACC2129; date of first hind May 25, 1993) and the ACT-specific monoclonal application antibody (ACT 1/11, DSM ACC2132; date of first deposit June 18, 1993).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Kit zur Verwendung für das erfindungsgemäße Verfahren, wobei mindestens ein PSA/ACT-Komplex-spezifischer Antikörper, ein PSA-spezifischer monoklonaler Antikörper und ein ACT-spezifi­ scher monoklonaler Antikörper enthalten ist. Another object of the present application is a Kit for use in the method according to the invention, wherein at least one PSA / ACT complex specific antibody PSA-specific monoclonal antibody and an ACT-specific shear monoclonal antibody is included.  

Das erfindungsgemäße Verfahren kann die Differentialdiagnose beim Screening des Prostata-Karzinoms und der benignen Pro­ stata-Hyperplasie verbessern und insbesondere die Möglichkei­ ten der Krebsvorsorge beim CaP mitgestalten.The method according to the invention can be used for differential diagnosis screening of prostate carcinoma and benign prostate cancer Improve stata hyperplasia and especially the possibility Help shape cancer screening at the CaP.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.

Polystyrol-Platten mit 96 Vertiefungen, die mit Festphase­ gebundenem Anti-PSA-Antikörper (PSA 5/26, DSM ACC2128) beschichtet sind, wurden fünfmal mit Waschpuffer (Phosphat­ gepufferte, isotonische Kochsalzlösung (PBS) pH 7,2 mit 0,05% Tween 20) gewaschen. Danach wurden je 50 µl Serumproben (aus dem Blut von urologischen Patienten gewonnenes Serum) von neun Patienten pro Vertiefung (Doppelwertansätze) einpipet­ tiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie­ ßend wurden die Vertiefungen fünfmal mit Waschpuffer gewa­ schen, je 100 µl Nachweisantikörperlösung, die den Peroxidase­ konjugierten-PSA-Nachweisantikörper (PSA 17C2, DSM ACC2129) bzw. den Peroxidase-konjugierten-ACT-Nachweisantikörper (ACT 1/11, DSM ACC2132) jeweils in Konjugatverdünnungspuffer (PBS, 1% bovines Serumalbumin, 0,1% Thimerosal) enthält, pro Ver­ tiefung einpipettiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inku­ biert. Die Vertiefungen wurden fünfmal mit Waschpuffer gewa­ schen, je 100 µl TMB-Lösung (pro ml 1 mg 3,3′,5,5′-Tetrame­ thylbenzidin in 2% Dimethylsulfoxid, 0,05 M Na-Acetat-Puffer pH 5,0 und 0,01% H₂O₂) einpipettiert und 30 Minuten bei Raum­ temperatur inkubiert. Anschließend wurden je 50 µl 2N HCl pro Vertiefung einpipettiert und jeder Ansatz wurde photometrisch bei 450 nm (Referenz: 620 oder 750 nm) bestimmt. Als Standard wurden PSA-Lösungen (PSA-Konzentration (ng/ml) : 200, 40, 10, 5, 2,5, 1, 0) verwendet. Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengefaßt.Polystyrene plates with 96 wells, with solid phase bound anti-PSA antibody (PSA 5/26, DSM ACC2128) were coated five times with wash buffer (phosphate buffered, isotonic saline (PBS) pH 7.2 with 0.05% Tween 20) washed. Then 50 µl serum samples (from serum obtained from the blood of urological patients) pipet nine patients per well (double value approaches) and incubated for 30 minutes at room temperature. Then The wells were washed five times with washing buffer each, 100 µl detection antibody solution containing the peroxidase conjugated PSA detection antibody (PSA 17C2, DSM ACC2129) or the peroxidase-conjugated ACT detection antibody (ACT 1/11, DSM ACC2132) each in conjugate dilution buffer (PBS, 1% bovine serum albumin, 0.1% thimerosal) contains, per ver well pipetted in and incubated for 30 minutes at room temperature beer. The wells were washed five times with wash buffer , each 100 µl TMB solution (per ml 1 mg 3,3 ', 5,5'-tetrame thylbenzidine in 2% dimethyl sulfoxide, 0.05 M Na acetate buffer pH 5.0 and 0.01% H₂O₂) and 30 minutes in the room temperature incubated. Subsequently, 50 ul 2N HCl per Well pipetted in and each approach was photometric determined at 450 nm (reference: 620 or 750 nm). As standard PSA solutions (PSA concentration (ng / ml): 200, 40, 10, 5, 2.5, 1, 0) is used. The results are as follows Table summarized.

Die Reihenfolge der aufgeführten Patienten wurde nach stei­ genden PSA-Serumkonzentrationen vorgenommen.The order of the listed patients was according to stei PSA serum concentrations made.

Aus diesen Ergebnissen läßt sich erkennen, daß eine schwach erhöhte PSA-Konzentration im Serum auf ein CaP zurückzuführen ist, wie bei den Patienten Nr. 1, 3 und 4.From these results it can be seen that a weak increased serum PSA due to CaP is the same as for patients No. 1, 3 and 4.

Eine stärker erhöhte PSA-Konzentration muß nicht unbedingt mit einem CaP zusammenhängen, wie bei den Patienten 12 und 7; hier kann durch eine Verlaufskontroll-Messung in einem adäquaten Zeitabstand eine Klärung herbeigeführt werden. A higher PSA concentration is not essential related to a CaP, as in patients 12 and 7; Here you can do a follow-up measurement in one adequate clarification can be brought about.  

Der stark erhöhte Wert bei Patient Nr. 11 sollte unbedingt trotz niedrigem PSA/ACT-Verhältnis durch weitere Diagnostik abgeklärt werden.The sharply increased value in patient No. 11 should absolutely despite low PSA / ACT ratio through further diagnostics be clarified.

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis von PSA und PSA/ACT-Komplex im Serum von Patienten, umfassend die Schritte:
  • (1) Bindung von im Serum enthaltenem PSA und PSA/ACT-Kom­ plex an mindestens einen für PSA- und PSA/ACT-Komplex­ spezifischen immobilisierten Antikörper (AK) unter Bil­ dung eines AK/PSA-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT- Komplexes,
  • (2) Bindung eines markierten PSA-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK) an den AK/PSA-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/mAK-Kom­ plexes und/oder eines AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes,
  • (3) Detektion des AK/PSA/mAK-Komplexes und/oder des AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes über die Markierung des PSA- spezifischen monoklonalen Antikörpers,
  • (4) Bindung eines markierten ACT-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK′) an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bil­ dung eines AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes, und
  • (5) Detektion des AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes über die Markierung des ACT-spezifischen monoklonalen Antikör­ pers.
1. A method for the detection of PSA and PSA / ACT complex in the serum of patients, comprising the steps:
  • (1) Binding of PSA and PSA / ACT complex contained in the serum to at least one immobilized antibody (AK) specific for PSA and PSA / ACT complex to form an AK / PSA complex and / or an AK / PSA / ACT complex,
  • (2) binding of a labeled PSA-specific monoclonal antibody (mAK) to the AK / PSA complex and / or to the AK / PSA / ACT complex to form an AK / PSA / mAK complex and / or an AK / PSA / ACT / MAK complex,
  • (3) detection of the AK / PSA / mAK complex and / or the AK / PSA / ACT / mAK complex via the labeling of the PSA-specific monoclonal antibody,
  • (4) binding of a labeled ACT-specific monoclonal antibody (mAK ′) to the AK / PSA / ACT complex to form an AK / PSA / ACT / mAK ′ complex, and
  • (5) Detection of the AK / PSA / ACT / mAK ′ complex via the labeling of the ACT-specific monoclonal antibody.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierungen der monoklonalen Antikörper gleich oder unterschiedlich sind.2. The method according to claim 1, wherein the markings of the monoclonal antibodies are the same or different. 3. Verfahren zum Nachweis von PSA und PSA/ACT-Komplex im Serum von Patienten, umfassend die Schritte:
  • (1) Bindung von im Serum enthaltenem PSA und PSA/ACT-Kom­ plex an mindestens einen für PSA- und PSA/ACT-Komplex­ spezifischen immobilisierten Antikörper (AK) unter Bil­ dung eines AK/PSA-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT- Komplexes,
  • (2) Bindung eines markierten PSA-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK) an den AK/PSA-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/mAK-Kom­ plexes und/oder eines AK/PSA/ACT/mAK-Komplexes,
  • (3) Bindung eines markierten ACT-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAK′) an den AK/PSA/ACT-Komplex und/oder an den AK/PSA/ACT/mAK-Komplex unter Bildung eines AK/PSA/ACT/mAK′-Komplexes und/oder eines AK/PSA/ACT/ mAK/mAK′-Komplexes, und
  • (4) Detektion der AK/PSA/mAK-, AK/PSA/ACT/mAK-, AK/PSA/ ACT/mAK′- und/oder Ak/PSA/ACT/mAK/mAK′-Komplexe über die Markierungen der monoklonalen Antikörper.
3. A method for the detection of PSA and PSA / ACT complex in the serum of patients, comprising the steps:
  • (1) Binding of PSA and PSA / ACT complex contained in the serum to at least one immobilized antibody (AK) specific for PSA and PSA / ACT complex to form an AK / PSA complex and / or an AK / PSA / ACT complex,
  • (2) binding of a labeled PSA-specific monoclonal antibody (mAK) to the AK / PSA complex and / or to the AK / PSA / ACT complex to form an AK / PSA / mAK complex and / or an AK / PSA / ACT / MAK complex,
  • (3) Binding of a labeled ACT-specific monoclonal antibody (mAK ′) to the AK / PSA / ACT complex and / or to the AK / PSA / ACT / mAK complex to form an AK / PSA / ACT / mAK′- Complex and / or an AK / PSA / ACT / mAK / mAK′-complex, and
  • (4) Detection of the AK / PSA / mAK, AK / PSA / ACT / mAK, AK / PSA / ACT / mAK 'and / or Ak / PSA / ACT / mAK / mAK' complexes via the labels of the monoclonal Antibody.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schritte (2) und (3) gleichzeitig oder sequentiell erfolgen.4. The method of claim 3, wherein steps (2) and (3) done simultaneously or sequentially. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Markierun­ gen der monoklonalen Antikörper bei gleichzeitiger Detektion In Schritt (4) unterschiedlich sind.5. The method according to claim 3 or 4, wherein the marking gene of the monoclonal antibodies with simultaneous detection In step (4) are different. 6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Markierun­ gen der monoklonalen Antikörper bei sequentieller Detektion in Schritt (4) gleich oder unterschiedlich sind.6. The method according to claim 3 or 4, wherein the marking gene of the monoclonal antibodies in sequential detection in step (4) are the same or different. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Markierung ein enzymatisches System, ein Fluoreszenzsystem, ein Lumineszenzsystem, ein System für kaskadenartige Signal­ verstärkung oder radioaktiv ist.7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the Labeling an enzymatic system, a fluorescence system, a luminescence system, a system for cascade-like signal amplification or radioactive. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Antikörper in Schritt (1) ein monoklonaler Antikörper ist.8. The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the Antibody in step (1) is a monoclonal antibody. 9. PSA- und PSA/ACT-Komplex-spezifischer monoklonaler An­ tikörper (DSM ACC2128).9. PSA and PSA / ACT complex specific monoclonal An antibody (DSM ACC2128). 10. PSA-spezifischer monoklonaler Antikörper (DSM ACC2129).10. PSA-specific monoclonal antibody (DSM ACC2129). 11. ACT-spezifischer monoklonaler Antikörper (DSM ACC2132). 11. ACT-specific monoclonal antibody (DSM ACC2132).   12. Kit zur Verwendung für ein Verfahren nach einem der An­ sprüche 1 bis 8, enthaltend mindestens einen PSA- und PSA/ACT-Komplex-spezifischen Antikörper, einen PSA-spezifi­ schen monoklonalen Antikörper und einen ACT-spezifischen monoklonalen Antikörper.12. Kit for use in a method according to one of the An Proverbs 1 to 8, containing at least one PSA and PSA / ACT complex-specific antibody, a PSA-specific monoclonal antibody and an ACT-specific monoclonal antibodies. 13. Verwendung eines PSA- und PSA/ACT-Komplex-spezifischen Antikörpers, eines PSA-spezifischen monoklonalen Antikörpers und eines ACT-spezifischen monoklonalen Antikörpers zur Dif­ ferentialdiagnostik des Prostata-Karzinoms und der benignen Hyperplasie.13. Use of a PSA and PSA / ACT complex specific Antibody, a PSA-specific monoclonal antibody and an ACT-specific monoclonal antibody for dif differential diagnosis of prostate carcinoma and benign Hyperplasia.
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