DE4312916C2

DE4312916C2 - Medicines used to treat immune reactions

Info

Publication number: DE4312916C2
Application number: DE19934312916
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Schuh; Stefan Dr Thierfelder
Original assignee: Fresenius SE and Co KGaA
Current assignee: Fresenius SE and Co KGaA
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1993-04-14
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: AU6677894A; DE4312916A1; WO1994023747A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behand lung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen und von T-Zell-Leukä mien, welches als Wirkstoff eine Kombination aus mindestens vier monoklonalen Antikörpern unterschiedlicher Spezifität enthält, wobei zwei der Antikörper gegen unterschiedliche, nicht-über lappende Epitope des humanen Lymphozytenmarkers CD5 und die beiden anderen gegen unterschiedliche, nicht-überlappende Epitope des humanen Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind.The present invention relates to a medicament for treatment T-cell-specific immune reactions and T-cell leukemia mien, which as an active ingredient is a combination of at least four contains monoclonal antibodies of different specificity, taking two of the antibodies against different, non-over lapping epitopes of the human lymphocyte marker CD5 and the the other two against different, non-overlapping epitopes of the human lymphocyte marker CD7.

Das Arzneimittel hat sich als äußerst wirksam für die Behandlung von Leukämie, Autoimmunerkrankungen und für die Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantationen erwiesen, ohne die im Zusammenhang mit bisher im Stand der Technik bekannten Antikörperpräparaten beobachteten Neben wirkungen zu erzeugen.The drug has proven to be extremely effective for treatment of leukemia, autoimmune diseases and for the suppression of Immune reactions to organ or bone marrow transplants proven without the in connection with so far in the state of the Antibody preparations known in the art observed side effects to produce effects.

Der "Lymphozytenmarker" CD5 ist ein antigen wirksames Molekül, welches auf praktisch allen normalen peripheren T-Zellen sowie auf einer Subpopulation der normalen peripheren B-Zellen exprimiert wird, die sogenannte polyreaktive IgM-Antikörper produzieren. Der "Lymphozytenmarker" CD7 ist ein antigen wirksames Molekül, welches innerhalb der Lymphozytenpopulation auf den meisten normalen peripheren T- und NK-Zellen (Natural Killer Cells) exprimiert wird.The "lymphocyte marker" CD5 is an antigenic molecule, which is found on practically all normal peripheral T cells as well on a subpopulation of normal peripheral B cells is expressed, the so-called polyreactive IgM antibodies to produce. The "lymphocyte marker" CD7 is an antigen effective molecule which is within the lymphocyte population on most normal peripheral T and NK cells (Natural Killer Cells) is expressed.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel erfaßt somit ein breites, aber genau definiertes Spektrum von Zielzellen, wodurch eine äußerst wirksame Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarkstransplantationen erreicht wird.The medicament according to the invention thus covers a broad, but well-defined spectrum of target cells, making an extremely effective suppression of immune reactions in organ or Bone marrow transplantation is accomplished.

T-Lymphozyten (T-Zellen) entwickeln nach Kontakt mit fremden Antigenen eine zelluläre Immunantwort. Im Falle einer allogenen Organtransplantation erkennen die T-Zellen des Wirts die Zellen des Spenderorgans als fremd; der Patient entwickelt eine Wirt- gegen-Spender-Erkrankung. Im Falle einer allogenen Knochenmark transplantation erkennen die mit dem Spenderknochenmark über tragenen oder daraus nachreifenden T-Zellen den Wirt als fremd; der Patient entwickelt eine Spender-gegen-Wirt-Erkrankung (graft- versus-host-desease; GvHD). Im Falle einer Autoimmunerkrankung erkennen die T-Zellen des Patienten aufgrund einer Fehlregulation körpereigenes Gewebe als fremd.T lymphocytes (T cells) develop after contact with strangers Antigens have a cellular immune response. In the case of an allogeneic Organ transplantation, the host's T cells recognize the cells of the donor organ as foreign; the patient develops a host against donor disease. In the case of an allogeneic bone marrow transplantation to identify those with the donor bone marrow the T cells that carry or ripen therefrom make the host foreign; the patient develops a donor versus host disease (graft versus-host-desease; GvHD). In the case of an autoimmune disease recognize the patient's T cells due to improper regulation the body's own tissue as foreign.

Im ersten Schritt wird durch die als fremd erkannten Antigene eine Proliferation der T-Lymphozyten ausgelöst und die Induktion von Helfer- und zytotoxischen T-Zellen stellt die erste Stufe der T-Zell-spezifischen Immunreaktionen dar. Von T-Zellen können im weiteren Verlauf chemotaktisch wirksame, d. h. unter anderem Makrophagen anlockende, sowie mitogene Substanzen und γ-Inter feron freigesetzt werden. Als Folge der T-Zell-Antigen-Reaktion kommt es zur Ausschüttung zytotoxischer Substanzen, die das Fremdantigen enthaltende Zellen abtöten. Im Fall einer Organ transplantation wirkt sich diese Zellzerstörung makroskopisch in einer Abstoßung des Transplantats aus. Im Falle einer Knochen marktransplantation kommt es makroskopisch zu Abstoßungserschei nungen hauptsächlich am Darm, Leber und Haut. The first step is through the antigens recognized as foreign proliferation of T lymphocytes triggered and induction of helper and cytotoxic T cells represents the first stage of T-cell-specific immune reactions. Of T cells can in further course chemotactically active, d. H. amongst other things Macrophage attracting as well as mitogenic substances and γ-inter feron to be released. As a result of the T cell antigen response cytotoxic substances are released, which Kill cells containing foreign antigen. In the case of an organ transplantation, this cell destruction affects macroscopically rejection of the graft. In the case of a bone marrow transplantation, macroscopic signs of rejection occur mainly on the intestine, liver and skin.

Als eine weitere Effektorzellpopulation für die Vermittlung von Abstoßungserscheinungen - zumindest bei der GvHD - kommen nach neuestem Kenntnisstand auch NK-Zellen in Frage. Zudem könnten CD5⁺ B-Zellen an der Induktion einer humoralen Immunantwort beteiligt sein.As another effector cell population for mediating Rejection symptoms - at least at the GvHD - follow the latest state of knowledge also NK cells in question. In addition, could CD5⁺ B cells at the induction of a humoral immune response be involved.

Eine Möglichkeit, Abstoßungserscheinungen prophylaktisch oder therapeutisch zu beeinflussen, besteht in der Zerstörung bzw. Inaktivierung der Effektorzellen. Möglich ist dies durch Verwendung spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikör per. Durch die Bindung von Antikörpern an ihre Zielzellen können in vivo und in vitro zelleliminierende Mechanismen, wie zum Beispiel das Komplementsystem, angeworfen werden.One way to prevent or prevent symptoms of rejection to influence therapeutically consists in the destruction or Inactivation of the effector cells. This is possible through Use of specific polyclonal or monoclonal antibodies by. By binding antibodies to their target cells in vivo and in vitro cell-eliminating mechanisms, such as Example of the complement system.

Eine der möglichen Konsequenzen der Komplementaktivierung ist die sequentielle Zusammenfügung der sogenannten späten Komplementkom ponenten (C5, C6, C7, C8 und C9) zu einem großen Proteinkomplex, der dann die Zell-Lyse vermittelt (Müller-Eberhard, Springer Semin. Immunopathol., 7, 93 (1984)).One of the possible consequences of complement activation is that sequential assembly of the so-called late complement components (C5, C6, C7, C8 and C9) into a large protein complex, which then mediates cell lysis (Müller-Eberhard, Springer Semin. Immunopathol., 7, 93 (1984)).

Neben der lytischen Funktion trägt das Komplementsystem auch zur Initiierung zellulärer Effekte und Mechanismen bei. Bekannt sind zum Beispiel Komplement-Rezeptoren auf Makrophagen, durch die diese Effektorzellen die Zielzellen erkennen, auf denen die Komplementaktivierung stattgefunden hat (Tenner und Cooper, J. Immunol. 1981, 126, 1174). Es wurde auch eine Stimulation der Makrophagen-vermittelten, Antikörper-abhängigen Zytotoxizität beschrieben (Leu et al., J. Immunol. 1989, 143, 3250).In addition to the lytic function, the complement system also contributes Initiation of cellular effects and mechanisms. Are known for example, complement receptors on macrophages through which these effector cells recognize the target cells on which the Complement activation has taken place (Tenner and Cooper, J. Immunol. 1981, 126, 1174). There was also a stimulation of the Macrophage-mediated, antibody-dependent cytotoxicity (Leu et al., J. Immunol. 1989, 143, 3250).

Die erste Komponente der klassischen Komponentenkaskade ist C1, ein pentameres Molekül, dessen größte Untereinheit, C1q, die Bindung zwischen C1 und den Fc-Teilen von Immunglobulinen vermittelt (Cooper, Advances in Immunol. (Editor: Dixon) Academic Press, New York, 1985, 151). C1q besteht aus sechs beweglichen kollagenen Armen mit je einem globulären Bindungskopf. Die Affinitätskonstante einer monovalenten Bindung zwischen einer C1q-Bindungseinheit und einem IgG-Molekül ist jedoch so schwach, daß eine stabile Bindung von C1q an IgG-besetzte Zellen oder Immunkomplexe nur dann zustande kommt, wenn C1q mit mindestens zwei Bindungseinheiten an nebeneinander fixierten Antikörpern binden kann (Hughes-Jones, Immunology, 1978, 32, 191).The first component of the classic component cascade is C1, a pentameric molecule, its largest subunit, C1q, the Binding between C1 and the Fc parts of immunoglobulins mediates (Cooper, Advances in Immunol. (Editor: Dixon) Academic Press, New York, 1985, 151). C1q consists of six movable collagen arms each with a globular binding head. The Affinity constant of a monovalent bond between one C1q binding unit and an IgG molecule, however, is so weak that stable binding of C1q to IgG-occupied cells or Immune complexes only occur if C1q with at least two binding units on antibodies fixed next to each other can bind (Hughes-Jones, Immunology, 1978, 32, 191).

Im Stand der Technik sind folgende Parameter bekannt, die eine C1q-Bindung an IgG-besetzte Zielzellen bedingen und die C1- Aktivierung bedingen: (1) der Isotop des verwendeten Antikörpers und (2) die Expensionsdichte des Zielantigens.The following parameters are known in the prior art, one C1q binding to IgG-occupied target cells and the C1- Activation conditions: (1) the isotope of the antibody used and (2) the density of expansion of the target antigen.

Der Isotop vermittelt die Affinität von C1q an den Fc-Teil der Antikörper. Von den gut untersuchten Maus-, Ratten- und Mensch- Isotypen weisen Maus-IgG2b und Maus-IgG2a, Ratte-IgG2b und Mensch-IgG1 und Mensch-IgG3 eine hohe C1q-Affinität auf (Füst et al., Immunol. Lett. 1980, 1, 249; Schumaker et al., Biochemistry 1976, 15, 5175).The isotope conveys the affinity of C1q to the Fc part of the Antibody. Of the well-studied mouse, rat and human Isotypes have mouse IgG2b and mouse IgG2a, rat IgG2b and Human IgG1 and Human IgG3 have a high C1q affinity (Füst et al., Immunol. Lett. 1980, 1, 249; Schumaker et al., Biochemistry 1976, 15, 5175).

Die Expressionsdichte der Antigene determiniert die möglichen C1q-Bindungsstellen. Daher muß die Antigendichte auf der Zielzelle theoretisch einen gewissen Schwellenwert überschreiten, so daß der durchschnittliche Abstand zwischen zwei benachbart gebundenen Immunglobulinen innerhalb der Spannweite eines C1q- Moleküls liegt (Hughes-Jones et al., Eur. J. Immunol. 1985, 15, 976).The expression density of the antigens determines the possible C1q binding sites. Therefore, the antigen density on the Target cell theoretically exceed a certain threshold, so the average distance between two is adjacent bound immunoglobulins within the range of a C1q Molecule (Hughes-Jones et al., Eur. J. Immunol. 1985, 15, 976).

Alternativ kann ein C1q-Molekül auch an zwei unterschiedliche Antikörper binden, die gegen zwei sich nicht überlappende Epitope auf demselben Antigen gerichtet sind (sogenanntes synergistisches Antikörperpaar). Nach Hughes-Jones et al. (Eur. J. Immunol. 1984, 14, 974) stellt jedes Antigen unabhängig von der Expressions dichte eine potentielle C1q-Bindungsstelle dar, wenn geeignete Antikörperpaare vorliegen, die innerhalb der Spannweite von C1q zwei Epitope dieses Antigens binden. Alternatively, a C1q molecule can also be attached to two different ones Antibodies bind to two non-overlapping epitopes are directed to the same antigen (so-called synergistic Antibody pair). According to Hughes-Jones et al. (Eur. J. Immunol. 1984, 14, 974) each antigen is independent of expression density a potential C1q binding site if appropriate Antibody pairs exist that are within the range of C1q bind two epitopes of this antigen.

Eine gewisse Korrelation zwischen der in vitro meßbaren Bindung von C1q gegenüber einer gegebenen Antikörperpräparation und deren zelldepletorischen Potenz in vivo wurde von Kummer et al. (J. Immunol. 1987, 138, 4069) beschrieben. Es wurde bislang jedoch noch kein gesicherter Nachweis für einen direkten kausalen Zusammenhang geliefert.A certain correlation between the binding that can be measured in vitro of C1q versus a given antibody preparation and its cell depletoric potency in vivo was developed by Kummer et al. (J. Immunol. 1987, 138, 4069). So far it has been not yet verified evidence for a direct causal Context delivered.

Im Stand der Technik ist die Verwendung von Antikörperpräparaten gegen T-Zellen und andere Leukozyten zur Immunsuppression, zur Leukämietherapie und zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen bekannt.The use of antibody preparations is state of the art against T cells and other leukocytes for immunosuppression, for Leukemia therapy and for the treatment of autoimmune diseases known.

Zur Reduktion von Leukämiezellen wird entweder das zu trans plantierende Knochenmark vor einer autologen Knochenmarktrans plantation in vitro behandelt, oder es können in vivo-Behandlun gen zum Erreichen einer Remission erfolgen.To reduce leukemia cells, either that is too trans Planting bone marrow before an autologous bone marrow trans plantation treated in vitro, or it can be treated in vivo to achieve remission.

Bei der Reduktion immunkompetenter Zellen zur Verhinderung bzw. Behandlung einer Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD) nach allogener Knochenmarktransplantation erfolgt entweder eine in vitro-Be handlung des Spender-Knochenmarks, oder der Empfänger wird vor oder nach der erfolgten Transplantation mit entsprechenden Antikörpern in vivo behandelt.When reducing immunocompetent cells to prevent or Treatment of a graft-versus-host (GvHD) response after allogeneic Bone marrow transplantation is done either in vitro act on the donor bone marrow, or the recipient will or after the transplant has taken place with appropriate Antibodies treated in vivo.

Bei Organtransplantationen läßt sich durch eine in vivo-Behand lung des Transplantat-Empfängers die Zahl immunkompetenter Zellen reduzieren, um Abstoßungen zu verhindern bzw. zu unterdrücken. Autoimmunerkrankungen können mit einer vergleichbaren Therapie behandelt werden.Organ transplants can be treated in vivo the number of immunocompetent cells in the transplant recipient reduce to prevent or suppress rejection. Autoimmune diseases can be treated with a comparable therapy be treated.

Die in der Klinik eingesetzten Antikörperpräparate können entweder zu einer Elimination der Zielzellen durch Aktivierung körpereigener Effektormechanismen führen oder die Funktions bereitschaft der Zielzellen verändern, wie z. B. durch Blockade oder Aktivierung von funktionsrelevanten Rezeptoren, z. B. IL2- Rezeptor. The antibody preparations used in the clinic can either elimination of the target cells by activation the body's own effector mechanisms or the functional change the willingness of the target cells, such as B. by blockade or activation of functionally relevant receptors, e.g. B. IL2- Receptor.

Neben der Applikation von unmodifizierten Antikörpern wird auch die Verwendung Toxin- oder Radionuklid-konjugierten Antikörpern praktiziert. Während Antikörper selbst zu einer Aktivierung natürlicher Effektormechanismen führen (Elimination der Zielzel len oder Veränderung ihres Funktionszustandes), kann im Fall der Antikörper-Toxin-Konjugate eine toxische Komponente direkt an die Zielzellen transportiert werden (in vitro und in vivo). Darüber hinaus kommen auch Antikörper in Frage, die gentechnologisch oder chemisch verändert werden, z. B. durch den Austausch konstanter Regionen, durch Kopplung von Antikörpern unterschiedlicher oder gleicher Spezifitäten, durch Anfügen oder Entfernen funktioneller Komponenten, wie z. B. durch Anfügen von Enzymen oder Enfernen des Fc-Teils der Immunglobuline u.ä.In addition to the application of unmodified antibodies the use of toxin or radionuclide conjugated antibodies practiced. While antibodies themselves activate natural effector mechanisms (elimination of the target cell len or change in their functional state), in the case of Antibody-toxin conjugates a toxic component directly to the Target cells are transported (in vitro and in vivo). About that Antibodies that are genetic engineering or be chemically changed, e.g. B. constant by the exchange Regions, by coupling different or different antibodies same specificities, by adding or removing functional Components such as B. by adding enzymes or removing the Fc part of the immunoglobulins and the like

Bekannte immunsuppressive Antikörperpräparate sind beispielsweise monoklonale Antikörper gegen das humane CD3-T-Zellantigen (OKT3) und polyklonales Antiserum gegen humane T-Zellen (ATG).Known immunosuppressive antibody preparations are, for example monoclonal antibodies against human CD3 T cell antigen (OKT3) and polyclonal antiserum against human T cells (ATG).

Die typischen Nebenwirkungen von ATG beruhen auf dem polyklonalen Charakter des Präparates, das mit seiner breitgefächerten Spezifität neben T-Zellen auch noch eine Vielzahl anderer Zellen erkennt. So kommt es neben ausgeprägten Lymphozytopenien auch zu Thrombo- und Granulozytopenien, die in einigen Fällen den Abbruch der immunsuppressiven Antikörper-Therapie mit ATG erforderlich machen. Durch die massive Zelleliminierung wird eine große Zahl von Zellinhaltsstoffen und Immunmediatoren freigesetzt, was neben Unverträglichkeitsreaktionen insbesondere zu Beginn der Behand lung zu Blutdruckabfall, Thoraxschmerzen, Fieberreaktionen, Durchfällen und Juckreiz führt (ATG-Fresenius, Informations broschüre).The typical side effects of ATG are based on the polyclonal Character of the preparation with its wide range Specificity in addition to T cells also a variety of other cells recognizes. In addition to pronounced lymphocytopenia, this also occurs Thrombo- and granulocytopenia, which in some cases cancels immunosuppressive antibody therapy with ATG is required do. The massive cell elimination results in a large number released from cell contents and immune mediators, which besides Intolerance reactions especially at the beginning of treatment lung pressure drop, chest pain, fever, Diarrhea and itching (ATG-Fresenius, Informations brochure).

Die für polyklonale Antikörperpräparate typischen pleotropen Nebenwirkungen können durch Verwendung monoklonaler Antikörper stark eingeschränkt werden, da diese aufgrund ihrer Antigen spezifität ihre Zielzellpopulation selektiv erkennen können. Jedoch kommt es wegen der im Vergleich zu polyklonalem Antikör perpräparat geringen Bindungsdichte auf diesen Zellen zu einer nur milde verlaufenden Zellelimination.The typical pleotropic for polyclonal antibody preparations Side effects can be reduced by using monoclonal antibodies be severely restricted because of their antigen selectively recognize their target cell population. However, it happens because of the compared to polyclonal antibody preparatively low binding density on these cells to a only mild cell elimination.

Andererseits weisen monoklonale Antikörper einen hohen spezifi schen Titer auf, so daß unerwünschte Reaktionen, die gegebenen falls durch die spezielle Antigen/Antikörper-Interaktion initiiert werden, massiv und ungebremst ablaufen können.On the other hand, monoclonal antibodies have a high specific titer, so that undesirable reactions, the given if by the special antigen / antibody interaction initiated, can run massively and unchecked.

So zeigt das Antikörperpäparat OKT3 in vivo deutliche Neben wirkungen, die auf der initialen Stimulation der CD3⁺-T-Zellen sowie der damit verbundenen massiven Freisetzung an Immunmediato ren basieren. Diese äußerst vielfältigen Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Fieber (73%), Schüttelfrost (57%), Atemnot (21%), pektanginöse Beschwerden (14%), Spastik (11%), Übelkeit (11%), Erbrechen (13%) und Durchfall (20%), können lebensbedrohlich sein (Todd und Brogden, Drugs 1989, 37, 871).The antibody preparation OKT3 shows clear side effects in vivo effects on the initial stimulation of CD3⁺ T cells and the associated massive release of immunmediato based. These extremely diverse side effects, such as Example fever (73%), chills (57%), shortness of breath (21%), pectanginous complaints (14%), spasticity (11%), nausea (11%), Vomiting (13%) and diarrhea (20%) can be life threatening be (Todd and Brogden, Drugs 1989, 37, 871).

Neben einer initialen Stimulation der T-Zelle induziert OKT3 die Modulation des CD3-Antigens und bewirkt somit einen funktions losen, sogenannten anergischen Zustand.In addition to an initial stimulation of the T cell, OKT3 induces the Modulation of the CD3 antigen and thus causes a functional loose, so-called anergic state.

Die meisten monoklonalen Antikörper gegen das humane CD3-Antigen weisen - abhängig vom Isotyp und dem Vorhandensein entsprechender Fc-Rezeptoren auf sogenannten akzessorischen Zellen wie Monozyten und Granulozyten - ähnliche stimulatorische Eigenschaften in vitro und klinische Nebenwirkungen in vivo auf wie OKT3 (Rao et al. Human Immunol. 1992, 37, 275).Most monoclonal antibodies to the human CD3 antigen indicate - depending on the isotype and the presence of appropriate Fc receptors on so-called accessory cells such as monocytes and granulocytes - similar stimulatory properties in vitro and clinical side effects in vivo as on OKT3 (Rao et al. Human immunol. 1992, 37, 275).

Daneben sind eine Reihe CD5-spezifischer Antikörper im Stand der Technik bekannt, die in vitro eine costimulierende (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 26, 137; Vandenberghe und Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 21, 251) beziehungsweise eine stimulierende (Spertini et al., J. Immunol. 1991, 146, 47) Wirkung auf T-Zellen ausüben können. Nach Lydyard und MacKenzie (Leucocyte Typing IV (Editor: Knapp et al.), Oxford University Press 1989, 338) konnte keine Korrelation mit dem Isotyp des Antikörpers festgestellt werden, jedoch ist die Stimulationspotenz auch bei CD5-spezifi schen Antikörpern vom jeweiligen Fc-Rezeptortyp auf den akzesso rischen Zellen abhängig. Eine Korrelation der Epitopspezifität der verwendeten Antikörper scheint nicht zu bestehen.In addition, a number of CD5-specific antibodies are in the prior art Known technology that a costimulierend in vitro (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 26, 137; Vandenberghe and Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 21, 251) or a stimulating one (Spertini et al., J. Immunol. 1991, 146, 47) Effect on T cells can exercise. After Lydyard and MacKenzie (Leucocyte Typing IV (Editor: Knapp et al., Oxford University Press 1989, 338) no correlation with the isotype of the antibody was found but the stimulation potency is also specific for CD5 antibodies from the respective Fc receptor type to the accessory dependent cells. A correlation of epitope specificity the antibody used does not appear to exist.

Von Bertram et al. (Blood 1986, 68, 752) wurden im Zusammenhang mit der Verwendung eines CD5-spezifischen Antikörpers bei T- Lymphom-Patienten zahlreiche Nebenwirkungen wie Juckreiz, Hautrötung, Kurzatmigkeit, Fieber, Durchfall, Erbrechen, Herzrhythmusstörungen und Blutdruckschwankungen beschrieben. Das Erscheinungsbild ist, wenngleich auch etwas abgeschwächt, ähnlich wie nach OKT3-Behandlung.By Bertram et al. (Blood 1986, 68, 752) have been related with the use of a CD5-specific antibody in T- Lymphoma patients have numerous side effects such as itching, Reddening of the skin, shortness of breath, fever, diarrhea, vomiting, Cardiac arrhythmias and fluctuations in blood pressure are described. The Appearance is similar, although somewhat weakened like after OKT3 treatment.

Neben monoklonalen Antikörpern gegen das CD5-Antigen sind auch entsprechende Antikörper gegen CD7 im Stand der Technik bekannt und wurden therapeutisch eingesetzt (Raftery et al., Transplant. Proceedings 1985, 17, 2737). Im Gegensatz zu CD3- bzw. CD5- spezifischen Antikörpern ist für Antikörper gegen das CD7-Antigen keine (co)stimulatorische Wirkung auf periphere T-Zellen beobachtet worden (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 26, 137; Vandenberghe und Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 21, 251).In addition to monoclonal antibodies to the CD5 antigen corresponding antibodies against CD7 are known in the prior art and have been used therapeutically (Raftery et al., Transplant. Proceedings 1985, 17, 2737). In contrast to CD3 or CD5 specific antibodies is for antibodies to the CD7 antigen no (co) stimulatory effect on peripheral T cells have been observed (Ledbetter et al., Mol. Immunol. 1989, 26, 137; Vandenberghe and Ceuppens, Eur. J. Immunol. 1991, 21, 251).

Außer der Verwendung von Antikörpern gegen ein T-Zell-Antigen zum Zweck der Immunsuppression durch Elimination von T-Zellen wurden im Stand der Technik auch Mischungen monoklonaler Antikörper gegen unterschiedliche T-Zell-Antigene verwendet. So beschrieben Uckun et al. (Blood 1990, 76, 1723) die in vitro-Anwendung einer Kombination aus je einem Toxin-konjugierten Antikörper gegen CD5 und CD7 zur Leukämiezellreduktion. Auch die Verwendung einer Mischung aus je einem Antikörper gegen CD2, CD5 und CD7 zusammen mit einer Komplementquelle in vitro ist im Stand der Technik bekannt (Autran et al. Exp. Hematol. 1987, 15, 1121).Except for the use of antibodies to a T cell antigen for Purpose of immunosuppression through elimination of T cells were in the prior art also mixtures of monoclonal antibodies against different T cell antigens. So described Uckun et al. (Blood 1990, 76, 1723) the in vitro application of a Combination of one toxin-conjugated antibody against CD5 and CD7 for leukemia cell reduction. Even the use of a Mixture of one antibody against CD2, CD5 and CD7 together with a complement source in vitro is state of the art known (Autran et al. Exp. Hematol. 1987, 15, 1121).

Die in vivo-Wirkung synergistischer, d. h. gegen nicht-über lappende Epitope eines Antigens gerichteter, C1q-bindender Antikörper wurde unter anderem von Qin et al. (Eur. J. Immunol. 1987, 17, 1159) beschrieben. Der in Tierexperimenten nach gewiesene Synergismus wurde mit Hilfe von einem Antikörperpaar gegen das humane Leukozytenantigen CD45 zur Elimination immunre gulatorischer Leukozyten aus der Spenderniere ex vivo in der Humanmedizin ausgenutzt (Brewer et al., Transplant. Proc., 1989, 21, 1772).The in vivo effect of synergistic, i.e. H. against not-over lapping epitopes of an antigen directed, C1q-binding Antibody has been described by Qin et al. (Eur. J. Immunol. 1987, 17, 1159). That in animal experiments Synergism was demonstrated with the help of an antibody pair immune to the human leukocyte antigen CD45 for elimination gulatory leukocytes from the donor kidney ex vivo in the Human medicine exploited (Brewer et al., Transplant. Proc., 1989, 21, 1772).

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Verfügung zu stellen, das monoklonale Antikörper enthält, die vorrangig mit humanen T- (und NK-)Zellen reagieren, und welches geeignet ist, durch Eliminierung oder Inaktivierung dieser Zielzellen klinisch manifeste Abstoßungsreaktionen wirksam zu unterdrücken bzw. zu verzögern, ohne die bei Verwendung der bisher bekannten Antikörperpräparate auftretenden Nachteile bzw. drastischen Nebenwirkungen hervorzurufen.It is an object of the present invention to provide a medicament for To provide that contains monoclonal antibodies that primarily react with human T (and NK) cells, and which one is suitable by eliminating or inactivating them Target cells clinically manifest rejection reactions effectively suppress or delay without using the Disadvantages or previously known antibody preparations or cause drastic side effects.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird das Arzneimittel nach Anspruch 1 vorgeschlagen, welches als Wirkstoff mindestens vier monoklonale Antikörper unterschiedlicher Spezifität enthält, von denen zwei gegen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD5 und zwei gegen nicht-überlappende Epitope des Lymphozytenmarkers CD7 gerichtet sind.To achieve this object, the medicament according to claim 1 proposed which as an active ingredient at least four monoclonal Contains antibodies of different specificity, two of which against non-overlapping epitopes of the lymphocyte marker CD5 and two against non-overlapping epitopes of the CD7 lymphocyte marker are directed.

Während beim Übergang von polyklonalen zu monoklonalen Antikör perpräparaten wegen der Erhöhung der Antigen-Spezifität nicht nur mit einer Reduktion der beobachteten pleotropen Nebenwirkungen sondern gleichzeitig auch mit einer verminderten Wirksamkeit zu rechnen ist, weist das erfindungsgemäße Arzneimittel über raschenderweise nicht nur in Zahl und Ausmaß drastisch reduzierte Nebenwirkungen auf, sondern es besitzt eine unerwartete, im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten monoklonalen Antikörperpräparaten signifikant erhöhte Wirksamkeit bei der Behandlung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen. Das erfin dungsgemäße Arzneimittel eignet sich aufgrund der effektiven Eliminierung bzw. Inaktivierung der T-Zellen zur wirksamen Behandlung bzw. Verzögerung klinisch manifester Abstoßungs reaktionen bei Organ- und/oder Knochenmarktransplantationen, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen sowie von CD5- und/oder CD7- positiven Leukämien.During the transition from polyclonal to monoclonal antibodies not only because of the increase in antigen specificity with a reduction in the observed pleotropic side effects but at the same time with reduced effectiveness is calculated, the medicament according to the invention transfers surprisingly not only drastically reduced in number and extent Side effects but it has an unexpected im Contrary to monoclonal known from the prior art Antibody preparations significantly increased effectiveness at Treatment of T cell-specific immune reactions. That invented Medicament according to the invention is suitable because of the effective Elimination or inactivation of the T cells for effective Treatment or delay of clinically manifest rejection reactions in organ and / or bone marrow transplants, for Treatment of autoimmune diseases and CD5 and / or CD7 positive leukemia.

Mit der Auswahl synergistischer Antikörperpaare gegen das CD5- und das CD7-Antigen wird zum einen eine starke C1q-Antikörper- Bindung erreicht, zum anderen kann in besonders vorteilhafter Weise ein breites, aber genau definiertes Spektrum von Zielzellen erfaßt werden, wodurch eine äußerst wirksame Suppression von Immunreaktionen bei Organ- oder Knochenmarktransplantationen erreicht wird. So erfaßt das erfindungsgemäße Arzneimittel nicht nur praktisch alle T-Zellen, sondern vorteilhafterweise auch die das CD7-Antigen tragenden NK-Zellen, die in besonderer Weise für Abstoßungsreaktionen mitverantwortlich sind. Neben T-Zellen weisen auch etwa 10% der B-Zellen (polyreaktive, IgM-produzieren de B-Zellen) das CD5-Antigen auf und stellen somit für das erfindungsgemäße Arzneimittel ebenfalls eine Zielzellpopulation dar. Daher wird mit dem Antikörperpräparat die erste humorale Reaktion auf Fremdantigene äußerst wirksam unterdrückt.By choosing synergistic antibody pairs against the CD5- and the CD7 antigen becomes a strong C1q antibody Binding achieved, on the other hand can be particularly advantageous A broad but well-defined range of target cells can be detected, making an extremely effective suppression of Immune reactions to organ or bone marrow transplants is achieved. So the drug according to the invention does not cover only practically all T cells, but advantageously also those the CD7 antigen-bearing NK cells, which are special for Rejection reactions are jointly responsible. In addition to T cells also exhibit about 10% of B cells (polyreactive, IgM-producing de B cells) the CD5 antigen and thus represent the Medicaments according to the invention also a target cell population Therefore, with the antibody preparation, the first humoral Reaction to foreign antigens suppressed extremely effectively.

Die Verwendung des erfindungsgemäßen Arzneimittels führt initial zu einer deutlichen Elimination der CD5- und/oder CD7-positiven Zielzellen aus dem peripheren Blut. Parallel und in Konkurrenz zu diesem Wirkmechanismus kommt es auf einigen Zielzellen zum Verlust der Zielantigene durch Modulation. Diese modulierten und daher CD5- und/oder CD7-negativen Zielzellen werden jedoch überraschenderweise bei der weiteren Anwendung des erfindungs gemäßen Arzneimittels nach ca. 5 bis 10 Tagen weiter deutlich reduziert. Voraussetzung hierfür ist eine Dosierung, die gewähr leistet, daß der Serumspiegel für die Einzelkomponenten des erfindungsgemäßen Arzneimittels nicht auf Null absinkt.The use of the medicament according to the invention leads initially to a clear elimination of CD5 and / or CD7 positive Target cells from peripheral blood. In parallel and in competition this mechanism of action occurs on some target cells Loss of target antigens through modulation. These modulated and therefore CD5 and / or CD7 negative target cells become Surprisingly in the further application of the invention according to the drug after 5 to 10 days reduced. A prerequisite for this is a dosage that guarantees ensures that the serum level for the individual components of the drug according to the invention does not drop to zero.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen CD5 und CD7 führen im Gegensatz zu vielen, im Stand der Technik bekannten Antikörpern gegen CD3 oder CD5 weder einzeln noch in einer beliebigen Kombination zu einer signifikanten Stimulation der T- Zellen in vitro. Eine vom Blutzellspender bedingte Fc-Rezeptor- Heterogenität konnte ausgeschlossen werden.The monoclonal antibodies against CD5 and CD7 according to the invention lead in contrast to many known in the prior art Antibodies to CD3 or CD5 neither individually nor in one any combination for a significant stimulation of the T- Cells in vitro. An Fc receptor caused by the blood cell donor Heterogeneity could be excluded.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung werden im Gegensatz zu den im Stand der Technik bekannten Antikörperpräparaten keine mit ATG vergleichbaren, d. h. pleotropen, oder mit OKT3 vergleichbaren, stimulations-assoziierten Nebenwirkungen beobachtet.In the use according to the invention, in contrast to the Antibody preparations known in the prior art do not contain ATG comparable, d. H. pleotropic, or comparable to OKT3, stimulation-associated side effects were observed.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel gestattet somit eine effektive Behandlung T-Zell-spezifischer Immunreaktionen, mit der sich klinisch manifeste Abstoßungsreaktionen wirkungsvoll verzögern bzw. unterdrücken lassen, ohne die bei bisher verwendeten Antikörperpräparaten auftretenden und zum Teil lebensbedrohlichen Nebenwirkungen hervorzurufen.The medicament according to the invention thus permits an effective one Treatment of T cell-specific immune reactions with which Effectively delay clinically manifest rejection reactions or have suppressed, without the previously used Antibody preparations occurring and sometimes life-threatening Cause side effects.

Obwohl eine Vielzahl verschiedener Isotypen zur erfolgreichen Immunsuppression eingesetzt werden kann, enthält das erfindungs gemäße Arzneimittel vorzugsweise Antikörper der Subklasse Ratte- IgG2b.Although a variety of different isotypes are successful Immunosuppression can be used contains the fiction appropriate drugs, preferably antibodies of the rat subclass IgG2b.

Weiterhin haben sich monoklonale Antikörper der Subklasse Maus- IgG2a, Maus-IgG2b, Mensch-IgG1 und Mensch-IgG3 als besonders vorteilhaft zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel erwiesen.Furthermore, monoclonal antibodies of the mouse subclass IgG2a, mouse IgG2b, human IgG1 and human IgG3 as special advantageous for use in the medicament according to the invention proven.

Prinzipiell kommen für das erfindungsgemäße Arzneimittel aber auch IgG-Subklassen anderer Tiere in Frage, die eine hohe Affinität zu C1q aufweisen.In principle, however, come for the medicament according to the invention IgG subclasses of other animals that have a high Have affinity for C1q.

Neben der erfindungsgemäßen Verwendung monoklonaler Antikörper gegen die humanen Lymphozytenmarker CD5 und CD7 kann das Arzneimittel zusätzlich zwei monoklonale Antikörper gegen nicht- überlappende Epitope eines weiteren (dritten) Lymphozytenmarkers enthalten. In addition to the use of monoclonal antibodies according to the invention against the human lymphocyte markers CD5 and CD7 that can Drug additionally two monoclonal antibodies against non- overlapping epitopes of another (third) lymphocyte marker contain.

Darüber hinaus ist es von Vorteil, wenn in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel wenigstens ein Antikörper mit einer toxischen Komponente konjugiert ist. Zum Beispiel können diese Toxine Ricin, Saporin, cis-Platin, oder Radionuklide sein, die in Form einer chemischen Bindung an den entsprechenden Antikörper gebunden sind.In addition, it is advantageous if in the invention Medicament at least one antibody with a toxic Component is conjugated. For example, these toxins Ricin, saporin, cis-platinum, or radionuclides can be in the form a chemical bond to the corresponding antibody are bound.

Zudem können ein oder mehrere der in dem Arzneimittel enthaltenen Antikörper gentechnologisch modifiziert sein. Beispiele für in Betracht kommende Modifikationen sind: 1. Austausch konstanter Regionen gegen homologe Sequenzen von Antikörpern einer anderen Subklasse der gleichen oder einer anderen Spezies, vorzugsweise des Menschen, (Chimärisierung, Humanisierung); 2. Kopplung von Antikörpern untereinander zum Zwecke der effizienten Induktion von Effektormechanismen, vorzugsweise der Bindung von C1q (Dimerisierung); 3. Eliminierung von Teilen des Antikörpers, vorzugsweise des Fc-Teils oder eines Fab-Teils (monovalente Antikörper, Antikörperfragmente).In addition, one or more of those contained in the drug Antibodies must be genetically modified. Examples of in Possible modifications are: 1. Constant exchange Regions against homologous sequences of another's antibodies Subclass of the same or a different species, preferably of man, (chimerization, humanization); 2. Coupling of Antibodies among themselves for the purpose of efficient induction of effector mechanisms, preferably the binding of C1q (Dimerization); 3. elimination of parts of the antibody, preferably the Fc part or a Fab part (monovalent Antibodies, antibody fragments).

Eine weitere Modifikation betrifft die direkte und indirekte Kopplung mindestens eines Antikörpers an Komponenten bzw. Agentien, die eine physikalische Trennung bzw. Entfernung der Zielzellen erlauben oder allgemein eine Anreicherung oder Abreicherung ermöglichen. Als an die Antikörper gekoppelte Agentien kommen hierbei solche in Frage, die eine Kopplung auf Membranen gestatten oder magnetische Partikel.Another modification concerns the direct and indirect Coupling at least one antibody to components or Agents that physically separate or remove the Allow target cells or generally enrichment or Enable depletion. As coupled to the antibodies Agents come into question here that have a coupling Allow membranes or magnetic particles.

Das Arzneimittel entsprechend der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, die Zahl der Leukämiezellen zu reduzieren, und es wird insbesondere zur in vitro-Behandlung von autologem, zu trans plantierendem Knochenmark verwendet, wobei das Knochenmark vorzugsweise mit dem Arzneimittel und einer lytischen Kom plementquelle inkubiert wird. Desweiteren ist die Verwendung des Arzneimittels zum Erreichen einer Remission in vivo von Vorteil, wenn man dem Leukämiepatienten das Arzneimittel i.v. in Form täglicher Dosen appliziert. The medicament according to the present invention is in able to reduce the number of leukemia cells and it will especially for the in vitro treatment of autologous to trans planting bone marrow used, the bone marrow preferably with the drug and a lytic com incubation source is incubated. Furthermore, the use of the Advantageous drug for achieving remission in vivo, if you give the leukemia patient the i.v. in shape daily doses applied.

Das erfindungsgemäße Präparat aus monoklonalen Antikörpern gegen CD5 und CD7 ermöglicht auch nach allogener Knochenmarktrans plantation die Reduktion der Zahl immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Graft-versus-Host- Erkrankung (GvHD). Dabei ist es von Vorteil, wenn das Arznei mittel vor der Transplantation zur in vitro-Behandlung des Spender-Knochenmarks verwendet wird, es führt aber wenigstens zum gleichen Effekt, wenn das Arzneimittel zur prophylaktischen und therapeutischen in vivo-Behandlung des Knochenmark-Empfängers eingesetzt wird.The preparation of monoclonal antibodies against CD5 and CD7 enables transplantation even after allogeneic bone marrow plantation to reduce the number of immune competent cells Prevention and / or treatment of a graft versus host Disease (GvHD). It is advantageous if the drug medium before the transplant for in vitro treatment of the Donor marrow is used, but at least it leads to same effect if the drug for prophylactic and therapeutic in vivo treatment of the bone marrow recipient is used.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ermöglicht darüber hinaus die Reduktion der Zahl immunkompetenter Zellen zur Verhinderung und/oder Behandlung von Abstoßungen nach Organtransplantationen, wobei das Arzneimittel dem Empfänger des Organtransplantats verabreicht wird.The medicament according to the invention also enables Reduction in the number of immune competent cells for prevention and / or treatment of rejection after organ transplantation, the drug to the recipient of the organ transplant is administered.

Ebenso ist eine Therapie von Autoimmunerkrankungen möglich, wobei der Patient in vivo mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel behandelt wird.Therapy of autoimmune diseases is also possible, whereby the patient in vivo with the medicament according to the invention is treated.

Die erfindungsgemäß verwendeten monoklonalen Antikörper liegen in gereinigter Form vor, vorzugsweise gelöst in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), gegebenenfalls versetzt mit einem oberflächenaktiven Mittel wie beispielsweise Tween 80, in einer Menge von beispielsweise 0,02%, bezogen die Gesamtlösung. Die Lösung kann die Antikörpermischung in Mengen von 0,5 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3 und in besonders bevorzugter Weise 1 mg/ml enthalten, wobei die verschiedenen Antikörpertypen vorzugsweise in etwa gleichen Mengenanteilen vorliegen.The monoclonal antibodies used according to the invention are in a purified form, preferably dissolved in phosphate buffered saline (PBS), optionally mixed with a surfactant such as Tween 80, in an amount of, for example, 0.02%, based on the total solution. The solution can contain the antibody mixture in amounts of 0.5 to 5. preferably 1 to 3 and particularly preferably 1 mg / ml included, with the different types of antibodies preferably are present in approximately equal proportions.

Eine derartige Lösung kann für die intravenöse Applikation vorgesehen sein, wobei die Tagesdosis 10 bis 30 mg Antikörper präparat betragen kann. Vorzugsweise werden 2×täglich je 6 bis 10 mg Antikörper gelöst in 500 ml physiologischer Kochsalzlösung über einen Zeitraum von einer halben Stunde infundiert. Such a solution can be used for intravenous administration be provided, the daily dose being 10 to 30 mg of antibody preparation can be. Preferably 6 to 2 times a day 10 mg of antibody dissolved in 500 ml of physiological saline infused over a period of half an hour.

Die Herstellung der monoklonalen Antikörper-Paare gegen die humanen Lymphozytenmarker CD5 und CD7 erfolgt im Prinzip durch eine gezielte Immunisierung von Ratten oder Mäusen durch i.p., i.v. oder s.c. Applikation des Antigens vorzugsweise in Form ganzer humaner T-Zellen (Lymphozyten, T-Zellinie) oder von entsprechenden Zell-Lysaten oder (an-)gereinigten Oberflächenmo lekülen.The production of the monoclonal antibody pairs against the human lymphocyte markers CD5 and CD7 are made in principle by targeted immunization of rats or mice by i.p., i.v. or s.c. Application of the antigen preferably in the form whole human T cells (lymphocytes, T cell line) or of corresponding cell lysates or (cleaned) surface mo read.

Nach erfolgter Immunisierung werden je nach Komplexität des Antigens, seiner antigenen Wirkung, Art und Anzahl der Immunisie rungsschritte und der physiologischen Bereitschaft des Tieres, eine Vielzahl von B-Lymphozyten zur Proliferation und Antikör perproduktion angeregt. Die sogenannten B-Blasten werden aus dem Tier gewonnen, vorzugsweise durch Entnahme der Milz und in vitro immortalisiert.After immunization, depending on the complexity of the Antigen, its antigenic effect, type and number of immunization steps and the physiological readiness of the animal, a variety of B lymphocytes for proliferation and antibody production stimulated. The so-called B blasts are made from the Animal obtained, preferably by removing the spleen and in vitro immortalized.

Die Immortalisierung erfolgt durch Polyethylenglykol-induzierte Zellhybridisierung, oder durch Elektrofusion mit einer in vitro lebens- und teilungsfähigen Myelomzellinie. Geeignete Myelomli nien weisen vorzugsweise eine Anzaguranin-Resistenz auf, die eine Selektion der immortalisierten B-Zell/Myelom-Hybride (Hybridome) ermöglicht.Immortalization is done by polyethylene glycol-induced Cell hybridization, or by electrofusion with an in vitro viable and divisible myeloma cell line. Suitable myelomli nien preferably have an anzaguranin resistance, the one Selection of immortalized B cell / myeloma hybrids (hybridomas) enables.

Nach der Fusion werden die Zellen mit HAT-Selektionsmedium verdünnt und in entsprechende Kulturgefäße (z. B. 96-Lochplatten) überführt, so daß Einzelklone entstehen und getrennt manipuliert werden können. Jeder Einzelklon sezerniert typischerweise identische Antikörper, die nicht immer gegen das gewünschte Antigen gerichtet sind.After the fusion, the cells are filled with HAT selection medium diluted and in appropriate culture vessels (e.g. 96-perforated plates) transferred so that single clones are created and manipulated separately can be. Each individual clone typically secretes identical antibodies that are not always against the desired one Antigen.

Die Antikörper werden mittels geeigneter Testsysteme auf gewünschte Eigenschaften (z. B. Isotyp und/oder Spezifität) untersucht. Zur Bestimmung des Isotyps bietet sich ein sub klassenspezifischer ELISA an, zur Bestimmung der Spezifität gegen humane T-Zellen ein Immunassay (z. B. EIA), der das Bindungs verhalten der Antikörper auf T- und nicht-T-Zellen (z. B. B- Zellen) untersucht. Klone, die geeignete Antikörper produzieren, werden in Flüssigmedium expandiert und wiederholt auf Einzelzell niveau rekliniert, bis eine stabile Zellinie mit nahezu kon stanten Eigenschaften generiert ist.The antibodies are found using suitable test systems desired properties (e.g. isotype and / or specificity) examined. A sub class-specific ELISA to determine the specificity against human T cells an immunoassay (e.g. EIA) that does the binding the antibody behaves on T and non-T cells (e.g. B- Cells). Clones that produce appropriate antibodies are expanded in liquid medium and repeated on single cell level reclined until a stable cell line with almost con constant properties is generated.

Die genaue Antigen-Spezifität der Antikörper kann in FACS- Doppelmarkierungsexperimenten auf humanen Blutlymphozyten mit Referenzantikörpern der gewünschten Spezifität (anti-CD5, anti- CD7) untersucht werden, wobei die Verteilung und Lage der doppelt- und einzelpositiven Zellen zur Beurteilung herangezogen werden. Die Antigenspezifität wird nach Immunpräzipitaten aus dem Solubilisat von humanen T-Zellen im Vergleich mit den durch Referenzantikörper präzipitierten Molekulargewichte bestätigt. Die relative Epitopspezifität der generierten Antikörper kann durch Kreuzinhibition im EIA ermittelt werden.The exact antigen specificity of the antibodies can be found in FACS Double-labeling experiments on human blood lymphocytes with Reference antibodies of the desired specificity (anti-CD5, anti CD7) are examined, the distribution and location of the double and single positive cells used for assessment become. The antigen specificity is determined from the immunoprecipitates Solubilizate of human T cells compared with that of Reference antibody precipitated molecular weights confirmed. The relative epitope specificity of the antibodies generated can can be determined by cross-inhibition in the EIA.

Die Antikörper werden von den Hybridomzellen in das Kulturmedium sezerniert; die technische Umsetzung dieses Vorgangs wird Fermentation genannt. Aus dem Fermentationsüberstand werden die Zellen durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und die Antikörper durch Reinigung gewonnen. Dabei werden spezifische immunologische und/oder physiko-chemische Parameter der Antikör per ausgenützt, um diese vorzugsweise durch chromatographische Verfahren selektiv anzureichern.The antibodies are transferred from the hybridoma cells into the culture medium secreted; the technical implementation of this process will Called fermentation. The fermentation supernatant becomes the Cells removed by centrifugation or filtration and the Antibodies obtained by purification. Thereby specific immunological and / or physico-chemical parameters of the antibody per exploited, preferably by chromatographic Selectively enrich procedures.

Die gereinigten Antikörper können lyophilisiert oder in ge eigneten Puffern gelöst aufbewahrt werden, entweder tiefgefroren oder vorzugsweise bei 4°C.The purified antibodies can be lyophilized or in ge suitable buffers are stored in solution, either deep-frozen or preferably at 4 ° C.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.The invention is explained below using examples.

example 1 Immunization, fusion and establishment of the hybridoma cell lines RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q

Lou/C-Ratten wurden mit der humanen T-Zellinie Molt-3 (American Type Culture Collection (ATCC), CRL 1552) bzw. humanen peripheren Lymphozyten aus dem Blut immunisiert, wobei die Zellen 3 Tage lang mit Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert worden waren. Das genaue Immunisierungsschema, das zur Etablierung der vier beschriebenen Zellinien führte, ist in Tabelle 1 angegeben.Lou / C rats were treated with the human T cell line Molt-3 (American Type Culture Collection (ATCC), CRL 1552) or human peripheral Lymphocytes immunized from the blood, leaving the cells for 3 days long stimulated with phytohaemagglutinin (PHA). The exact immunization schedule necessary to establish the four described cell lines is shown in Table 1.

Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere getötet, die Milzen entnommen und daraus eine Einzelzellsuspension gewonnen. Als Fusionspartner diente die Azaguanin-resistente, nicht produzierende Maus-Myelomlinie P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), die zuvor in einem Standardmedium (RPMI 1640, 10% fötales Kälberserum, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, Na-Pyruvat) expandiert wurde. Die Fusion erfolgte nach Standardprozeduren (Galfr´ et al., Nature 1977, 266, 550) mit Polyethylenglykol 1500. Pro Ansatz wurden 100×10⁶ Ratten-Milzzellen und 50×10⁶ Maus-Myelomzellen verwendet.The animals were sacrificed three days after the last injection, the spleens removed and a single cell suspension won. Azaguanine-resistant, non-producing mouse myeloma line P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) previously in standard media (RPMI 1640, 10% fetal Calf serum, glutamine, non-essential amino acids, sodium pyruvate) was expanded. The merger was carried out according to standard procedures (Galfr´ et al., Nature 1977, 266, 550) with polyethylene glycol 1500. 100 × 10⁶ rat spleen cells and 50 × 10⁶ were used per approach Mouse myeloma cells used.

Nach der Fusion wurden die Zellen auf 96-Loch Kulturplatten überführt. Dazu wurden sie so verdünnt, daß durchschnittlich ein Klon pro Loch zu erwarten war. Dem Standard-Medium wurde dabei das HAT-Supplement zugesetzt, das eine Selektion von fusionierten Zellen ermöglicht. Ca. 24 Stunden vor der Fusion wurden diese Kulturplatten mit einem Zellrasen aus Maus-Peretonealmakrophagen beschichtet, die das Anwachsen von Hybridomzellen in der sensiblen Phase nach der Fusion begünstigen. After the fusion, the cells were placed on 96-well culture plates transferred. For this purpose, they were diluted so that an average Clone per hole was expected. The standard medium was included added the HAT supplement that merged a selection of Cells. Approx. 24 hours before the merger, these were Culture plates with a cell lawn from mouse peretoneal macrophages coated, which the growth of hybridoma cells in the favor sensitive phase after the merger.

Tabelle 1: Immunisierungsschema Table 1: Immunization scheme

Sobald die wachsenden Klone ca. 10% der Kulturfläche überdeckten (nach ca. 7 Tagen), wurden die Kulturüberstände der einzelnen Löcher in einem Subklassen-spezifischen ELISA-Test auf das Vorhandensein von Ratten-IgG2b Antikörpern untersucht (siehe Bei spiel 2, Test I). Einen Tag später wurden die Kulturüberstände, die Ratten-IgG2b Antikörper enthielten, hinsichtlich ihrer Zielzellspezifität in einem Zellbindungstest untersucht (siehe Beispiel 2, Test II). Die Zellen aus den Löchern, die T-zell spezifische Antikörper der Subklasse Ratten IgG2b enthielten, wurden einzeln auf 24-Loch-Kulturplatten überführt, expandiert und kryokonserviert.As soon as the growing clones covered about 10% of the cultivated area (after about 7 days), the culture supernatants of the individual Holes in a subclass specific ELISA test for that Existence of rat IgG2b antibodies examined (see Bei game 2, test I). A day later, the culture supernatants, the rat IgG2b contained antibodies for their Target cell specificity examined in a cell binding test (see Example 2, Test II). The cells from the holes, the T cell contained specific antibodies of the IgG2b subclass, were transferred individually to 24-well culture plates, expanded and cryopreserved.

Die Zielzell- und Antigenspezifität wurde in einem Doppelmarkie rungsexperiment mit Referenzantikörpern gegen geeignete CD- Antigene ermittelt (siehe Beispiel 2, Test III).The target cell and antigen specificity was in a double marker experiment with reference antibodies against suitable CD Antigens determined (see Example 2, Test III).

Die Hybridomzellinien, die die CD5- bzw. CD7-spezifischen Antikörper sezernierten, wurden wieder aufgetaut und bis zum Erreichen einer Monoklonalität bzw. einer stabilen Produktionsrate auf Einzelzellniveau in 96-Loch-Kulturplatten rekloniert. Zum Austesten der Überstände aus den Reklonierungen wurde ein subklassenspezifischer ELISA- (siehe Beispiel 2, Test I) oder ein Zellbindungstest (siehe Beispiel 2, Test II) durchgeführt.The hybridoma cell lines that are CD5 and CD7 specific Antibodies secreted, were thawed again and by Achieving a monoclonality or a stable production rate at single cell level in 96-well culture plates. A was used to test the supernatants from the recloning subclass-specific ELISA- (see Example 2, Test I) or a Cell binding test (see Example 2, Test II) carried out.

Parallel mit den Reklonierungsschritten wurden die Antikörper hinsichtlich Antigenspezifität durch Immunpräzipitation (siehe Beispiel 2, Test V) exakt charakterisiert.In parallel with the recloning steps, the antibodies were with regard to antigen specificity by immunoprecipitation (see Example 2, test V) exactly characterized.

Dabei zeigte sich, daß RhCD5p und RhCD5q gegen das humane CD5- Antigen gerichtet ist, das auf praktisch allen peripheren T- Zellen und ca. 10% der B-Zellen im peripheren Blut exprimiert ist; RhCD7p und RhCD7q sind gegen das humane CD7-Antigen gerichtet, das auf den meisten humanen T- und NK-Zellen im peripheren Blut sowie auf myeloischen Verläuferzellen im Knochenmark exprimiert ist. It was shown that RhCD5p and RhCD5q against human CD5- Antigen directed to virtually all peripheral T- Cells and approximately 10% of the B cells are expressed in peripheral blood is; RhCD7p and RhCD7q are against the human CD7 antigen directed to most human T and NK cells in the peripheral blood and on myeloid progenitor cells in the Bone marrow is expressed.

Durch Bindungsinhibitionsexperimente (siehe Beispiel 2, Test IV) wurde die relative Epitopspezifität der Antikörper untersucht. Daraus ergab sich, daß sich weder RhCD5p und RhCD5q noch RhCD7p und RhCD7q deutlich inhibieren. Sie binden daher an jeweils zwei unterschiedliche Epitope auf dem CD5- bzw. CD7-Antigen.By binding inhibition experiments (see Example 2, Test IV) the relative epitope specificity of the antibodies was examined. As a result, neither RhCD5p and RhCD5q nor RhCD7p and significantly inhibit RhCD7q. You therefore bind to two each different epitopes on the CD5 or CD7 antigen.

Nach der vollständigen Charakterisierung und entsprechenden Reklonierungsschritten wurde eine Zellinie als Master Cell Bank (MCB) kryokonserviert. Aus jeder MCB wurde durch entsprechende Expandierungsschritte in Zellkulturflaschen eine Working Cell Bank (WCB) etabliert, die ihrerseits als Ausgangsmaterial für die Fermentation (siehe Beispiel 3) diente.After full characterization and corresponding A cell line became the master cell bank (MCB) cryopreserved. Each MCB was replaced by a corresponding one Expansion steps in cell culture flasks a working cell Bank (WCB) established, which in turn as the starting material for the Fermentation (see example 3) was used.

Die Zellinien wurden am 3.2.1993 bei "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) Abt. Menschliche und Tierische Zellinien" (Marscheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Germany) unter folgenden Nummern hinterlegt:The cell lines were published on 3.2.1993 at "Deutsche Sammlung von Microorganisms and Cell Cultures (DSM) Dept. Human and Animal cell lines "(Marscheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Germany) under the following numbers:

Example 2 Test systems for the detection of the subclass or the binding spec the antibodies RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q I. Subclassification

Dafür wurde ein spezifischer ELISA-Test in 96-Loch-Flachbo denplatten durchgeführt. Als Fängerantikörper diente ein monoklonaler Mausantikörper, der spezifisch reagiert mit Ratten-IgG_2b-Antikörpern (ATCC 174). Als Nachweisantikörper diente ein polyklonaler, Peroxidase-konjugierter Maus-anti- Ratten-IgG-Antikörper (Dianova). Der Test wurde durch Zugabe von o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) entwickelt und in einem ELISA-Reader ausgewertet.For this, a specific ELISA test was carried out in 96-hole flat-bottom plates. A mouse monoclonal antibody, which reacts specifically with rat IgG _2b antibodies (ATCC 174), served as the capture antibody. A polyclonal, peroxidase-conjugated mouse anti-rat IgG antibody (Dianova) served as detection antibody. The test was developed by adding o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) and evaluated in an ELISA reader.

II. Cell binding test

Dieser Test wurde als Zell-Immunoassay in 96-Loch-Rundboden platten durchgeführt. Eine T-Zellinie (z. B. Molt-3; ATCC, CRL 1552) diente als positive Zielzelle, eine nicht-T- Zellinie (z. B. HL-60; ATCC, CCL 240) diente als negative Zielzelle. Die Zellen wurden mit dem zu testenden Kultur überstand inkubiert und anschließend gewaschen. Der Nachweis der Bindung des Antikörpers an die Zielzelle erfolgte durch Inkubation mit einem polyklonalen, Peroxidase-konjugiertem Maus-anti-Ratten-IgG-Antikörper (Dianova). Der Test wurde durch Zugabe von OPD entwickelt und in einem ELISA-Reader ausgewertet.This test was performed as a cell immunoassay in a 96-hole round bottom plates carried out. AT cell line (e.g. Molt-3; ATCC, CRL 1552) served as a positive target cell, a non-T Cell line (e.g. HL-60; ATCC, CCL 240) served as negative Target cell. The cells were filled with the culture to be tested incubated supernatant and then washed. The proof the antibody was bound to the target cell by Incubation with a polyclonal, peroxidase-conjugated Mouse anti-rat IgG antibody (Dianova). The test was developed by adding OPD and in an ELISA reader evaluated.

III. Double fluorescent label

Dieser Test wurde in einem Durchflußzytometer (FACScan, Becton Dickinson) unter Verwendung des FSCScan Programms durchgeführt. Eine natürliche Zellpopulation (z. B. Ficoll- getrennte humane Blutlymphozyten) wurden mit dem zu te stenden Kulturüberstand und gleichzeitig mit Biotin-markier ten Maus-Referenzantikörpern (CD2: OKT11, ATCC, CRL 8027; CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, beide Becton Dickinson) inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und mit Phycoerythin- markiertem Avidin (Dianova) sowie FITC-konjugiertem, polyklonalem Ratte-anti-Maus-IgG-Antikörper (Dianova) inkubiert. Die Zellparameter (Fluoreszenz 1, Fluoreszenz 2, Forwardscatter, Sidescatter) wurden im Zytofluorometer gemessen und die Daten abgespeichert. Bei der Analyse wurden nur die Zellen durch Setzen eines entsprechenden Fensters in der Forward-versus-Sidescatter-Darstellung berücksichtigt, die aufgrund ihrer Größe und Granulation in die Lymphozyten population fielen.This test was carried out in a flow cytometer (FACScan, Becton Dickinson) using the FSCScan program carried out. A natural cell population (e.g. Ficoll separate human blood lymphocytes) were treated with the constant culture supernatant and at the same time with biotin marker mouse reference antibodies (CD2: OKT11, ATCC, CRL 8027; CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, both Becton Dickinson). The cells were then washed and washed with phycoerythin labeled avidin (Dianova) and FITC-conjugated, rat polyclonal anti-mouse IgG antibody (Dianova) incubated. The cell parameters (fluorescence 1, fluorescence 2, Forwardscatter, Sidescatter) were in the cytofluorometer measured and the data saved. When analyzing just the cells by setting an appropriate window in the forward-versus-sidescatter representation, which due to their size and granulation in the lymphocytes population fell.

Aus der Lage und dem Verhältnis der doppelt-, einfach- und unmarkierten Zellen konnte man auf die Zell- und Antigen spezifität schließen. Dabei konnten folgende Konstellationen unterschieden werden:From the location and the ratio of double, single and unlabeled cells could be found on the cell and antigen close specificity. The following constellations were possible a distinction is made between:

1) The antibody to be tested did not form with any of the Reference antibody a significant double positive Population: The test antibody is not T cell specific fish.
2) The antibody to be tested formed with an or a flat distribution of several reference antibodies: in addition, a significant number of only one subject-positive cells occur: the test antibody showed a similar distribution pattern as the Refe antibody and recognizes T cells. At the Einfachpo Sitive cells can be single-labeled B- or NK cells act, which is another clue to that Antigen specificity of the test antibody there.
3) The double-labeled cell population is approximately on a diagonal, and there is no significant one Population of single positive cells: reference and Test antibodies bind to two different ones, however coupled expressed epitopes that are likely to the antigen defined by the reference antibody lie.
4) The double positive cell population disappears most of a single positive cell population: reference and test antibodies mutually inhibit, i. H. they are against closely adjacent or overlap de epitopes directed on the same antigen.

IV. Binding inhibition test

Zur relativen Epitopcharakterisierung wurde ein Zell- Immunoassay durchgeführt. Geeignete Zielzellen (z. B. 3 Tage mit Phytohämagglutinin stimulierte Lymphozyten aus humanen Tonsillen) wurden sequentiell zunächst mit dem zu testenden Antikörper RhCD5p, RhCD5q und RhCD7p und RhCD7q bzw. mit Maus-Referenzantikörpern (CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, beide Becton Dickinson) und anschließend mit dem Nachweisantikör per in 96-Loch-Rundbodenplatten inkubiert und gewaschen. Als Nachweisantikörper wurden die Rattenantikörper RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p und RhCD7q verwendet, die zuvor über Protein- G-Sephadex (Pharmacia) gereinigt und mit einem 100-fachen molaren Überschuß an NHS-LC-Biotin (Pierce) markiert wurden. Der Nachweis der Biotin-markierten Rattenantikörper erfolgte durch Peroxidase-konjugiertes Avidin (Dianova). Der Test wurde mit OPD entwickelt und mit einem ELISA-Reader ausge wertet. Die maximale Bindung des Nachweisantikörpers wurde in Kontrollansätzen ohne kompetierenden Testantikörper bestimmt. Das Ausmaß der Inhibition wurde errechnet nach folgender Formel:For the relative epitope characterization, a cell Immunoassay performed. Suitable target cells (e.g. 3 days lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin from human Tonsils) were sequentially initially tested with the one to be tested Antibodies RhCD5p, RhCD5q and RhCD7p and RhCD7q or with Mouse reference antibodies (CD5: Leu 1; CD7: Leu 9, both Becton Dickinson) and then with the detection antibody incubated and washed in 96-hole round bottom plates. When The RhCD5p rat antibodies were detection antibodies, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q used previously on protein G-Sephadex (Pharmacia) cleaned and with a 100-fold molar excess of NHS-LC-Biotin (Pierce) were labeled. The biotin-labeled rat antibodies were detected by peroxidase-conjugated avidin (Dianova). The test was developed with OPD and developed with an ELISA reader evaluates. The maximum binding of the detection antibody was in control batches without a competent test antibody certainly. The extent of the inhibition was calculated from following formula:

Dabei wurde eine vollständige Inhibition (»50%) als eine gegenseitige sterische Behinderung der beiden Antikörper aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur.A complete inhibition (»50%) was identified as one mutual steric hindrance of the two antibodies because of their three-dimensional structure.

V. Immunoprecipitation and Western blot

Dazu wurde eine humane T-Zell-haltige Zellpopulation (z. B. 3 Tage mit Phytohämagglutinin stimulierte Lymphozyten aus Tonsillen) mit NHS-LC-Biotin (Pierce) markiert und mit NP-40 lysiert (Schuh et al., J. Immunol. Meth. 1992, 152, 59). Die zu testenden Antikörper wurden gereinigt oder über einen Fängerantikörper an die Festphase in 96-Loch-ELISA-Platte geheftet und mit dem Biotin-markierten Zellsolubilisat inkubiert. Überschüssiges Material wurde durch intensives Waschen entfernt. Das spezifisch gebundene Antigen wurde mit einem Zitronensäurepuffer pH 2,7 in Anwesenheit von 1% SDS eluiert und einer Gelelektrophorese unterzogen. Als Moleku largewichststandard diente ein gefärbtes Proteingemisch (LMW Biorad).A human T cell-containing cell population (e.g. Lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin for 3 days Tonsils) labeled with NHS-LC-Biotin (Pierce) and with NP-40 lysed (Schuh et al., J. Immunol. Meth. 1992, 152, 59). The Antibodies to be tested were purified or via a Capture antibodies to the solid phase in a 96-well ELISA plate stapled and with the biotin-labeled cell solubilizate incubated. Excess material was caused by intense Wash away. The specifically bound antigen was a citric acid buffer pH 2.7 in the presence of 1% SDS eluted and subjected to gel electrophoresis. As a molecule largewichststandard served a colored protein mixture (LMW Biorad).

Anschließend wurde das Protein aus dem Gel auf Nitrocellulo se-Papier transferiert und über Streptovidin-gekoppelte Phosphatase (Dianova) mit Echtfarbstoff sichtbar gemacht. Als Referenzantikörper diente Leu 1 (CD5) und Leu 9 (CD7; beide Becton Dickinson). Aus dem Vergleich der Bandenmuster zwischen Referenz- und Testantikörper konnte die Antigen spezifität nachgewiesen werden.Then the protein from the gel was on nitrocellulo se paper transferred and coupled via streptovidin Phosphatase (Dianova) made visible with real dye. Leu 1 (CD5) and Leu 9 (CD7; both Becton Dickinson). From the comparison of the band patterns between the reference and test antibody, the antigen specificity can be demonstrated.

Example 3 Production and purification of the monoclonal antibodies RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q as well as production of the monoclonal ATG Cocktails

Die nach Beispiel 1 und 2 charakterisierten und als MCB bzw. WCB etablierten Zellinien wurden einzeln in serumhaltigem Medium (RPMI 1640, 10% fötales Kälberserum, Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, Na-Pyruvat) aufgetaut und in Kunststoffkultur flaschen bei 37°C und 5% CO₂ angezüchtet. Danach wurden die Zellen auf serumfreie LP-Medium (Gibco) umgestellt, expandiert und in eine entsprechende Anzahl von 10er Wannenstapel (NUNC) überführt.The characterized according to Examples 1 and 2 and as MCB and WCB Established cell lines were grown individually in serum-containing medium (RPMI 1640, 10% fetal calf serum, glutamine, non-essential Amino acids, Na pyruvate) thawed and in plastic culture bottles grown at 37 ° C and 5% CO₂. After that, the Cells switched to serum-free LP medium (Gibco), expanded and in a corresponding number of 10 tub stack (NUNC) transferred.

Die Fermentation erfolgte über einen Zeitraum von ca. 2 Monaten in einem Volumen von ca. 2 l pro Wannenstapel. Die Wannenstapel wurden dreimal wöchentlich semikontinuierlich geerntet, wobei zweimal 1,5 l und einmal 1 l zellhaltiger Kulturüberstand geerntet und durch frisches Medium ersetzt wurde. Die täglichen Ernten der parallel angesetzten Wannenstapel einer Zellinie wurden gemeinsam zur Entfernung der Zellen aus dem Kulturüber stand über ein Glasfaservorfilter und ein Sterilfilter (0,22 µm) filtriert. Die filtrierten Kulturüberstände der Gesamtfermenta tion einer Zellinie wurden nach Abschluß der Fermentation über ein Hohlfasermodul mit einer Ausschlußgrenze von 30kD bis zu einem Antikörpergehalt von ca. 0,5 g/l eingeengt. Die Messung der Antikörperkonzentration erfolgte in einem Subklassen-spezifischen ELISA (siehe Beispiel 2, Test I), wobei die Proben in einer seriellen Verdünnung austitriert wurden. Der Antikörpergehalt wurde rechnerisch ermittelt durch Vergleich der Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Probe mit der Verdünnungsreihe eines Standardantikörpers der gleichen Subklasse und bekannter Konzentration.The fermentation took place over a period of about 2 months in a volume of approx. 2 l per bath stack. The tub stack were harvested semi-continuously three times a week, with two 1.5 l and one 1 l cell-containing culture supernatant harvested and replaced with fresh medium. The daily Harvesting the parallel stack of tubs in a cell line were used together to remove the cells from the culture stood over a glass fiber pre-filter and a sterile filter (0.22 µm) filtered. The filtered culture supernatants of the total fermenta tion of a cell line were over after completion of the fermentation a hollow fiber module with an exclusion limit of 30kD up to concentrated to an antibody content of about 0.5 g / l. The measurement of Antibody concentration was in a subclass-specific ELISA (see Example 2, Test I), the samples in a serial dilution were titrated. The antibody content was calculated by comparing the dilution series the sample to be examined with the dilution series of a Standard antibody of the same subclass and known Concentration.

Die Reinigung erfolgte mittels FPLC-Anlage und gliederte sich in zwei Teilschritte:The cleaning was carried out by means of an FPLC system and was divided into two steps:

Teilschritt 1 (Fig. 1) beinhaltete eine komplexe Abfolge von fünf chromatographischen Schritten sowie einem Virus-Inaktivie rungsschritt, wobei die Antikörper in Portionen von ca. 200 mg aus dem Kulturüberstand gereinigt wurden. Für die weitere Verarbeitung wurden nur solche Einzelreinigungen weiterverwendet, die einen Endotoxingehalt < 0,03 EE/ml aufwiesen. Die Einzel reinigungen wurden getrennt für jeden der vier Antikörper zu Rohchargen vereinigt. Entsprechend ihrem Proteingehalt (photome trische Bestimmung: c = (E₂₃₅-E₂₈₀)/2,51; Whitaker et al., Anual. Biochem. 1980, 104, 156) wurde aus diesen Rohchargen eine äquimolare Mischung der gereinigten Antikörper RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p und RhCD7q hergestellt und auf eine Proteinkonzentration von 3 mg/ml eingestellt.Sub-step 1 ( Fig. 1) included a complex sequence of five chromatographic steps and a virus inactivation step, the antibodies being purified in portions of approximately 200 mg from the culture supernatant. Only those individual cleanings that had an endotoxin content of <0.03 EA / ml were used for further processing. The individual cleanings were combined separately for each of the four antibodies into raw batches. According to their protein content (photometric determination: c = (E₂₃₅-E₂₈₀) / 2.51; Whitaker et al., Anual. Biochem. 1980, 104, 156) an equimolar mixture of the purified antibodies RhCD5p, RhCD5q, RhCD7p and RhCD7q were prepared and adjusted to a protein concentration of 3 mg / ml.

Teilschritt 2 (Fig. 2) bezog sich auf eine weitere Behandlung der Gesamtmischung. Diese bestand aus einem chromatographischen Verfahren sowie einem weiteren Virusinaktivierungsschritt und endete in der Herstellung des sterilen Endprodukts.Sub-step 2 ( Fig. 2) related to a further treatment of the total mixture. This consisted of a chromatographic process and a further virus inactivation step and ended in the production of the sterile end product.

Das sterile Endprodukt (mATG) wurde bei 4°C in Kunststoffflaschen aufbewahrt. Bei Bedarf wurden die entsprechenden Volumina in silikonisierte, sterile 30ml-Glasflaschen mit Gummistopfen umgefüllt und bei 4°C in aufrechter Stellung aufbewahrt.The sterile end product (mATG) was placed in plastic bottles at 4 ° C kept. If necessary, the corresponding volumes in Siliconized, sterile 30ml glass bottles with rubber stoppers transferred and stored in an upright position at 4 ° C.

Example 4 Use of the anti-CD5 / anti-CD7 monoclonal antibody preparation in 2 patients with refractory acute graft versus host response (GvHD) after Allogeneic Bone Marrow Transplantation (KMT)

1. Eine 32 Jahre alte weibliche Patientin (A) wurde im begin nenden Rezidiv einer sekundären AML von ihrer HLA-DR differenten Mutter transplantiert. Die AML trat 6 Monate zuvor erstmals auf und mußte im Zusammenhang mit einer 6 Jahre zuvor durchgeführten Chemo- und Radiotherapie wegen eines M. Hodgkin als sekundäre AML betrachtet werden. Aufgrund des raschen Rezidivs der AML wurde auf die Suche nach einem optimal passenden Spender verzichtet und trotz des erhöhten GvHD-Risikos die HLA-DR haploidentische Mutter als Knochenmarkspenderin gewählt.1. A 32 year old female patient (A) was admitted in the begin recurrent secondary AML from their HLA-DR different mother transplanted. The AML occurred 6 months ago previously first and had to in connection with a Chemotherapy and radiotherapy performed 6 years earlier of a M. Hodgkin can be considered secondary AML. Due to the rapid relapse of the AML was on the lookout waived for an optimally fitting donor and despite of the increased GvHD risk the HLA-DR haploidentic mother chosen as bone marrow donor.

Die Patientin entwickelte am 14. Tag nach KMT eine GvHD Grad II der Haut und der Leber bei begleitender Cytomegalie- Virus-assoziierter interstitieller Pneumonie. Die GvHD wurde zunächst mit hochdosierten Steroiden und einem monoklonalen Antikörper gegen TNFα behandelt. Die Hautsymptomatik erwies sich als primär refraktär und erforderte am Tag 20 eine 7- tägige weitere Behandlung mit OKT3, nach nur kurzem An sprechen hierauf am Tag 29 eine 10-tägige Behandlung mit polyklonalem ATG. Die Begleittherapie mit Corticosteroiden und Ciclosporin wurde in Erhaltungsdosen fortgeführt, zusätzlich wurde einmal pro Woche Methotrexat in einer niedrigen Dosis appliziert. Nach erneutem vorübergehenden Ansprechen auf ATG verschlechterte sich die Hautsymptomatik ab Tag 48 nach KMT erneut, weshalb ein zweiter Zyklus mit OKT3 für 10 Tage und eine Erhaltungstherapie mit Thalidomid angesetzt wurde. Infolge der OKT3-Therapie trat eine generalisierte Mikroangiopathie mit Hämolyse, Thrombopenie und Blutungsneigung auf, die die Gabe von Frischplasma erforderte.The patient developed GvHD on the 14th day after KMT Grade II of the skin and liver with accompanying cytomegaly Virus-associated interstitial pneumonia. The GvHD was initially with high-dose steroids and a monoclonal Antibodies to TNFα treated. The skin symptoms proved himself as a primary refractory and required a 7- further treatment with OKT3 after a short period of time have a 10-day treatment on day 29 polyclonal ATG. Concomitant therapy with corticosteroids and cyclosporine was continued in maintenance doses, in addition, methotrexate was administered once a week in one low dose applied. After another temporary In response to ATG, the skin symptoms worsened from day 48 after KMT again, which is why a second cycle with OKT3 for 10 days and maintenance therapy with thalidomide was scheduled. As a result of the OKT3 therapy, one occurred generalized microangiopathy with hemolysis, thrombopenia and tendency to bleed on the administration of fresh plasma required.

Bei persistierendem Hautexanthem und ansteigenden Cholesta se-Parametern wurde von Tag 69 bis 75 ein Behandlungsversuch mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Interleukin-2- Rezeptor (IL2-Rezeptor) durchgeführt, der keine Wirkung zeigte. Daraufhin wurden von Tag 76 bis Tag 85 jeweils täglich 20 mg des erfindungsgemäßen monoklonalen anti- CD5/anti-CD7-Antikörperpräparates (in 500 ml isotonischer Kochsalzlösung) appliziert. Diese Behandlung erschien trotz der vorbestehenden radiologischen Zeichen pulmonaler Infiltrate wegen des refraktären Verhaltens der GvHD indiziert, sie wurde unter breitem antibiotischen und antimykotischen Schutz durchgeführt. Am 1. Tag der Behand lung mit dem erfindungsgemäßen Antikörperpräparat kam es 1 Stunde nach Infusionsende zu einer geringgradigen Dyspnoe der Patientin, die ohne zusätzliche Maßnahmen nach weiteren 30 Minuten sistierte. Die folgenden Applikationen des Antikörperpräparates wurden ohne akute Reaktionen vertragen. Im Verlauf der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Antikör perpräparat blaßte das Hautexanthem ab, die Besserung zeigte sich ab dem 4. Behandlungstag. Die initial als Ausdruck einer Leber-GvHD erhöhte alkalische Phosphatase (AP) im Serum fiel von 469 U/ml auf 339 U/ml am Ende des Zyklus ab. Die Leukozyten blieben unter der Antikörper-Gabe stabil, die vorbestehende Thrombopenie sowie die plasmatische Gerinnung wurde nicht nachteilig beeinflußt. Im Verlauf entwickelte die Patientin am Tag 89 eine zunehmende Dyspnoe, die auf die bereits vor Therapie bestehenden pulmonalen Infiltrate zurückzuführen war. Dadurch wurde die Patientin beatmungs pflichtig. Während der intensivmedizinischen Behandlung kam es erst ab dem Tag 100 nach KMT wieder zu einer Progression der Hautsymptomatik der GvHD, die wegen der zunehmenden pulmonalen Verschlechterung, der die Patientin schließlich erlag, nicht mehr behandelt wurde.With persistent skin rash and increasing cholesta A treatment attempt was made from day 69 to 75 se parameters with a monoclonal antibody against interleukin-2 Receptor (IL2 receptor) carried out of no effect showed. Thereupon, from day 76 to day 85 each 20 mg daily of the monoclonal anti- CD5 / anti-CD7 antibody preparation (in 500 ml isotonic Saline solution). This treatment appeared despite the pre-existing radiological signs pulmonary Infiltrates due to the refractory behavior of GvHD indicated, she was under broad antibiotic and antifungal protection performed. On the 1st day of treatment It came with the antibody preparation according to the invention Minor dyspnea 1 hour after the end of the infusion the patient, who took additional measures without further measures 30 minutes was suspended. The following applications of the Antibody preparations were tolerated without acute reactions. In the course of treatment with the antibody according to the invention the skin rash faded off, which showed improvement from the 4th day of treatment. The initial as an expression a liver GvHD increased alkaline phosphatase (AP) in the Serum dropped from 469 U / ml to 339 U / ml at the end of the cycle. The leukocytes remained stable under the antibody administration pre-existing thrombopenia and plasmatic coagulation was not adversely affected. Developed in the course the patient had increasing dyspnea on day 89 due to the pre-existing pulmonary infiltrates was due. This made the patient ventilated mandatory. During the intensive care treatment came it only progresses again from day 100 after KMT the skin symptoms of GvHD, which are increasing because of the pulmonary deterioration, which the patient eventually succumbed, was no longer treated.

2. Ein 31 Jahre alter männlicher Patient (B) wurde in akze lierter Phase einer chronisch-myeloischen Leukämie von einem HLA-identen Fremdspender knochenmarktransplantiert. Kom plizierend lag als Folge des 9-jährigen Verlaufs der Erkrankung eine Myelofibrose mit sekundärer Hapato- und Spenomegalie und Zeichen der Leberschädigung vor. Dieser Patient entwickelte am Tag 16 nach KMT eine GvHD Grad II-III von Haut und Leber, die unter Fortführung der Ciclosporin- Prophylaxe zunächst mit anti-TNF-Antikörper und hochdosier ter Steroide-Gabe behandelt wurde. Bei progredientem Bilirubin- und Transaminasen-Anstieg unter dieser Behandlung wurde am Tag 20 ein 7-tägiger Zyklus mit ATG zugesetzt. Während das Bilirubin im Verlauf zunächst rückläufig war, flammte das Hautexanthem am Tag 32 nach KMT erneut im Sinne eines Grad III der akuten GvHD auf, so daß eine Behandlung mit OKT3 unter Pentoxifyllin-Schutz erforderlich wurde. Auch diese Behandlung zeigte nur einen vorübergehenden Effekt, ab dem Tag 52 traten Zeichen der Haut-, Darm- und Leber-GvHD (jeweils Grad III, damit Gesamtgrad der GvHD IV) auf, so daß die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Antikörperpräparat (20 mg/Tag) am Tag 55 begonnen wurde. Am 1. Tag der Antikör per-Verabreichung kam es 1 Stunde nach Infusions-Ende zu Symptomen der pulmonalen Spastik sowie einer Sinustachykar die, die selbstlimitiert waren und nach etwa 30 Minuten sistierten. Bereits am 3. Tag der Gabe des erfindungsgemäß verwendeten Antikörperpräparates war die Haut-GvHD des Patienten deutlich rückläufig (Grad I-II), und die Diarrhoen sprachen mit einem Rückgang von über 1400 ml auf weniger als 500 ml an. Wegen eines zunehmenden Anstiegs der bereits vor Therapiebeginn mit einer Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) von über 150 U/ml erhöhten Transaminasen auf maximal 1000 U/ml wurde die Therapie am 4. Tag unterbrochen, da zu diesem Zeitpunkt eine zusätzlich zur GvHD bestehende Virushepatitis nicht ausgeschlossen werden konnte. Wiederum konnten bei Verabreichung des erfindungsgemäßen Antikörper präparates keine negativen Effekte auf das Blutbild be obachtet werden. 3 Tage nach Unterbrechung der Applikation des Antikörperpräparates war die Hautsymptomatik im Sinne des Lyell-Syndroms erneut progredient, die Werte stiegen auf über 8 mg/dl an, so daß erneut hochdosiert Steroide sowie ATG eingesetzt wurden. Das Lyell-Syndrom sprach auf die ATG- Gabe nicht an, so daß von Tag 72 bis 76 nochmals das erfindungsgemäße Antikörperpräparat kombiniert mit anti-TNF appliziert wurde. Während hierunter das Lyell-Syndrom zum Stillstand kam, stand jetzt ein zunehmendes hepatorenales Syndrom im Vordergrund, der Patient verstarb am Tag 77 mit den Zeichen der Leber- und Niereninsuffizienz.2. A 31 year old male patient (B) was diagnosed in acute phase of chronic myeloid leukemia by one HLA-identical foreign donor transplanted bone marrow. Com The 9-year course of the Disease a myelofibrosis with secondary hapato and Spenomegaly and signs of liver damage. This Patient developed GvHD grade II-III on day 16 after KMT of skin and liver, which continue the cyclosporine Prophylaxis first with anti-TNF antibody and high dose steroid administration was treated. With progressive Bilirubin and transaminase increases under this treatment a 7 day ATG cycle was added on day 20. While bilirubin initially declined, The skin rash flared again on day 32 after KMT a grade III of acute GvHD, making treatment with OKT3 under pentoxifylline protection was required. Also this treatment showed only a temporary effect Day 52 showed signs of skin, intestinal and liver GvHD (in each case grade III, thus the total grade of GvHD IV), so that treatment with the antibody preparation according to the invention (20 mg / day) was started on day 55. On the 1st day the antibody per-administration occurred 1 hour after the end of the infusion Symptoms of pulmonary spasticity and sinus tachycar the ones that were self-limited and after about 30 minutes ceased. Already on the 3rd day of administration of the invention Antibody preparation used was the skin GvHD of the Patients significantly decreased (grade I-II), and the diarrhea spoke with a drop from over 1400 ml to less than 500 ml. Because of an increasing increase already Start of therapy with a glutamate pyruvate transaminase (GPT) from over 150 U / ml increased transaminases to a maximum Therapy was interrupted on day 4 due to 1000 U / ml at this time an existing one in addition to the GvHD Viral hepatitis could not be excluded. In turn could when administering the antibody of the invention no negative effects on the blood count be taken care of. 3 days after interrupting the application of the antibody preparation was the skin symptoms in the sense Lyell syndrome progressed again, the values rose over 8 mg / dl, so that again high-dose steroids as well ATG were used. Lyell syndrome spoke to the ATG Not specified, so that from day 72 to 76 again antibody preparation according to the invention combined with anti-TNF was applied. While this includes Lyell syndrome for Came to a standstill, there was now an increasing hepatorial Syndrome in the foreground, the patient died on day 77 the signs of liver and kidney failure.

3. Bei einem 22 Jahre alten männlichen Patienten C wurde eine allogene KMT von einem HLA-identen Fremdspender wegen einer chronisch myeloischen Leukämie durchgeführt. Der Patient entwickelte bereits ab dem 10. Transplantationstag eine akute GvHD der Haut, die zunächst mit Corticosteroiden und anti-TNF-Antikörper unter Fortführung der Ciclosporinprophy laxe behandelt wurde. Nach primärem Ansprechen der Haut auf diese Behandlung zeigte sich unter Corticoidreduktion ab dem 34. Tag nach KMT eine erneute Zunahme, die die Behandlung mit polyklonalem ATG erforderlich machte. Auch diese Behandlung führte nur zu einer vorübergehenden Stabilisie rung der Haut-GvHD, bei mäßiger Aktivität wurde zunächst eine Erhaltungstherapie mit Corticosteroiden, CsA und wöchentlichen Gaben von MTX versucht. Bei eindeutiger Progression der Symptomatik wurde am 83. Tag nach KMT zusätzlich Thalidomid eingesetzt, diese Behandlung mußte allerdings wegen einer transienten neurologischen Symp tomatik im Sinne von Parästhesien im Trigeminusbereich nach wenigen Tagen wieder abgebrochen werden. Bei progredientem Hautexanthem wurde deshalb die Indikation zur Gabe des erfindungsgemäßen Präparates (Cocktail) nach Ausschöpfung der konventionellen Therapiemaßnahmen gesehen und mit dem Patienten eingehend besprochen. Vom 91. bis 98. Tag nach KMT wurden deshalb jeweils 2×7,5 mg des Cocktails appliziert, auch hier kam es unter den ersten Antikörpergaben jeweils zu kurzfristiger Dyspnoe durch Spastik sowie zur Urtikaria, die rasch auf Fenistil ansprach. Bei im weiteren Verlauf guter Verträglichkeit bildete sich das Hautexanthem allmählich zurück. Am 99. Tag nach KMT traten akute Wortfindungs störungen sowie Kopfschmerzen auf, ein daraufhin durch geführtes CCT zeigte hypodense Areale, die mit einer cerebralen Toxoplasmose vereinbar schienen. Die Therapie mit dem Cocktail wurde aufgrund dieser Entwicklung nicht fortgeführt, wobei ein kausaler Zusammenhang mit der Applikation des Cocktails unwahrscheinlich erscheint, da bereits vor Therapiebeginn neurologische Symptome aufgetre ten waren. Die cerebrale Toxoplasmose konnte im weiteren Verlauf bestätigt werden, der Patient entwickelte vier Monate nach KMT auf dem Boden dieser Herde eine cerebrale Blutung, an der er schließlich am 124. Tag nach KMT ver starb. Im ganzen Verlauf war dabei die Haut-GvHD des Patienten trotz allmählicher Reduktion der Steroidmedikation nicht mehr aufgeflammt, so daß von einer dauerhaften Wirkung des Cocktails ausgegangen werden muß.3. A 22 year old male patient C had one allogeneic KMT from a HLA-identical donor because of a chronic myeloid leukemia performed. The patient developed one from the 10th day of transplantation acute skin GvHD, initially with corticosteroids and anti-TNF antibody continued with cyclosporine propy was treated lax. After primary skin response this treatment was shown with corticoid reduction from the 34th day after KMT a renewed increase in treatment with polyclonal ATG. This too Treatment only resulted in temporary stabilization skin GvHD, with moderate activity initially maintenance therapy with corticosteroids, CsA and tried weekly gifts from MTX. With clear Progression of symptoms was seen on the 83rd day after KMT additionally thalidomide was used, this treatment had to however due to a transient neurological symp tomato in the sense of paresthesia in the trigeminal area can be canceled within a few days. With progressive Skin rash was therefore the indication for the administration of the preparation according to the invention (cocktail) after exhaustion seen the conventional therapy measures and with the Patients discussed in detail. From the 91st to the 98th day after KMT 2 × 7.5 mg of the cocktail were therefore applied in each case, here too, the first antibody doses occurred short-term dyspnea due to spasticity and urticaria, the responded quickly to Fenistil. With good in the further course The skin rash gradually became tolerable back. Acute word finding occurred on the 99th day after KMT disorders as well as a headache, followed by a guided CCT showed hypodense areas with a Cerebral toxoplasmosis seemed compatible. Therapy with the cocktail was not due to this development continued, with a causal relationship with the Application of the cocktail seems unlikely because neurological symptoms appear before therapy begins were. The cerebral toxoplasmosis could in the further Course confirmed, the patient developed four Months after KMT on the floor of this herd a cerebral Bleeding, on which he finally died on the 124th day after KMT died. Throughout the course, the skin GvHD of the Patients despite a gradual reduction in steroid medication no longer flared, so that it has a lasting effect of the cocktail must be gone.

Zusammenfassend kann zur Wirksamkeit des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperpräparates (anti-CD5/anti-CD7) bei den Patienten A und B festgestellt werden:In summary, the effectiveness of the invention monoclonal antibody preparation (anti-CD5 / anti-CD7) in the Patients A and B are diagnosed:

a) The patients occurred despite massive pretreatment with various anti-T cell antibodies when 20 mg / day (patients A and B) or 2 × 7.5 mg / day (pa tient C) of the antibody preparation according to the invention Improvement in the symptoms of GvHD on patient B on the skin and intestines was quick and extremely impressive and Patient C on the skin over 25 days after discontinuation of the Therapy stopped.
b) The acute tolerance of that used according to the invention Antibody preparation was compared to that of OKT3 only with additional protection with anti-TNF antibodies, high-dose steroids and / or pentoxifylline performed can become significantly better. In particular, it did not happen the hyperpyrexia that occurs regularly at OKT3 or Signs of respiratory insufficiency, moreover, the observed as an expression of a first dose response interpreted symptoms in both cases transiently and not in need of treatment.
c) Haematological side effects as with the administration of ATG and OCT3 could not be observed.
d) The courses had to be fateful for the patients to be viewed as. Pulmonary infiltrates at the Patient A and liver damage in patient B as well as cerebral toxoplasmosis in patient C were before existing. Interstitial pneumonia and liver failure are common causes of death in patients with refractory GvHD and on the one hand directly associated with GvHD, others partly as a result of months of immunosuppressi ven treatment.
e) Based on the observations of use, it can be stated that the antibody preparation according to the invention is sufficient for the acute tolerability achieved the desired effect and no further than the changes described Toxicity related to haematopoiesis or more important Organ functions occur.

Example 5

Der 20 Jahre alte Patient D wurde zur allogenen KMT in 2. Remission einer T-ALL überwiesen. Bei Aufnahme zeigte er bereits wieder ein Rezidiv der Grunderkrankung mit multiplen bis fünfmarkstückgroßen Hautinfiltraten im Stammbereich und einer Vermehrung der Blastenzahl im peripheren Blut auf 4%. Da der Patient während vorangehender Chemotherapien schwere Komplikatio nen im Sinne einer Pneumonie mit ARDS erlitten hatte, erschien eine erneute Chemotherapie vor Durchführung der KMT zu riskant, andererseits war bei Beginn der Konditionierung ohne vorausgehen de Tumorreduktion eine ungünstige Ausgangssituation für die KMT zu befürchten. Da die leukämischen Zellen des Patienten beim Rezidiv die T-Zell-Marker CD5 und CD7 getragen hatten, entschloß man sich in dieser Situation nach eingehender Aufklärung des Patienten zur Durchführung einer Behandlung mit dem Cocktail zur Tumorreduktion: Der Cocktail wurde über drei Tage in einer Dosis von 2×7,5 mg/Tag appliziert. Zur Vermeidung von First Dose Reaktionen, die aufgrund der gewünschten Zerstörung der großen Tumormasse zu erwarten war, wurde von der 1. Applikation Prednisolon in einer Dosis von 100 mg appliziert: Unmittelbar nach Ende der 1. Cocktail-Infusion klagte der Patient über Juckreiz, der innerhalb weniger Minuten von der Ausbildung einer fleckigen Urtikaria zum Teil im Gebiet der Leukämieherde, zum Teil im gesunden Hautbereich gefolgt wurde. Gleichzeitig gab der Patient eine erschwerte Atmung an, die die Gabe von Sauerstoff erforderlich machte. Nach Gabe von Antihistaminika und 2×100 mg Prednisolon besserte sich die Urtikaria innerhalb von 10 Minuten, die Dyspnose nach etwa einer Stunde. Weitere Reaktionen wie Fieberanstieg oder Herzrhythmusstörungen wurden nicht beobachtet, die weiteren Antikörpergaben wurden ohne jegliche Reaktionen gut vertragen. Bereits am 2. Tag der erfindungsgemäßen Behandlung zeigten die größeren Hautinfiltrate einen deutlichen Rückgang sowohl der Ausdehnung als auch der Dicke, der sich im weiteren Verlauf fortsetzte. Am vierten Tag, dem Tag der ersten Ganzkör perbestrahlung zur KMT, waren sie praktisch nicht mehr nachweis bar. Parallel dazu zeigte das periphere Blutbild am zweiten Tag der Verabreichung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper präparates ein Verschwinden der zirkulierenden Blasten, das Knochenmark am vierten Tag der Behandlung eine Vollremission. Insgesamt muß davon ausgegangen werden, daß die Applikation des Cocktails zu der beabsichtigten Tumorreduktion bei Ausbleiben schwerer Reaktionen im Sinne eines Tumorlysesyndroms führte. Der weitere Transplantationsverlauf war bis auf eine ab dem vierten bis zum sechsten Tag bestehende Kollapsneigung, die am ehesten einem postfunktionellen Syndrom nach Liquorpunktion zuzuordnen war, komplikationsarm. Der Patient konnte kurze Zeit später mit normaler hämatologischer Rekonstitution und dem Bild einer Vollremission in die ambulante Betreuung entlassen werden.The 20 year old patient D became an allogeneic KMT in 2. Remission of a T-ALL transferred. When shooting, he already showed again a recurrence of the underlying disease with multiple up five-mark-sized skin infiltrates in the trunk area and one Increase in peripheral blast count to 4%. Since the Patient complications severe during previous chemotherapy had suffered from ARDS pneumonia re-chemotherapy before the KMT is too risky, on the other hand, there was no precedence at the start of conditioning de Tumor reduction is an unfavorable starting point for KMT to fear. Since the patient's leukemic cells when Relapsed who had carried the T cell markers CD5 and CD7 in this situation, after thorough clarification of the Patients undergoing treatment with the cocktail Tumor reduction: The cocktail was dosed over three days of 2 × 7.5 mg / day. To avoid First Dose Reactions due to the desired destruction of the large Tumor mass was expected from the 1st application Prednisolone applied in a dose of 100 mg: Immediately after the end of the first cocktail infusion, the patient complained Itching that occurs within minutes of training one spotty urticaria partly in the area of the leukemia focus, to Part was followed in the healthy skin area. At the same time, the Patient has difficulty breathing, which is the addition of oxygen made necessary. After administration of antihistamines and 2 × 100 mg Prednisolone improved urticaria within 10 minutes, the dyspnosis after about an hour. More reactions like No increase in fever or irregular heartbeat was observed the further administration of antibodies became good without any reactions tolerate. Already on the 2nd day of the treatment according to the invention the larger skin infiltrates showed a significant decrease both the extent and the thickness, which changes further Course continued. On the fourth day, the day of the first whole body exposure to KMT, they were practically no longer detectable bar. In parallel, the peripheral blood count showed on the second day the administration of the monoclonal antibody according to the invention prepares a disappearance of the circulating blasts, the Bone marrow full remission on the fourth day of treatment. Overall, it must be assumed that the application of the Cocktails for the intended tumor reduction in the absence severe reactions in the sense of a tumor lysis syndrome. Of the further course of transplantation was except for one from the fourth the tendency to collapse existing until the sixth day, most likely to be assigned to a post-functional syndrome after cerebrospinal fluid puncture was, low complications. The patient was able to join shortly afterwards normal hematological reconstitution and the image of a Full remission to be discharged into outpatient care.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungs gemäße monoklonale Antikörperpräparat bei ausreichender Akut- Verträglichkeit die erwünschte Wirkung einer Vollremission erzielte und über die geschilderten Veränderungen hinaus keine weiteren Toxizitäten hinsichtlich der Hämatopoese oder wichtiger Organfunktionen auftraten.In summary, it can be stated that the invention appropriate monoclonal antibody preparation with sufficient acute Compatibility is the desired effect of a full remission achieved and none beyond the described changes other toxicities related to hematopoiesis or more important Organ functions occurred.

Claims

1. Medicament for the treatment of T-cell-specific immune reactions and T-cell leukemia, characterized in that it contains four monoclonal antibodies differing specificity as an active substance, two of which against essentially non-overlapping epitopes of the CD5 lymphocyte marker and two are directed against essentially non-overlapping epitopes of the CD7 lymphocyte marker.

2. Medicament according to claim 1, characterized in that the monoclonal antibodies of the rat IgG2b, mouse IgG2a, mouse IgG2b, human IgG1 or human IgG3.

3. Medicament according to claims 1 or 2, characterized records that the antibodies of cell lines according to DSM ACC 2113, DSM ACC 2112, DSM ACC 2115 and DSM ACC 2114 be formed.

4. Medicament according to one of claims 1 to 3, characterized characterized in that it continues to have two monoclonal antibodies different specificity, which against non- overlapping epitopes of another lymphocyte marker are directed.

5. Medicament according to one of claims 1 to 4, characterized characterized in that at least one antibody with a toxic component is conjugated.

6. Medicament according to claim 5, characterized in that the toxic component is ricin or a radionuclide.

7. Medicament according to one of claims 1 to 6, characterized characterized in that the antibodies are genetically engineered by Chimerize, dimerize and / or fragment modifi are adorned.

8. Medicament according to one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the antibodies are coupled to agents that are a physical separation and / or anrei Protection and / or depletion of the target cells possible chen.

9. Medicament according to claim 8, characterized in that the agents enable coupling on membranes.

10. Medicament according to claim 8, characterized in that the agents are magnetic particles.

11. Medicament according to one of claims 1 to 10, characterized characterized that it is in an intravinous application suitable form.

12. Use of the medicament according to one of claims 1 to 11 to reduce the number of leukemia cells in vivo.

13. Use of the medicament according to one of claims 1 to 11 for the vitro treatment of autologous, for transplantation bone marrow to reduce leukemia cells.

14. Use of the medicament according to one of claims 1 to 11 for the reduction of immune competent cells for prevention and / or treating a graft versus host response allogeneic bone marrow transplant.

15. Use according to claim 14 for the in vitro treatment of Allogeneic donor bone marrow before transplantation.

16. Use of the medicament according to one of claims 1 to 11 for the reduction of immune competent cells for prevention and / or treatment of organ transplant rejections ions.

17. Use of the medicament according to one of claims 1 to 11 for the treatment of autoimmune diseases.