DE4310516A1 - Lipoprotein (a) peptides and their use - Google Patents
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Abstract
Description
Gegenstand der Erfindung sind Peptide, die eine Teil sequenz von Lipoprotein (a) aufweisen, sowie deren Verwen dung zur affinitätschromatographischen Aufreinigung von Antikörpern, als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern sowie als Standard in einem immunologischen Test oder als kompetitierendes Hapten in einem Agglutinationstest.The invention relates to peptides that are part Show sequence of lipoprotein (a), and their use for affinity chromatographic purification of Antibodies, as an immunogen for the production of antibodies as well as standard in an immunological test or as competitive hapten in an agglutination test.
Eine erhöhte Konzentration von Lipoprotein (a) (Lp(a)) stellt einen von der LDL-Konzentration unabhängigen Risi kofaktor für einen Herzinfarkt oder Schlaganfall dar (H.- C. Guo et al., Journal of Lipid Research 30 (1989), 23-37). Die Bedeutung dieses Risikofaktors für die Diagnostik liegt insbesondere darin, daß die Lp(a)-Konzentration nicht durch Ernährungsgewohnheiten oder eine Therapie mit Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase-Inhibitoren beeinflußt wird, so daß über die Bestimmung der Lp(a)-Konzentration ein wichtiger Hinweis auf eine genetische Disposition für einen Herzinfarkt oder Schlaganfall erhalten werden kann (C. Labeur et al., Clinical Chemistry 35 (1989), 1380-1384). Der spezifische diagnostische Nachweis von Lp(a) wird jedoch dadurch erschwert, daß Lp(a) einerseits in seinem hohen Gehalt an Cholesterinestern und dem Bestand teil Apoprotein B100 dem LDL sehr ähnlich ist, anderer seits das Lp(a) von LDL unterscheidende Apoprotein (a) eine sehr hohe Homologie zum Plasminogen aufweist (H.-C. Guo et al., Journal of Lipid Research 30 (1989), 23-37). Die durch Immunisierung mit Lp(a) erhaltenen Antiseren reagieren daher nicht nur mit Lp(a), sondern in erhebli chem Umfang auch mit LDL und/oder Plasminogen.An increased concentration of lipoprotein (a) (Lp (a)) poses a risk independent of the LDL concentration cofactor for a heart attack or stroke (H.- C. Guo et al., Journal of Lipid Research 30 (1989), 23-37). The importance of this risk factor for diagnostics lies in particular in that the Lp (a) concentration not through eating habits or having therapy Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitors affected is so that the determination of the Lp (a) concentration an important indicator of a genetic disposition for a heart attack or stroke can be received (C. Labeur et al., Clinical Chemistry 35 (1989), 1380-1384). The specific diagnostic evidence of Lp (a) is complicated by the fact that Lp (a) on the one hand in its high content of cholesterol esters and the stock some apoprotein B100 is very similar to LDL, others Apoprotein (a) differentiating Lp (a) from LDL has a very high homology to plasminogen (H.-C. Guo et al., Journal of Lipid Research 30 (1989) 23-37). The antisera obtained by immunization with Lp (a) therefore react not only with Lp (a), but in elevation chem scope also with LDL and / or plasminogen.
Um dennoch möglichst spezifisch Lp(a) nachweisen zu kön nen, wurden Antiseren gegen Lp(a) durch eine aufwendige immunadsorptive Reinigung an LDL, Lp(a) oder Apolipo protein (a) aufgereinigt (Kraft et al., Arteriosclerosis 8 (1988), 212-216). Daneben wurde versucht, einen spezifi schen Lp(a)-Nachweis über eine spezielle ELISA-Testführung zu erreichen (Fless et al., Journal of Lipid Research 30 (1989), 651-662). Hierbei wird z. B. ein Antikörper gegen das Apolipoprotein (a) zur Immobilisierung von nachzuwei sendem Lp(a) aus der Probe verwendet und ein Antikörper gegen das Apolipoprotein B100 zum Nachweis von immobili siertem Lp(a) eingesetzt. Diese Verfahren sind jedoch sehr aufwendig. Zudem ist bei den physiologischen Konzentra tionen von Lp(a) (bis zu über 1 mg/ml) für eine Bestimmung gemäß dem ELISA-Prinzip eine hohe (100- bis 1000fache) Probenverdünnung erforderlich, die sehr störanfällig ist.In order to be able to demonstrate Lp (a) as specifically as possible antisera against Lp (a) were elaborate immunoadsorptive cleaning on LDL, Lp (a) or Apolipo protein (a) purified (Kraft et al., Arteriosclerosis 8 (1988), 212-216). In addition, an attempt was made to specify a specific Lp (a) detection via a special ELISA test procedure to achieve (Fless et al., Journal of Lipid Research 30 (1989), 651-662). Here, for. B. an antibody against the apolipoprotein (a) for the immobilization of detection Send Lp (a) from the sample and an antibody against the apolipoprotein B100 for the detection of immobili based Lp (a) used. However, these procedures are very complex. In addition, the physiological concentration ions of Lp (a) (up to over 1 mg / ml) for one determination a high (100 to 1000 times) according to the ELISA principle Sample dilution required, which is very susceptible to interference.
Aufgabe der Erfindung war es daher, eine einfachere Auf reinigung von Antikörpern gegen Lp(a) sowie ein zuverläs sigereres Nachweisverfahren zur spezifischen Bestimmung von Lp(a) zur Verfügung zu stellen.The object of the invention was therefore to simplify cleaning of antibodies against Lp (a) and a reliable more sophisticated detection method for specific determination by Lp (a).
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Peptid, das eine der in SEQ ID NO: 1-8 gezeigten Sequenzen enthält und im CD- Spektrum eine negative Bande zwischen 190 und 200 nm zeigt. In dem Fachmann geläufiger Weise kann davon ausge gangen werden, daß Peptide, die nur einen Teil der in SEQ ID NO 1-8 gezeigten Sequenzen enthalten, in analoger Weise wirken und verwendet werden können, sofern sie mindestens vier Aminosäuren enthalten.This problem is solved by a peptide that is one of the contains sequences shown in SEQ ID NO: 1-8 and in CD- Spectrum a negative band between 190 and 200 nm shows. This can be assumed in a manner familiar to the person skilled in the art that peptides that are only a part of the SEQ ID NO 1-8 contain sequences shown, in an analogous manner act and can be used, provided that they at least contain four amino acids.
Wesentlich für die Eignung der erfindungsgemäßen Peptid antigene ist, daß sie nicht in einer definierten gefalte ten Struktur, sondern linear vorliegen. Eine solche lineare Struktur wird auch als random-coil-Struktur bezeichnet. Ob für ein Oligopeptid eine solche Struktur vorliegt, läßt sich durch CD-Spektroskopie überprüfen. Ein Peptid mit random-coil-Struktur besitzt zwischen 190 und 200 nm im CD-Spektrum eine negative Bande (vgl. Ann. Rev. Biophys. Chem. 17 (1988), 145-166).Essential for the suitability of the peptide according to the invention Antigens is that they are not in a defined fold structure, but linear. Such linear structure is also called a random coil structure designated. Such a structure for an oligopeptide can be checked by CD spectroscopy. A Peptide with a random coil structure has between 190 and 200 nm in the CD spectrum a negative band (see Ann. Rev. Biophys. Chem. 17: 145-166 (1988).
Die erfindungsgemäßen Peptide werden in bekannter Weise synthetisch hergestellt, vorzugsweise mittels Fluorenyl oxycarbonyl-Festphasen-Synthese.The peptides according to the invention are in a known manner synthetically produced, preferably by means of fluorenyl oxycarbonyl solid phase synthesis.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß mit Hilfe dieser Peptide in einem einzigen affinitätschromatographi schen Schritt Antikörper gegen Lp(a) erhalten werden können, welche nur eine geringe Reaktivität mit LDL und/oder Plasminogen aufweisen. Unter einer geringen Reaktivität ist dabei zu verstehen, daß die Kreuzreaktivi tät mit LDL und/oder Plasminogen maximal 1,0%, bezogen auf die Reaktivität mit Lp(a), beträgt.Surprisingly, it has been shown that with the help of these peptides in a single affinity chromatography antibodies against Lp (a) can be obtained which have low reactivity with LDL and / or have plasminogen. Under a minor Reactivity is understood to mean that the cross reactiv activity with LDL and / or plasminogen maximum 1.0% on the reactivity with Lp (a).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Ver wendung eines erfindungsgemäßen Peptids zur affinitäts chromatographischen Aufreinigung von Antikörpern gegen Lp(a), wobei man das Peptid an ein Trägermaterial bindet, an dem dann der Antikörper in an sich bekannter Weise affinitätschromatographisch aufgereinigt werden kann. Another object of the invention is therefore the Ver use of a peptide according to the invention for affinity chromatographic purification of antibodies against Lp (a), whereby the peptide is bound to a carrier material, on which then the antibody in a manner known per se can be purified by affinity chromatography.
Als Trägermaterial eignen sich alle üblicherweise in der Affinitätschromatographie eingesetzten Trägermaterialien, vorzugsweise wird Sepharose-AH (Pharmacia LKB) oder Affi- Gel 10 (BioRad) verwendet. Die Bindung des Peptids an Sepharose-AH erfolgt dabei in bekannter Weise durch Akti vierung des Peptids mit Maleinimidobenzoyl-N-hydroxy succinimidester (MBS) oder Glutardialdehyd. Die Bindung an Affi-Gel 10 erfordert keine Aktivierung des Peptids und erfolgt nach Angaben des Herstellers. Die Aufreinigung des Antiserums über die so erhaltene Affinitätschromato graphiematrix erfolgt in an sich bekannter Weise durch Auftragen des Antiserums, Waschen mit einem Puffer hoher Ionenstärke und anschließender Elution mit einem Puffer geringer Ionenstärke und einem pH-Wert unter 5. Vorzugs weise wird mit PBS (nach Dulbecco und Vogt, J. Exp. Med. 99 (1954), 167-182)/0,5 mol/l Natriumchlorid gewaschen und mit 0,2 mol/l Glycin HCl pH 2,6 eluiert. Die so erhal tenen Antikörper zeigen nur eine geringe Reaktivität mit LDL und Plasminogen.All are usually suitable as carrier materials in the Affinity chromatography used carrier materials, Sepharose-AH (Pharmacia LKB) or Affi- Gel 10 (BioRad) used. Binding of the peptide to Sepharose-AH is done in a known manner by Akti cation of the peptide with maleimidobenzoyl-N-hydroxy succinimide ester (MBS) or glutardialdehyde. Binding to Affi-Gel 10 does not require activation of the peptide and takes place according to the manufacturer. The purification of the Antiserums via the affinity chromato thus obtained graphiematrix is carried out in a manner known per se Apply the antiserum, wash with a high buffer Ionic strength and subsequent elution with a buffer low ionic strength and a pH below 5th preference wise with PBS (according to Dulbecco and Vogt, J. Exp. Med. 99 (1954), 167-182) / 0.5 mol / l sodium chloride and eluted with 0.2 mol / l glycine HCl pH 2.6. The so get Antibodies show only a low reactivity with LDL and plasminogen.
Weiterhin eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide als Immunogen oder Hapten zur Herstellung von Antikörpern gegen Lp(a), die nur eine geringe Reaktivität mit LDL oder Plasminogen aufweisen.The peptides according to the invention are also suitable as Immunogen or hapten for the production of antibodies against Lp (a), which has little reactivity with LDL or Have plasminogen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Ver wendung eines erfindungsgemäßen Peptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern gegen Lp(a), die nur eine geringe Reaktivität mit LDL oder Plasminogen aufweisen. Die Peptide können dabei als solche oder gebunden an ein Trägermolekül zur Immunisierung eingesetzt werden. Die Immunisierung erfolgt in an sich bekannter Weise in den hierfür üblicherweise verwendeten Tieren. Vorzugsweise werden Kaninchen, Ziegen, Ratten, Schafe oder, zur Her stellung monoklonaler Antikörper, Mäuse verwendet. Das erhaltene Antiserum kann vorzugsweise wie oben beschrieben affinititätschromatographisch aufgereinigt werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden die Milzzellen der immunisierten Tiere nach bekannten Verfahren immorta lisiert und diejenigen immortalisierten Zellen, deren Kulturüberstand einen Antikörper gegen Lp(a) aufweist, kloniert. Ob ein Kulturüberstand einen Antikörper gegen Lp(a) aufweist, wird in üblicher Weise über einen ELISA- Test bestimmt.Another object of the invention is therefore the Ver use of a peptide according to the invention as an immunogen for Production of antibodies against Lp (a), which is only one have low reactivity with LDL or plasminogen. The peptides can be used as such or bound to a Carrier molecule can be used for immunization. The Immunization takes place in a manner known per se in the animals commonly used for this. Preferably rabbits, goats, rats, sheep or, to the Her position monoclonal antibodies, mice used. The Antiserum obtained can preferably be as described above be purified by affinity chromatography. For The spleen cells are producing monoclonal antibodies of the immunized animals by known methods immorta and those immortalized cells whose Culture supernatant has an antibody against Lp (a), cloned. Whether a culture supernatant has an antibody against Lp (a) is in the usual way via an ELISA Test determined.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Peptide liegt darin, daß sie in großen Mengen in einheitlicher Zusammen setzung erhalten werden können.Another advantage of the peptides according to the invention is in that they come together in large quantities in a uniform manner setting can be obtained.
Sie eignen sich daher besser als Standard für quantitative Bestimmungen von Lp(a) als das aus natürlichen Quellen isolierte, sehr uneinheitliche Material.They are therefore better suited as a standard for quantitative Determinations of Lp (a) as that from natural sources isolated, very inconsistent material.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Ver wendung eines erfindungsgemäßen Peptids als Standard in einem immunologischen Test zur quantitativen Bestimmung von Lp(a). Die immunologische Bestimmung von Lp(a) kann dabei nach allen bekannten Verfahren erfolgen. In bestimm ten Fällen, wie z. B. bei nicht kompetitiven Testsystemen, ist es erforderlich, mehrere erfindungsgemäße Peptide gleicher oder unterschiedlicher Sequenz an ein Trägermole kül zu binden.Another object of the invention is therefore the Ver use of a peptide according to the invention as a standard in an immunological test for quantitative determination from Lp (a). The immunological determination of Lp (a) can take place according to all known methods. In certain ten cases, such as B. in the case of non-competitive test systems, it is necessary to use several peptides according to the invention same or different sequence to a carrier mole tie cool.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwen dung eines erfindungsgemäßen Peptids als Hapten in einem kompetitiven immunologischen Test. Vorzugsweise werden dazu die erfindungsgemäßen Peptide biotinyliert, an eine mit Streptavidin beschichtete feste Phase gebunden und der kompetitive Test in üblicher Weise nach dem ELISA-Prinzip durchgeführt. Das erfindungsgemäße Peptid kann jedoch bei einem kompetitiven Test nach dem ELISA-Prinzip auch an den Marker (Enzym, Fluoreszenzmarker) gebunden werden.Another object of the invention is the use formation of a peptide according to the invention as a hapten in one competitive immunological test. Preferably be for this purpose the peptides according to the invention are biotinylated to a solid phase coated with streptavidin and the competitive test in the usual way according to the ELISA principle carried out. However, the peptide according to the invention can a competitive test according to the ELISA principle also to the Markers (enzyme, fluorescent markers) are bound.
Bei einem Immunoassay nach dem ELISA-Prinzip ist aller dings bei den physiologischen Konzentrationen von Lp(a) eine hohe und damit zeitaufwendige und fehleranfällige Probenvorverdünnung erforderlich. Die hier vom Konzen trationsbereich her besser geeignetere turbidimetrische Bestimmungsmethode (TINIA = turbidimetrischer Inhibitions- Immunoassay) wurde bislang dadurch erschwert, daß Lp(a) sowohl mit polyklonalen als auch mit monoklonalen Antikör pern nur unter bestimmten Bedingungen ausreichende Trü bungssignale bewirkt. Eine solche ausreichende Trübung kann jedoch erreicht werden, wenn einzelne oder mehrere erfindungsgemäße Peptide an einen Träger gekoppelt werden und der erhaltene Komplex als Hapten im Agglutinationstest eingesetzt wird. Durch den zu bestimmenden Analyten wird diese Trübung dann in einem zur Menge des Analyten propor tionalen Ausmaß reduziert. Vorzugsweise werden 30 bis 40 Peptidmoleküle je Trägermolekül gekoppelt. Die Bindung des erfindungsgemäßen Peptids an den Träger kann dabei direkt über kovalente Bindungen erfolgen oder aber indirekt, z. B. durch Biotinylierung des Peptids und eine Streptavidin- Beschichtung des Trägermaterials. Als Trägermolekül werden dabei vorzugsweise Proteine wie Immunglobuline, Albumin, β-Galactosidase, Polymere wie Aminodextrane oder Polylysi ne oder Partikel wie Latex oder Gold, jeweils allein oder in Kombination miteinander, verwendet. Die Kopplung an das Trägermolekül erfolgt in bekannter Weise, z. B. mit Reagen zien wie Glutardialdehyd, Ethyldimethylaminopropylcarbo diimid, Maleinimidohexansäure-N-hydroxysuccinimidester oder anderen bekannten homo- und heterobifunktionellen Linkern.In an immunoassay based on the ELISA principle, everything is However, at the physiological concentrations of Lp (a) a high and therefore time-consuming and error-prone Sample pre-dilution required. This one from the Konzen range more suitable turbidimetric Determination method (TINIA = turbidimetric inhibition Immunoassay) has so far been complicated by the fact that Lp (a) with both polyclonal and monoclonal antibodies sufficient turbidity only under certain conditions exercise signals. Such a sufficient cloudiness however, can be achieved if single or multiple Peptides according to the invention are coupled to a carrier and the complex obtained as a hapten in the agglutination test is used. Through the analyte to be determined this turbidity is then proportional to the amount of analyte national scale reduced. Preferably 30 to 40 Peptide molecules coupled per carrier molecule. The binding of the Peptide according to the invention on the carrier can be directly take place via covalent bonds or indirectly, e.g. B. by biotinylation of the peptide and a streptavidin Coating of the carrier material. As a carrier molecule preferably proteins such as immunoglobulins, albumin, β-galactosidase, polymers such as aminodextrans or polylysi ne or particles such as latex or gold, each alone or in combination with each other. The coupling to that Carrier molecule is carried out in a known manner, for. B. with reagents such as glutardialdehyde, ethyldimethylaminopropylcarbo diimide, maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester or other known homo- and heterobifunctional Linkers.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Ver wendung eines erfindungsgemäßen Peptids als Lp(a)-Hapten in einem Agglutinationstest zur Bestimmung von Lp(a), wobei mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid an einen Träger gebunden wird, so daß sich bei Inkubation des dadurch gebildeten Komplexes mit einem Antikörper, der das entsprechende Lp(a)-Hapten erkennt, ein Agglutinat bildet, dessen Ausbildung in Gegenwart von freiem Lp(a) aus der Probe vermindert wird.Another object of the invention is therefore the Ver use of a peptide according to the invention as Lp (a) hapten in an agglutination test to determine Lp (a), wherein at least one peptide according to the invention on one Carrier is bound so that when the thus formed complex with an antibody that the recognizes corresponding Lp (a) hapten, forms an agglutinate, its formation in the presence of free Lp (a) from the Sample is reduced.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Lp(a) über einen kompetitiven Agglutinationstest durch Inkubation eines trägergebundenen Lp(a)-Haptens mit einem Antikörper gegen dieses Hapten und der zu analysierenden Probe und Messung des dabei auftretenden Meßsignals in Gegenwart und Abwesenheit der zu analysierenden Probe, wobei das träger gebundene Lp(a)-Hapten mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid enthält.Another object of the invention is finally a Method for the immunological determination of Lp (a) via a competitive agglutination test by incubation a carrier-bound Lp (a) hapten with an antibody against this hapten and the sample to be analyzed and Measurement of the measuring signal occurring in the presence and Absence of the sample to be analyzed, the sluggish bound Lp (a) hapten at least one according to the invention Contains peptide.
Der Agglutinationstest wird dabei in an sich bekannter Weise durchgeführt. Dazu wird z. B. zunächst das träger gebundene Lp(a)-Hapten mit einem Antikörper inkubiert, der dieses Hapten erkennt und daher einen Komplex mit dem trägergebundenen Lp(a)-Hapten bildet, der zu einem bestimmten Meßsignal, in der Regel einer bestimmten Trü bung der Reagenzlösung, führt. Nach Zugabe der zu analy sierenden Probe kompetiert freies Lp(a) aus dieser Probe mit dem trägergebundenen Lp(a)-Hapten um die Bindung an den Antikörper und verringert somit die Aggregation des trägergebundenen Lp(a)-Haptens durch den Antikörper und damit die Trübung. Die gemessene Trübungsabnahme wird verglichen mit der Trübungsabnahme, die durch Zugabe von bekannten Mengen eines Lp(a)-Standards erhalten wird, und aus dem Vergleich die Menge an Lp(a) in der zu analysie renden Probe ermittelt. Als Standard wird dabei vorzugs weise ein erfindungsgemäßes Peptid verwendet. Daneben kann der Agglutinationstest aber auch nach anderen dem Fachmann geläufigen Verfahren einer kompetitiven Testführung durch geführt werden. Z.B. kann das trägergebundene Lp(a)-Hapten auch gleichzeitig mit der Probe und dem Antikörper inku biert werden, wobei das freie Lp(a) aus der Probe mit dem trägergebundenen Hapten um die Bindung an den Antikörper konkurriert, so daß die beobachtete Agglutination umge kehrt proportional zu der Menge an freiem Lp(a) in der Probe ist. Eine weitere Möglichkeit ist, zunächst den Antikörper mit der Probe zu inkubieren, wodurch eine der Menge an freiem Lp(a) in der Probe entsprechende Menge an Antikörper gebunden wird. Nach Inkubation mit dem träger gebundenen Lp(a)-Hapten erfolgt eine Agglutination, die der Menge an freiem Lp(a) in der Probe direkt proportional ist.The agglutination test is known per se Way performed. For this, z. B. first the carrier bound Lp (a) hapten with an antibody that recognizes this hapten and therefore a complex with the carrier-bound Lp (a) hapten that leads to a certain measurement signal, usually a certain cloudy exercise of the reagent solution. After adding the analy sample competes free Lp (a) from this sample with the carrier-bound Lp (a) hapten to bind to the antibody and thus reduces the aggregation of the carrier-bound Lp (a) haptens by the antibody and with it the cloudiness. The measured decrease in turbidity is compared to the decrease in turbidity caused by the addition of known amounts of an Lp (a) standard is obtained, and from the comparison the amount of Lp (a) in the analysis determined sample. The default is preferred as a peptide according to the invention used. Besides that, can the agglutination test according to others to the expert common procedures of competitive testing be performed. E.g. the carrier-bound Lp (a) hapten also simultaneously with the sample and the antibody inku be beer, whereby the free Lp (a) from the sample with the carrier-bound hapten for binding to the antibody competes so that the observed agglutination reversed returns in proportion to the amount of free Lp (a) in the Sample is. Another option is to start with Incubate antibody with the sample, causing one of the Amount of free Lp (a) in the sample corresponding amount Antibody is bound. After incubation with the carrier bound Lp (a) hapten there is an agglutination that directly proportional to the amount of free Lp (a) in the sample is.
Die Bestimmung der Lp(a)-Konzentration erfolgt dabei entweder auf molarer Basis (bei Verwendung eines Peptides, das nur einmal in Lp(a) vorkommt, z. B. das Peptid der in SEQ ID NO 8 gezeigten Sequenz) oder auf Massenbasis (die bei Verwendung eines Peptides, das mehrmals per Lp(a)- Molekül vorkommt, z. B. die Peptide mit der in SEQ ID NO 1-7 gezeigten Sequenz).The Lp (a) concentration is determined either on a molar basis (when using a peptide, that occurs only once in Lp (a), e.g. B. the peptide in SEQ ID NO 8 sequence shown) or on a mass basis (the when using a peptide which is repeated several times via Lp (a) - Molecule occurs, e.g. B. the peptides with that in SEQ ID NO 1-7 sequence shown).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Lp(a) durch Inkubation eines Marker-gebundenen Lp(a)-Haptens mit einem Antikörper gegen dieses Hapten und der zu analysierenden Probe und Messung des dabei auftretenden Meßsignals in Gegenwart und Abwesenheit der zu analysierenden Probe, dadurch gekenn zeichnet, daß das Marker-gebundene Lp(a)-Hapten mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid enthält. Als Marker können dabei alle üblicherweise verwendeten Marker wie Enzyme, Enzymfragmente, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzfarb stoffe und radioaktive Isotope verwendet werden. Vorzugs weise erfolgt die Bestimmung nach dem FPIA-, EMIT- oder CEDIA-Prinzip.Another object of the invention is a method for the immunological determination of Lp (a) by incubation a marker-bound Lp (a) hapten with an antibody against this hapten and the sample to be analyzed and Measurement of the measuring signal occurring in the presence and Absence of the sample to be analyzed, thereby identified records that the marker-bound Lp (a) hapten at least contains a peptide according to the invention. Can be used as a marker all commonly used markers such as enzymes, Enzyme fragments, chemiluminescent or fluorescent color substances and radioactive isotopes can be used. Preferential the determination is made according to the FPIA, EMIT or CEDIA principle.
Beim Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay (FPIA) wird das Hapten mit einer fluoreszierenden Substanz markiert. Diese Moleküle absorbieren Lichtenergie und geben sie in einem Zeitraum von etwa 10-8 sec als Licht längerer Wellenlänge wieder ab. Wird der Fluorophor durch polarisiertes Licht angeregt, so hängt der Polarisationsgrad des emittierten Lichts von der Rotationsgeschwindigkeit des Tracers (Analyt-Fluorophor-Konjugat) ab. Die Bindung des Tracers an einen Antikörper behindert die Rotation des Fluoro phors. Der freie Tracer rotiert schneller und depolari siert das anregende Licht mehr als der größere, trägere Antikörper-Tracer-Komplex. Je mehr der Analyt in der Probe vorhanden ist, desto weniger Antikörper-Tracer-Komplexe entstehen und desto weniger Fluoreszenzpolarisation ist meßbar (W. Dandliker et al., Journal of Exp. Med. 122 (1965), 1029).In fluorescence polarization immunoassay (FPIA), the hapten is labeled with a fluorescent substance. These molecules absorb light energy and release it as light of a longer wavelength in a period of about 10 -8 sec. If the fluorophore is excited by polarized light, the degree of polarization of the emitted light depends on the rotational speed of the tracer (analyte-fluorophore conjugate). The binding of the tracer to an antibody hinders the rotation of the fluorophore. The free tracer rotates faster and depolarizes the exciting light more than the larger, slower antibody-tracer complex. The more the analyte is present in the sample, the fewer antibody-tracer complexes are formed and the less fluorescence polarization can be measured (W. Dandliker et al., Journal of Exp. Med. 122 (1965), 1029).
Bei der Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) wird das nachzuweisende Hapten so kovalent mit dem Marker enzym gekoppelt, daß die Enzymaktivität erhalten bleibt. Nach Bindung eines Antikörpers an den Haptenanteil wird die Substratbindung an das Enzym sterisch jedoch behin dert, so daß keine enzymatische Umsetzung des Substrats erfolgen kann. Wie beim CEDIA-Prinzip verdrängt dann auch hier das Antigen aus der zu bestimmenden Probelösung den Antikörper vom enzymgebundenen Hapten und ermöglicht so eine enzymatische Aktivität, die proportional zur Konzen tration des zu analysierenden Antigens in der Probelösung ist (Gunzer et al., Kontakte III, 1980, 3-11 und K. Rubenstein, Biochemical and Biophysical Research Communi cations 47 (1972), 846-851).At the Enzyme Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) the hapten to be detected becomes covalent with the marker enzyme coupled, that the enzyme activity is retained. After binding an antibody to the hapten portion however, the substrate binding to the enzyme is steric changes, so that no enzymatic conversion of the substrate can be done. As with the CEDIA principle, it also displaces here the antigen from the sample solution to be determined Antibody from the enzyme-bound hapten and thus enables an enzymatic activity proportional to the concentration tration of the antigen to be analyzed in the sample solution (Gunzer et al., contacts III, 1980, 3-11 and K. Rubenstein, Biochemical and Biophysical Research Communi cations 47 (1972), 846-851).
Beim CEDIA-Prinzip bewirkt das Antigen aus der zu analy sierenden Probe die Assoziation von allein jeweils inakti vem Enzymakzeptor und Enzymdonor zu einem aktiven Enzym, dessen Aktivität somit proportional zur Menge an Antigen in der zu analysierenden Probe ist (Henderson et al., Clinical Chemistry 32 (1986), 1637-1641). Zum Nachweis werden hierbei bestimmte Enzyme wie z. B. die β-Galactosi dase verwendet, die in zwei jeweils enzymatisch inaktiven Bestandteilen, nämlich einem großen Polypeptid (Enzym akzeptor) und einem kleinen Polypeptid (Enzymdonor) vor liegen, wobei diese Bestandteile spontan zu einem enzymatisch aktiven Protein assoziieren. An den Enzymdonor wird das als Analyt nachzuweisende Hapten derart gebunden, daß die Assoziation des Enzymdonors mit dem Enzymakzeptor zum aktiven Enzym durch diese Bindung nicht verhindert wird. Diese Assoziation wird aber dann gehemmt, wenn an den Antigen-Enzymdonor-Komplex ein Antikörper gegen das Antigen bindet. In einer Reagenzlösung, in der Enzym akzeptor, Antigen-Enzymdonor-Komplex und der entsprechende Antikörper vorliegen, kann daher kein aktives Enzym gebil det werden und es wird keine enzymatische Aktivität gemes sen. Nach Zugabe der Probelösung verdrängt nun das Antigen aus dieser Probelösung den Antikörper aus der Bindung an den Antigen-Enzymdonor-Komplex und ermöglicht so die Ausbildung des aktiven Enzyms.With the CEDIA principle, the antigen results from the analy sample inactivates the association alone an enzyme acceptor and an enzyme donor to an active enzyme, its activity is therefore proportional to the amount of antigen in the sample to be analyzed (Henderson et al., Clinical Chemistry 32 (1986), 1637-1641). As proof certain enzymes such as B. the β-galactosi dase uses that in two each enzymatically inactive Constituents, namely a large polypeptide (enzyme acceptor) and a small polypeptide (enzyme donor) lie, these components spontaneously to one Associate enzymatically active protein. To the enzyme donor the hapten to be detected as an analyte is bound in such a way that the association of the enzyme donor with the enzyme acceptor to the active enzyme is not prevented by this binding becomes. However, this association is inhibited when on the antigen-enzyme donor complex is an antibody against that Antigen binds. In a reagent solution, in the enzyme acceptor, antigen-enzyme donor complex and the corresponding Antibodies are present, therefore no active enzyme can be formed be det and no enzymatic activity is measured sen. After adding the sample solution, the antigen is displaced the antibody from the binding to this sample solution the antigen-enzyme donor complex and thus enables Formation of the active enzyme.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele zusammen mit den Sequenzprotokollen 1-8, welche die Sequenz der erfindungsgemäßen Peptide angeben, näher erläutert.The invention is illustrated by the following examples with the sequence listing 1-8, which the sequence of the Specify peptides according to the invention, explained in more detail.
Das Peptid mit der um ein C-terminales Cys verlängerten Sequenz SEQ ID NO 1 wird mittels Fluorenyloxycarb onyl (Fmoc)-Festphasensynthese hergestellt. Die Reaktionen werden an einem Labortec SP 640 Peptidsynthesizer (Labor tec, Schweiz) durchgeführt. Die Synthese erfolgt dabei an 5 g Wang-Harz (Polystyrol/1% Divinylbenzol) mit einer Beladung an Peptid von 0,5 mmol/g (entsprechend JACS 95 (1973), 1328). Die Kupplung erfolgt durch Inkubation des Harzes mit dem entsprechenden Fmoc-Aminosäurederivat (1 Äquivalent) sowie 1,2 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 1,1 Äquivalenten N-Hydroxybenzotriazol für 90 Min. bei Raumtemperatur in Dimethylformamid als Reaktionsmedium. Von den Fmoc-Aminosäurederivaten werden je 4 Äquivalente bezogen auf 1 Mol Ankergruppierung in folgender Reihenfol ge verwendet: Glutamin (mit Trityl.-Schutzgruppe), Alanin, Prolin, Threonin (mit tert. Butyl-Schutzgruppe), Glutamin säure (mit tert. Butylester-Schutzgruppe), Glutamin (mit Trityl-Schutzgruppe), Arginin (mit Pentamethylchroman- Schutzgruppe), Prolin, Glycin, Valin, Glutamin (mit Trityl-Schutzgruppe), Glutaminsäure (mit tert. Butylester- Schutzgruppe) und Cystein (mit Trityl-Schutzgruppe). Der Kupplungserfolg wird mittels Kaisertest (Anal. Biochem. 34 (1970), 595) geprüft. Nach der Kupplung wird die Fmoc- Gruppe durch Inkubation mit 20% Piperidin in Dimethyl formamid für 10-20 Min. bei Raumtemperatur abgespalten. Die Harzbeladung wird mittels UV-Absorption der frei gesetzten Fulven-Gruppe nach jeder Piperidinspaltung ermittelt. Nach vollständiger Synthese des Peptids beträgt der Beladungsgrad noch 0,43 mmol/g.The peptide with the one extended by a C-terminal Cys Sequence SEQ ID NO 1 is by means of fluorenyloxycarb onyl (Fmoc) solid phase synthesis. The reactions are used on a Labortec SP 640 peptide synthesizer (Labor tec, Switzerland). The synthesis takes place on 5 g Wang resin (polystyrene / 1% divinylbenzene) with one Peptide loading of 0.5 mmol / g (corresponding to JACS 95 (1973), 1328). The coupling is done by incubating the Resin with the corresponding Fmoc amino acid derivative (1 Equivalent) and 1.2 equivalents of dicyclohexylcarbodiimide and 1.1 equivalents of N-hydroxybenzotriazole for 90 min Room temperature in dimethylformamide as the reaction medium. 4 equivalents of each of the Fmoc amino acid derivatives based on 1 mole anchor grouping in the following order used: glutamine (with trityl protecting group), alanine, Proline, threonine (with tert. Butyl protecting group), glutamine acid (with tert. butyl ester protecting group), glutamine (with Trityl protecting group), arginine (with pentamethylchroman Protecting group), proline, glycine, valine, glutamine (with Trityl protecting group), glutamic acid (with tert. Butyl ester) Protecting group) and cysteine (with trityl protecting group). Of the Coupling success is achieved using the Kaisertest (Anal. Biochem. 34 (1970), 595) checked. After coupling, the Fmoc Group by incubation with 20% piperidine in dimethyl Split formamide for 10-20 minutes at room temperature. The resin load is released by means of UV absorption set fulven group after each piperidine cleavage determined. After complete synthesis of the peptide is the degree of loading is still 0.43 mmol / g.
Die Freisetzung des Peptids vom Harz erfolgt durch Inkuba tion mit 200 ml Trifluoressigsäure, 20 ml Ethandithiol, 20 ml m-Kresol und 10 ml Wasser für 30 Min. bei Raumtempe ratur. Die Reaktionslösung wird unter Sauerstoffausschluß anschließend mehrmals mit Toluol eingeengt und dann das Peptid mit peroxidfreiem Diethylether ausgefällt.The peptide is released from the resin by inkuba tion with 200 ml trifluoroacetic acid, 20 ml ethanedithiol, 20 ml of m-cresol and 10 ml of water for 30 minutes at room temperature maturity. The reaction solution is in the absence of oxygen then concentrated several times with toluene and then that Peptide precipitated with peroxide-free diethyl ether.
Zur Aufreinigung wird das erhaltene Rohmaterial unter N2- Atmosphäre über eine Sephadex-G10-Säule gereinigt. Es werden nach Lyophilisieren 2,4 g Material einer Reinheit von 54% gemäß RP-HPLC erhalten.For purification, the raw material obtained is cleaned under a N 2 atmosphere on a Sephadex G10 column. After lyophilization, 2.4 g of material with a purity of 54% according to RP-HPLC are obtained.
Zur weiteren Aufreinigung werden 400 mg dieses Peptids über eine präparative RP-HPLC-Säule (40 mm x 250 mm C18- Material, 5 µm, 300 Å) mit einem Wasser/Trifluoressigsäure zu Acetontril/Trifluoressigsäure-Gradienten gereinigt (Puffer A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Puffer B: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril 60 : 40 von 0% B nach 100% B in 60 min.). Nach Lyophilisation werden 97 mg weißes Material mit einer gemäß HPLC 97,2%igen Reinheit erhalten. Die Identität des erhaltenen Peptids wird mittels FAB-MS überprüft.For further purification, 400 mg of this peptide via a preparative RP-HPLC column (40 mm x 250 mm C18- Material, 5 µm, 300 Å) with a water / trifluoroacetic acid purified to acetone tril / trifluoroacetic acid gradient (Buffer A: 0.1% trifluoroacetic acid in water, buffer B: 0.1% trifluoroacetic acid in water / acetonitrile 60:40 from 0% B after 100% B in 60 min.). After lyophilization 97 mg of white material with a 97.2% HPLC Preserve purity. The identity of the peptide obtained is checked using FAB-MS.
Zur Biotinylierung eines Moläquivalents des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Peptidantigens wird das Peptid in einer Konzentration von 5 mg/ml in Argon-gesättigtem Kalium phosphatpuffer (0,1 mol/l pH 8,0) gelöst, mit 3 Äquivalen ten D-Biotinyl-E-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester (1 µmol gelöst in 5 µl Argon-gesättigtem Dimethylformamid) versetzt und 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren und Argonatmosphäre inkubiert. Sobald gemäß Kontrolle über analytische RP-HPLC die Ausgangsprodukte auf weniger als 5% abgenommen haben, wird der Reaktionsansatz direkt auf eine präparative RP-HPLC-Säule gegeben und das Produkt über einen 0,1% Trifluoressigsäure/Wasser zu 0,1% Tri fluoressigsäure/Acetonitril-Gradienten (0% bis 100% Acetonitril in 90 Min.) aufgereinigt. Das Produkt wird eingeengt und lyophilisiert, die Ausbeute beträgt zwischen 40 und 90%. Die Reinheit des erhaltenen Materials wird über HPLC, Kapillarelektrophorese und DC bestimmt, die Identität über FAB-MS und DC mit spezifischen Anfärbe reagenzien (p-Dimethylaminozimtaldehyd für den Gehalt an Biotin) sowie Gehaltsbestimmung über Mikroanalyse. For the biotinylation of a molar equivalent of that according to Example 1 peptide antigen obtained, the peptide is in a Concentration of 5 mg / ml in argon-saturated potassium phosphate buffer (0.1 mol / l pH 8.0) dissolved, with 3 equivalents ten D-biotinyl-E-aminocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester (1 µmol dissolved in 5 µl argon-saturated dimethylformamide) added and 2 h at room temperature with stirring and Incubated in an argon atmosphere. Once under control of analytical RP-HPLC the starting products to less than Have decreased 5%, the reaction batch is directly on a preparative RP-HPLC column and the product over a 0.1% trifluoroacetic acid / water to 0.1% tri fluoroacetic acid / acetonitrile gradients (0% to 100% Acetonitrile cleaned in 90 min.). The product will concentrated and lyophilized, the yield is between 40 and 90%. The purity of the material obtained will determined by HPLC, capillary electrophoresis and TLC, the Identity via FAB-MS and DC with specific stains reagents (p-dimethylamino cinnamaldehyde for the content of Biotin) and content determination via microanalysis.
Das Immunabsorbens wird wie von Chersi et al. (J. Immunol. Meth. 122 (1989), 285-289) beschrieben hergestellt. Hierzu wird Sepharose-AH (3 ml gepacktes Gel in 6 ml PBS) mit Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS, 5 mg/ml in Dimethylformamid) für 2 h bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Mischen behandelt. Überschüssiger MBS wird anschließend durch Zentrifugation bei 2000 g für 15 Min. bei 4°C entfernt. Um das Gelmaterial zu waschen, wird es in PBS resuspendiert und nochmals abzentrifugiert. Diese Waschzyklen werden noch mehrfach wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt werden 2 mg einer äquimolaren Mischung der Peptide mit den in SEQ ID NO 1-8 gezeigten Sequenzen in 4 ml PBS zum Gel hinzugegeben, vorsichtig gemischt und für 60 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wird daraufhin ad 10 mmol/l Mercaptoethanol aufgestockt, nochmals 30 Min. inkubiert, in eine kleine Säule gefüllt und mit PBS/10 mmol/l Mer captoethanol gewaschen. Vor der Aufreinigung der Antikör per wird das Gelmaterial dem folgenden Waschzyklus unterworfen. Gewaschen wird mit mindestens 3 Säulenvolumen PBS, 0,5 mmol/l NaCl/0,05% Tween 20, 30 mmol/l NaCl, 0,2 mol/l Glycin, pH 2,6 und 30 mmol/l NaCl. Anschließend wird das Gelmaterial mit PBS, pH 7,0 equilibriert und das den Antikörper enthaltende aufzureinigende Serum auf die Säule aufgetragen. Nach Waschschritten mit PBS, 0,5 mol/l NaCl/0,05% Tween 20 und 30 mmol/l NaCl wird der gebundene Antikörper mit 0,2 mol/l Glycin, pH 2,6 eluiert und direkt anschließend bei 4°C gegen PBS dialysiert.The immune absorbent is used as described by Chersi et al. (J. Immunol. Meth. 122 (1989), 285-289). For this, Sepharose-AH (3 ml packed gel in 6 ml PBS) with maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS, 5 mg / ml in dimethylformamide) for 2 h at room temperature treated with careful mixing. Excess MBS is then centrifuged at 2000 g for 15 Min. At 4 ° C removed. To wash the gel material is resuspended it in PBS and centrifuged again. These washing cycles are repeated several times. To the last centrifugation step 2 mg one equimolar mixture of the peptides with those in SEQ ID NO 1-8 added sequences shown in 4 ml PBS to the gel, mixed gently and for 60 min at room temperature incubated. The suspension is then ad 10 mmol / l Mercaptoethanol increased, incubated again for 30 minutes, filled into a small column and with PBS / 10 mmol / l Mer washed captoethanol. Before cleaning the antibody per the gel material the following wash cycle subject. Wash with at least 3 column volumes PBS, 0.5 mmol / l NaCl / 0.05% Tween 20, 30 mmol / l NaCl, 0.2 mol / l glycine, pH 2.6 and 30 mmol / l NaCl. Subsequently the gel material is equilibrated with PBS, pH 7.0 and the the serum to be purified containing the antibody to the Applied to the column. After washing steps with PBS, 0.5 mol / l NaCl / 0.05% Tween 20 and 30 mmol / l NaCl becomes the bound Antibody eluted with 0.2 mol / l glycine, pH 2.6 and directly then dialyzed against PBS at 4 ° C.
Die Spezifität der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Antikörper wird über einen Sandwich-Assay bestimmt. Dazu werden die folgenden Reagenzien verwendet:The specificity of the antibodies obtained according to Example 3 is determined using a sandwich assay. To do this, the following reagents are used:
Gemäß Beispiel 1 hergestelltes biotinyliertes Peptid
(0,2 µg/ml)
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0,
0,9% Natriumchlorid
10% BSA.Biotinylated peptide prepared according to Example 1 (0.2 µg / ml)
40 mmol / l phosphate buffer pH 7.0,
0.9% sodium chloride
10% BSA.
20 mU/ml Peroxidase-markierter Fab-Fragmente gegen Schaf
immunglobulin G (Boehringer Mannheim GmbH, Kat. -Nr. 1301
977)
40 mmol/l Phosphatpuffer pH 7,0
0,5% Tween 20
0,2% BSA
0,2% Rinderimmunglobulin G (Sigma, Kat.-Nr. I 5506).20 mU / ml peroxidase-labeled Fab fragments against sheep immunoglobulin G (Boehringer Mannheim GmbH, Cat. No. 1301 977)
40 mmol / l phosphate buffer pH 7.0
0.5% Tween 20
0.2% BSA
0.2% bovine immunoglobulin G (Sigma, Cat.No. I 5506).
Zur Versuchsdurchführung wird 1 ml Reagenz 1 und 10 µl der zu testenden Antikörperlösung 1 : 100 verdünnt in Strept avidin-beschichtete Polystyrolröhrchen (hergestellt gemäß Beispiel 1 von EP-A 344 578) pipettiert und 1 h bei Raum temperatur inkubiert. Die Röhrchen werden dann 3× mit normalem Leitungswasser gewaschen und anschließend mit 1 ml Reagenz 2 für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann nochmals 3× mit Leitungswasser gewaschen. Nach Zugabe von 1 ml ABTS® in 100 mmol/l Phosphat-Citratpuffer pH 4,4, der 3,2 mmol/l Natriumperborat enthält (Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 746 407) und Inkubation für 60 Min. bei Raumtemperatur wird dann die Bindung der markierten Fab-Fragmente durch Messung der Extinktion bei 420 nm bestimmt. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Reaktivität von 8 untersuchten Antiseren mit den Peptiden der in SEQ ID NO 1-8 gezeigten Sequenz. Als positiv wird dabei ein Signal gewertet, das einen um 3 Standardabweichungen höheren Wert als der Mittelwert von 10 negativen Kontroll seren aufweist. 1 ml of reagent 1 and 10 μl of Antibody solution to be tested diluted 1: 100 in strept avidin-coated polystyrene tubes (manufactured according to Example 1 of EP-A 344 578) pipetted and 1 h at room temperature incubated. The tubes are then 3 times with washed normal tap water and then with 1 ml of reagent 2 incubated for 1 h at room temperature and then washed again 3 × with tap water. After adding 1 ml ABTS® in 100 mmol / l phosphate citrate buffer pH 4.4, the Contains 3.2 mmol / l sodium perborate (Boehringer Mannheim GmbH, cat.no. 746 407) and incubation for 60 min Room temperature is then the binding of the marked Fab fragments by measuring the absorbance at 420 nm certainly. The following table shows the reactivity of 8 antisera examined with the peptides of the SEQ ID NO 1-8 sequence shown. It is considered positive Signal evaluated that one by 3 standard deviations higher than the mean of 10 negative control has seren.
Zur Bestimmung der Kreuzreaktivität des Antiserums a (siehe Beispiel 4, Tabelle 1) wird der in Beispiel 4 beschriebene Sandwich-Immunoassay in Gegenwart verschiede ner Konzentrationen an Lp(a), LDL bzw. Plasminogen (Kon zentrationen siehe Tabelle 2) durchgeführt. Hierbei konkurrieren diese zugesetzten freien Antigene mit den immobilisierten biotinylierten Peptiden um die Bindung des Antiserums, so daß die Bindung des Antiserums an die feste Phase und damit die Signalstärke in einem Ausmaß abnimmt, das der Reaktivität der zugesetzten freien Antigene mit dem Antiserum entspricht. Je mehr freies Antigen für eine Reduzierung des erhaltenen Signals benötigt wird, desto geringer ist also die Reaktivität des Antiserums mit diesem Antigen. Auf diese Weise wird das Antiserum a vor und nach der affinitätschromatographischen Aufreinigung gemäß Beispiel 3 untersucht. Wie die nachfolgende Tabelle 2 zeigt, kann die Kreuzreaktivität des Antiserums a gegen über LDL und Plasminogen durch die affinitätschromatogra phische Aufreinigung deutlich reduziert werden. To determine the cross-reactivity of the antiserum a (see example 4, table 1) becomes that in example 4 described sandwich immunoassay in the presence of various ner concentrations of Lp (a), LDL or plasminogen (Kon see table 2). Here these added free antigens compete with the immobilized biotinylated peptides to bind the Antiserum, so that the binding of the antiserum to the solid Phase and thus the signal strength decreases to an extent that of the reactivity of the added free antigens corresponds to the antiserum. The more free antigen for one Reduction of the received signal is needed, the more the reactivity of the antiserum is therefore less with this antigen. In this way the antiserum becomes a and after affinity chromatographic purification examined according to Example 3. Like the table below 2 shows the cross-reactivity of the antiserum a against via LDL and plasminogen through the affinity chromatograph phic purification can be significantly reduced.
Lp(a) wird in einem homogenen Immunoassay bestimmt. Zum Nachweis werden die Reagenzien mit folgender Zusammenset zung verwendet:Lp (a) is determined in a homogeneous immunoassay. To the The reagents are verified with the following composition tongue used:
Reagenz 1:Reagent 1:
monoklonaler Antikörper gegen Peptid 1 (75 µg/ml,
Boehringer Mannheim GmbH, Kat.-Nr. 1411 012)
Polystreptavidin (20 µg/ml)
20 mmol/l MES, pH 6,0
225 mmol/l NaCl
4,5% PEG 6000
0,75% Brÿ 35
0,1% NaN3.monoclonal antibody against peptide 1 (75 µg / ml,
Boehringer Mannheim GmbH, cat.-no. 1411 012)
Polystreptavidin (20 µg / ml)
20 mmol / l MES, pH 6.0
225 mmol / l NaCl
4.5% PEG 6000
0.75% Brÿ 35
0.1% NaN 3 .
Reagenz 2:Reagent 2:
20 mmol/l MES, pH 6,0
150 mmol/l NaCl
6,0% PEG 6000
0,5% Brÿ 35
0,1% NaN3
biotinyliertes Peptid 1 (2 µg/ml, siehe Beispiel 2).20 mmol / l MES, pH 6.0
150 mmol / l NaCl
6.0% PEG 6000
0.5% Brÿ 35
0.1% NaN 3 biotinylated peptide 1 (2 µg / ml, see Example 2).
Die Messungen werden an einem Hitachi 704 bei 37°C durch geführt. In einer Küvette werden 350 µl Reagenz 1 und 10 µl Probe 5 Min. inkubiert. Anschließend wird 70 µl Reagenz 2 zupipettiert und für 5 Min. inkubiert und die Änderung der Adsorption bei 340 nm bestimmt. Die gemessene Trübung wird verglichen mit der Trübung, die durch Zugabe von bekannten Mengen eines Lp(a)-Standards erhalten wird, und aus dem Vergleich die Menge an Lp(a) in der zu analy sierenden Probe ermittelt. The measurements are carried out on a Hitachi 704 at 37 ° C guided. 350 µl of reagent 1 and 10 µl sample incubated for 5 min. Then 70 µl Pipette in reagent 2 and incubate for 5 min Change in adsorption determined at 340 nm. The measured Turbidity is compared to the turbidity caused by addition is obtained from known amounts of an Lp (a) standard, and from the comparison the amount of Lp (a) in the analy determined sample.
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:(1) GENERAL INFORMATION:
-
(i) ANMELDER:
- (A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH.
- (B) STRASSE: Sandhöfer Str. 116.
- (C) ORT: Mannheim.
- (E) LAND: Deutschland.
- (F) POSTLEITZAHL: D - 6800.
- (A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH.
- (B) STREET: Sandhöfer Str. 116.
- (C) LOCATION: Mannheim.
- (E) COUNTRY: Germany.
- (F) POSTAL NUMBER: D - 6800.
- (ii) ANMELDETITEL: Lipoprotein (a)-Peptide und deren Verwendung.(ii) APPLICATION TITLE: Lipoprotein (a) peptides and their use.
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8.(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 8.
-
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
- (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
- (A) DISK: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC compatible
- (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patent In Release # 1.0, Version # 1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 1:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 12 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid.(ii) MOLECULE TYPE: Peptide.
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 2:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 13 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION ZU SEC ID NO: 3:(2) INFORMATION ABOUT SEC ID NO: 3:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 12 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ TD NO: 3: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ TD NO: 3:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 4:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 8 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid.(ii) MOLECULE TYPE: Peptide.
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 5:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 10 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 6:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 7 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 7:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 11 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid(ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7:
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:(2) INFORMATION ABOUT SEQ ID NO: 8:
-
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
- (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
- (B) ART: Aminosäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (A) LENGTH: 8 amino acids
- (B) TYPE: amino acid
- (C) STRAND FORM: Single
- (D) TOPOLOGY: linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (ii) MOLECULE TYPE: Peptide
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8:
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| ES94101703T ES2148248T3 (en) | 1993-02-09 | 1994-02-04 | LIPOPROTEIN PEPTIDES (A) AND THEIR USE. |
| DE59409345T DE59409345D1 (en) | 1993-02-09 | 1994-02-04 | Lipoprotein (a) peptides and their use |
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|---|---|---|---|
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| DE4310516A DE4310516A1 (en) | 1993-02-09 | 1993-03-31 | Lipoprotein (a) peptides and their use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4310516A1 true DE4310516A1 (en) | 1994-08-11 |
Family
ID=6479914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE4310516A Withdrawn DE4310516A1 (en) | 1993-02-09 | 1993-03-31 | Lipoprotein (a) peptides and their use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4310516A1 (en) |
-
1993
- 1993-03-31 DE DE4310516A patent/DE4310516A1/en not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, 68305 MANNHEIM, DE |
|
| 8141 | Disposal/no request for examination |