DE4233686A1 - Selective optical display or marking of given atoms or mols. - uses electron flow between micro point and sample for detection to give an image signal - Google Patents

Selective optical display or marking of given atoms or mols. - uses electron flow between micro point and sample for detection to give an image signal

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Abstract

For the selective optical display and marking of given atoms, mols. or mol. gps. by fluorescence in a sample, a grid tunnel microscope or similar appts. is used. A micropoint gives a surface gridding at the sample surface or at the sample on a substrate. The fluorescence of the given atoms, mols. or mol. groups is energised by an electron flow between the points and the sample, to be identified by an image and/or detection system, as a signal to form an image. Pref. the image signal is transferred as part of an image, according to the location of the micropoint or to assemble the geometrical position or coordinate data to be held in memory, for a control signal to position the point. The voltage between the micropoint and the sample is increased to energise the fluorescence by an electron flow between the micropoint and the sample. USE/ADVANTAGE - The method is for the study of mol. structures or part-structures, for optical identification and marking especially to give DNA sequences. The system gives an improved geometrical resolution and localising of separate sequences.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Art sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.The invention relates to a method in the preamble of claim 1 specified type and a device for Execution of the procedure.

Bei Untersuchungen im molekularen Bereich bestehen viel­ fach Schwierigkeiten bei der Identifikation einzelner Mo­ lekülstrukturen oder -strukturteile. There is a lot going on in molecular studies Difficulty in identifying individual months lecular structures or structural parts.  

Es sind verschiedene Verfahren zur selektierenden opti­ schen Darstellung bzw. Markierung vorbestimmter Atomen, Molekülen oder Molekülegruppen in einer Probe, insbesonde­ re zur DNA-Sequenzierung bekannt geworden.There are various methods for selecting opti representation or marking of predetermined atoms, Molecules or groups of molecules in a sample, in particular re known for DNA sequencing.

Die konventionellen Verfahren zur DNA-Sequenzierung bein­ halten die folgenden Schritte:The conventional methods for DNA sequencing include keep the following steps:

  • 1. Die Erzeugung von DNA-Fragmenten einer zu analysie­ renden DNA-Probe mittels basenspezifischer chemischer Spaltung nach Maxam and Gilbert [A. M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 560 (1977)] oder mit Hilfe der enzymatischen Kettenabbruchmethode [F. Sanger, S. Nickler and A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)], die am häufigsten angewendet wird.1. The generation of DNA fragments to be analyzed DNA sample using base-specific chemical Maxam and Gilbert [A. M. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 560 (1977)] or using the enzymatic chain termination method [F. Sanger, S. Nickler and A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)], the most common is applied.
  • 2. Die Markierung der DNA-Fragmente durch radioaktive Isotope (beispielsweise die Markierung von dNTP mit 35S- oder 32P-Nukliden) oder mit Fluoreszenzfarbstof­ fen (Die Markierung kann bei Anwendung der Sanger- Methode während der Polymerase-Kettenreaktion erfolgen).2. The labeling of the DNA fragments by radioactive isotopes (for example the labeling of dNTP with 35 S or 32 P nuclides) or with fluorescent dyes (the labeling can be carried out using the Sanger method during the polymerase chain reaction).
  • 3. Die Trennung der DNA-Fragmente entsprechend ihrer un­ terschiedlichen Längen mit Hilfe des Elektrophorese- Verfahrens.3. The separation of the DNA fragments according to their un different lengths with the help of electrophoresis Procedure.
  • 4. Das Detektieren der radioaktiven Strahlung oder der Fluoreszenz mittels Elektrophorese voneinander sepa­ rierten DNA-Fragmente. Aus der Reihenfolge der detek­ tierten DNA-Fragmente kann die DNA-Sequenz der Probe direkt abgeleitet werden, wobei in modernen Sequen­ zierern das Auslesen, Abspeichern und Auswerten der Sequenzrohdaten automatisch in angeschlossenen Compu­ tersystemen erfolgt. Zum Nachweis der radioaktiven Strahlung werden meist Röntgenfilme benutzt, welche anschließend von Hand oder mit Hilfe optischer Scan­ ner ausgelesen werden. Aufgrund der Probleme, die mit der Verwendung radioaktiver Isotope verbunden sind - und insbesondere in den hohen Kosten, der beschränk­ ten Lagerfähigkeit, und den Schwierigkeiten bei der Abfallbeseitigung bestehen - werden auch Fluoreszenz­ farbstoffe für die Markierung der DNA-Fragmente ver­ wendet.4. Detecting radioactive radiation or Fluorescence from each other using electrophoresis DNA fragments. From the order of the detec  DNA fragments can be the DNA sequence of the sample are derived directly, being in modern sequences adorn reading, storing and evaluating the Sequence raw data automatically in connected compu systems takes place. For the detection of radioactive Radiation is mostly used in X-ray films, which then by hand or with the help of an optical scan be read out. Because of the problems with associated with the use of radioactive isotopes - and especially in the high cost that restricts shelf life, and the difficulties in Waste disposal exist - also become fluorescence dyes for labeling the DNA fragments ver turns.

Bei diesem von der Firma Applied Biosystems (Foster City, CA) vertriebenen "373A DNA Seguencer" werden vier unterschiedliche basenspezifische Farbstoffe für die Markierung der DNA-Fragmente verwendet. Die opti­ sche Anregung dieser Farbstoffe (unterschiedliche Li­ nien eines Ar⁺-Lasers) sowie die Detektion der Fluo­ reszenzstrahlung (Filterrad und "Photomultiplier­ tube") erfolgt während der Elektrophorese, wobei eine Gelspur für die DNA-Sequenzierung einer Probe benö­ tigt wird. Mit Hilfe dieser Technik lassen sich maxi­ mal nur etwa 500 Basen einer DNA-Probe mit einem re­ lativen Fehler von ca. 1% lesen. Da das Gerät 24 Gel­ spuren besitzt, können hiermit 24 Proben synchron analysiert werden, woraus sich eine Sequenzierungs­ leistung von ca. 1000 Basenpaaren pro h ergibt. In this case from Applied Biosystems (Foster City, CA) "373A DNA Seguencer" four different base-specific dyes for labeling the DNA fragments. The opti cal excitation of these dyes (different Li arien laser) and the detection of the fluo Resence radiation (filter wheel and "photomultiplier tube ") takes place during electrophoresis, with one Gel track required for DNA sequencing of a sample is done. With the help of this technique, maxi times only about 500 bases of a DNA sample with a right read latent errors of approx. 1%. Since the device 24 gel 24 samples can be synchronized be analyzed, resulting in a sequencing performance of approx. 1000 base pairs per hour.  

Es sind verschiedentlich Versuche unternommen worden, die­ se Art der Sequenzierungstechnik abzuwandeln oder weiter­ zuentwickeln, wie beispielsweise durch die Verwendung ei­ nes gekühlten CCD-Arrays zur Detektion der Fluoreszenz [A. E. Karger, J. M. Harris, R. F. Gesteland, Nucleic Acids Res. 19, 4955 (1991)] anstelle der Kombination Fil­ terrad und PMT. Jedoch läßt sich im Rahmen dieser Technik die Sequenzierungsleistung sowie die Anzahl Basen einer DNA-Probe, die maximal in einer Gelspur gelesen werden können, nicht wesentlich steigern.Various attempts have been made to: Modify the type of sequencing technique or continue develop, such as by using egg a cooled CCD array for detection of fluorescence [A. E. Karger, J.M. Harris, R.F. Gesteland, Nucleic Acids Res. 19, 4955 (1991)] instead of the combination Fil terrad and PMT. However, within the scope of this technique the sequencing performance as well as the number of bases of one DNA sample that can be read at most in a gel track can not increase significantly.

Deshalb wurde international seit etwa 1987 intensiv nach neuen Sequenzierungsmethoden und Techniken gesucht [T. Hunkapiller, R. J. Kaiser, B. F. Koop, L. Hood, Science 254, 59 (1991)].That is why international efforts have been intensive since around 1987 new sequencing methods and techniques sought [T. Hunkapiller, R.J. Kaiser, B.F. Koop, L. Hood, Science 254, 59 (1991)].

Hierbei sind zwei Methoden von besonderem Interesse, ins­ besondere im Hinblick auf die potentielle Sequenzierungs­ leistung und Probenlänge: die Einzel-Molekül-Sequenzierung [J. H. Jett, R. A. Keller, J. C. Martin, B. L. Marrone, R. K. Moyzis, R. L. Ratliff, N. K. Seitzinger, E. Brooks Shera and C. C. Stewart, J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 301 (1989)].Two methods are of particular interest, ins particular with regard to potential sequencing performance and sample length: single-molecule sequencing [J. H. Jett, R.A. Keller, J.C. Martin, B.L. Marrone, R.K. Moyzis, R.L. Ratliff, N.K. Seitzinger, E. Brooks Shera and C.C. Stewart, J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 301 (1989)].

Allen bekannten Verfahren gemeinsam ist die geringe Se­ quenzerleistung und die fehlende Möglichkeit der Markie­ rung einzelner Moleküle.Common to all known methods is the low Se quenzer performance and the lack of possibility of the markie tion of individual molecules.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bei einem Ver­ fahren der eingangs genannten Gattung die geometrische Auflösung und die Lokalisierbarkeit einzelner Sequenzen zu verbessern. Außerdem soll eine vorteilhafte Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens angegeben werden.The invention is based, with a Ver drive the geometric type mentioned above Resolution and the localizability of individual sequences  improve. In addition, an advantageous device be specified for carrying out the method.

Diese Aufgabe wird mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 sowie der entsprechenden Vorrichtungsansprü­ che gelöst.This task is carried out with the characteristic features of the Claim 1 and the corresponding device claims che solved.

Die Erfindung schließt die Erkenntnis ein, daß mit einer Einrichtung nach Art eines Tunnel-Raster-Elektronenmi­ kroskops eine Vorrichtung vorhanden ist, welche es gestat­ tet, eine Elektrolumineszenz-Anregung unter hochgenauer Positionierung zu erreichen, so daß erstmalig eine entsprechend genaue Lokalisierung der ausgewählten Ein­ zelsequenzen in molekularer Größenordnung möglich ist.The invention includes the finding that with a Device in the manner of a tunnel raster electron mi microscope there is a device which allows it tet, an electroluminescent excitation with high accuracy To achieve positioning, so that for the first time accordingly exact localization of the selected On individual sequences on a molecular scale is possible.

Zusätzlich zur Ausnutzung der somit zur Verfügung stehen­ den geometrischen Koordinatendaten lassen sich in bevor­ zugter Weise die bildgebenden Eigenschaften des Tunnel- Rasterelektronenmikroskops zur Erzeugung überlagerter Bilddarstellungen ausnutzen, welche die Lokalisierung der markierten Sequenzen erleichtern.In addition to taking advantage of the thus available the geometric coordinate data can be in advance the imaging properties of the tunnel Scanning electron microscope for the generation of superimposed Exploit image representations, which the localization of the marked sequences easier.

Das vorgestellte Verfahren zur DNA-Sequenzierung unter Ausnutzung der vorliegenden Erfindung verbindet die Vor­ teile, die sich aus einer basenspezifischen Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen für die eindeutige Unterscheidung und Zuordnung der DNA-Basen ergeben, mit denen, die aus der submolekularen Auflösung der Raster-Tunnelelektronen- Mikroskop resultieren. Da die Anregung der Fluoreszenz eben-falls im submolekularen Bereich, aber an örtlich fixierten Farbstoffmolekülen, stattfindet, sind die beim Einzel-Molekül-Sequenzierungsverfahren beschriebenen Probleme des Rausch-Untergrundes und der kurzen Meßzeiten pro DNA-Molekül ausgeräumt. Weitere wesentliche Vorteile gegenüber dein Einzel-Molekül-Sequenzierungsverfahren sind die Reproduzierbarkeit der Analyse an ein und demselben DNA-Molekül, der völlige Verzicht auf ein kompliziertes Strömungssystem sowie das Fehlen eines Systems für den Transport und die Fixierung des Einzel-Moleküls.The presented procedure for DNA sequencing below Exploitation of the present invention combines the advantages parts that result from a base-specific marking Fluorescent dyes for clear differentiation and assignment of the DNA bases to those resulting from the submolecular resolution of the scanning tunneling electron Microscope result. Because the excitation of fluorescence also in the submolecular range, but locally fixed dye molecules takes place, are those with  Single-molecule sequencing methods described Problems of the noise background and the short measuring times cleared out per DNA molecule. Other essential advantages versus your single molecule sequencing method the reproducibility of the analysis on one and the same DNA molecule, the complete absence of a complicated Flow system as well as the lack of a system for the Transport and fixation of the single molecule.

Mit der Erfindung lassen sich auf einfache Weise die Anre­ gungsbedingungen verändern, beispielsweise durch Variation der Spannung und/oder des Stroms aus der Mikrospitze oder der Feldeffektkathode, wodurch eine zusätzliche Unter­ scheidungsmöglichkeit verschiedener Farbstoffmoleküle ge­ geben ist.With the invention, the Anre change conditions, for example by variation the voltage and / or the current from the microtip or the field effect cathode, creating an additional sub Different dye molecules can be separated give is.

Die günstige Verwendung eines Raster-Tunnelelektronen- Mikroskops ermöglicht zusätzlich die Struktur- und Ober­ flächenanalyse unterschiedlicher organischer und anorgani­ scher Substanzen, wobei eine als Sonde wirkende Mikrospit­ ze mit atomaren Dimensionen eine Probe abrastert und der Abstand sowie der Tunnelstrom zwischen der Probe und der Mikrospitze variiert und gemessen werden können. Beide Meßgrößen können für eine Abbildung der atomaren bzw. mo­ lekularen Struktur der Probe genutzt werden. Durch die gleichzeitige Erfassung zusätzlicher Meßgrößen, wie bei­ spielsweise elektronischer Zustände oder Schwingungsmoden, kann eine wesentliche Verbesserung der Identifikations­ möglichkeiten einzelner Atome, Moleküle oder Probendefek­ te erreicht werden. The convenient use of a scanning tunnel electron Microscope also enables the structure and upper area analysis of different organic and inorganic sher substances, with a microspit acting as a probe ze scans a sample with atomic dimensions and the Distance as well as the tunnel current between the sample and the Micro tip can be varied and measured. Both Measured variables can be used to map the atomic or mo lecular structure of the sample can be used. Through the simultaneous acquisition of additional measured variables, as with for example electronic states or vibration modes, can significantly improve identification possibilities of individual atoms, molecules or sample defects te can be achieved.  

Die Erfindung befaßt sich mit der vorteilhaften Verwendung eines derartigen Raster-Tunnelelektronen-Mikroskops (RTM), das eine gleichzeitige Anregung und Detektion von Fluores­ zenzstrahlung bestimmter ausgewählter und/oder mit Farb­ stoffmolekülen gekennzeichneter Atome, Moleküle, Molekül­ gruppen oder Defekte der Probe erlaubt.The invention is concerned with the advantageous use of such a scanning tunneling electron microscope (RTM), which is a simultaneous excitation and detection of fluorescence zenzstrahl certain selected and / or with color molecules of labeled atoms, molecules, molecule groups or defects of the sample allowed.

Bei der erfindungsgemäßen Lösung wird in bevorzugter Weise eine gleichzeitige Anregung und Detektion von Fluoreszenz­ strahlung bestimmter ausgewählter und/oder mit Farbstoff­ molekülen gekennzeichneter Atome, Moleküle, Molekülgruppen oder Defekte der Probe ermöglicht. Insbesondere stellt die Basen-Sequenzierung von DNA-Proben eine bevorzugte Anwen­ dung der Erfindung dar.In the solution according to the invention, it is preferred simultaneous excitation and detection of fluorescence radiation of certain selected and / or with dye Molecularly labeled atoms, molecules, groups of molecules or defects in the sample. In particular, the Base sequencing of DNA samples is a preferred application tion of the invention.

Andere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet bzw. werden nachstehend zusammen mit der Beschreibung der bevorzugten Ausführung der Erfindung anhand der Figuren näher dargestellt. Es zeigen:Other advantageous developments of the invention are in the subclaims or are identified below along with the description of the preferred embodiment the invention with reference to the figures. It demonstrate:

Fig. 1 die wesentlichen Elemente einer bevorzugten Aus­ führung eines Raster-Tunnelelektronen-Mikroskop zur Ver­ wendung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, Fig. 1 shows the essential elements of a preferred execution of a scanning tunneling electron microscope for uses with the inventive method,

Fig. 2 ein Beispiel eines DNA-Moleküls mit basenspezi­ fischen Farbstoffmolekülen in schematischer Darstellung, Fig. 2 shows an example of a DNA molecule with basenspezi fishing dye molecules in a schematic representation;

Fig. 3 eine bevorzugte Ausführungsform eines Raster- Tunnelelektronen-Mikroskop mit separatem Elektronenstrah­ ler zur Durchführung der Erfindung, Fig. 3 shows a preferred embodiment of a scanning tunneling electron microscope with separate Elektronenstrah ler for practicing the invention,

Fig. 4 eine Schnittdarstellung eines Ausführungsbeispiels einer Mikrospitze mit zugehöriger Dünnfilm-Feldeffekt­ kathode, Fig. 4 is a sectional view of an embodiment of a cathode of a microtip with associated thin-film field effect,

Fig. 5 schematisch eine Ausführungsform der Erfindung mit zusätzlicher Strahlungsquelle sowie Fig. 6 in grafischer Darstellung das Energieniveauschema des Tb3+. Fig. 5 shows diagrammatically an embodiment of the invention with additional radiation source, and Fig. 6 in graphical representation the energy level scheme of Tb 3+.

Bei dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der Erfindung befindet sich eine Mikrospitze 1 über der auf einem Substrat 2 angeordneten Probe 3, die an vorbestimm­ ten Positionen mit fluoreszenten Farbstoffmolekülen 4 ge­ kennzeichnet wurde. Bei der Probe handelt es sich um ein DNA-Molekül, bei dem an jede der vier möglichen Basen je ein basenspezifisches Farbstoffmolekül 4 chemisch angela­ gert wurde, wie es in Fig. 2 näher dargestellt ist.In the embodiment of the invention shown in Fig. 1, there is a microtip 1 above the sample 3 arranged on a substrate 2 , which has been marked with fluorescent dye molecules 4 at predetermined positions. The sample is a DNA molecule in which a base-specific dye molecule 4 has been chemically attached to each of the four possible bases, as is shown in more detail in FIG. 2.

Mit Hilfe von piezoelektrisch angetriebenen Stellelementen 5 und 6 kann die Mikrospitze 1 über die molekulare Probe 3 mit subatomarer Rasterweite bewegt werden. Mit einem wei­ teren piezoelektrischen Stellelement 7 wird der Abstand zwischen der Mikrospitze 1 und der Probe soweit verrin­ gert, daß bei angelegter äußerer Spannung 8 zwischen der Mikrospitze 1 und der Probe 3 infolge des Tunneleffektes ein Elektronenstrom fließt, der mit einem Meßinstrument 9 nachgewiesen werden kann. Im vorliegenden Ausführungsbei­ spiel wird der Tunnelstrom mit Hilfe einer Rückkopplungse­ lektronik 10, die auf das piezo-elektrische Stellelement 7 wirkt, konstant gehalten, in dem der Abstand zwischen der Mikrospitze 1 und der Probe 3 entsprechend variiert wird. Die Positionen des Stellelementes 7 und diejenige der Stellelemente 5 und 6 werden in digitalisierte Signale überführt und bilden Eingangsgrößen für einen Rechner 11. Durch eine entsprechende Nachverarbeitung werden die - je­ weils einzelnen Bildpunkten entsprechenden - Signale zu einem eine vollständige Bilddarstellung repräsentierenden Ausgangssignal des Rechners 11 zusammengefügt, welches ei­ nem nachgeschalteten Bildschirm zugeführt wird. Auf dem angeschlossenen Bildschirm 12 erscheint somit eine Ab­ bildung der Probe 3.With the aid of piezoelectrically driven actuating elements 5 and 6 , the micro tip 1 can be moved over the molecular sample 3 with a subatomic grid. With a white direct piezoelectric actuator 7 , the distance between the microtip 1 and the sample is reduced so much that when the external voltage 8 is applied between the microtip 1 and the sample 3, an electron current flows due to the tunnel effect, which can be detected with a measuring instrument 9 . In the present exemplary embodiment, the tunnel current is kept constant by means of a feedback electronics 10 , which acts on the piezoelectric actuating element 7 , in which the distance between the microtip 1 and the sample 3 is varied accordingly. The positions of the control element 7 and that of the control elements 5 and 6 are converted into digitized signals and form input variables for a computer 11 . By means of appropriate postprocessing, the signals, which correspond to individual pixels, are combined to form an output signal of the computer 11 which represents a complete image representation and which is fed to a downstream screen. An image of the sample 3 thus appears on the connected screen 12 .

Nach dem Stand der Technik konnten bisher mit Hilfe die­ ser Abbildung allein keine Aussagen getroffen werden, die eine Unterscheidung der vier möglichen Basen in der DNS- Probe anhand beobachteter Strukturen in der Abbildung zu­ lassen würden.According to the state of the art, the In this figure alone, no statements are made that a distinction between the four possible bases in the DNA Sample based on observed structures in the figure would let.

Nach dem Verfahren nach der Erfindung kann durch Herauf­ setzung der Spannung an der Spannungsquelle 8 die Energie der aus der Mikrospitze 1 austretenden Elektronen derart erhöht werden, daß diese für eine Anregung der Farbstoff­ moleküle 4 zur Fluoreszenz ausreicht. Erfindungsgemäß wird die hierbei emittierte Fluoreszenzstrahlung weiterhin von einem als Abbildungssystem wirkenden Mikroskopobjektiv 13 erfaßt und gelangt durch ein ausgewähltes Filter eines zwischengeschalteten Filterrades 14 zu einem Photomultip­ lier 15. Das detektierte Signal wird in anschließend (als Ausgangssignal des Photomultipliers 15) einer Einzel- Photonen-Zähl-Einrichtung 16 zugeführt. According to the method according to the invention, by increasing the voltage at the voltage source 8, the energy of the electrons emerging from the microtip 1 can be increased such that it is sufficient for an excitation of the dye molecules 4 for fluorescence. According to the invention, the fluorescence radiation emitted here is still detected by a microscope objective 13, which acts as an imaging system, and passes through a selected filter of an intermediate filter wheel 14 to a photomultiplier 15 . The detected signal is then fed (as the output signal of the photomultiplier 15 ) to a single photon counter 16 .

Im Filterrad sind vier verschiedene Bandpaßfilter - ent­ sprechend den vier unterschiedlichen Spektren der vier ba­ senspezifischen Farbstoffe - auswählbar angeordnet. Durch vier aufeinanderfolgende Spannungsimpulse, die zeitlich korreliert mit den vier möglichen Positionen des Filter­ rades abgegeben werden und während einer festen Positio­ nierung des Probenmoleküls erfolgen, kann nun aufgrund der jeweils gemessenen Fluoreszenzstrahlung eine Unter­ scheidung bezüglich der vier Basen an dieser festen Posi­ tion des DNA-Probenmoleküls vorgenommen werden.There are four different bandpass filters in the filter wheel speaking the four different spectra of the four ba Sensitive dyes - selectable arrangement. By four successive voltage pulses, the temporal correlates with the four possible positions of the filter rades are delivered and during a fixed position of the sample molecule can now occur due to the each measured fluorescence radiation a sub divide the four bases at this fixed position tion of the DNA sample molecule.

Die Signale, die von der Einzel-Photonen-Zähl-Einrichtung 16 bereitgestellt werden, gelangen zu dem Rechner 11, wo sie in Zuordnung zu den zugehörigen Filterradpositionen und den Positionen der piezoelektrischen Stellelemente 5 und 6 weiterverarbeitet werden. Sie gelangen als zusätzli­ che Bildsignale zum Bildschirm 12 und werden dort in ge­ eigneter Weise (abgehoben von der übrigen Bildinformation durch farbliche oder sonstige Hervorhebung unterscheidbar) dargestellt. Aus den erfaßten Daten kann somit ohne weite­ res die Position und die chemische Identität der Farb­ stoffmoleküle und damit die resultierende Basen-Sequenz innerhalb des DNA-Probenmoleküls abgeleitet werden.The signals provided by the single photon counter 16 arrive at the computer 11 , where they are processed in association with the associated filter wheel positions and the positions of the piezoelectric actuators 5 and 6 . They arrive at screen 12 as additional image signals and are displayed there in a suitable manner (distinguishable from the rest of the image information by color or other highlighting). The position and the chemical identity of the dye molecules and thus the resulting base sequence within the DNA sample molecule can thus be derived from the recorded data without further notice.

Fig. 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung, bei dem eine zusätzliche Dünnfilm-Feldeffektkathode 17 mit der als Sonde wirkenden Mikrospitze 1 mechanisch fest verbunden ist und zusammen mit dieser mittels der Stellelemente 5, 6 und 7 bewegt werden kann. Die Dünnfilm- Feldeffektkathode 17, deren Aufbau und prinzipielle Funk­ tionsweise beispielsweise in [J. Appl. Phys. 47, 5248 (1976)] beschrieben sind, wirkt als separater "Elektro­ nenstrahler", der die Farbstoffmoleküle 4 einer Probe 3 (beispielsweise DNA-Molekül) zur Fluoreszenz anzuregen vermag, so daß die Mikrospitze 1 ausschließlich als Sonde und nicht als Anregungsquelle der Fluoreszenz dient. Über eine entsprechende Ansteuerelektronik 18 ist die Dünnfilm- Feldeffektkathode 17 mit dem Rechner 11 verbunden, der in Abhängigkeit von der Position der Mikrospitze 1 und den von der Einzel-Photonen-Zähl-Einrichtung 16 kommenden Fluoreszenzsignalen die Dauer und die Intensität des Elek­ tronenstrahls der Dünnfilm-Feldeffektkathode 17 steuert. Folglich kann mit der Mikrospitze als Sonde eine gewöhnli­ che Raster-Tunnel-Elektronen-Mikroskop-Abbildung der Probe 3 erhalten werden und parallel hierzu eine zweite Abbil­ dung aus den registrierten und rechentechnisch verarbeite­ ten Fluoreszenzsignalen der an der Probe 3 befindlichen Farbstoffmoleküle 4 erzeugt werden. Fig. 3 shows another embodiment of the inven tion, in which an additional thin-film field effect cathode 17 is mechanically fixed to the micro tip 1 acting as a probe and can be moved together with this by means of the actuating elements 5 , 6 and 7 . The thin-film field-effect cathode 17 , its structure and principle of operation, for example, in [J. Appl. Phys. 47, 5248 (1976)], acts as a separate "electron emitter" which is able to excite the dye molecules 4 of a sample 3 (for example DNA molecule) for fluorescence, so that the microtip 1 is used exclusively as a probe and not as an excitation source for fluorescence serves. A corresponding control electronics 18 , the thin film field effect cathode 17 is connected to the computer 11 which, depending on the position of the micro tip 1 and the fluorescence signals coming from the single photon counter 16 , the duration and intensity of the electron beam of the thin film -Field effect cathode 17 controls. Consequently, a conventional scanning tunneling electron microscope image of sample 3 can be obtained with the micro tip and a parallel image can be generated from the registered and computationally processed fluorescence signals of the dye molecules 4 on sample 3 .

Da der Abstand zwischen der Mikrospitze 1 und dem Auf­ treffpunkt des Elektronenstrahls der Dünnfilm-Feldeffekt­ kathode 17 bekannt ist, ermöglicht eine Verschiebung der zweiten gegenüber der ersten Abbildung um diesen Abstand eine eindeutige Zuordnung der Farbstoffmoleküle 4 zur Pro­ be 3. Bevorzugt kann mit Hilfe dieser Zuordnung die Se­ quenz einer Base in einem DNA-Molekül abgeleitet werden. Verwendet man vier basenspezifische Farbstoffmoleküle für die Markierung der Basen einer DNA-Probe, was in Fig. 2 schematisch dargestellt ist, kann durch die Registrierung der Position des Filterrades 14 und der zugehörigen Inten­ sitäten der Fluoreszenzsignale mit Hilfe des Rechners 11 eine vollständige DNA-Sequenzierung des erfaßten Probenbe­ reiches durchgeführt werden. Dabei können entweder an je­ der Rasterposition der Mikrospitze 1 bzw. des Elektronen­ strahlers 17 und zu jeder der vier möglichen Filterradpo­ sitionen die entsprechenden Fluoreszenzsignale detektiert werden oder für eine jeweils feste Filterrad-Einstellung die zuvor beschriebene Bilderfassung und -analyse ausge­ führt werden. Im letzten Fall wären folglich vier aufein­ anderfolgende Abbildungen eines DNA-Moleküls für seine vollständige DNA-Sequenzierung notwendig.Since the distance between the micro tip 1 and the point of impact of the electron beam of the thin-film field effect cathode 17 is known, a shift of the second compared to the first image by this distance enables a clear assignment of the dye molecules 4 to the sample 3 . This sequence can preferably be used to derive the sequence of a base in a DNA molecule. If four base-specific dye molecules are used for labeling the bases of a DNA sample, which is shown schematically in FIG. 2, the DNA 11 can be used for complete DNA sequencing by registering the position of the filter wheel 14 and the associated intensities of the fluorescence signals of the recorded sample area can be performed. The corresponding fluorescence signals can either be detected at each of the grid positions of the microtip 1 or the electron emitter 17 and at each of the four possible Filterrad positions, or the image acquisition and analysis described above can be carried out for a respective fixed filter wheel setting. In the latter case, four consecutive images of a DNA molecule would therefore be necessary for its complete DNA sequencing.

Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform einer Dünnfilm-Feldeffektkathode 17, die neben der Mikrospitze 1 und fest verbunden mit dieser an­ geordnet wurde. Eine erste Dünnfilm-Elektrode 17b, in die gegenüber der als Kathode dienenden Mikrospitze 17a ein Loch geätzt wurde, ist durch einen Isolatorfilm 17c von dieser getrennt. Eine zweite Dünnfilm-Elektrode 17d, die ebenfalls mit einem Loch versehen ist, wurde über der er­ sten getrennt durch einen weiteren Isolatorfilm 17e ange­ ordnet. Legt man beispielsweise zwischen der Spitze 17a und der ersten Dünnfilm-Elektrode 17b über die Zulei­ tungen 19 und 20 eine geeignete negative Spannung an, so werden infolge der hohen Feldstärke aus der Spitze 17a Elektronen emittiert ("Feldelektronenemission"), die durch das Loch in der ersten und zweiten Elektrode hindurchtre­ ten. Durch Anlegen einer zusätzlichen Spannung zwischen die Elektroden 17b und 17d können je nach der Richtung dieser Spannung die emittierten Elektronen beschleunigt oder abgebremst werden, wodurch eine Steuerung des Elek­ tronenstrahls ermöglicht wird. Außerdem wirken die Elek­ troden 17b und 17d unter geeigneten Bedingungen wie eine elektrostatische Elektronenlinse, die zu einer Fokussie­ rung des Elektronenstrahls führt. Fig. 4 shows a schematic representation of a further embodiment of a thin film field effect cathode 17 , which was arranged next to the micro tip 1 and firmly connected to it. A first thin film electrode 17 b, into which a hole was etched opposite the micro tip 17 a serving as the cathode, is separated from it by an insulator film 17 c. A second thin film electrode 17 d, which is also provided with a hole, was arranged over which it was separated by another insulator film 17 e. For example, if a suitable negative voltage is applied between the tip 17 a and the first thin-film electrode 17 b via the feed lines 19 and 20 , electrons are emitted from the tip 17 a due to the high field strength (“field electron emission”) through the hole in the first and second electrodes. By applying an additional voltage between the electrodes 17 b and 17 d, depending on the direction of this voltage, the emitted electrons can be accelerated or decelerated, thereby enabling control of the electron beam. In addition, the electrodes 17 b and 17 d act under suitable conditions like an electrostatic electron lens, which leads to a focusing of the electron beam.

Die Dünnfilm-Feldeffektkathode 17 kann auch derart mit der Mikrospitze 1 verbunden werden, daß der Elektronenstrahl schräg auf das Substrat 2 oder die Probe 3 auftrifft.The thin film field effect cathode 17 can also be connected to the micro tip 1 in such a way that the electron beam strikes the substrate 2 or the sample 3 at an angle.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 5 wiedergegeben. Hier ist eine optische Strahlungsquelle 22 einschließlich eines entsprechenden Abbildungssystems in eines der zuvor erläuterten Ausführungsformen integriert, wodurch eine zusätzliche optische Anregung der Farbstoff­ moleküle 4 möglich wird. Wenn diese Farbstoffmoleküle bei­ spielsweise ein Seltenerd-Ion wie Tb3+ enthalten, kann entsprechend dem Energieniveauschema des Tb3+ - siehe Fig. 6 - eine Zwei-Stufen-Anregung für die Erzeugung der gewünschten grünen Fluoreszenz ausgenutzt werden.Another embodiment of the invention is shown in FIG. 5. Here, an optical radiation source 22, including a corresponding imaging system, is integrated in one of the previously explained embodiments, as a result of which an additional optical excitation of the dye molecules 4 is possible. If, for example, these dye molecules contain a rare earth ion such as Tb 3+ , then according to the energy level scheme of Tb 3+ - see FIG. 6 - a two-stage excitation can be used to generate the desired green fluorescence.

Die Strahlungsquelle 22 liefert Photonen einer Energie von 2,07 eV (599 nm), die für eine direkte optische Anregung des 5D4-Niveaus nicht ausreicht. Durch die Mikrospitze kann jedoch das Tb3+ in den 7F4-Zustand angeregt werden, wozu von den Elektronen eine Anregungsenergie von minde­ stens 0,43 eV aufgebracht werden muß. Aus diesem Zustand kann jetzt mit Hilfe der Strahlungsquelle 22 eine optische Anregung des 5D4-Niveaus erreicht werden (Übergang 24), von dem aus der strahlende Fluoreszenzübergang 25 möglich wird.The radiation source 22 supplies photons with an energy of 2.07 eV (599 nm), which is not sufficient for a direct optical excitation of the 5 D 4 level. However, the Tb 3+ can be excited in the 7 F 4 state by the microtip, for which purpose an excitation energy of at least 0.43 eV must be applied by the electrons. From this state, the radiation source 22 can now be used to achieve an optical excitation of the 5 D 4 level (transition 24 ), from which the radiating fluorescence transition 25 is possible.

Als Strahlungsquelle wird in diesem Fall ein Farbstoffla­ ser mit einer Wellenlänge von 599 nm verwendet, dessen Ausgangsstrahlung mit einer Lichtleitfaser auf die Probe 3 gerichtet wird. Geeignete Filter 14 verhindern eine uner­ wünschte direkte Laserbestrahlung des Photomultipliers 15.In this case, a dye laser with a wavelength of 599 nm is used as the radiation source, the output radiation of which is directed onto the sample 3 with an optical fiber. Suitable filters 14 prevent undesired direct laser irradiation of the photomultiplier 15 .

Die Erfindung beschränkt sich in ihrer Ausführung nicht auf das vorstehend angegebene bevorzugte Ausführungsbei­ spiel. Vielmehr ist eine Anzahl von Varianten denkbar, welche von der dargestellten Lösung auch bei grundsätzlich anders gearteten Ausführungen Gebrauch macht.The invention is not restricted in its implementation to the preferred embodiment given above game. Rather, a number of variants are conceivable which of the solution shown also in principle makes use of different types.

Claims (18)

1. Verfahren zur selektiven optischen Darstellung bzw. Markierung vorbestimmter Atome, Moleküle oder Molekül­ gruppen in einer Probe mittels Fluoreszenz, insbesondere zur DNA-Sequenzierung, dadurch gekennzeichnet, daß die Darstellung mittels eines Raster-Tunnelelektronen- Mikroskops oder eine ähnlichen Anordnung erfolgt, welche eine Mikrospitze zur flächenhaften Abrasterung der auf der Probenoberfläche oder der auf einem Substrat befindlichen Probe aufweist, wobei die Fluoreszenzstrahlung der vorbe­ stimmten Atome, Moleküle oder Molekülgruppen bzw. Defekte durch einen zwischen Mikrospitze und der Probe fließenden Elektronenstrom angeregt und mit einem Abbildungs- und/oder Detektionssystem als bildgebendes Signal nachge­ wiesen wird.1. A method for the selective optical representation or marking of predetermined atoms, molecules or groups of molecules in a sample by means of fluorescence, in particular for DNA sequencing, characterized in that the representation is carried out by means of a scanning tunneling electron microscope or a similar arrangement, which one Has micro tip for scanning the surface of the sample or the sample located on a substrate, the fluorescent radiation of the predetermined atoms, molecules or groups of molecules or defects excited by an electron current flowing between the micro tip and the sample and excited with an imaging and / or detection system is demonstrated as an imaging signal. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das bildgebende Signal in Abhängigkeit von der Position der Mikrospitze als Element einer Bilddarstellung wiedergegeben oder in Zuordnung zu geometrischen Positionsdaten oder Koordinatendaten in ei­ nem Speicher festgehalten wird.2. The method according to claim 1, characterized ge indicates that the imaging signal in Depends on the position of the microtip as an element reproduced in an image or in association with geometric position data or coordinate data in egg nem memory is held. 3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die geometrischen Positionsdaten oder Koordinatendaten von einem Steuersignal für eine Vorrichtung zur Positionierung der Spitze abgeleitet werden.3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the  geometric position data or coordinate data from a control signal for a positioning device the top. 4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Spannung zwischen Mikrospitze und Probe derart vergrößert ist, daß die Fluoreszenzstrahlung der vorbestimmten Atome, Molekü­ le, Molekülgruppen oder Defekte in und/oder an der Probe, durch einen zwischen der Mikrospitze und der Probe flie­ ßenden Elektronenstrom angeregt wird.4. The method according to any one of the preceding claims, since characterized by that the tension between the micro tip and the sample is enlarged such that the fluorescent radiation of the predetermined atoms, molecules le, molecular groups or defects in and / or on the sample, through a flow between the microtip and the sample ß electron current is excited. 5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das bildgebende Signal mit optischen Mitteln erfaßt wird.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the imaging signal is detected with optical means. 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die geo­ metrischen Positions- oder Koordinatendaten oder das bild­ gebende Signal mit einem optischen Abbildungs- und/oder Detektionssystem erzeugt und zusammen mit der Position der Spitze registriert und/oder dargestellt werden.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the geo metric position or coordinate data or the image giving signal with an optical imaging and / or Detection system generated and together with the position of the Tip registered and / or displayed. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zwi­ schen Mikrospitze und Probe fließende Tunnelstrom durch Variation des Abstandes zwischen der Mikrospitze und der Probe konstant gehalten und eine mit diesem Abstand oder dieser Abstandsänderung korrelierte Meßgröße und/oder der zwischen Mikrospitze und Probe fließende Tunnelstrom bei konstantem Abstand zwischen der Mikrospitze und der Probe ein zusätzliches bildgebendes Ausgangssignal bildet.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the interim tunneling current flowing through the micro tip and sample Varying the distance between the microtip and the  Sample kept constant and one with this distance or this change in distance correlated measured variable and / or tunnel current flowing between microtip and sample constant distance between the microtip and the sample forms an additional imaging output signal. 8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die von der Mikrospitze emittierten Elektronen zusammen mit der optischen Strahlungsquelle die Farbstoffatome oder -moleküle - insbesondere über einen oder mehrere angeregte Zwischenzustände - in einen Anregungszustand überführt werden, aus dem unter Ausstrahlung der gewünschten Fluo­ reszenz ein Übergang in den Ausgangs- oder Grundzustand erfolgt.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the electrons emitted from the microtip along with the optical radiation source the dye atoms or -Molecules - in particular via one or more excited Intermediate states - converted into an excitation state from which the desired Fluo is broadcast resence a transition to the initial or basic state he follows. 9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die flä­ chenhafte Abrasterung der Probenoberfläche oder einer auf einem Substrat befindlichen Probe durch entsprechende relative Bewegungen der Probe oder des Substrates unter der örtlich fixierten Mikrospitze erfolgt.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the flä like scanning of the sample surface or one sample located on a substrate by appropriate relative movements of the sample or the substrate below the locally fixed microtip. 10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstel­ le einer Mikrospitze eine Dünnfilm-Feldeffektkathode ver­ wendet wird. 10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that instead of le a microtip a thin film field effect cathode ver is applied.   11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Pro­ be Desoxyribonucleinsäure- oder Ribonucleinsäure-Moleküle, verwendet werden, deren Nucleotide basenspezifisch mit Farbstoffmolekülen markiert sind.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as a pro be deoxyribonucleic acid or ribonucleic acid molecules, are used, the nucleotides of which are base-specific Dye molecules are marked. 12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mittels oder als Teil eines Raster-Tunnelelektronen-Mikroskops oder einer ähnlichen Anordnung, nach einem der vorangehen­ den Ansprüche, dadurch gekennzeich­ net, daß mindestens eine Mikrospitze oder ein separa­ ter Elektronenemitter für die Anregung der Fluoreszenz der ausgewählten Atome, Moleküle, Molekülgruppen oder Defekte in und/oder an der Probe oder zur flächenhaften Abraste­ rung der auf der Probenoberfläche oder der auf einem Sub­ strat befindlichen Probe vorgesehen ist, wobei ein Abbildungs- oder Detektionssystem zur bildgebenden Dar­ stellung der Fluoreszenzstrahlung der vorbestimmten Atome, Moleküle oder Molekülgruppen oder Defekte durch einen zwi­ schen Mikrospitzenanordnung und der Probe fließenden Elek­ tronenstrom unter relativer Verschiebung von Mikrospitze und Elektronenemitter durch eine Positionierungsvorrich­ tung vorgesehen ist.12. Device for carrying out the method or as part of a scanning tunneling electron microscope or a similar arrangement, according to one of the preceding the claims, characterized net that at least one microtip or a separa ter electron emitter for the excitation of the fluorescence of the selected atoms, molecules, groups of molecules or defects in and / or on the sample or for flat scanning tion on the sample surface or on a sub Strat located sample is provided, with a Imaging or detection system for imaging Dar position of the fluorescence radiation of the predetermined atoms, Molecules or groups of molecules or defects caused by an intermediate micro-tip arrangement and the sample flowing elec Tronenstrom with relative shift of microtip and electron emitter through a positioning device tion is provided. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Mikrospitze einen Teil einer linearen oder sich flächenhaft erstreckenden Anord­ nung von Mikrospitzen bildet. 13. The apparatus according to claim 12, characterized ge indicates that the micro tip is a part a linear or areal arrangement formation of microtips.   14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle einer Mikrospitze eine einzelne Dünnfilm-Feldeffektkathode vorgesehen ist.14. Device according to one of claims 12 or 13, characterized in that instead of a microtip a single thin film field effect cathode is provided. 15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Dünnfilm-Feldeffekt­ elektrode eine zusätzliche Steuerelektrode aufweist.15. The apparatus according to claim 14, characterized ge indicates that the thin film field effect electrode has an additional control electrode. 16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, da­ durch gekennzeichnet, daß eine Strah­ lungsquelle geeigneter Wellenlänge zur zusätzlichen optischen Anregung der ausgewählten Farbstoffatome oder -moleküle, die zur Kennzeichnung ausgewählter Atome, Mole­ küle, Molekülgruppen oder Defekte in der Probe dienen, vorgesehen ist.16. The device according to one of claims 12 to 15, there characterized in that a beam Source of suitable wavelength for additional optical excitation of the selected dye atoms or -molecules used to identify selected atoms, moles cools, molecular groups or defects in the sample, is provided. 17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 16, da­ durch gekennzeichnet, daß als Detek­ tionssystem eine Einzel-Photonen-Zähleinrichtung vorgese­ hen ist.17. The device according to one of claims 8 to 16, there characterized in that as Detek tion system vorese a single photon counter hen is. 18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Photonenzähleinrichtung eine Anordnung zur spektralen Zerlegung und/oder zum Her­ ausfiltern vorbestimmter spektraler Anteile der Fluores­ zenzstrahlung vorgeschaltet ist.18. The apparatus according to claim 17, characterized ge indicates that the photon counter an arrangement for spectral decomposition and / or forth filter out predetermined spectral components of the fluores is connected upstream.
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