DE4232330C1 - Allergen detection by inhibition assays - using serial dilutions of antibody=contg serum - Google Patents

Allergen detection by inhibition assays - using serial dilutions of antibody=contg serum

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Abstract

An improved method for detection of allergens effected by performing a series of inhibition assays in which serum contg. anti-allergen antibodies is added to an allergen contg. extract is claimed. The improvement comprises keeping the allergen concn. constant throughout the series while reducing the antibody concn. in the serum. USE/ADVANTAGE - The method may be applied to foodstuffs, animal feeds, pharmaceuticals and cosmetics. The method is capable of detecting lower allergen concns. than prior art methods (cf. DD 254054).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Allergenen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method for detection allergens according to the preamble of claim 1.

Derartige Verfahren sind beispielsweise in Form der RAST Inhibition bekannt.Such methods are, for example, in the form of RAST inhibition known.

Aus der DD 2 45 054 A1 ist bekannt, daß durch Komparti­ mentierung von Inhibitions- und Antikörperbestim­ mungsphase des RAST-Inhibitionstestes auch die Mes­ sung der Allergenaktivität von sogenannten Depot­ allergenextrakten (an in Flüssigkeit suspendierte Partikel adsorbierte Allergenextrakte) möglich wird. Mit diesem Verfahren wird der Titer allergen­ spezifischer Immunglobulin E-(IgE-)Antikörper, der im ersten Schritt durch Inkubation mit dem in Flüssigkeit suspendierten Allergenträger nicht verbraucht wird, in einem zweiten Schritt auf der Basis eines klassischen Enzym-Immunoassays be­ stimmt. Die im Enzym-Immunoassay mit einer Ver­ dünnungsreihe des IgE-Antiserums erstellte Eich­ kurve ermöglicht die Bestimmung der Menge des im ersten Schritt verbrauchten IgE-Antiserums und damit die Abschätzung der an den suspendierten Träger gebundenen Allergenmenge.From DD 2 45 054 A1 it is known that by Komparti mentation of inhibition and antibody determination phase of the RAST inhibition test also the measurement Solution of allergen activity from so-called depot allergen extracts (on suspended in liquid Particle adsorbed allergen extracts) possible becomes. With this procedure the titer becomes allergenic specific immunoglobulin E (IgE) antibody which in the first step by incubation with the in Liquid allergy carriers did not suspend is consumed in a second step on the Basis of a classic enzyme immunoassay be Right. The in the enzyme immunoassay with a ver calibration series of IgE antiserum curve allows to determine the amount of the first step consumed IgE antiserum and thus the estimate of those suspended Carrier bound allergen amount.

Das Verfahren zielt ab auf die vergleichende Be­ stimmung der Allergenaktivität verschiedener Depot­ allergenextrakte und kann zur Prüfung der Gleichför­ migkeit unterschiedlicher Chargen desselben Depot­ allergenextraktes eingesetzt werden. Es dient jedoch nicht zur Messung kleinster Allergenmengen.The procedure aims at the comparative Be mood of the allergen activity of different depot allergen extracts and can be used to test the equiv different batches of the same depot  allergen extract can be used. However, it serves not for measuring the smallest amounts of allergen.

Aus L. DI BERARDINO et al., J. Immunological Methods 61 (1983), 335-338 ist bekannt, daß die Durchführung des RAST-Inhibitionstests in seiner An­ wendung zur Bestimmung von Antigenaktivitäten kom­ merziell hergestellter Allergenextrakte auch mit tierischen (Kaninchen) Antiseren möglich ist. Die Allergenspezifität der tierischen Antiseren wird im RAST-Inhibitionstest mit humanen Antiseren bekannter Spezifität geprüft (humanes und tierisches Serum konkurrieren um dieselbe Allergenbindungsstelle, wenn sie identische Epitope erkennen). Die Serum­ verdünnung der tierischen Antiseren erfolgt hier ausschließlich zu dem Zweck eine optimale einheit­ liche Titerstufe für den RAST-Inhibitionstest mit dem kommerziell hergestellten Allergenextrakt fest­ zulegen. Zum Vergleich der Antigenaktivitäten ver­ schiedener Allergenextraktchargen werden die 50%-Inhibitionswerte verschiedener RAST-Inhibi­ tionstests herangezogen. Es handelt sich also um einen RAST-Inhibitionstest im klassischen Verständ­ nis, und nicht um ein Verfahren zur Feststellung kleinster Allergenmengen.It is known from L. DI BERARDINO et al., J. Immunological Methods 61 (1983), 335-338 that the Carrying out the RAST inhibition test in its own way application for the determination of antigen activities com commercially produced allergen extracts also with animal (rabbit) antisera is possible. The The allergen specificity of the animal antisera is discussed in the RAST inhibition test with human antisera known Specificity tested (human and animal serum compete for the same allergen binding site, if they recognize identical epitopes). The serum The animal antisera are diluted here an optimal unit solely for the purpose titer level for the RAST inhibition test with the commercially produced allergen extract increase. To compare the antigen activities ver of different allergen extract batches 50% inhibition values of various RAST inhibi tion tests. So it's about a RAST inhibition test in the classic understanding nis, and not a method of determination smallest amounts of allergen.

Bei der RAST-Inhibition werden unterschiedliche Men­ gen an Allergenen, also unterschiedliche Verdünnun­ gen eines die Allergene enthaltenden Extraktes, einer konstanten Menge eines Poolserums zugesetzt. Das Immunglobulin E als Träger der allergischen Reaktion erlaubt es, durch Bestimmung des spezi­ fischen Immunglobulins E die Inhibitionswerte und damit letztlich die Inhibitionskurven zu berechnen.Different menus are used for RAST inhibition allergens, so different dilutions gene of an extract containing the allergens, added to a constant amount of pool serum. The immunoglobulin E as a carrier of allergic Reaction allows the speci fish immunoglobulin E the inhibition values and ultimately to calculate the inhibition curves.

Bei einem solchen Verfahren, wie es beispielsweise auch aus "T. Berg, H. Bennich und S. G. O. Johansson, Int. Arch. Allergy 40 : 770-778 (1971)" oder aus "G. J. Gleich et al., J. Allergy Clin. Immunol., March 1974, Vol . 53, Nr. 3, pp. 158-169" bekannt ist, werden die Allergenkonzentra­ tionen bis zu einer Inhibition von etwa 20% verwen­ det, wobei bereits in diesem Bereich und insbeson­ dere bei niedrigeren Inhibitionswerten die erhalte­ nen Meßpunkte größeren Streuungen unterworfen sind, so daß in diesem Bereich keine klaren Aussagen in Form von Meßkurven erhalten werden können, sondern lediglich Einzelpunktmessungen vorliegen. Ein quan­ titativer Vergleich, wie er beispielsweise im Be­ reich einer 50%igen Inhibition möglich ist, ist in dem Bereich unterhalb 20% bei dem bekannten Ver­ fahren nicht mehr möglich.In such a method, for example  also from "T. Berg, H. Bennich and S. G. O. Johansson, Int. Arch. Allergy 40: 770-778 (1971) " or from "G. J. Gleich et al., J. Allergy Clin. Immunol., March 1974, vol. 53, No. 3, pp. 158-169 "is known, the allergen concentration Use up to an inhibition of about 20% det, already in this area and in particular which are obtained with lower inhibition values NEN measuring points are subject to greater scatter, so that no clear statements in this area Form of measurement curves can be obtained, but only single point measurements are available. A quan quantitative comparison, as described, for example, in Be 50% inhibition is possible is in the range below 20% in the known Ver driving no longer possible.

Das zunehmende Auftreten allergischer Reaktionen und zunehmend größere Empfindlichkeiten bei den betrof­ fenen Personen führen zu der Anforderung, im Bereich von Lebens- oder Futtermitteln, von Arzneimitteln und Kosmetik möglichst geringe Spuren von Allerge­ nen nachweisen zu können.The increasing occurrence of allergic reactions and increasingly greater sensitivity among those affected Open people lead to the requirement in the area of food or feed, of medicines and cosmetics minimal traces of allergen to be able to prove.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gat­ tungsgemäßes Verfahren dahingehend zu verbessern, daß ein Verfahren zum Nachweis von Allergenen ge­ schaffen wird, welches auch bei kleinen und klein­ sten Allergenkonzentrationen eine gesicherte Aus­ sage ermöglicht.The invention has for its object a gat to improve the method in accordance with that a method for the detection of allergens ge will create, even with small and small the most secure allergen concentrations say allows.

Diese der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. This object underlying the invention will by the characterizing features of claim 1 solved.  

Aus US 4 243 651 ist bekannt, daß durch die Verwen­ dung von Positiv- (mit allergenspezifischen IgE-Anti­ körpern) und Negativ-Seren (ohne IgE-Antikörper der geforderten Spezifität) inklusive serieller Verdün­ nung dieser Seren und einer Meßanordnung mit Zählung der Radioaktivität im RAST bis zur Signalkonstanz eine Erhöhung der Meßbereichsempfindlichkeit im unteren Bereich (niedrige IgE-Titer) möglich ist. Zur Verifizierung der RAST-Messungen (spezifisches IgE) wird dabei der Papier-Radio-Immuno-Sorbenttest (PRIST, Gesamt-IgE) herangezogen. Der mit der Durch­ führung dieses Verfahrens verbundene Aufwand ist für Routineuntersuchungen untragbar. Außerdem zielt die Anwendung auf eine früher für therapeutische Frage­ stellungen bedeutsam gewesene Bestimmung des Titers allergenspezifischer IgE-Antikörper ab, nicht jedoch auf den Nachweis von Antigenspuren in biologischen Proben mittels Inhibitionsverfahren.From US 4,243,651 it is known that by the use formation of positive (with allergen-specific IgE anti bodies) and negative sera (without IgE antibodies of the required specificity) including serial dilution tion of these sera and a measuring arrangement with counting the radioactivity in the RAST until the signal is constant an increase in measuring range sensitivity in lower range (low IgE titer) is possible. To verify the RAST measurements (specific IgE) is the paper radio immunosorbent test (PRIST, total IgE). The one with the through This procedure involves effort for Routine examinations intolerable. In addition, the Application to an earlier for therapeutic question significant determination of the titer allergen-specific IgE antibodies, but not on the detection of traces of antigens in biological Samples using inhibition methods.

Die Erfindung schlägt mit anderen Worten vor, im Gegensatz zu der bekannten RAST-Inhibition die Menge an Allergenen bei einer einzelnen Inhibitionsge­ raden, also für jeweils eine Inhibitions-Meßreihe, nicht zu verändern, sondern konstant zu halten. Dieser konstanten und ohnehin sehr geringen Aller­ genmenge sollen erfindungsgemäß unterschiedliche, und zwar abnehmende Mengen an spezifischen Immun­ globulin E-Antikörpern im Serum zugesetzt werden. Die Bestimmung des spezifischen Immunglobulin E mit Hilfe von Allergenscheiben derselben Allergenart führt zu RAST Ergebnissen (vergleiche hierzu etwa DD 2 45 054), die direkt der Titrationsstufe des Serums zugeordnet werden können (Titration des Serums mit PBS), so daß analog den Inhibitionsgera­ den die Geraden aus der Inhibition - Titration ent­ stehen. In other words, the invention proposes in Contrary to the known RAST inhibition the amount of allergens in a single inhibition gene wheel, i.e. for one inhibition measurement series at a time, not to change, but to keep constant. This constant and very small all according to the invention, different amounts of namely decreasing amounts of specific immune globulin E antibodies are added in the serum. Determination of the specific immunoglobulin E with Help from allergy slices of the same type of allergen leads to RAST results (compare about DD 2 45 054), which corresponds directly to the titration level of the Serum can be assigned (titration of the Serums with PBS), so that analogous to the Inhibitionsgera which the lines from the inhibition titration ent  stand.  

Diese Geraden haben auch für Werte unterhalb einer 20%igen Allergeninhibition Gültigkeit und er­ lauben gesicherte Aussagen über das Vorliegen kreuz­ reaktiver Allergene.These lines also have values below one 20% allergen inhibition validity and he  secure statements about the existence cross reactive allergens.

Vorteilhaft wird eine Leerkurve ermittelt, indem das Verfahren auf den reinen Puffer, also den Träger der Allergene, angewendet wird. Diese Leer­ kurve kann anschließend mit den eigentlichen Meß­ kurven verglichen werden und damit eine quantitative Aussage ermöglichen.An empty curve is advantageously determined by the procedure on the pure buffer, i.e. the Carrier of allergens, is applied. This empty curve can then with the actual measurement curves are compared and thus a quantitative Allow statement.

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen im folgenden näher erläutert. Dabei zeigtThe invention is based on the drawings in following explained in more detail. It shows

Fig. 1 ein theoretisches Beispiel einer RAST-Inhibition drei verschiedener Allergene und Fig. 1 shows a theoretical example of a RAST inhibition of three different allergens and

Fig. 2 die Inhibition - Titration. FIG. 2 shows the inhibition - titration.

In Fig. 1 ist ein theoretisches Beispiel darge­ stellt, bei dem der Inhibitionsgrad für drei ver­ schiedene Allergene und für verschiedene Verdünnun­ gen der Allergenkonzentration aufgetragen ist.In Fig. 1, a theoretical example is Darge, in which the degree of inhibition for three different allergens and for different dilutions of the allergen concentration is applied.

Die mit 1 gekennzeichnete Gerade zeigt die Selbst­ inhibition eines Allergens A und stellt damit einen Bezugswert für die Allergenpotenz des eingesetzten Extraktes dar.The straight line marked with 1 shows the self-inhibition of an allergen A and thus represents a reference value for the allergen potency of the extract used.

Bei der mit 2 bezeichneten Geraden wird das Allergen A, das für die Messung der Geraden 1 verwendet wurde, durch den Extrakt B inhibiert, so daß erkenn­ bar ist, daß gemeinsame Allergendeterminanten vor­ handen sind. Die Steigung der Geraden 2 ist ein Maß für die Gemeinsamkeit dieser Allergendeterminan­ ten. In the straight line labeled 2 , allergen A , which was used for the measurement of straight line 1 , is inhibited by extract B , so that it can be seen that common allergen determinants are present. The slope of the straight line 2 is a measure of the commonality of these allergy determinants.

Die Gerade 3 als Meßergebnis eines Extraktes C zeigt, daß keine Inhibition des Extraktes A durch ein Allergen C vorliegt, so daß C höchstwahrschein­ lich keine allergene Komponente von A aufweist.Line 3 as the measurement result of an extract C shows that there is no inhibition of extract A by an allergen C , so that C most likely does not have an allergenic component of A.

In Fig. 1 ist der Wert der 50% Inhibition durch eine gestrichelte horizontale Linie markiert. Durch die Schnittstellen mit den Geraden 1 und 2 und dem daraus jeweils resultierenden Verdünnungsgrad der beiden Allergene A und B können Vergleiche über die Stärke der Allergengemeinsamkeit gemacht werden.In Fig. 1 the value of 50% inhibition is marked by a dashed horizontal line. Due to the interfaces with the straight lines 1 and 2 and the resulting degree of dilution of the two allergens A and B , comparisons can be made about the strength of the allergen togetherness.

Unterhalb der 20% Marke der Inhibition ist ein typischer Bereich eingezeichnet und durch Kreise markiert, in dem vorteilhaft das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden kann und in dem der klassische Nachweis für Allergene nur mit unbefrie­ digender Genauigkeit geführt werden kann.Below the 20% mark of inhibition is one typical area and drawn by circles marked, in which advantageously the invention Procedure can be applied and in which the classic proof of allergens only with unfree reasonable accuracy can be performed.

In ähnlicher Darstellung wie in Fig. 1 würden bei Anwendung bekannter Meßverfahren Ergebnisse erzielt, wenn die Inhibition gleicher Allergene unterschied­ licher Herstellung und/oder unterschiedlicher Kon­ zentrationen gemessen würde. In diesem Fall wäre die Gerade 1 ebenfalls die Darstellung der Selbstinhibi­ tion und würde daher den Bezugswert darstellen. Die Gerade 2 bringt zum Ausdruck, daß der gemessene Stoff die gleichen Allergene enthält, jedoch in schwächerer Konzentration. Die Gerade 3 zeigt, daß der gemessene Stoff entweder das Allergen gar nicht oder in einer ganz erheblich schwächeren Konzentra­ tion enthält. Meßtechnisch kann dies bei dem bekannten Verfahren nicht differenziert werden, da im oder unterhalb des Bereiches von 20% Inhibi­ tionsgrad keine gesicherten Aussagen möglich sind. In a representation similar to that in FIG. 1, results would be achieved using known measuring methods if the inhibition of the same allergens of different manufacture and / or different concentrations were measured. In this case, straight line 1 would also represent the self-inhibition and would therefore represent the reference value. Line 2 expresses that the measured substance contains the same allergens, but in a weaker concentration. The straight line 3 shows that the measured substance either does not contain the allergen or contains it in a considerably weaker concentration. In terms of measurement technology, this cannot be differentiated in the known method, since no reliable statements are possible in or below the range of 20% degree of inhibition.

In Fig. 2 sind Meßergebnisse für den Nachweis von Allergenen dargestellt, die mit dem erfindungsge­ mäßen Verfahren der Inhibition/Titration erhalten wurden. Dabei ist horizontal - wie in Fig. 1 - der Verdünnungsgrad der Serumkonzentration von unver­ dünnt ausgehend aufgetragen. Senkrecht ist die pro­ zentuale Bindung der Gesamtaktivität aufgetragen.In Fig. 2 measurement results for the detection of allergens are shown, which were obtained with the inventive method of inhibition / titration. Here, as in FIG. 1, the degree of dilution of the serum concentration is plotted horizontally starting from undiluted. Percentage of total activity is plotted.

Eine Gerade 4 stellt einen Leerwert dar, bei dem lediglich der Träger, also das Lösungsmittel bzw. der Verdünnungspuffer, des zu untersuchenden Allergens getestet wurde.A straight line 4 represents a blank value, in which only the carrier, ie the solvent or the dilution buffer, of the allergen to be examined was tested.

Demgegenüber weicht eine Gerade 5 stark vom Verlauf der Geraden 4 ab, wobei die Gerade 5 die Meßergeb­ nisse der Selbstinhibition des Prüfallergens wieder­ gibt, dessen Spuren in weiteren Stoffen C oder A′′ noch nachgewiesen werden sollen. Die Gerade 5 stellt daher eine Kontrollkurve dar.In contrast, a straight line 5 differs greatly from the course of the straight line 4 , the straight line 5 giving the measurement results of the self-inhibition of the test gene, the traces of which are to be detected in further substances C or A '' . The straight line 5 therefore represents a control curve.

Die Gerade 6 stellt die Meßergebnisse für den Stoff C dar. Diese Gerade liegt im Meßbereich der Leer­ wertgeraden 4, so daß davon ausgegangen werden kann, daß der Stoff A auch nicht im kleinen Maßstab ge­ meinsame Allergendeterminanten mit dem untersuchten Allergen A aufweist.The straight line 6 represents the measurement results for the substance C. This straight line lies in the measuring range of the empty straight line 4 , so that it can be assumed that the substance A does not have common allergen determinants with the examined allergen A even on a small scale.

Eine Gerade 7 stellt das Meßergebnis eines Stoffes A′′ dar, wobei durch den Kurvenverlauf ersichtlich ist, daß A′′ auch Allergen des Typs A enthält, jedoch nur in geringen Mengen. Durch verschiedene jeweils konstant gehaltene Mengen von A′′ bei der Inhibi­ tion/Titration von A kann ein entsprechender Faktor ermittelt werden, der über das Maß der Allergenakti­ vität des Allergens A im Stoff A′′ Aufschluß gibt. A straight line 7 represents the measurement result of a substance A '' , it being evident from the course of the curve that A '' also contains type A allergens, but only in small amounts. A corresponding factor can be determined by different amounts of A '' in the inhibition / titration of A , which provides information about the degree of allergen activity of the allergen A in the substance A '' .

Durch das in Fig. 2 verwendete Verfahren sind auch Kurvenverläufe unterhalb 20% Inhibition erhält­ lich, die gut voneinander zu unterscheiden sind. In diesem Bereich erlaubt das erfindungsgemäße Ver­ fahren gesicherte Aussagen über das Vorhandensein gleicher oder verwandter Allergene im Vergleich zu dem Referenzextrakt, der das Referenzallergen ent­ hält.The method used in FIG. 2 also gives curves below 20% inhibition, which can be clearly distinguished from one another. In this area, the method according to the invention allows reliable statements to be made about the presence of the same or related allergens in comparison with the reference extract containing the reference allergen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher ver­ wendet werden, um auch noch geringste Allergenkon­ zentrationen in beliebigen Stoffen nachzuweisen, beispielsweise im Bereich von Lebensmitteln, von Futtermitteln, im Bereich von Arzneimitteln oder von Kosmetika.The inventive method can therefore ver be applied to even the smallest allergen con to demonstrate concentrations in any substance, for example in the field of food from Feed, in the field of pharmaceuticals or of Cosmetics.

Claims (2)

1. Verfahren zum Nachweis von Allergenen mittels Inhibitionsmethode, wobei einem Allergene enthaltenden Extrakt Serum zugegeben wird, welches Allergen-Antikörper enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Allergenmenge des Extraktes für jeweils eine Inhibitions-Meß­ reihe konstant gehalten wird und abnehmenden Mengen von Allergen-Antikörpern im Serum zu­ gesetzt wird. 1. A method for the detection of allergens by means of an inhibition method, wherein an allergen-containing extract serum is added, which contains allergen antibodies, characterized in that the allergen amount of the extract is kept constant for one inhibition measurement series and decreasing amounts of allergen antibodies is added to the serum. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß einerseits eine Leerkurve mit dem Puffer erarbeitet wird, der als Träger des Allergens dient, und daß anderer­ seits die eigentlichen Meßkurven mit unter­ schiedlichen Allergenverdünnungen erarbeitet werden, bei denen dem Träger das Allergen zu­ gesetzt ist.2. The method according to claim 1, characterized records that on the one hand an empty curve is worked out with the buffer, which as Carrier of the allergen serves and that of others the actual measurement curves with under worked out different allergen dilutions be in which the carrier to the allergen is set.
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