DE4225340A1 - Enzyme immunoassay with chemiluminescence detection - using a system comprising oxalate, condensing agent and peroxide - Google Patents

Enzyme immunoassay with chemiluminescence detection - using a system comprising oxalate, condensing agent and peroxide

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Abstract

Immunoassaying for a biomolecule using an enzyme label comprises detecting the label by enzyme-catalysed conversion of a non-fluorescent substrate to a fluorescent prod. followed by chemiluminescence detection in a system comprising oxalic acid (or an oxalate), a condensing agent and a peroxide in a protic medium. The assay is performed using an antigen, antibody, hapten, receptor, ligand or nucleotide labelled with a hydrolase, oxidase, phosphatase or catalase. The substrate is a non-fluorescent coumarin, indoxyl, porphyrin, xanthene, sulphoflavin or phthalocyanine deriv. which is readily soluble in the protic medium. The condensing agent is a carbodiimide, e.g. DCC. The peroxide is H2O2 or an H2O2 adduct. The protic medium is aq. EtOH with a pH of 1-4. USE/ADVANTAGE - The assay may be used for quantitative determn. of all kinds of biomolecules, e.g. pharmaceuticals and environmental poisons. The chemiluminescence detection system is more sensitive than fluorescence or absorption detection systems and avoids using expensive and unstable reagents such as adamantane dioxetanes.

Description

Stand der Technik:State of the art:

Chemilumineszenzdetektionen stellen die empfindlichste Art der quantitativen Auswertung von Immunoassays dar [1]. Neben älteren nur mäßig empfindlichen Verfahren wird der gegenwärtige Stand der Technik durch folgende Varianten bestimmt:Chemiluminescence detections represent the most sensitive type of quantitative evaluation of immunoassays [1]. In addition to older ones the current state of the art is only moderately sensitive Technology determined by the following variants:

1. Chemilumineszenzdetektion durch direkte Luminophormarkierung [1,2,3]1. Chemiluminescence detection by direct luminophore labeling [1,2,3]

Die hauptsächlich eingesetzten Luminophore, Luminol- und Acridiniumderivate, weisen dabei den Nachteil einer nur bedingten Beständigkeit auf. Eine Amplifizierung des Signals ist nicht möglich.The main used luminophores, Luminol- and Acridinium derivatives have the disadvantage of only a limited one Resistance to. The signal is not amplified possible.

2. Chemilumineszenzdetektion durch Enzymmarkierung und Verwendung chemilumineszenter Substrate [2,3,4]2. Chemiluminescence detection by enzyme labeling and use chemiluminescent substrates [2,3,4]

Bei Verwendung des POD/Luminolsystems treten relativ große interserielle Inpräzisionen auf und die Haltbarkeit bzw. Enzymaktivität der POD-Konjugate ist unbefriedigend.When using the POD / Luminol system occur relatively large interserial precision and the durability or Enzyme activity of the POD conjugates is unsatisfactory.

Bei Verwendung von Dioxetanderivaten als 15 Enzymsubstrate erreicht man sehr hohe Empfindlichkeit - nachteilig ist der hohe Preis der Dioxetane.Achieved when using dioxetane derivatives as 15 enzyme substrates one very high sensitivity - disadvantageous is the high price of the Dioxetanes.

Literatur:Literature:

1. S. Albrecht, H. Brandl, W. Adam, Chem.i.u.Zeit 24 (1990) 227-238.1. S. Albrecht, H. Brandl, W. Adam, Chem.i.u.Zeit 24 (1990) 227-238.

2. A.K. Campbell, Chemiluminescence, VCH Weinheim 19882. A.K. Campbell, Chemiluminescence, VCH Weinheim 1988

3. S. Albrecht, H. Brandl, W. Adam, Nachr. Chem. Techn. Lab. 40 (1992) 547-5513. S. Albrecht, H. Brandl, W. Adam, Nachr. Chem. Techn. Lab. 40 (1992) 547-551

4. A.P.Schaap, US-Patent 4.857.652 vom 23.08.1988 4. A.P. Schaap, U.S. Patent 4,857,652, Aug. 23, 1988  

Ziel der Erfindung:Purpose of the invention:

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines neuen, ökonomisch günstigen und hochsensitiven Verfahrens zur Chemilumineszenz­ detektion von Immunoassays.The aim of the invention is the development of a new, economical inexpensive and highly sensitive process for chemiluminescence detection of immunoassays.

Anwendungsgebiet der Erfindung:Field of application of the invention:

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in den Bereichen Bioche­ mie, Biomedizin, Molekularbiologie, Umweltanalytik und Pharmakologie. Es können alle Biomoleküle im weitesten Sinn auf immunologischer Basis durch das hier beschriebene Chemilumineszenzdetektionsverfahren nachgewiesen werden.The field of application of the invention lies in the areas of bioche chemistry, biomedicine, molecular biology, environmental analysis and Pharmacology. It can open up all biomolecules in the broadest sense immunological basis by the described here Chemiluminescence detection methods can be detected.

Darstellung des Wesens der Erfindung:Presentation of the nature of the invention:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Chemilumineszenzdetektion von Immunoassays für Biomoleküle.The invention relates to a method for chemiluminescence detection of immunoassays for biomolecules.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß nach erfolgter immunologischer Reaktion unter Verwendung eines enzymmarkierten Antigens, Antikörper, Haptens, Rezeptors, Liganden oder Nukleotids ein fluoreszenzfähiges Molekül aus einem nichtfluoreszenten Enzymsubstrat enzymkatalysiert synthetisiert wird sind dessen Quantifizierung durch Chemilimineszenzdetektion im System Oxalsäure oder Oxalat/Kondensationsmittel/Peroxid in protischem Milieu erfolgt. According to the invention the object is achieved in that after immunological reaction using a enzyme-labeled antigen, antibody, haptens, receptor, ligand or nucleotide is a fluorescent molecule from a non-fluorescent enzyme substrate synthesized by enzyme catalysis is its quantification by chemiliminescence detection in the System oxalic acid or oxalate / condensing agent / peroxide in protic milieu.  

Der Reaktionsmechanismus wird durch die folgenden allgemeinen Gleichungen widergespiegelt:The reaction mechanism is generalized by the following Equations reflected:

ES = nicht fluoreszentes Enzymsubstrat
<-E = enzymmarkierter Analyt
P = hoch fluoreszentes Produkt
P* = Produkt in elektronisch angeregten Zustand.ES = non-fluorescent enzyme substrate
<-E = enzyme-labeled analyte
P = highly fluorescent product
P * = product in electronically excited state.

Die Reaktion erfolgt im protischen Milieu (H2O/Ethanol) was einen großen Vorteil für biochemische Analysen darstellt. Dabei ist die Menge des pro Zeiteinheit entstehenden fluoreszenten Produktes P direkt oder indirekt proportional der Analytkonzentration. Das Produkt P sensibilisiert die chemilumineszente Reaktion von Oxalsäure mit einem Peroxid in Gegenwart eines Kondensationsmittels (Gl. 2) und wird dabei in den ersten elektronisch angeregten Singulett- oder Triplettzustand überführt. Das angeregte Produkt kehrt unter Lichtemission in den Grundzustand zurück, wobei die mit einem empfindlichen Luminometer zu detektierenden Lichtquanten proportional der Produktkonzentration sind. Die Menge des detektierten Lichts stellt somit ein direktes Maß für die Analytkonzentration dar und kann nach Kalibrierung des Verfahrens zur quantitativen Bestimmung des Analyten eingesetzt werden. The reaction takes place in a protic environment (H 2 O / ethanol), which is a great advantage for biochemical analyzes. The amount of fluorescent product P produced per unit of time is directly or indirectly proportional to the analyte concentration. Product P sensitizes the chemiluminescent reaction of oxalic acid with a peroxide in the presence of a condensing agent (Eq. 2) and is thereby converted into the first electronically excited singlet or triplet state. The excited product returns to the ground state with light emission, the light quanta to be detected with a sensitive luminometer being proportional to the product concentration. The amount of light detected is therefore a direct measure of the analyte concentration and, after calibration of the method, can be used for the quantitative determination of the analyte.

Da die Detektionsreaktion mit Chemilumineszenzmessung optimal bei einem pH-Wert um 1 abläuft, müssen bei Nutzung des beschriebenen Systems als Enzymsubstrate vorrangig solche Verbindungen eingesetzt werden, welche im sauren, protischen Milieu Produkte mit hoher Fluoreszenz und damit in der Mehrzahl der Fälle guten Sensibilisatoreigenschaften für die Peroxyoxalatchemilumineszenz liefern. Namentlich seien hier erwähnt Cumarinderivate, Indoxylderivate, Porphyrinderivate, Xanthenderivate, Sulfoflavine oder Phthalocyanine.Because the detection reaction with chemiluminescence measurement is optimal a pH value around 1, must be used when using the Systems as enzyme substrates primarily such compounds which are used in acidic, protic environments with high fluorescence and therefore good in the majority of cases Sensitizer properties for peroxyoxalate emiluminescence deliver. Coumarin derivatives should be mentioned here, Indoxyl derivatives, porphyrin derivatives, xanthene derivatives, sulfoflavins or phthalocyanines.

Besondere Vorteile des Verfahrens sind:Particular advantages of the process are:

1. Chemilumineszenzmessungen sind aufgrund des gegenwärtigen Standes der Technik sehr empfindlich möglich, bis hin zur Detektion von Einzelphotonen.1. Chemiluminescence measurements are based on the current State of the art very sensitive possible up to Detection of single photons.

2. Chemilumineszenzmessungen haben deutliche Vorteile gegenüber Fluoreszenz oder Absorptionsmessungen.2. Chemiluminescence measurements have clear advantages over Fluorescence or absorption measurements.

3. Eine deutliche Empfindlichkeitsteigerung des Verfahrens gegenüber einer direkten Markierung mit Luminophor oder Fluoreszenzfarbstoff wird dadurch erzielt, daß durch den enzymatischen Schritt pro Analytmolekül eine Vielzahl von zu detektierenden Produktmolekülen gebildet werden.3. A significant increase in sensitivity of the process compared to direct labeling with luminophore or Fluorescent dye is achieved in that enzymatic step per analyte molecule a variety of to Detecting product molecules are formed.

4. Die benötigten Reagenzien für die Chemilumineszenzdetektion sind wesentlich kostengünstiger im Vergleich zu ähnlich empfind­ lichen Verfahren z. B. auf der Basis von Adamantandioxetanen.4. The reagents required for chemiluminescence detection are much cheaper compared to similarly sensitive union process z. B. based on adamantanedioxetanes.

5. Die Meßzeit beträgt pro Probe nur wenige Sekunden, was einen ökonomischen Vorteil vor allem für serielle Messungen darstellt.5. The measurement time is only a few seconds per sample, which is one represents economic advantage especially for serial measurements.

6. Das Verfahren ist universell für die quantitative Bestimmung von Biomolekülen, einschließlich Pharmaka und Umweltgiften einsetzbar. 6. The procedure is universal for quantitative determination of biomolecules, including pharmaceuticals and environmental toxins applicable.  

Ausführungsbeispiel:Design example: Chemiluminometrische Bestimmung des Prostataspezifischen Antigens PSAChemiluminometric determination of the prostate-specific antigen PSA

Zur Durchführung der PSA-Bestimmung wurden folgende Reagenzien aus dem TANDEM®-PSA-Kit der Firma HYBRITECH (Best.-Nr. 1813) verwen­ det:The following reagents from the TANDEM® PSA kit from HYBRITECH (order no. 1813 ) were used to carry out the PSA determination:

  • 1. Antikörperkonjugat
    Monoklonales MAUS-IgG, (gegen PSA) konjugiert mit Alkalischer Phosphatase (Rind) in einer Proteinmatrix mit 0,1% Natrium­ azid.    1. Antibody conjugate
    Monoclonal MOUSE IgG (against PSA) conjugated to alkaline phosphatase (bovine) in a protein matrix with 0.1% sodium azide.
  • 2. Kugeln
    Plastikkugeln mit monoklonalem Maus-IgG (gegen PSA) beschich­ tet, in Puffer mit 0,1% Natriumazid.    2. bullets
    Plastic balls coated with monoclonal mouse IgG (against PSA), in buffer with 0.1% sodium azide.
  • 3. Nullstandard
    Humanserum ohne meßbaren Anteil PSA.    3. Zero standard
    Human serum with no measurable proportion of PSA.
  • 4. Standard
    Humanserum mit 10 ng PSA/ml.    4. Standard
    Human serum with 10 ng PSA / ml.
  • 5. Waschkonzentrat5. Wash concentrate

Desweiteren wurden verwendet:The following were also used:

  • - Ammoniumoxalat, Indoxylphosphat und Bis(cyclohexyl)carbodiimid (DCC) (Fa. SIGMA)- ammonium oxalate, indoxyl phosphate and bis (cyclohexyl) carbodiimide (DCC) (SIGMA)
  • - H2O2 und HCl p. a. (Fa. MERCK)- H 2 O 2 and HCl pa (MERCK)

Das Testprinzip ist in Abbildung 1 dargestellt. The test principle is shown in Figure 1.  

Testdurchführung:Test execution:

Die Behandlung der Proben, Kontrollen bzw. Standards erfolgt zunächst gemäß Hybritech-PSA-Arbeitsanleitung bis zum Wasch­ schritt.The samples, controls and standards are treated first according to Hybritech PSA work instructions until washing step.

Dann erfolgt die Zugabe von 100 µl Indoxylphosphatlösung (1 g/l) in Boratpuffer (pH = 8,3) pro Röhrchen. Nach Mischen und Inkubieren (20 min) wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Ethanol abs. gestoppt.Then 100 μl of indoxyl phosphate solution (1 g / l) are added Borate buffer (pH = 8.3) per tube. After mixing and incubating (20th min) the reaction by adding 1 ml of abs. stopped.

Zur Chemilumineszenzmessung werden 100 µl Probe gemischt mit 100 µl (NH4)2(COO)2-Lösung (1 g/l), 10 µl H2O2 (3%ig in Ethanol) und 10 µl HCl (15%ig). Der resultierende pH-Wert liegt bei 1. Die so vorbereiteten Röhrchen werden in die Meßkammer des Luminometers gebracht (LB 9503, Fa. Berthold, BRD), wo nach Injektion von 300 µl DCC-Lösung in Ethanol (10 g/l) über 1 s die Photoemission gemessen wird. Das integrale Meßsignal in RLU (relative light units) wird zur Auswertung genutzt.For the chemiluminescence measurement, 100 µl sample is mixed with 100 µl (NH 4 ) 2 (COO) 2 solution (1 g / l), 10 µl H 2 O 2 (3% in ethanol) and 10 µl HCl (15%) . The resulting pH value is 1. The tubes prepared in this way are brought into the measuring chamber of the luminometer (LB 9503, from Berthold, FRG), where after injection of 300 .mu.l of DCC solution in ethanol (10 g / l) over 1 s the photoemission is measured. The integral measurement signal in RLU (relative light units) is used for evaluation.

Beispiele von Meßdaten:
0-Standard: 5015 g RLU/1 s
40 ng/ml-Standard: 154026 RLU/1 s
81 ng/ml-Probe: 61846 RLU/4 s.Examples of measurement data:
0 standard: 5015 g RLU / 1 s
40 ng / ml standard: 154026 RLU / 1 s
81 ng / ml sample: 61846 RLU / 4 s.

Bei Linearität des Tests bis 100 ng/ml PSA-Konzentration beträgt die Intraassaypräzision 3% - die Interassaypräzision 6%. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,1 ng/ml PSA.If the test is linear, the concentration is up to 100 ng / ml PSA intra-assay precision 3% - inter-assay precision 6%. The Detection limit is 0.1 ng / ml PSA.

Im Vergleich zum immunoenzymetrischen Test von Hybritech wird mit dem beschriebenen Verfahren eine höhere Präzision und Empfindlichkeit erreicht.In comparison to the immunoenzymetric test from Hybritech with the method described a higher precision and Sensitivity reached.

Claims (9)

1. Verfahren zur Chemilumineszenzdetektion von Immunoassays für Biomoleküle, gekennzeichnet dadurch, daß nach erfolgter immunologischer Reaktion unter Verwendung eines enzymmarkierten Biomoleküls ein fluoreszenzfähiges Molekül aus einem nichtfluoreszenten Enzymsubstrat enzymkatalysiert synthetisiert wird und dessen Quantifizierung durch Chemilumineszenzdetektion im System Oxalsäure oder Oxalat/Kondensationsmittel/Peroxid in protischem Milieu erfolgt.1. Method for chemiluminescence detection of immunoassays for Biomolecules, characterized in that after immunological reaction using an enzyme labeled Biomolecule is a fluorescent molecule from one non-fluorescent enzyme substrate synthesized by enzyme catalysis and its quantification by chemiluminescence detection in the System oxalic acid or oxalate / condensing agent / peroxide in protic milieu. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomoleküle Antigene, Antikörper, Haptene, Rezeptoren, Liganden oder Nucleotide eingesetzt werden können.2. The method according to claim 1, characterized in that as Biomolecules antigens, antibodies, haptens, receptors, ligands or nucleotides can be used. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Enzymmarkierung beliebige Enzyme, namentlich Hydrolasen, Oxidasen, Phosphatasen oder Katalasen eingesetzt werden können.3. The method according to claim 1, characterized in that for Enzyme labeling any enzyme, namely hydrolases, oxidases, Phosphatases or catalases can be used. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymsubstrate vorrangig nicht fluoreszierende und im protischen Milieu leicht lösliche Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen, namentlich Cumarin-, Indoxyl-, Porphyrin-, Xanthen-, Sulfoflavin- oder Phthalocyaninderivate eingesetzt werden können.4. The method according to claim 1, characterized in that as Enzyme substrates primarily non-fluorescent and protic Environment easily soluble derivatives of fluorescent dyes, namely coumarin, indoxyl, porphyrin, xanthene, sulfoflavin or phthalocyanine derivatives can be used. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Quantifizierung des gebildeten fluoreszenten Produktes das System Oxalsäure oder Oxalat/Kondensationsmittel/Peroxid im sauren, protischen Milieu eingesetzt wird bei Nutzung eines empfindlichen Chemilumineszenzmeßgerätes.5. The method according to claim 1, characterized in that for Quantification of the fluorescent product formed the system Oxalic acid or oxalate / condensing agent / peroxide in acid, protic milieu is used when using a sensitive Chemiluminescence meter. 6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vorrangig freie Oxalsäure oder leicht lösliche Salze der Oxalsäure eingesetzt werden. 6. The method according to claim 1, characterized in that primarily free oxalic acid or easily soluble salts of oxalic acid be used.   7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kondensationsmittel vorrangig ein Carbodiimid, z. B. DCC, eingesetzt wird.7. The method according to claim 1, characterized in that as Condensing agent primarily a carbodiimide, e.g. B. DCC, is used. 8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxid vorrangig H2O2 oder ein H2O2-Addukt eingesetzt wird.8. The method according to claim 1, characterized in that H 2 O 2 or an H 2 O 2 adduct is primarily used as the peroxide. 9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion vorrangig im wäßrig-ethanolischen Milieu bei pH 1-4 durchgeführt wird.9. The method according to claim 1, characterized in that the Reaction primarily in an aqueous-ethanolic environment at pH 1-4 is carried out.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994027154A1 (en) * 1993-05-12 1994-11-24 Thomas Schlederer Method for detection of substances
RU2720807C1 (en) * 2019-06-04 2020-05-13 Международная общественная организация "Международная академия аграрного образования" (МААО) Method for determining chemical participation of chemoluminescence activator in lipoperoxidase reaction

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