DE4224213A1 - HIRUDINANALOGES AND METHOD FOR THEIR PRODUCTION - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft hirudinanaloge Polypeptide, ein Ver fahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende, pharmazeu tische Zusammensetzungen.The invention relates to hirudin analogue polypeptides, a Ver drive for their preparation and containing them, pharmazeu table compositions.
Das zum ersten Mal aus dem Blutegel Hirudo medicinalis isolierte Hirudin ist ein ein bekannter polypeptidischer Thrombin-Inhibitor (Markwardt, F., Methods in Enzymology, 19, S. 924; Markwardt, F., 1985, Biomed. Biochim. Asta 44, s. 1007).This is the first time from the leech Hirudo medicinalis isolated hirudin is a known polypeptidic Thrombin inhibitor (Markwardt, F., Methods in Enzymology, 19, p. 924; Markwardt, F., 1985, Biomed. Biochim. Asta 44, s. 1007).
Insbesondere übt Hirudin seine gerinnungshemmende Wirkung durch Bindung an Thrombin über ionische Wechselwirkungen aus, wobei es auf diese Weise die Umlagerung von Fibrinogen in Fibrin und die anschließende Bildung eines Blutklumpens verhindert.In particular, hirudin exerts its anticoagulant effect by binding to thrombin via ionic interactions , whereby it is in this way the rearrangement of fibrinogen in fibrin and the subsequent formation of a blood clot prevented.
In Tierstudien wurde gezeigt, daß Hirudin selbst bei der Verhinderung von venösen Thrombosen, Gefäßverschlüssen und verteilter, intravaskulärer Thrombin induzierter Koagulation wirksam ist. In animal studies it was shown that hirudin itself in the Prevention of venous thrombosis, vascular occlusions and distributed, intravascular thrombin induced coagulation is effective.
Daneben zeichnet sich Hirudin durch seine niedrige Toxizi tät, und geringe oder völlig fehlende Antigenität aus, und es wird auch rasch aus dem Kreislauf entfernt (Markwardt, F. et al. 1982, Thromb. Haemostasis 47, S. 226).In addition, Hirudin is characterized by its low toxicity and low or total lack of antigenicity, and it is also quickly removed from the circulation (Markwardt, F. et al. 1982, Thromb. Haemostasis 47, p. 226).
Es sind drei natürliche Varianten des Hirudin bekannt. Die Sequenz der ersten als HV1 bezeichneten Variante wurde von Dodt et al FEBS 165 (1984) 180-184 aufgeklärt.There are three natural variants of hirudin known. The Sequence of the first variant designated HV1 was from Dodt et al FEBS 165 (1984) 180-184.
Die Amiosäuresequenz der HV1-Variante ist wie folgt (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984):The amino acid sequence of the HV1 variant is as follows (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984):
Eine zweite als HV2 bezeichnete Variante wurde bei Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 (1986) 803-811 beschrie ben, und eine dritte Variante namens HV3 wurde bei Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 1084-1088 beschrie ben. A second variant, designated HV2, was developed by Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 (1986) 803-811 ben, and a third variant called HV3 was at Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 1084-1088 ben.
Gegenstand der Erfindung ist eine Polypeptid, abgeleitet aus einem Hirudin, mit der folgenden Formel (I)The invention relates to a polypeptide derived from a hirudin, with the following formula (I)
P-(Gly)n-X (I)P- (Gly) n -X (I)
worin
P eine HV1 oder HV1 (Val 65) Polypeptidid-Einheiten mit der in
Fig. 1 definierten Aminosäuresequenz ist,
-(Gly)- ist das bivalente Radikal von Glycin -NHCH₂-CO-;
X ist -OH oder -NH₂ und
n ist Null oder 1,
mit der Maßgabe, daß, wenn P HV1 und n Null ist, X nur -NH₂
ist, und daß, wenn n 1 ist, X nur -OH ist.wherein
P is an HV1 or HV1 (Val 65) polypeptide units having the amino acid sequence defined in Figure 1,
- (Gly) - is the bivalent radical of glycine -NHCH₂-CO-;
X is -OH or -NH₂ and
n is zero or 1,
with the proviso that when P HV1 and n is zero, X is only -NH₂, and when n is 1, X is only -OH.
Die Erfindung umfaßt auch pharmazeutisch annehmbare Salze der Verbindung der Formel (I).The invention also includes pharmaceutically acceptable salts the compound of formula (I).
Beispiele pharmazeutisch annehmbarer Salze können Salze mit pharmazeutisch annehmbaren, anorganischen Säure sein, z. B. Salzsäure, Bromwasserstoff, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und Salze mit pharmazeutisch annehmbaren, organischen Säuren, z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Äpfel säure, Succinsäure, Ascorbinsäure und Weinsäure.Examples of pharmaceutically acceptable salts may include salts with pharmaceutically acceptable inorganic acid, e.g. B. Hydrochloric acid, hydrogen bromide, sulfuric acid and phosphoric acid, and salts with pharmaceutically acceptable, organic Acids, e.g. Acetic acid, citric acid, maleic acid, apples acid, succinic acid, ascorbic acid and tartaric acid.
Weitere Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Salzen kön nen Salze sein mit pharmazeutisch annehmbaren, anorganischen Basen, z. B. Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium oder Ammo niumsalzen, oder Salze mit organischen Basen mit zur Salzbildung geeignetem Stickstoff, wie sie üblicherweise in der Pharmazie eingesetzt werden.Other examples of pharmaceutically acceptable salts may be mentioned salts with pharmaceutically acceptable, inorganic Bases, e.g. As sodium, potassium, calcium, magnesium or ammo niumsalzen, or salts with organic bases with zur Salt formation of suitable nitrogen, as commonly used in used in pharmacy.
Daneben können die erfindungsgemäßen, von Hirudin abgeleiteten Polypeptide auch innere Salze bilden, vorausgesetzt, daß sie gleichzeitig freie Carbonsäuren und Aminogruppen enthalten.In addition, the inventive, of hirudin derived polypeptides also form internal salts, provided that they simultaneously contain free carboxylic acids and Contain amino groups.
Die Verbindungen, die Gegenstand der Erfindung sind, können durch ein Verfahren hergestellt werden, das umfaßt:The compounds which are the subject of the invention can be prepared by a process comprising:
- a) die Herstellung eines Expressionsvektors, der ein für das vom Hirudin abgeleitete Polypeptid der Formel (I) kodierendes DNA-Molekül enthält, worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe x gleich -OH ist, und der in der Lage ist, die Synthese des Polypeptids in einem geeigneten Wirtsmikroorganismus zu bewerkstelligen;a) the production of an expression vector containing a the hirudin-derived polypeptide of the formula (I) containing coding DNA molecule, wherein under Considering the above proviso x is -OH, and which is capable of the synthesis of the polypeptide in a suitable host microorganism accomplish;
- b) Einführung des Expressionsvektors in den geeigneten Wirtsmikroorganismus;b) Introduction of the expression vector into the appropriate Host microorganism;
- c) Expression, Sekretion und Isolierung des Polypeptids aus dem Wirtsmikroorganismus, wodurch eine Verbindung der Formel (I) erhalten wird, worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe P, -(Gly)- und n die Bedeutungen wie oben haben und X -OH ist; undc) expression, secretion and isolation of the polypeptide from the host microorganism, creating a compound of the formula (I), wherein under Considering the above proviso P, - (Gly) - and n have the meanings as above and X is -OH; and
- d) falls erwünscht, eine enzymatische Umwandlung der Ver bindung der Formel (I), worin unter den obigen Bedin gungen n gleich 1 und x -OH ist, in die entsprechende Verbindung der Formel (I), worin Berücksichtigung der obigen Maßgabe n gleich Null und X -NH₂ ist, durch ein geeignetes, amidierendes Enzym und, falls erwünscht, die Umwandlung der Verbindung der Formel (I) in sein pharmazeutisch annehmbares Salz.d) if desired, an enzymatic conversion of Ver Compound of the formula (I), wherein under the above Bedin n equals 1 and x is -OH, in the corresponding Compound of formula (I), wherein consideration of above proviso n is zero and X is -NH₂, by a suitable amidating enzyme and, if desired, the conversion of the compound of formula (I) into pharmaceutically acceptable salt.
Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "PRIMER" die Bezugnahme auf eine PRIMER-NUCLEOTID. According to the invention, the term "PRIMER" means the reference on a PRIMER NUCLEOTID.
Die Polypeptidderviate der Formel (I), worin n gleich 1 und X -OH ist (HV1 (Gly 66)-Mutante und HV1 (Val 65 Gly 66)-Mu tante) wurden nach dem folgenden Verfahrensschema, das zusammen mit den entsprechenden technischen Angaben und den verschiedenen eingesetzten Prozeduren vorgestellt wird, hergestellt.The Polypeptidderviate of formula (I), wherein n is 1 and X-OH is (HV1 (Gly 66) mutant and HV1 (Val 65 Gly 66) mu ate) were prepared according to the following procedure, the together with the corresponding technical data and the various procedures used, manufactured.
Synthese synthetischer Oligonucleotide, von denen einige wichtige Mutationen enthalten zur Verwendung als Primer während des Amplifizierungsprozesses.Synthesis of synthetic oligonucleotides, some of which contain important mutations for use as primers during the amplification process.
Das verwendete Plasmid pFC84 und das hierzu identische plasmid pFC-HV1 sind beschrieben bei P. de Taxis du Poet et al., Blood, Coagulation and Fibrinolysis, 1991, Bd. 2, Seiten 113-120. pFC85 (pFC-HV2) entspricht dem pFC84, nur daß es anstelle des Hirudin HV1 Gens das Hirudin HV2 Gen trägt.The plasmid pFC84 used and the identical thereto Plasmid pFC-HV1 are described in P. de Taxis du Poet et al., Blood, Coagulation and Fibrinolysis, 1991, Vol. 2, Pages 113-120. pFC85 (pFC-HV2) corresponds to pFC84, only that instead of the hirudin HV1 gene, the hirudin HV2 gene wearing.
Ausgehend von der HV1-Hirudinseqenz wurden die folgenden Oligonucleotide entwickelt:Starting from the HV1 Hirudinseqenz were the following Oligonucleotides developed:
Die Tripletts, die für die unterschiedliche Aminosäure, die die Mutante selbst charakterisiert, kodiert, ist fett gedruckt. The triplets responsible for the different amino acid, the the mutant itself characterizes, encodes, is bold printed.
Ein zweiter Primer, der zu einem Bereich auf den pFC 84 und pFC 85-Plasmiden komplementär ist, wurde für die Gewinnung der beiden Mutanten verwendet:A second primer leading to an area on the pFC 84 and pFC 85 plasmids is complementary, was for recovery of the two mutants used:
5′-GAG GAG GCC GTT TCG TCT TC 3′ 5'-GAG GAG GCC GTT TCG TCT TC 3 '
Amplifizierung von unterschiedlichen Fragmenten durch Taq- Polymerase.Amplification of different fragments by Taq Polymerase.
Ausgehend von den beschriebenen Oligonucletiden wurden die DNA-Fragmente unter Verwendung des pFC-HV1-Plasmids als Matrize, das das HV1-Hirudingen enthielt (Fig. 2 und 3) amplifiziert.Starting from the described oligonucleotides, the DNA fragments were amplified using the pFC-HV1 plasmid as a template containing the HV1 hirudin gene ( Figures 2 and 3).
Die Amplifikationen müssen zur Gewinnung eines Fragments von ca. 400 bp, das die Ptrp-Promotorsequenz, die RBS- und die OmpA-Signalsequenz und die kompletten, am terminalen G modi fizierten HV1-Gene oder HV1 (Gly 66)- und HV1 (Val 65 Gly 66)-Gene enthält. Hierfür wurde das im folgenden dargestellte Standardverfahren eingesetzt.The amplifications must be for obtaining a fragment of about 400 bp containing the Ptrp promoter sequence, the RBS and the OmpA signal sequence and the complete, at the terminal G modes labeled HV1 genes or HV1 (Gly 66) and HV1 (Val 65 Gly 66) genes. This became the following used standard methods used.
Abdecken der Reaktionsmischung mit einer Paraffinabdeckung (wenige Tropfen), um Verdunstung zu verhindern. Durchführung einer Reihe von geeigneten Denaturierungszyklen mit den Pro ben und Elongation.Cover the reaction mixture with a paraffin cover (a few drops) to prevent evaporation. execution a series of suitable denaturation cycles with the Pro ben and elongation.
Reinigung der amplifizierten Fragmente, Restriktion und ihre Isolierung.Purification of amplified fragments, restriction and their Insulation.
Nach Bestätigung der Effizienz des Amplifikationsverfahrens durch elektrophoretische Analyse auf einem Agarosegel, her gestellt nach der Vorschrift von Maniatis et al. (Maniatis T., Fritsch E. und Sambrook J., 1982, Molecular cloning, a laboratory manual - Cold Spring Harbor Labority) wurden die amplifizierten Produkte nach dem im folgenden vorgestellten Verfahren gereinigt. After confirming the efficiency of the amplification process by electrophoretic analysis on an agarose gel prepared according to the instructions of Maniatis et al. (Maniatis T., Fritsch E. and Sambrook J., 1982, Molecular cloning, a Laboratory Manual - Cold Spring Harbor Laboratory) were the amplified products according to the presented below Procedure cleaned.
Reinigung der DNA-Fragmente nach Amplifikation mit PCR.Purification of the DNA fragments after amplification with PCR.
Sammlung der Reaktionsmischung am Ende des Amplifikations zyklus ohne der Entfernung des Paraffins; anschließende Extraktion mit Phenol/Chloroform unter Zusatz des gleichen Phenol/CHCl3-Volumens zu dem Eppendorf-Gefäß.Collection of the reaction mixture at the end of the amplification cycle without the removal of the paraffin; subsequent extraction with phenol / chloroform with addition of the same phenol / CHCl 3 volume to the Eppendorf tube.
Schütteln und Zentrifugieren für 5′.Shake and spin for 5 '.
Abnehmen der überstehenden Phase (ca. 90 µl), Zugabe von 3 M Natriumacetat, pH 5, in einem Verhältnis 1/10, und 1,5 Volumenanteile von 95%igen kaltem Ethanol.Remove the supernatant phase (approximately 90 μl), add 3 M Sodium acetate, pH 5, in a ratio of 1/10, and 1.5 Volume of 95% cold ethanol.
Mischen und Einfrieren bei -80°C für 20′.Mix and freeze at -80 ° C for 20 '.
Zentrifugieren für 15′ in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4°C.Centrifuge for 15 'in an Eppendorf centrifuge 4 ° C.
Abgießen des Überstandes und Trocknung des Pellets.Drain the supernatant and dry the pellet.
Resuspendieren des Pellets in sterilem H2O.Resuspend the pellet in sterile H 2 O.
Es wurden enzymatische Restriktionen mit den gereinigten Fragmenten durchgeführt, wobei die Restriktionen zu neuen, kürzeren Fragmente zur Verwendung bei den folgenden Subklonierungen zur Herstellung der fertigen, mutagenisierten Gene führten.There were enzymatic restrictions with the purified ones Fragments, the restrictions being new, shorter fragments for use in the following Subcloning to produce the finished, mutagenized genes.
Die Restriktionen wurden unter Verwendung des Hind III- und BamHI -Enzyms nach Standardbedingungen entsprechend dem Hersteller (Boehringer) durchgeführt. The restrictions were made using the Hind III and BamHI enzyme according to standard conditions according to Manufacturer (Boehringer) performed.
Die Wirksamkeit des Restriktionsschnittes wurde durch Analy sieren verschiedener DNAs durch ihre elektrophoretische Be weglichkeit auf einem Agarosegel nachgewiesen.The effectiveness of the restriction cut was determined by Analy different DNAs by their electrophoretic Be Mobility demonstrated on an agarose gel.
Die spezifischen Fragmente, welche die RBS-, OmpA-Signal sequenz und gesamten Gene enthielten, wurden immer über ihre elektrophoretische Beweglichkeit aus den zusätzlichen DNA- Bereichen isoliert, die auf dem amplifizierten Originalfrag ment vorhanden sind (Ptrp).The specific fragments representing the RBS, OmpA signal Sequence and entire genes were always on their electrophoretic mobility from the additional DNA Isolated areas on the amplified original question ment are present (Ptrp).
Bindung der amplifizierten Fragmente an den pFC HV1-Vektor (Fig. 4 und 5).Binding of the amplified fragments to the pFC HV1 vector ( Figures 4 and 5).
Die Bindung erfolgt durch T4 DNA-Ligaseenzym, welches in der Lage ist, die kohäsiven Enden in Gegenwart von ATP zu ver binden. Das Vektor/Fragment-Verhältnis liegt im allgemeinen bei 1/5, kann jedoch sogar auf 1/10 erhöht werden.The binding is by T4 DNA ligase enzyme, which in the It is able to ver the cohesive ends in the presence of ATP tie. The vector / fragment ratio is generally at 1/5, but can even be increased to 1/10.
Die verschiedenen Bindungsreaktionen werden entsprechend den optimalen Bedingungen, wie vom Hersteller (Boehringer) angegeben, durchgeführt. Die pFC HV1 (Gly)- (Fig. 4) und pFC HV1 (Val Gly)- (Fig. 5) Expressionsvektoren sind das Ergebnis der Bindungen.The various binding reactions are carried out according to the optimal conditions as indicated by the manufacturer (Boehringer). The pFC HV1 (Gly) - ( Figure 4) and pFC HV1 (Val Gly) - ( Figure 5) expression vectors are the result of the binding.
Einführung der Expression. Sekretion und Isolierung der HV1 (Gly 66)- oder der HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante.Introduction of expression. Secretion and isolation of HV1 (Gly 66) - or the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant.
Der pFC HV1 (Gly)-Expressionsvektor oder der pFC HV1 (Val Gly)Expressionsvektor wird ein einen geeigneten Wirt einge schleust.The pFC HV1 (Gly) expression vector or the pFC HV1 (Val Gly) expression vector is a suitable host discharged.
Die Empfängerzellen werden mit dem Gen für die HV1 (Gly 66)- Mutante oder für die HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante trans formiert. The recipient cells are labeled with the gene for the HV1 (Gly 66) - Mutant or for the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant trans formed.
Die durch den Wirt transformierten Zellen werden kultiviert, z. B. unter solchen Bedingungen, die die Expression der HV1 (Gly 66)-Mutante oder der HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante er leichtern.The cells transformed by the host are cultured, z. B. under such conditions as the expression of HV1 (Gly 66) mutant or the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant easier.
Jedes beliebige wirt-vektor-verträgliche System kann einge setzt werden. Der transformierte Wirt kann procaryontisch, z. B. ein Bacterium, z. B. E. coli oder B. subtilis, oder eucaryontisch, z. B. eine S. cerevisiae Hefe sein.Any host-compatible system can be used be set. The transformed host may be procaryontic, z. B. a bacterium, z. B. E. coli or B. subtilis, or eucaryotic, e.g. B. be a S. cerevisiae yeast.
Einer der am bevorzugtesten Wirte vom bakteriellen Typ ist ein E. coli-Stamm vom B-Typ.One of the most preferred bacterial type hosts is an E. coli B-type strain.
Als Alternative können Insektenzellen eingesetzt werden, und in solchen Fällen ist das "Baculovirus"-Expressionssystem geeignet.As an alternative, insect cells can be used, and in such cases is the "baculovirus" expression system suitable.
Die allgemein verwendeten Insektenzellen sind Spodontera frugiperda-Zellen.The commonly used insect cells are Spodontera frugiperda cells.
Als weitere Möglichkeit können Zellen aus Säugerzellinien eingesetzt werden. Ein transgenes Tier kann eingesetzt werden, z. B. ein nicht-menschlicher Säuger, worin Hirudin produziert wird.As another possibility, cells from mammalian cell lines be used. A transgenic animal can be used be, for. A non-human mammal wherein hirudin is produced.
Die HV1 (Gly 66)-Mutante oder die HV1 (Val 65 Gly 66)-Mu tante, die in den obigen zellulären Systemen exprimiert wird, kann nach bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.The HV1 (Gly 66) mutant or the HV1 (Val 65 Gly 66) mu aant expressing in the above cellular systems can be isolated and purified by known methods become.
Wie bereits erwähnt, sind als Wirtszellen E. coli-Bakterien stämme vom B-Typ zur Expression und Sekretion in Hirudin periplasma und Derivate davon besonders geeignet. As already mentioned, the host cells are E. coli bacteria B-type strains for expression and secretion in hirudin periplasma and derivatives thereof are particularly suitable.
In der Tat führt die Insertion des pFC HV1 (Gly)-Plasmids oder des pFC HV1 (Val Gly)-Plasmids in E. coli-Bakterien stämme vom B-Typ zu einem hohen Produktionsrate der HV1 (Gly 66)-Mutane oder der HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante im Gegensatz zu anderen E. coli-Stämmen, die weniger effizient sind.In fact, the insertion of pFC leads HV1 (Gly) plasmid or the pFC HV1 (Val Gly) plasmid in E. coli bacteria B-type strains produce a high production rate of HV1 (Gly 66) mutans or the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant in contrast to other E. coli strains that are less efficient.
Eine Anzahl von E. coli-Stämmen vom B-Typ sind erhältlich und können für die HV1 (Gly 66)- oder HV1 (Val 65 Gly 66)- Herstellung eingesetzt werden.A number of B-type E. coli strains are available and can be used for the HV1 (Gly 66) or HV1 (Val 65 Gly 66) - Production can be used.
Die bevorzugten Stämme sind: ATCC 12407, ATCC 11303 und NCTC 10573.The preferred strains are: ATCC 12407, ATCC 11303 and NCTC 10,573th
Z.B. können geeignete Zellen des NCTC 10537-Stammes nach dem calciumchloridverfahren von Mandel und Higa (Mandel und Higa, 1970, J. Mol. Biol. S. 53, 154) hergestellt werden.For example, For example, suitable cells of the NCTC 10537 strain may be used after the Calcium chloride method of almond and Higa (almond and Higa, 1970, J. Mol. Biol. P. 53, 154).
Es wurden ca. 200 µl einer Zellpräparation mit 1,10 g Zellen/ml, mit 2 µl DNA-Plasmid (Konzentration ca. 5 µg/ml) transformiert.There were about 200 .mu.l of a cell preparation with 1.10 g Cells / ml, with 2 μl of DNA plasmid (concentration about 5 μg / ml) transformed.
Die transformierten Zellen wurden auf L-Agar-Platten mit 100 µg/ml Ampicillin selektiert.The transformed cells were plated on L agar plates with 100 μg / ml ampicillin.
Es wurden zwei kleine Kolonien mit zwei Zahnstochern (es wurden drei Streifen mit einer Länge von ca. 1 cm erhalten) auf L-Agar mit demselben Antibiotikum übertragen.There were two small colonies with two toothpicks (es three strips were obtained with a length of about 1 cm) transferred to L-agar with the same antibiotic.
Nach 12stündiger Inkubation bei 37°C wurden einige Bereiche der Schmierbildung untersucht, um die Produktion von HV1 (Gly 66) und HV1 (Val 65 Gly 66) zu überprüfen, indem 10 ml LB-Medium (enthaltend Ampicillin mit einer Konzentration von 100 µg/ml) angeimpft wurden, und die Kulturen bei 37°C über Nacht inkubiert wurden. After 12 hours incubation at 37 ° C, some areas became the smear formation is examined to increase the production of HV1 (Gly 66) and HV1 (Val 65 Gly 66) to check by adding 10 ml LB medium (containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml) were inoculated, and the cultures were transferred at 37 ° C Were incubated overnight.
Am nächsten Tag wurden die Kulturen 1 : 100 in M9-Medium mit derselben Ampicillinkonzentration verdünnt und bei 37°C 6 h inkubiert.The next day, the cultures were diluted 1: 100 in M9 medium at the same ampicillin concentration and incubated at 37 ° C for 6 hours.
20 ml der Kulturen wurden bei 12 000 xg 10 min bei 4°C zen trifugiert.20 ml of the cultures were incubated at 12,000 xg for 10 min at 4 ° C trifugiert.
Das Bakterienpellet wurden in 2 ml HCl 33 mM, Tris pH 8, re suspendiert; das gleiche Volumen einer zweiten Lösung von EDTA 33 mM, 40% Saccharose wurde zugegeben und die End mischung unter leichtem Rühren 10 min bei 37°C inkubiert.The bacterial pellet was dissolved in 2 ml HCl 33 mM, Tris pH 8, re suspended; the same volume of a second solution of EDTA 33mM, 40% sucrose was added and the end Mixture with gentle stirring for 10 min at 37 ° C incubated.
Nach Zentrifugation wurden die permeabilisierten Zellen in 2 ml kaltem Wasser resuspendiert, und man ließ 10 min im Eis stehen. Der erhaltene überstand wurde durch Zentrifugation isoliert und stellt die periplasmatische Fraktion der Bak terienzellen dar.After centrifugation, the permeabilized cells were incubated in 2 ml of cold water was resuspended and allowed to ice for 10 min stand. The resulting supernatant was purified by centrifugation isolated and represents the periplasmic fraction of Bak series cells.
Unter Verwendung eines chromogenen Tests, der selbst auf der Inhibierung der Fähigkeit des Thrombins zur Spaltung eines synthetischen S-2238-Derivats beruht (Krstenanski, J.K. und Mao, S.J.T., 1987 FEBS Lett. 211, S. 10) wurde das Vorliegen von Antithrombinaktivität in der periplasmatischen Fraktion von HV1 (Gly 66) und HV1 (Val 65 Gly 66) produzierenden Zellen gemessen.Using a chromogenic test that is self-evident Inhibition of the ability of thrombin to cleave a synthetic S-2238 derivative (Krstenanski, J.K. Mao, S.J.T., 1987 FEBS Lett. 211, p. 10) was the case of antithrombin activity in the periplasmic fraction of HV1 (Gly 66) and HV1 (Val 65 Gly 66) producing Cells measured.
Es wurde keine Aktivität in den perisplasmatischen Kontroll fraktionen festgestellt.There was no activity in the perisplasmic control fractions.
Für die Extraktion und Reinigung der HV1 (Gly 66)-Mutante und der HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante wurden übliche, vom Fachmann verwendete Standardverfahren eingesetzt.For the extraction and purification of the HV1 (Gly 66) mutant and the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant were common, from Professional used standard methods.
Die Mutanten können, falls erwünscht, als ideales Substrat für die folgende Amidierungsreaktion verwendet werden, welche die Umwandlung der Verbindung der Formel (I), worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe n 1 ist, X -OH ist, in eine entsprechende Verbindung der Formel (I) erlaubt, worin n Null und X NH2 ist.The mutants may, if desired, be used as an ideal substrate for the following amidation reaction, which is the conversion of the compound of formula (I) wherein n is 1 in consideration of the above proviso, X is -OH into a corresponding compound of formula (II). I), where n is zero and X is NH 2 .
Viele biologisch aktive Polypeptide werden an ihren Carboxylende durch Amidierung geschützt, wobei die Ami dierung wesentlich für die Rezeptorrekennung und/oder bio logische Aktivität ist (J.F. Rehfeld, 1981, Am. J. Physiol. 240, 6251-6266).Many biologically active polypeptides will be added to theirs Carboxylende protected by amidation, the Ami tion essential for receptor recognition and / or bio logical activity (J.F. Rehfeld, 1981, Am. J. Physiol. 240, 6251-6266).
Die Amidierung an der terminalen Carboxyleinheit (oder α-Amidierung) verleiht den meisten Carboxypeptidasen Stabi lität und erhöht wahrscheinlich die Halbwertszeit und unter stützt die Rezeptorselektivität der Peptide. (G.S. Wand et al., 1985, Neuroendocrinol. 41, 482-489).The amidation on the terminal carboxy moiety (or α-amidation) confers stability to most carboxypeptidases and probably increases the half-life and below supports the receptor selectivity of the peptides. (G.S. Wall et al., 1985, Neuroendocrinol. 41, 482-489).
Die α-Amidierung stellt eine der posttranslationalen Ver änderungen der Sekretionspeptide in eucaryontischen Organis men dar.The α-amidation represents one of the post-translational Ver Changes of Secretion Peptides in Eucaryotic Organ men dar.
Die α-Amidierung kann z. B. durch ein Enzym, die sog. Pepti dylglycin-α-Amidierungsmonooxygenase (PAM) durchgeführt werden, welche das terminale Carboxylende, dem das Glycin eines Peptids zugefügt wurde, in das entsprechende Amid peptid ohne das Glycin an seinem Carboxylende umwandelt, wobei gleichzeitig Bildung von Glyoxylsäure auftritt (A.F. Bradbury et al., 1982, Nature 289, 686, 688).The α-amidation may, for. B. by an enzyme, the so-called. Pepti dylglycine α-amidation monooxygenase (PAM) which are the terminal carboxyl endings of the glycine of a peptide was added to the corresponding amide peptide without converting glycine at its carboxyl end, whereby formation of glyoxylic acid occurs simultaneously (A.F. Bradbury et al., 1982, Nature 289, 686, 688).
Die katalytische Reaktion erfolgt in Gegenwart von Sauer stoff und kann das Vorliegen von Kupfer und Ascorbationen als Kofaktoren erfordern (B. Eipper et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5144-5148). The catalytic reaction takes place in the presence of acid and can be the presence of copper and ascorbates as cofactors (B. Eipper et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5144-5148).
Erfindungsgemäß können die Polypeptidanaloge von Hirudin der Formel (I), worin P HV1 oder HV1 (Val 65), n 1 und X -NH2 ist (HV1-NH2 und HV1 (Val65)-NH2)), ausgehend von den ent sprechenden Verbindungen der Formel (I) hergestellt werden, worin P HV1 oder HVa (Val 65), n 1 und X -OH ist (HV1 (Gly 66)-Mutante und HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante), erhalten wie oben, durch Reaktion eines geeigneten Amidierungsenzyms, wie z B. einer Peptidylglycin-Amidierungsmonooxygenase (PAM).According to the invention, the polypeptide analogues of hirudin of the formula (I) wherein P is HV1 or HV1 (Val 65), n is 1 and X is -NH 2 (HV 1 -NH 2 and HV 1 (Val 65) -NH 2 )), starting from the corresponding compounds of formula (I) wherein P is HV1 or HVa (Val 65), n is 1 and X is -OH (HV1 (Gly 66) mutant and HV1 (Val 65 Gly 66) mutant), as obtained above, by reaction of a suitable amidating enzyme, such as a peptidylglycine amidation monooxygenase (PAM).
Insbesondere wurde die HV1 (Gly 66)-Mutante oder die HV1 (Val 65 Gly 66)-Mutante mit einer halbgereinigten Präpa ration eines proteasenfreien PAM-Enzyms, z. B. mit der aus dem medullären Ratten-Thyroid Karzinom (N.M. Mehta et al., 1988, Arch. Biochem. Biophys. 261, 44-54) oder mit der aus konditioniertem Medium von Zellen aus dem Tumor (J.P. Gilligan et al., 1989, Endocrinol. 124, 2729-2736) erhaltenen Präparation inkubiert.In particular, the HV1 (Gly 66) mutant or the HV1 (Val 65 Gly 66) mutant with a semi-purified Präpa ration of a protease-free PAM enzyme, eg. B. with the medullary rat thyroid carcinoma (N.M. Mehta et al. 1988, Arch. Biochem. Biophys. 261, 44-54) or with the Conditioned medium of cells from the tumor (J.P. Gilligan et al., 1989, Endocrinol. 124, 2729-2736) incubated preparation.
Das amidierende Enzym kann auch durch rekombinante DNA-Tech niken erhalten werden.The amidating enzyme can also be produced by recombinant DNA technology be obtained.
Die enzymatische Reaktion wurde in einem wäßrigen Puffer, z. B. TES bei pH 7, mit Kupfer, Ascorbationen, Catalase, Kaliumiodid, SDS und Tween 20 durchgeführt.The enzymatic reaction was carried out in an aqueous buffer, z. TES at pH 7, with copper, ascorbate ions, catalase, Potassium iodide, SDS and Tween 20 performed.
Die Amidierungsreaktion wurde durch das Corbett und Corbett- Verfahren (J. Org. Chem. 1980, 45, 2834-2839) nach Derivati sierung mit Nitrosobenzol eingestellt, das auf der Glycoxyl säurebestimmung beruht.The amidation reaction was carried out by the Corbett and Corbett Method (J. Org. Chem. 1980, 45, 2834-2839) by Derivati tion with nitrosobenzene, which is on the glyoxylic acid acid determination is based.
Das amidierte Produkt HV1-NH2 oder HV1 (Val 65)-NH2 wurde nach üblichen Verfahren gereinigt. The amidated product HV1-NH 2 or HV1 (Val 65) -NH 2 was purified by conventional methods.
Wahlweise kann die Amidierungsreaktion, die die Gewinnung von HV1-NH2 oder HV1 (Val 65)-NH2 erlaubt, über einen chemischen Weg mit den entsprechenden HV1 und HV1 (Val 65)- Verbindungen nach üblichen Methoden durchgeführt werden.Alternatively, the amidation reaction which allows the production of HV1-NH 2 or HV1 (Val 65) -NH2, by a chemical way with the corresponding HV1 and HV1 (Val 65) - are carried out compounds by conventional methods.
Die erfindungsgemäßen Hirudinanalogpeptide sind in der Lage, den gesamten proteolytischen Effekt von Thrombin, z. B. die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin und die Aktivierung der Faktoren V und VIII zu inhibieren.The hirudin analogue peptides of the invention are capable of the overall proteolytic effect of thrombin, e.g. B. the Conversion of fibrinogen into fibrin and the activation of the Factors V and VIII to inhibit.
Sie können daher z. B. als antikoagulierende oder antithrom botische Arzneimitteln bei der Behandlung von thromoemboly tischen Krankheitszuständen, z. B. verteilter intravaskulärer Koagulation, cerebraler Embolie, tiefen venösen Thrombosen, und weiterhin zur gerinnungshemmenden oder anti thrombotischen Prophylaxe, z. B. bei der Therapie des akuten Myokardinfraktes, eingesetzt werden.You can therefore z. B. as anticoagulant or antithrom botische drugs in the treatment of thromoemboly table disease states, z. B. distributed intravascular Coagulation, cerebral embolism, deep venous thrombosis, and continue to anticoagulant or anti thrombotic prophylaxis, e.g. B. in the therapy of the acute Myocardial infarcts, are used.
Eine weitere Verwendung dieser von Hirudin abgeleiteten Polypeptide ist außerhalb des Menschen oder Tieres, in Präparationen, die z. B. als gerinnungshemmende Mittel für Blut, das einem Kreislauf oder einer Behandlung außerhalb des Körpers unterzogen wird, z. B. bei renaler Dialyse oder Dialyse zur Eliminierung von überschüssigem Fett im Blut, eingesetzt werden.Another use of these derived from hirudin Polypeptides are outside the human or animal, in Preparations, the z. B. as anticoagulant for Blood, a circulatory or a treatment outside is subjected to the body, z. B. in renal dialysis or Dialysis for the elimination of excess fat in the blood, be used.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde in biologischen Tests, wie im folgenden aufgeführt, nach den vorgeschlagenen Gebrauchsanweisungen nachgewiesen.The activity of the compounds of the invention was in biological tests, as listed below, according to the proven instructions for use.
Die spezifische Antithrombinaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde aufgrund der spezifischen und schnellen stöchiometrischen Reaktion von Hirudin mit Thrombin bestimmt.The specific antithrombin activity of the invention Connections was due to the specific and fast stoichiometric reaction of hirudin with thrombin certainly.
Die Aktivität wurde quantitativ durch Titration mit einer Standardlösung von Thrombin bestimmt (Lundblad R. L., Kingdon H.S. und Hann K.G., Methods in Enzymology, 45, 156-161, 1976).The activity was quantified by titration with a Standard solution of thrombin (Lundblad R.L., Kingdon H. S. and Hann K.G., Methods in Enzymology, 45, 156-161, 1976).
Die Antithrombinaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde mit der Aktivität von HV1 (rHV1) rekombinantem Hiru din, das mit rekombinanten DNA-Techniken in E. coli erhalten wurde, verglichen.The antithrombin activity of the compounds of the invention was coupled with the activity of HV1 (rHV1) recombinant hiru din obtained by recombinant DNA techniques in E. coli was compared.
Die Thrombinaktivität wurde auf den Standard des "National Institute of Health Units" (NIH-Einheiten) unter Verwendung einer internationalen Thrombin-Standard-Präparation (c70/157), die vom National Institute for Biological Standards and Controls of London, (U. K.) zur Verfügung ge stellt wurde, bezogen.The thrombin activity was based on the standard of "National Institute of Health Units "(NIH units) using an international thrombin standard preparation (c70 / 157), published by the National Institute for Biological Standards and Controls of London, (U.K.) was made, related.
Die Aktivität der getesteten Verbindungen zur Neutralisie rung des Thrombins wurde in Antithrombineinheiten (U-AT) ausgedrückt, eine U-AT ist die Menge der getesteten Ver bindung, die eine NIH-Einheit von Thrombin neutralisiert.The activity of the tested compounds for neutralization tion of thrombin was detected in antithrombin units (U-AT) expressed, a U-AT is the amount of Ver tested bond that neutralizes an NIH unit of thrombin.
Der Test wurde wie folgt durchgeführt.The test was carried out as follows.
Eine standardisierte, humane Fibrinogenlösung (Kabi Vitrium, Schweden) wurde in Gegenwart bekannter Konzentrationen der zu testenden Verbindungen inkubiert.A standardized human fibrinogen solution (Kabi Vitrium, Sweden) was in the presence of known concentrations of Incubated compounds to be tested.
Das Fibrinogen koaguliert unter diesen Bedingungen nicht, bis soviel Thrombin zugegeben wurde, wie es zur Neutralisierung des vorhandenen Hirudins erforderlich ist. The fibrinogen does not coagulate under these conditions, until as much thrombin as was added to the Neutralization of the existing hirudin is required.
Zusatz von einem Überschuß von Thrombin wird innerhalb weniger Sekunden durch Auftreten eines Fibrinklumpens sicht bar.Addition of an excess of thrombin is within less seconds by the appearance of a fibrin clot sight bar.
Es wurden Aliquots von 0,01 bis 0,1 ml der Lösung der zu testenden Verbindungen mit 0,2 ml einer 0,05%igen Fibrinogenlösung in Tris. HCl-Puffer pH 7,4 wurden vermischt.Aliquots of 0.01 to 0.1 ml of the solution were added testing compounds with 0.2 ml of a 0.05% Fibrinogen solution in Tris. HCl buffer pH 7.4 mixed.
Eine standardisierte Thrombinlösung (Rinderthrombin mit einem erhöhten Reinheitsgrad, Sigma) mit einer Konzentration von 100 NIH/ml Einheiten, in einem Aliquot von 0,005 ml (0,5 NIH-Einheiten) wurden der Reihe nach in einminütigen Abstän den zugegeben und sofort mit der Mischung, die das Fibrino gen und die Testverbindung enthielt, vermischt.A standardized thrombin solution (bovine thrombin with an increased degree of purity, Sigma) with one concentration of 100 NIH / ml units, in an aliquot of 0.005 ml (0.5 NIH units) were sequentially measured in one minute intervals The added and immediately with the mixture, the fibrino gene and the test compound were mixed.
Der Endpunkt der Titration wurde erreicht, wenn das Fibrino gen innerhalb einer Minute koagulierte.The endpoint of the titration was reached when the fibrino Gen coagulated within a minute.
Die Aktivität der Testverbindungen wurde in U-AT/mg Protein ausgedrückt.The activity of the test compounds was in U-AT / mg protein expressed.
Der Proteingehalt der Testverbindungen wurde durch Amino säureanalyse bestimmt.The protein content of the test compounds was determined by amino acid analysis.
Der Verfahren beruht auf der inhibierenden Aktivität des Hi rudins bei der Reaktion zwischen Thrombin und seinem synthe tischen, chromogenen, spezifischen Substrat S-2238 (Wiman et al., BBA, 579, 142-154, 1979).The method is based on the inhibiting activity of Hi rudins in the reaction between thrombin and its synthe Tables, chromogenic, specific substrate S-2238 (Wiman et al., BBA, 579, 142-154, 1979).
Die Inhibierungsaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde mit der Inhibierungsaktivität von HV1 (rHV1) rekombi nanten Hirudinreferenzverbindungen verglichen. The inhibitory activity of the compounds of the invention was recombined with the inhibitory activity of HV1 (rHV1) compared to hirudin reference compounds.
Es wurde das folgende Verfahren durchgeführt. 630 µl einer 0,5 mM S2238 Lösung in Tris 0,05 M Puffer, pH 8,3, mit NaCl 0,1 M und Aprilotinin 100 KUI/ml wurden 10 min bei 25°C in einem Thermostaten inkubiert.The following procedure was carried out. 630 μl of a 0.5 mM S2238 solution in Tris 0.05 M buffer, pH 8.3, with NaCl 0.1 M and Aprilotinine 100 KUI / ml were added 10 min incubated at 25 ° C in a thermostat.
Nach der Vorinkubierung wurden 70 pl einer Thrombinlösung 2 UI/ml in Natriumphosphatpuffer 0,025 M, pH 6,6, mit NaCl 0,3 M und Rinderalbumin 0,5% zur Mischung zugegeben. 70 µl Puffer wurden als Kontrolle verwendet.After preincubation, 70 μl of a thrombin solution 2 UI / ml in sodium phosphate buffer 0.025 M, pH 6.6, with NaCl 0.3 M and bovine albumin 0.5% was added to the mixture. 70 μl buffer was used as control.
Die Ablesung der kinetischen Daten begann unmittelbar nach der Thrombinzugabe.The reading of the kinetic data started immediately after the thrombin addition.
Das Spektralfotometer wurde in einer solchen Weise kali briert, um die Absorptionsabweichungen bei einer Wellenlänge von 405 nm pro min innerhalb eines 6-minütigen Zeitraums abzulesen. 20 µl der Lösung der Testverbindungen wurden anschließend in Kuvetten gegeben und das Ablesen der Werte wurde wieder jede min für 6 min aufgenommen.The spectrophotometer was calibrated in such a manner bristles around the absorption deviations at one wavelength of 405 nm per minute within a 6-minute period read. 20 .mu.l of the solution of the test compounds were then in Given cuvettes and reading the values again became each min recorded for 6 min.
Die Endkonzentration der Testverbindungen war 1,25, 2,5, 7,5, 10 und 15 ng/ml.The final concentration of the test compounds was 1.25, 2.5, 7.5, 10 and 15 ng / ml.
Der verwendete Verdünnungspuffer war Natriumphosphat 0,025 H, pH 6,6 Puffer mit NaCl 0,3 M.The dilution buffer used was sodium phosphate 0.025 H, pH 6.6 buffer with NaCl 0.3M.
Der Prozentsatz der Inhibierungsreaktion zwischen Thrombin und dem chromogenen Substrat wurde für jede Probe aus dem mittleren Δ Abs/min, erhalten nach Zugabe der Testverbin dungen, und dem mittleren Δ Abs/min, erhalten vor ihrer Zu gabe, berechnet.The percentage of inhibition reaction between thrombin and the chromogenic substrate was determined for each sample from mean Δ Abs / min, obtained after addition of the test compound tions, and the mean Δ Abs / min, obtained before their admission gift, calculated.
Eine Standardkurve wurde durch Auftragen des Prozentsatzes der Inhibierung gegen die Inhibierungskonzentration in einem Graphen erhalten.A standard curve was calculated by plotting the percentage the inhibition against the inhibition concentration in one Graphene obtained.
Die abschließenden Ergebnisse wurden als Endkonzentration der Testverbindungen ausgedrückt, welche die 50%ige Inhibie rung (C.I. 50%) der Reaktion zwischen dem Thrombin und chromogenen Substrat angibt.The final results were as final concentration of the test compounds expressing the 50% inhibition (C.I. 50%) of the reaction between the thrombin and indicates chromogenic substrate.
Die gerinnungshemmende Aktivität der erfindungsgemäßen Ver bindungen wurde durch Berechnung der Thrombinzeit (T T.) be stimmt.The anticoagulant activity of the Ver binding was determined by calculating the thrombin time (T.T.) Right.
Der Test wurde unter Verwendung eines automatischen Untersu chungskoagulometers (ACL 300 Research, Instrumentation Laboratory, Italy) durchgeführt.The test was carried out using an automatic subsystem chungskoagulometers (ACL 300 Research, Instrumentation Laboratory, Italy).
Die gerinnungshemmende Aktivität der erfindungsgemäßen Ver bindungen wurde mit der gerinnungshemmenden Aktivität der HV1 (rHV1) rekombinanten Hirudinreferenzverbindung verglichen.The anticoagulant activity of the Ver It was associated with the anticoagulant activity of HV1 (rHV1) recombinant hirudin reference compound compared.
Steigende Konzentrationen der Testverbindungen wurden zu normalem Citrat humanem Plasma (0,38% Endkonzentration) zu gegeben.Increasing concentrations of the test compounds became too normal citrate to human plasma (0.38% final concentration) given.
Die Proben wurden anschließend in das automatische Koagolu meter eingeführt, welches die Bestimmung der Thrombinzeit erlaubt, durch automatische Zugabe von humaner Thrombin lösung zum Plasma (Fibrindex, Ortho Diagnostics, Italy) bis eine Endkonzentration von 5 UI/ml erreicht wurde.The samples were then added to the automatic Koagolu introduced the determination of the thrombin time allowed by automatic addition of human thrombin Solution to Plasma (Fibrindex, Ortho Diagnostics, Italy) to a final concentration of 5 UI / ml was achieved.
Die Koagulationszeit, die für jede Testverbindung bestimmt wurde, wurde aufgezeichnet und in einem Diagramm gegen die entsprechende Endkonzentration jeder Testverbindung aufge tragen.The coagulation time, which determines for each test compound was recorded and charted against the corresponding final concentration of each test compound carry.
Die Endergebnisse wurden als Endkonzentration der Testver bindung, welche den normalen Wert der Thrombinzeit verdop pelt, ausgedrückt.The final results were used as the final concentration of the test ver binding, which doubles the normal value of thrombin time pelt, expressed.
(Kontrollprobe nur Plasma).(Control sample only plasma).
Aus den obigen Tests ergab sich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine höhere Aktivität als die rHV1-Referenzver bindung hatten.From the above tests it was found that the inventive Compounds have higher activity than the rHV1 reference ver had binding.
Die insbesondere die HV1 (Val 65 Gly 66) erfindungsgemäße Verbindung betreffenden Daten sind in der folgenden Tabelle angegeben, die zeigen, daß die Verbindung deutlich dem Referenzstandard biologisch überlegen ist.In particular the HV1 (Val 65 Gly 66) according to the invention Connection related data are in the following table indicated that show the compound clearly the Reference standard is biologically superior.
Die erfindungsgemäßen Hirudinanalogpeptide können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie als aktiven Bestandteil enthalten, per se oder in Form von pharmazeu tisch annehmbaren Salzen zusammen mit einem oder mehreren Excipienten, z. B. pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/ oder Verdünnern und/oder Bindern verabreicht werden.The Hirudinanalogpeptide invention can be in the form of pharmaceutical compositions that they are active Containing ingredient, per se or in the form of pharmazeu table acceptable salts together with one or more Excipients, eg. B. pharmaceutically acceptable carriers and / or or diluents and / or binders.
Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann z. B. parenteral (intravenös, intramuskulär oder subku tan) oder topisch, vorzugsweise parenteral, erfolgen.The administration of the pharmaceutical compositions can z. Parenteral (intravenous, intramuscular or subcu tan) or topically, preferably parenterally.
In diesem Fall wird zusätzlich zum aktiven Bestandteil die injizierbare, pharmazeutische Zusammensetzung, z. B. steriles Wasser, Puffer, Natriumchlorid, Mannitol oder Sorbitol, ent halten.In this case, in addition to the active ingredient, the injectable, pharmaceutical composition, e.g. B. sterile Water, buffer, sodium chloride, mannitol or sorbitol, ent hold.
Vorzugsweise wird eine endovenös injizierbare Lösung als Träger, z. B. steriles Wasser oder eine sterile, isotonische Salzlösung, enthalten.Preferably, an endovenous injectable solution as Carrier, z. As sterile water or a sterile, isotonic Saline solution, included.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur topischen Anwen dung, z. B. Cremes, Lotionen, Gels, Pasten, Lösungen oder Öl suspensionen, enthalten Excipienten, z. B. ölige Substanzen, Emulgatoren oder Gelbildner, die üblicherweise verwendet werden.The pharmaceutical compositions for topical application tion, eg As creams, lotions, gels, pastes, solutions or oil suspensions, contain excipients, eg. Oily substances, Emulsifiers or gel formers that are commonly used become.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen, pharmazeuti schen Zusammensetzungen nach bekannten Verfahren entspre chend den bei galenischen Herstellungen üblichen Prozeduren hergestellt werden.In general, the inventive, pharmi rule compositions according to known methods The usual procedures for galenic preparations getting produced.
Die wirksame Dosierung hängt von der Schwere der zu behan delnden Krankheit, dem Typ der verwendeten Formulierung, dem Zustand des Patienten und der Behandlungsdauer ab.The effective dosage depends on the severity of the treatment disease, the type of formulation used, the Condition of the patient and duration of treatment.
Claims (5)
P eine HV1 oder HV1 (Val 65) Polypeptidid-Einheiten mit der in Fig. 1 definierten Aminosäuresequenz ist,
-(Gly)- ist das bivalente Radikal von Glycin -NH-CH₂-CO-;
X ist -OH oder -NH₂ und
n ist Null oder 1,
mit der Maßgabe, daß, wenn P HV1 und n Null ist, X nur NH₂ ist, und daß, wenn n 1 ist, X nur -OH ist, und pharmazeutisch annehmbare Salze davon.A hirudin-derived polypeptide having the following formula (I) P- (Gly) n -X (I) wherein
P is an HV1 or HV1 (Val 65) polypeptide units having the amino acid sequence defined in Figure 1,
- (Gly) - is the bivalent radical of glycine -NH-CH₂-CO-;
X is -OH or -NH₂ and
n is zero or 1,
with the proviso that when P is HV1 and n is zero, X is only NH₂, and when n is 1, X is only -OH and pharmaceutically acceptable salts thereof.
- a) Herstellung eines Expressionsvektors, enthaltend ein für ein Hirudin abgeleitetes Polypeptid der Formel (I) kodierendes DNA-Molekül, worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe X -OH ist, der in der Lage ist, die Synthese des Polypeptids in einem geeigneten Wirts mikroorganismus durchzuführen;
- b) Einschleusung des Expressionsvektors in den geeigneten Wirtsmikroorganismus;
- c) Expression, Sekretion und Isolierung des Polypeptids aus dem Wirtsmikroorganismus, wobei eine Verbindung der Formel (I) erhalten wird, worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe P, -(Gly)- und n wie oben definiert sind und X -OH ist; und
- d) falls erwünscht, enzymatische Umwandlung einer Verbin dung der Formel (I), worin unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe n 1 und X OH ist, in eine entsprechende Verbindung der Formel (I), wo unter Berücksichtigung der obigen Maßgabe n Null und X -NH2 ist, durch ein geeignetes Amidierungsenzym und, falls erwünscht, Umwandlung einer Verbindung der Formel (I) in sein pharmazeutisch annehmbares Salz.
- a) Preparation of an expression vector containing a DNA molecule coding for a hirudin-derived polypeptide of the formula (I), wherein, taking into account the above proviso, X is -OH capable of carrying out the synthesis of the polypeptide in a suitable host microorganism ;
- b) introduction of the expression vector into the appropriate host microorganism;
- c) expression, secretion and isolation of the polypeptide from the host microorganism to give a compound of formula (I) wherein, in consideration of the above proviso, P, - (Gly) - and n are as defined above and X is -OH; and
- d) if desired, enzymatic conversion of a compound of formula (I) wherein, taking into account the above provisos, n 1 and X is OH, into a corresponding compound of formula (I) where, taking into account the above proviso, n is zero and X is NH 2 is, by a suitable amidation enzyme and, if desired, conversion of a compound of formula (I) into its pharmaceutically acceptable salt.
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Cited By (1)
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