DE4219381C2 - Zinc-resistant yeast for the production of glutathione - Google Patents
Zinc-resistant yeast for the production of glutathioneInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Zink-resistente Saccharomyces-Hefe und ihre Anwendung zur fermentativen Herstellung von Glutathion.The invention relates to a zinc-resistant Saccharomyces yeast and its Application for the fermentative production of glutathione.
Glutathion ist ein Tripeptid der Struktur γ-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin, das eine bedeutende Rolle als Cofaktor verschiedener Enzyme und als Schutz der Zellen gegen oxidative Schädigung durch toxische Verbindungen, reaktive Sauerstoffderivate und Strahlung und generell in der Inaktivie rung von zellschädigenden Substanzen besitzt. Es stellt das häufigste Thiol der Zellen dar.Glutathione is a tripeptide with the structure γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine, which plays an important role as a cofactor of various enzymes and as Protection of cells against oxidative damage by toxic compounds, reactive oxygen derivatives and radiation and generally in inactivity possesses cell-damaging substances. It represents the most common Thiol of the cells.
Wirtschaftliche Bedeutung hat Glutathion sowohl als Therapeutikum, z. B. in der vorbeugenden Behandlung von Leberschäden und zum Schutz vor Medi kament-induzierter Nephrotoxizität, als auch als Additiv in der Lebens mittelindustrie, z. B. als Backmittelzusatz.Glutathione is of economic importance both as a therapeutic agent, e.g. B. in the preventive treatment of liver damage and to protect against medi Kament-induced nephrotoxicity, as well as an additive in life medium industry, e.g. B. as a baking agent additive.
Die intrazelluläre Synthese erfolgt enzymatisch aus den Aminosäuren L- Glutaminsäure, L-Cystein und Glycin. Zur Anregung der Glutathion-Produk tion können den Zellen dabei als wirksame Vorläufer-Substanzen Schwefel verbindungen, wie die Aminosäure L-Cystein, zugesetzt werden.The intracellular synthesis takes place enzymatically from the amino acids L- Glutamic acid, L-cysteine and glycine. To stimulate the glutathione product tion, sulfur can act as an effective precursor for the cells compounds such as the amino acid L-cysteine can be added.
Da die Gewinnung des Glutathion üblicherweise aus Hefezellen erfolgt, ist die Verbesserung des Verfahrens zur biotechnologischen Herstellung von Glutathion von besonderer Bedeutung. Ein besonders wichtiger Aspekt ist dabei die Entwicklung von Hefe-Produktionsstämmen mit hoher Glutathion produktivität.Since glutathione is usually obtained from yeast cells the improvement of the process for the biotechnological production of Glutathione of particular importance. A particularly important aspect is the development of yeast production strains with high glutathione productivity.
Die Erhöhung des Glutathion-Gehalts kann durch gentechnische Veränderung der Produktionsstämme, im besonderen durch Klonierung von Glutathion-Syn these-Genen, erreicht werden. Ein solches gentechnisches Verfahren wird beispielsweise in EP-A 0 300 168 beschrieben.The increase in glutathione content can be caused by genetic engineering the production strains, in particular by cloning glutathione syn these genes. Such a genetic engineering process will described for example in EP-A 0 300 168.
Nach JP 89/141 591 können hohe Glutathion-Gehalte auch dadurch erzielt werden, daß man die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae in einem synthe tischen Medium, das Metallionen und Vitamine enthält, kultiviert. According to JP 89/141 591, high glutathione contents can also be achieved in this way be that the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae in a synthe medium, which contains metal ions and vitamins.
Es sind auch Verfahren bekannt, nach denen die Glutathion-Synthese durch den Einsatz von mutagen veränderten Hefen verbessert wird. So können nach JP 86/031 081 Hefen der Gattung Candida und nach JP 85/248 199 und EP-A- 0 079 241 auch Stämme von Saccharomyces cerevisiae mutiert werden. Mit den dabei erhaltenen Mutanten wird die Glutathion-Produktion erheblich gesteigert.Methods are also known by which glutathione synthesis is carried out the use of mutagen-modified yeasts is improved. So after JP 86/031 081 yeasts of the genus Candida and according to JP 85/248 199 and EP-A- 0 079 241 strains of Saccharomyces cerevisiae can also be mutated. With The mutants obtained thereby the glutathione production becomes significant increased.
Dabei führt allerdings die Verwendung von Candida-Hefen nicht zu einem Produkt, das ohne weitere Aufreinigungen in Lebensmitteln eingesetzt wer den kann. Bei Verwendung von Saccharomyces-Hefen, speziell von Saccharo myces cerevisiae, ist der Einsatz auch eines Rohprodukts als eine Art Hefeextrakt in Lebensmitteln unbedenklich. Allerdings zeigen die bisher beschriebenen Verfahren keine einfache Selektionsmöglichkeit für Gluta thion-überproduzierende Stämme auf, und die erhaltenen Mutanten besitzen beispielsweise nach JP 73/092 579 eine hohe Glutathion-Produktivität nur in Kulturmedium mit hohen Schwefelgehalten und unter Zusatz von Aminosäu ren.However, the use of Candida yeasts does not lead to one Product that is used in food without further purification that can. When using Saccharomyces yeast, especially from Saccharo myces cerevisiae, is the use of a raw product as a kind Yeast extract in food is harmless. However, they show so far described procedure no easy selection option for gluta thion overproducing strains and possess the mutants obtained For example, according to JP 73/092 579 only high glutathione productivity in culture medium with high sulfur contents and with the addition of amino acid ren.
In JP 90/295 480 werden Zink-resistente Saccharomyces-Hefen für die Her stellung von Glutathion beansprucht. Die Fermentation erfolgt dort jedoch in Gegenwart von Zinkionen und liefert Glutathion in noch nicht ausrei chenden Mengen.JP 90/295 480 describes zinc-resistant Saccharomyces yeasts for Her position of glutathione claimed. However, the fermentation takes place there in the presence of zinc ions and does not deliver glutathione in sufficient quantities.
Damit stellt sich die Aufgabe, Glutathion mit verbesserter Reinheit und hoher Ausbeute aus Stämmen zu gewinnen, die nach Selektion einen deutlich erhöhten Glutathion-Gehalt aufweisen und diesen erhöhten Gehalt auch bei Anzucht in einem Standardmedium ohne Zusatz von hohen Schwefelgaben oder von Aminosäuregemischen erbringen.This creates the task of having improved purity and glutathione high yield from strains, which after selection one clearly have increased glutathione content and also this increased content Cultivated in a standard medium without the addition of high sulfur additions of amino acid mixtures.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man bei der fer mentativen Herstellung von Glutathion den Zink-resistenten Stamm Saccha romyces cerevisiae DSM 7092 verwendet.This object is achieved in that at the fer mentative production of glutathione the zinc-resistant strain Saccha romyces cerevisiae DSM 7092 used.
Abgesehen von der Zink-resistenten Saccharomyces-Hefe erfordert die Fer mentation keine besonderen Maßnahmen. Die Fermentation kann also unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden. Aside from the zinc-resistant Saccharomyces yeast, the Fer requires mentation no special measures. The fermentation can be under usual conditions.
Die Zink-resistente Saccharomyces-Hefe wird durch Mutation und Selektion von Saccharomyces-Wildstämmen erhalten. Dabei werden zunächst Mutanten durch UV-Strahlung oder durch chemische Mutagene, wie z. B. Methyl- und Ethylmethansulfonsäure oder Nitrosomethylguanidin, erzeugt und isoliert. Von diesen Mutanten werden solche Mutanten selektiert, die gegenüber dem Wildstamm eine erhöhte Resistenz gegenüber Zink aufweisen. Die Selektion erfolgt dabei mit Hilfe von Zinksalzlösungen mit Salzkonzentrationen von vorzugsweise 2 bis 40 mMol/l. Geeignete Zinksalze sind beispielsweise Sulfate, Phosphate oder das Nitrat, Chlorid oder Acetat. Zinkchlorid wird vorzugsweise angewandt.The zinc-resistant Saccharomyces yeast is made by mutation and selection obtained from wild Saccharomyces strains. First, mutants by UV radiation or by chemical mutagens, such as. B. methyl and Ethyl methanesulfonic acid or nitrosomethylguanidine, produced and isolated. From these mutants, those mutants are selected which are compared to the Wildstamm show increased resistance to zinc. The selection takes place with the help of zinc salt solutions with salt concentrations of preferably 2 to 40 mmol / l. Suitable zinc salts are, for example Sulphates, phosphates or the nitrate, chloride or acetate. Zinc chloride preferably applied.
Die diese Selektion überlebenden Mutanten zeichnen sich dadurch aus, daß sie bei der Anzucht nach bekannten Verfahren ohne besondere Medienzusätze einen deutlich erhöhten Glutathion-Gehalt erreichen. Saccharomyces cere visiae DSM 7092 zeigt gegenüber dem Wildtyp-Stamm eine 8- bis 10fache Steigerung des Glutathion-Gehalts. Eine weitere Steigerung des Glu tathion-Gehalts kann durch Zufütterung von L-Cystein in der letzten Phase der Anzucht erzielt werden.The mutants surviving this selection are characterized in that when cultivated according to known methods without special media additives achieve a significantly increased glutathione content. Saccharomyces cere visiae DSM 7092 shows 8 to 10 times the wild-type strain Increase in the glutathione content. Another increase in glu tathion content can be increased by adding L-cysteine in the final phase of cultivation can be achieved.
Das Glutathion erhält man durch Extraktion der Hefezellen. Anschließend kann das extrahierte Produkt nach bekannten Methoden gereinigt werden. Glutathion kann beispielsweise nach dem in JP 86/031 081 angegebenen Ver fahren als Kupfersalz gefällt und anschließend mit Hilfe von Schwefelwas serstoff wieder freigesetzt werden.The glutathione is obtained by extracting the yeast cells. Subsequently the extracted product can be purified by known methods. Glutathione can, for example, according to the Ver specified in JP 86/031 081 drive as copper salt and then with the help of sulfur be released again.
Die vorliegende Erfindung hat folgende Vorteile:The present invention has the following advantages:
- - Die beschriebene Selektionsmethode erlaubt eine schnelle und eindeutige Anreicherung von Glutathion-überproduzierenden Mutanten.- The selection method described allows a quick and clear Enrichment of mutants overproducing glutathione.
- - Die Kultivierung kann in Standardmedien erfolgen, die für die Anzucht von Bäckerhefen in technischem Maßstab erprobt sind.- The cultivation can be done in standard media that are used for cultivation have been tested on a technical scale by baker's yeasts.
- - Das Verfahren erlaubt die Herstellung von Glutathion in Hefe in Konzen trationen, die bisher unter Verwendung von Standard-Melasse-Medien nicht erzielbar waren. - The process allows the production of glutathione in yeast in conc trations previously using standard molasses media were not achievable.
- - Die Hefe benötigt kein weiteres Zink und gegenüber einer normalen Backhefe-Fermentation keine erhöhten Mengen an Schwefel, um Glutathion in hohen Mengen zu produzieren.- The yeast does not need any more zinc and compared to a normal one Baker's yeast fermentation does not increase levels of sulfur to make glutathione to produce in large quantities.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern.The following examples are intended to illustrate the invention.
20 mg des haploiden Stammes A4 der Art Saccharomyces cerevisiae werden mit 0,1 ml einer 9,4 M Ethylmethansulfonsäure-Lösung und 4 ml 0,1 M Phos phatpuffer bei 28°C/60 min geschüttelt. Dabei wird eine Abtötungsrate von 90% erreicht.20 mg of the haploid A4 strain of the species Saccharomyces cerevisiae with 0.1 ml of a 9.4 M ethyl methanesulfonic acid solution and 4 ml of 0.1 M Phos shaken phate buffer at 28 ° C / 60 min. Doing so will result in a kill rate reached by 90%.
Die überlebenden Zellen werden auf dem Selektionsmedium ausplattiert. Dabei werden pro 1 Selektionsmedium 1 ml ZnCl2-Lösung, die 600 mMol/l ZnCl2 enthält, als Selektionsagens zugegeben.The surviving cells are plated on the selection medium. 1 ml of ZnCl 2 solution containing 600 mmol / l ZnCl 2 is added as selection agent per 1 selection medium.
ZnCl2-resistente Stämme ("Mutanten") werden isoliert und auf ihren Glu tathion-Gehalt untersucht. Ein Isolat Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 zeigt einen gegenüber dem Wildstamm um das 8- bis 10fache gesteigerten Glutathion-Gehalt.ZnCl 2 -resistant strains ("mutants") are isolated and examined for their glutathione content. An isolate Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 shows an 8 to 10-fold increase in the glutathione content compared to the wild strain.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 wird in einem für die Hefe- Kultivierung standardmäßig benutzten Vollmedium, das 2% Glucose und 0,5% Hefeextrakt enthält, für 48 Stunden bei 30°C mit einer Schüttel frequenz von 120 rpm angezogen.The strain Saccharomyces cerevisiae DSM 7092 is used in a Cultivation uses standard full medium, the 2% glucose and Contains 0.5% yeast extract for 48 hours at 30 ° C with a shaker frequency of 120 rpm attracted.
Glutathion wird durch Extraktion mit heißer 5%iger Phosphorsäure aus den Zellen herausgelöst und durch einen enzymatischen Test quantitativ nach gewiesen. Glutathione is extracted by extraction with hot 5% phosphoric acid Cells detached and quantified by an enzymatic test pointed.
Der Glutathion-Gehalt beträgt 4,1%, bezogen auf die Trockensubstanz.The glutathione content is 4.1%, based on the dry matter.
Der Stamm S. cerevisiae DSM 7092 wird unter den in Beispiel 2 genannten Bedingungen in einem im technischen Maßstab verwendeten Melasse-Medium (10% Melasse, 25 g/l Saccharose, 0,55 g/l (NH4)H2PO4, 5,8 g/l NH4Cl, 0,5 g/l MgCl2, 75 mg/l Inosit, 5 µg/l Biotin, 800 µg/l Thiamin) angezogen.The strain S. cerevisiae DSM 7092 is, under the conditions mentioned in Example 2, in a molasses medium used on an industrial scale (10% molasses, 25 g / l sucrose, 0.55 g / l (NH 4 ) H 2 PO 4 , 5.8 g / l NH 4 Cl, 0.5 g / l MgCl 2 , 75 mg / l inositol, 5 µg / l biotin, 800 µg / l thiamine).
Die Glutathion-Extraktion und Bestimmung erfolgt wie in Beispiel 2 be schrieben.The glutathione extraction and determination is carried out as in Example 2 wrote.
Die Glutathion-Gehalt beträgt 5,0%, bezogen auf die Trockensubstanz.The glutathione content is 5.0%, based on the dry matter.
Der Stamm S. cerevisiae DSM 7092 wird angezogen wie in Beispiel 3 be schrieben. 16 Stunden vor der Ernte werden 100 ml der Kultur-Lösung mit 30 mg L-Cystein-HCl versetzt.The S. cerevisiae DSM 7092 strain is grown as in Example 3 wrote. 16 hours before the harvest, 100 ml of the culture solution are added 30 mg L-cysteine HCl added.
Die Glutathion-Extraktion und Bestimmung erfolgt wie in Beispiel 2 be schrieben.The glutathione extraction and determination is carried out as in Example 2 wrote.
Der Glutathion-Gehalt beträgt 6,6%, bezogen auf die Trockensubstanz.The glutathione content is 6.6%, based on the dry matter.
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