DE4217679C2

DE4217679C2 - Cyclic guanosine 3 ', 5'-phosphorothioate derivatives

Info

Publication number: DE4217679C2
Application number: DE19924217679
Authority: DE
Inventors: Hans-Gottfried Dr Genieser; Ulrich Prof Dr Walter; Elke Dr Butt
Original assignee: GENIESER HANS GOTTFRIED DR
Current assignee: GENIESER HANS GOTTFRIED DR
Priority date: 1992-05-26
Filing date: 1992-05-26
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2012-05-27
Also published as: DE4217679A1

Description

Die Erfindung betrifft neue S_P- und R_P-konfigurierte cyclische Guanosin-3′,5′-phosphorothioat-Derivate sowie physiologisch verträgliche Salze dieser Verbindungen.The invention relates to novel S _P and R _P -configured cyclic guanosine-3 ', 5'-phosphorothioate derivatives and physiologically acceptable salts of these compounds.

Die zentrale Rolle des cyclischen Adenosin-3′,5′-monophosphats (cAMP) als zellulärer Signalübermittler (second messenger) ist seit seiner Entdeckung durch Sutherland (Ann. Rev. Biochem. 37, 149 (1968)) mittlerweile in zahllosen biochemischen Prozessen bestätigt worden.The central role of the cyclic adenosine 3 ', 5'-monophosphate (cAMP) as a cellular messenger (second messenger) since its discovery by Sutherland (Ann. Rev. Biochem. 149 (1968)) meanwhile in countless biochemical processes been confirmed.

Auch das entsprechende Guanosin-3′,5′-monophosphat (cGMP) regelt offensichtlich viele zellbiologische Prozesse, wie z. B. die Relaxation von kontrahierter Aortamuskulatur und die Hemmung der Thrombozytenfunktion (U. Walter, Rev. Physiol. Biochem. Pharma col. 113, 42-88 (1989)). Es kann sowohl parallel den cAMP-Si gnalweg unterstützen als auch einen gegensätzlichen Effekt aus lösen und so als Gegenregulator wirken. The corresponding guanosine 3 ', 5'-monophosphate (cGMP) also regulates obviously many cell biological processes, such. B. the Relaxation of contracted aortic muscles and inhibition of Platelet function (U.Walter, Rev. Physiol. Biochem col. 113, 42-88 (1989)). It can both parallel the cAMP Si gnalweg support as well as an opposite effect solve and thus act as a counter-regulator.

cAMP und cGMP werden in der Regel nach externer hormoneller Sti mulation durch intrazelluläre Cyclasen aus ATP bzw. GTP gebildet und binden im Zuge der Signalübermittlung an jeweils für sie spezifische Proteinkinasen, die dann ihrerseits weitere Proteine durch Phosphorylierung aktivieren oder des aktivieren und damit letztlich einen biologischen Effekt auslösen.cAMP and cGMP are usually after external hormonal Sti formed by intracellular cyclases from ATP or GTP and bind in the course of signaling to each for them specific protein kinases, which in turn then further proteins activate or activate by phosphorylation and thus ultimately trigger a biological effect.

Verschiedene Cyclonucleotid-abhängige Phosphodiesterasen sorgen für den Wiederabbau von cAMP und cGMP (J.A. Beavo, Second Mes senger and Phosphoprotein Res. 22, 1-38 (1988)) und schalten so ein ausgelöstes Signal wieder ab.Various cyclonucleotide-dependent phosphodiesterases provide for the degradation of cAMP and cGMP (J.A. Beavo, Second Mes Senger and Phosphoprotein Res. 22, 1-38 (1988)) and switch so a triggered signal again.

Die Tatsache, daß viele Erkrankungen im Humanbereich mit einem unnatürlich hohen oder niedrigen Spiegel an cAMP oder cGMP ein hergehen, hat zu zahlreichen Versuchen geführt, die intrazel luläre Signalübermittlung dieser "second messenger" zu beein flussen.The fact that many diseases in the human with a unnaturally high or low levels of cAMP or cGMP It has led to numerous attempts, the intracellular Signal transmission of this "second messenger" to impress influence.

Ein zu niedriger Spiegel an cAMP oder cGMP kann durch Inhibition der cyclonucleotidabhängigen Phosphodiesterasen kompensiert werden (Nicholson et al., TIBS 12, 19-27 (1991)). Auf diese Weise wird der Abbau von cAMP oder cGMP verhindert, so daß die Konzentration dieser Stoffe in der Zelle durch Akkumulation an steigt. Durch Gabe von membrangängigen cAMP- und cGMP-Derivaten, wie z. B. 8-Brom-cAMP/cGMP oder 8-(4-Chlorphenylthio)-cAMP/cGMP, können die jeweiligen Proteinkinasen direkt aktiviert und so ein zu niedriges Cyclonucleotid-Niveau ausgeglichen werden. Solche modifizierten Derivate können darüber hinaus zur Charakterisie rung der Spezifität von Kinasen eingesetzt werden (Wolfe et al. J. Biol. Chem. 264, 7734-7741 (1989), Geiger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1031-1035 (1992)). Eine Erhöhung der intra zellulären cAMP- oder cGMP-Konzentration läßt sich zudem durch Stimulation der entsprechenden Cyclasen erreichen (Forskolin, Choleratoxin, Nitroprussid u. a.). Too low a level of cAMP or cGMP may be due to inhibition the cyclonucleotide-dependent phosphodiesterases compensated (Nicholson et al., TIBS 12, 19-27 (1991)). To this Way the degradation of cAMP or cGMP is prevented, so that the Concentration of these substances in the cell by accumulation increases. By administration of membrane permeable cAMP and cGMP derivatives, such as 8-bromo-cAMP / cGMP or 8- (4-chlorophenylthio) -cAMP / cGMP, can directly activate the respective protein kinases and so on to low cyclonucleotide level. Such modified derivatives can also characterize specificity of kinases (Wolfe et al. J. Biol. Chem. 264, 7734-7741 (1989), Geiger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1031-1035 (1992)). An increase in intra Cellular cAMP or cGMP concentration can also be through Achieve stimulation of the corresponding cyclases (forskolin, Cholera toxin, nitroprusside and the like a.).

Sowohl in der Grundlagenforschung zellulärer Prozesse, als auch im Hinblick auf potentielle pharmakologische Verwendung ist aber auch die Möglichkeit einer Absenkung oder sogar einer vollstän digen Blockade des cAMP oder cGMP Signalwegs von großer Bedeu tung.Both in the basic research of cellular processes, as well with regard to potential pharmacological use is but also the possibility of lowering or even a complete blockade of the cAMP or cGMP signaling pathway is of great importance tung.

Als Inhibitoren der Proteinkinasen wurden bisher neben einigen unspezifisch wirkenden Isochinolin-Derivaten (Chÿawa et al., J. Biol. Chem. 265, 5267 (1990)) und einem Inhibitor auf Proteinba sis (Walsh et al., J. Biol. Chem. 246, 1977 (1971)) vor allem R_P- konfigurierte Derivate des Adenosin-3′,5′-monophosphorothioats (R_P-cAMPS) eingesetzt. Es wirkt als cAMP-Antagonist und Inhibitor der cAMP-abhängigen Proteinkinasen vom Typ I und II (cAK I & 11) (Botelho et al., Methods Enzymol. 159, 159 (1988)). Weitere diastereomere cAMP-Derivate mit R_P-Konfiguration wurden bereits dargestellt (Dostmann et al., J. Biol. Chem. 265, 10484 (1990)) und werden zur Zeit auf ihre biologischen Eigenschaften hin untersucht.As inhibitors of protein kinases have been hitherto in addition to some unspecific acting isoquinoline derivatives (Chÿawa et al., J. Biol. Chem. 265, 5267 (1990)) and an inhibitor of protein ba sis (Walsh et al., J. Biol. Chem. 246, 1977 (1971)) mainly R _P - configured derivatives of adenosine 3 ', 5'-monophosphorothioats (R _P -cAMPS) used. It acts as a cAMP antagonist and inhibitor of type I and II cAMP-dependent protein kinases (cAK I & II) (Botelho et al., Methods Enzymol., 159, 159 (1988)). Other diastereomeric cAMP derivatives of R _P configuration have been previously reported (Dostmann et al., J. Biol. Chem. 265, 10484 (1990)) and are currently being investigated for their biological properties.

Da sich im Falle der cAMPS-Derivate gezeigt hat, daß nicht alle R_P-Diastereomeren Inhibitoren der Cyclonukleotid-abhängigen Pro teinkinasen sind, sondern durchaus auch agonistisch wirken kön nen (Sandberg et al., Biochem. J. 279, 521-527 (1991)), und da die meisten der 20 bisher untersuchten R_P-Isomeren lediglich partielle Antagonisten und eher Agonisten der cAK darstellen, gibt es zum gegenwärtigen Zeitpunkt kein strukturelles Kriteri um, daß eine verläßliche Vorhersage erlaubt, ob ein R_P-konfigu riertes Adenosin-3′,5′-phosphorothioat-Derivat die cAK I bzw. II vollständig inhibieren kann oder nicht.Since it has been shown in the case of the cAMPS derivatives that not all R _P diastereomers are inhibitors of the cyclonucleotide-dependent protein kinases, but can certainly also have an agonistic action (Sandberg et al., Biochem J. 279, 521-527 ( 1991)), and since most of the 20 R _P isomers studied so far represent only partial antagonists and more agonists of the cAK, there is currently no structural criterion for a reliable prediction of whether an R _P -configured adenosine -3 ', 5'-phosphorothioate derivative may or may not completely inhibit cAK I and II, respectively.

Im Gegensatz zu den cAMPS-Derivaten wurden bisher lediglich zwei schwefelmodifizierte Verbindungen des cGMP mit inhibitorischen Eigenschaften beschrieben: R_P-Guanosin-3′,5′-monophosphorothioat (R_P-cGMPS) und R_P-8-Chlorguanosin-3′,5′-monophosphorothioat (R_P-8-Cl-cGMPS) (Butt et al., FEBS Lett. 263, 47 (1990)). In contrast to the cAMPS derivatives, only two sulfur-modified compounds of cGMP with inhibitory properties have so far been described: R _P -Guanosine 3 ', 5'-monophosphorothioate (R _P -cGMPS) and R _P -8-chloroguanosine-3', 5 'Monophosphorothioate (R _P -8-Cl-cGMPS) (Butt et al., FEBS Lett. 263, 47 (1990)).

Der potentiellen Verwendung dieser Substanzen als Inhibitoren des cGK-Signalwegs stehen allerdings gravierende Nachteile ent gegen. So ist z. B. für R_P-cGMPS die erforderliche Kinase-Selek tivität nicht gegeben. Weiterhin ist die Lipophilie, die zur Durchdringung der Zellmembran entscheidend ist, in beiden Fällen recht niedrig, obwohl die Modifikation mit Schwefel im Durch schnitt eine Verdoppelung der Lipophilie mit sich bringt (Brau mann et al., J. Chromatogr. 350, 105-118 (1985)).The potential use of these substances as inhibitors of the cGK signaling path, however, entails serious disadvantages. So z. B. for R _P -cGMPS the required kinase Selec activity not given. Furthermore, the lipophilicity, which is crucial for the penetration of the cell membrane, is quite low in both cases, although the modification with sulfur brings on average a doubling of the lipophilicity (Braumann et al., J. Chromatogr. 350, 105-118 (1985)).

Es bestand daher die Aufgabe, neue cGMPS-Derivate zu finden, die eine höhere Lipophilie und damit eine bessere Zellmembran-Per meabilität besitzen, die selektiv die cGMP-abhängigen Proteinki nasen kommpetitiv hemmen und die ferner eine ausreichende chemi sche, physikalische und metabolische Stabilität besitzen.It was therefore the task of finding new cGMPS derivatives, the a higher lipophilicity and thus a better cell membrane Per possessing selectively the cGMP-dependent proteinki inhibit nasal commas and which also has sufficient chemi physical, physical and metabolic stability.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden die in Anspruch 1 beschriebenen Verbindungen vorgeschlagen. Es zeigte sich überraschenderweise, daß die vorstehend aufgeführten Anforderungen an besonders vor teilhafte Inhibitoren der cGMP-abhängigen Proteinkinase durch die erfindungsgemäßen R_P-konfigurierten cGMPS-Derivate erfüllt werden. Besonders überraschend ist, daß selbst Modifikationen, die in Form der korrespondierenden R_P-cAMPS-Derivate die cAMP-ab hängigen Proteinkinasen eindeutig stimulieren können, als R_P- cGMPS-Analoge die cGK-Kinase inhibieren. Besonders vorteilhaft ist auch die hohe Selektivität der erfindungsgemäßen Verbindun gen. Inhibitorische oder aktivierende Effekte an den entspre chenden cAK′s zeigen sich erst bei sehr viel höheren Konzentra tionen, als sie an der cGK nötig sind. Die erfindungsgemäßen S_p-konfigurierten cGMPS-Derivate eignen sich als Aktivatoren cGMP- abhängiger Proteinkinasen.To solve this problem, the compounds described in claim 1 are proposed. It has surprisingly been found that the above listed requirements for particularly advantageous inhibitors of the cGMP-dependent protein kinase are fulfilled by the R _P -configured cGMPS derivatives according to the invention. It is particularly surprising that even modifications which can unambiguously stimulate the cAMP-dependent protein kinases in the form of the corresponding R _P -cAMPS derivatives inhibit the cGK kinase as R _P cGMPS analogues. The high selectivity of the compounds according to the invention is also particularly advantageous. Inhibitory or activating effects on the corresponding cAKs are only apparent at much higher concentrations than are required at the cGK. The S _p -configured cGMPS derivatives according to the invention are suitable as activators of cGMP-dependent protein kinases.

Die gefundenen Substanzen vereinen in sich eine Reihe von Eigen schaften, die ihren intensiven Einsatz in der zellulären Signal übertragungsforschung möglich machen und sowohl eine Verwendung als Therapeutikum bei Überfunktionen des cGMP-Systems als auch eine pharmakologisch sinnvolle Blockade von an sich normalen cGMP-Spiegeln ermöglichen. Darüber hinaus eignen sich die erfin dungsgemäßen Verbindungen als Modulatoren, d. h. als Inhibitoren (R_P-konfigurierte Derivate) oder Aktivatoren (S_P-konfigurierte Derivate), von cGMP-abhängigen Ionenkanälen, cyclonucleotid abhängigen Phosphodiesterasen oder anderen cGMP-abhängige Bin dungsproteinen. Die Schwefelmodifikation gewährleistet dabei bekanntermaßen bei allen R_P-konfigurierten Verbindungen voll ständige Stabilität gegenüber allen bekannten cyclonucleotid abbauenden Phosphodiesterasen in Säugern einschließlich Men schen, bei den S_P-konfigurierten Verbindung führt die Schwefelmo difikation zu einer starken Verzögerung des enzymatischen Ab baus.The substances found combine a number of properties that make their intensive use in cellular signal transduction research possible and allow both a use as a therapeutic in over-functioning of the cGMP system as well as a pharmacologically meaningful blockade of cGMP levels that are in themselves normal. In addition, the compounds according to the invention are suitable as modulators, ie as inhibitors (R _P -configured derivatives) or activators (S _P -configured derivatives), cGMP-dependent ion channels, cyclonucleotide-dependent phosphodiesterases or other cGMP-dependent binding proteins. The sulfur modification is known to ensure complete stability to all known cyclonucleotide degrading phosphodiesterases in mammals, including humans, in all R _P -configured compounds; in the S _P -configured compound, the sulfur modification leads to a strong delay in the enzymatic degradation.

Im Vergleich zu bekannten Nucleosid-Cyclophosphaten besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel I eine erhöhte Lipo philie und damit eine verbesserte Membrangängigkeit. Substitu tion mit Schwefel am Phosphatrest in axialer Position (S_P-Dia stereomere) führt zu Kinase aktivierenden Verbindungen, eine äquatoriale Stellung des Schwefels dagegen zu cGK Antagonisten (R_P-Diastereomere).In comparison to known nucleoside cyclophosphates, the compounds according to the invention have an increased lipophilicity and thus improved membrane permeability. Substitu tion with sulfur on the phosphate radical in the axial position (S _P -D stereomers) leads to kinase activating compounds, an equatorial position of sulfur, however, to cGK antagonists (R _P diastereomers).

R¹ und R² stellen jeweils Wasserstoff dar und X ist der 4-Chlorphenylthio-Rest. R¹ and R² are each hydrogen and X is the 4-chlorophenylthio radical.

Weiterhin zeigen Verbindungen der Formel II mit R_P-Konfiguration am Phosphatrest antagonistische Eigenschaften.Furthermore, compounds of the formula II with R _P configuration on the phosphate radical show antagonistic properties.

In diesem Fall ist X, -Br. In this case, X, -Br.

Kat⁺ kann ein Proton, ein physiologisch verträgliches Metall-Kation oder ein Trialkylammonium-Ion sein. Bevorzugte Metall kationen sind Na⁺, K⁺, Li⁺, Ca²⁺ und Mg²⁺.Kat⁺ may be a proton, a physiologically acceptable metal cation or a trialkylammonium ion. Preferred metal cations are Na⁺, K⁺, Li⁺, Ca ²⁺ and Mg ²⁺ .

Um die Membrangängigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen noch weiter erhöhen, kann es vorteilhaft sein, die 2′-Hydroxylgruppe des Pentoserests und/oder den Phosphatrest mit hydrophoben Grup pen zu derivatisieren, die durch intrazelluläre Enzyme, hydroly tisch oder durch die Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge im sichtbaren oder ultravioletten Bereich nach Durchdringen der Zellmembran abgespalten werden können.To membrane permeability of the compounds of the invention yet further increase, it may be advantageous to the 2'-hydroxyl group of the pentose residue and / or the phosphate moiety with hydrophobic group to derivatize by intracellular enzymes, hydroly table or by the irradiation with light of a certain Wavelength in the visible or ultraviolet range after Penetration of the cell membrane can be eliminated.

Als enzymatisch abspaltbare Schutzgruppen für die 2′-Hydroxyl gruppe eignen sich Ester von linearen oder verzweigten Carbon säuren kurzer oder mittlerer Kettenlängen (C₁-C₈), für den Phosphatrest kommen Ester mit linearen oder verzweigten C₁-C₈- Alkoholen mit primärer, sekundärer oder tertiärer Hydroxylgrup pe, mit Benzylalkohol oder die Derivatisierung mit der Acetox ymethyl-Gruppe in Betracht.As enzymatically cleavable protecting groups for the 2'-hydroxyl For example, esters of linear or branched carbon are suitable short or medium chain length (C₁-C₈) acids for which Phosphate esters are esters with linear or branched C₁-C₈- Alcohols with primary, secondary or tertiary hydroxyl group pe, with benzyl alcohol or the derivatization with the acetox ymethyl group into consideration.

Als Beispiel für sowohl von der 2′-Hydroxylgruppe als auch vom Phosphatrest hydrolytisch abspaltbare Gruppen seien Silyl-Grup pen genannt. Besonders geeignet sind Trialkylsilyl-Gruppen, insbesondere Trialkylsilylgruppen mit geradkettigen oder ver zweigten C₁-C₅-Alkylresten. Ganz besonders geeignet ist die Trimethylsilyl-Gruppe.As an example of both the 2'-hydroxyl group and the Phosphate group hydrolytically removable groups are silyl group called pen. Particularly suitable are trialkylsilyl groups, in particular trialkylsilyl groups with straight-chain or ver branched C₁-C₅-alkyl radicals. Especially suitable is the Trimethylsilyl group.

Als Licht-abspaltbare Gruppen eignen sich für den Phosphatrest z. B. die 1-(2-Nitrophenyl)ethyl- oder die 4,5-Dimethoxy-2-ni trobenzyl-Gruppe, zur Derivatisierung der 2′-OH-Gruppe eignet sich besonders die Butyrylgruppe.Suitable light-cleavable groups are suitable for the phosphate radical z. As the 1- (2-nitrophenyl) ethyl or 4,5-dimethoxy-2-ni trobenzyl group, for derivatization of the 2'-OH group is suitable especially the butyryl group.

Die Derivatisierung der Phosphatgruppe kann sowohl am Sauerstoff als auch am Schwefelatom erfolgen, bevorzugt sind die am Sauer stoff derivatisierten Verbindungen. Darüberhinaus können Gemi sche aus Sauerstoff- und Schwefelderivaten verwendet werden.The derivatization of the phosphate group can be both oxygen as well as on the sulfur atom, preferably those on the acid substance derivatized compounds. In addition, Gemi be used from oxygen and sulfur derivatives.

Es kann ferner zweckdienlich sein, die erfindungsgemäßen Ver bindungen mit fluoreszierenden Gruppen zu derivatisieren, um sie in der Zelle lokalisieren zu können oder um empfindliche Quan tifizierungen im Zusammenhang mit Phosphodiesterasen zu ermögli chen (J. Grewal et al., Biochemistry International, 19, 1287 (1989)).It may also be useful Ver derivatize bonds with fluorescent groups to give them to locate in the cell or sensitive quan in connection with phosphodiesterases J. Grewal et al., Biochemistry International, 19, 1287 (1989)).

Als Fluoreszenzmarker eignet sich beispielsweise eine Derivati sierung der 2′-Hydroxylgruppe mit dem Anthraniloyl oder N-Me thylanthraniloyl-Rest.As a fluorescent marker, for example, is a derivative tion of the 2'-hydroxyl group with the anthraniloyl or N-Me thylanthraniloyl radical.

Der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen als Arzneimittel erfolgt bevorzugt in Kombination mit pharmakologisch üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfstoffen z. B. als Salben, Puder, Tabletten, Kapseln, Tropfen, Supposito rien, Infusions- oder Injektions-Lösungen. Indikationen solcher Arzneimittel sind z. B. Thrombose, Asthma, Hypertonie, Arteros klerose.The use of the compounds according to the invention as medicaments is preferably in combination with pharmacologically usual Carriers and / or diluents and / or adjuvants z. As ointments, powders, tablets, capsules, drops, Supposito rien, infusion or injection solutions. Indications of such Medicines are z. B. thrombosis, asthma, hypertension, arteriosis klerose.

Aufgrund ihres spezifischen Bindungsvermögens und ihrer Hydroly seresistenz eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von stationären Phasen für die Flüssigkeits-Chroma tographie, insbesondere für die Affinitäts-Chromatographie, beispielsweise cyclonukleotid-abhängiger Bindungsproteine. Hier bei werden die Verbindungen über die endständige reaktive Gruppe, die Halogene, an unlösliche polyme re Träger gebunden. Die reaktiven Gruppen sind entweder direkt (X = Halogen) oder über molekulare Abstandshalter (spacer) an den Heterocylus gebunden.Because of their specific binding capacity and their hydroly Resistance are the compounds of the invention are suitable for Production of stationary phases for the liquid chroma tography, in particular for affinity chromatography, For example, cyclonucleotide-dependent binding proteins. here at, the compounds become via the terminal reactive group, the halogens, insoluble polyme tied back. The reactive groups are either direct (X = halogen) or via molecular spacers (spacer) bound to the heterocycle.

Bevorzugt sind Abstandshalter der Struktur X = -NHR⁵, wobei R⁵ ein linearer Alkyl-, Polyethylenglycol-, Polyethylenimin- oder Polypeptid-Rest mit einer endständigen reaktiven Gruppe ist. Besonders bevorzugt sind Spacer mit einer Länge von 2 bis 12 Atomen bzw. von 1 bis 5 Aminosäuren im Fall der Polypeptide. Als endständige, reaktive Gruppen sind Aminogruppen und insbe sondere primäre Aminogruppen bevorzugt.Preference is given to spacers of the structure X = -NHR⁵, where R⁵ a linear alkyl, polyethylene glycol, polyethyleneimine or Polypeptide residue having a terminal reactive group. Particularly preferred are spacers with a length of 2 to 12 atoms or from 1 to 5 amino acids in the case of the polypeptides. As terminal, reactive groups are amino groups and esp especially primary amino groups are preferred.

Als unlösliche polymere Matrix eignen sich Kieselgel, Glas, Siliconpolymere, Polyacrylamid, Polystyrol, Agarose, wie z. B. Sepharose®, Cellulose oder Dextran, wie z. B. Sephadex®. Bevorzugt sind Trägermaterialien, die bereits Spacer enthalten und die sich daher besonders zur Bindung der Derivate ohne Spacer eig nen. Hierzu zählen insbesondere kommerziell zur Ankopplung von Affinitätsliganden angebotene Ethylenglykol-Methacrylsäure-Copo lymere, wie z. B. Fraktogel TSK®, CNBr- oder Epoxy-aktivierte Sepharose® bzw. Sephadex® oder derivatisierte poröse Glas-Kugeln (CPG). Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen stationären Phasen in gebrauchsfertiger Form, d. h. in Form von Trägermateri alien mit daran gebundenen Liganden, angeboten.Suitable insoluble polymeric matrix are silica gel, glass, Silicone polymers, polyacrylamide, polystyrene, agarose, such as. B. Sepharose®, cellulose or dextran, such as. Sephadex®. Prefers are carrier materials that already contain spacers and the Therefore, especially for binding the derivatives without spacer eig NEN. These include in particular commercially for the coupling of Affinity ligands offered ethylene glycol-methacrylic acid copo polymers, such as. As Fraktogel TSK®, CNBr- or epoxy-activated Sepharose® or Sephadex® or derivatized porous glass beads (CPG). Preferably, the stationary invention Phases in ready to use form, d. H. in the form of carrier material alien with attached ligands offered.

Die Synthese der neuen Verbindungen erfolgt in an sich bekannter Weise entweder durch Cyclothiophosphorylierung der entsprechend modifizierten Nucleoside in Trialkylphosphaten mit PSCl₃ (Genie ser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988); WO 89/07108; DE- OS 38 02 685) durch Austausch von Halogen an bereits präformier ten, 8-halogenierten Guanosin-3′,5′-phosphorothioaten mit den entsprechenden Nukleophilen (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) oder durch Umsetzung von präformierten Guano sin-3′,5′-phosphorothioaten mit 2-Bromacetophenon (Miller et al., Biochem. Pharmacol. 30, 509-515 (1981)).The synthesis of the new compounds takes place in a manner known per se Either by cyclothiophosphorylation of the corresponding modified nucleosides in trialkyl phosphates with PSCl₃ (Genie ser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988); WO 89/07108; DE- OS 38 02 685) by exchanging halogen already preformier th, 8-halogenated guanosine-3 ', 5'-phosphorothioaten with the corresponding nucleophiles (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) or by reaction of preformed guano sin-3 ', 5'-phosphorothioates with 2-bromoacetophenone (Miller et al., Biochem. Pharmacol. 30, 509-515 (1981)).

Die Derivatisierung der 2′-Hydroxyl- und der Phosphatgruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt nach Standardmethoden. Die 2′-Hydroxylgruppe läßt sich zum Beispiel durch Reaktion mit Carbonsäurechloriden bzw. Anthraniloylchloriden und Pyridin verestern, die Veresterung des Phosphatrestes erfolgt z. B. durch Umsetzung mit Diazoverbindungen (J. Engels, Bioorg. Chem., 8, 9-16 (1979)).The derivatization of the 2'-hydroxyl and the phosphate group of Compounds according to the invention are carried out according to standard methods. The 2'-hydroxyl group can be, for example, by reaction with Carboxylic acid chlorides or anthraniloyl chlorides and pyridine esterify, the esterification of the phosphate radical takes place z. B. by Reaction with diazo compounds (J. Engels, Bioorg. Chem., 8, 9-16 (1979)).

Silyl-Schutzgruppen werden beispielsweise durch Umsetzung der Phosphorothioate mit Trialkylsilylchloriden und Pyridin einge führt (Gaffney et al., J. Am. Chem. Soc., 104, 1316-1319 (1982)).Silyl protecting groups are obtained, for example, by reaction of Phosphorothioates with trialkylsilyl chlorides and pyridine Gaffney et al., J. Am. Chem. Soc., 104, 1316-1319 (1982)).

Eine Derivatisierung des Phosphatrestes mit photolabilen Gruppen (cage-Verbindungen) werden durch Reaktion der Cyclothiophosphate mit entsprechenden Diazoverbindungen erhalten (McCray et al., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 18, 239 (1986)).Derivatization of the phosphate moiety with photolabile groups (cage compounds) are formed by reaction of the cyclothiophosphates with corresponding diazo compounds (McCray et al., Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 18, 239 (1986)).

Die Immobilisierung der Derivate für die Affinitäts-Chromatogra phie an kopplungsfähige Trägermaterialien unter Ausbildung hy drolytisch stabiler Bindungen erfolgt auf bekannte Weise. In der Regel wird dabei der zu bindende, erfindungsgemäße Affinititäts ligand mit dem in Puffer suspendierten Trägermaterial bei Raum temperatur oder einer höheren Temperaturen gerührt.The immobilization of the derivatives for the affinity chromatography phie to coupling support materials under training hy drolytically stable bonds take place in a known manner. In the The rule here is the affinity of the invention to be bound ligand with the suspended in buffer carrier material at room temperature or a higher temperature.

Die Lipophilie der erfindungsgemäßen Verbindungen wird in an sich bekannter Weise mit Hilfe der Reversed-Phase-Hochdruckflüs sigkeits-Chromatographie als Log K_w,-Wert bestimmt, der dem Log P-Wert in etwa vergleichbar ist (Braumann et al., J. Chromatogr., 350, 105-118 (1985)). Der Log K_w-Wert für die Stammverbindung cGMP ist 0,85. The lipophilicity of the compounds according to the invention is determined in a manner known per se with the aid of reversed-phase high-pressure liquid chromatography as Log K _w , value which is approximately comparable to the Log P value (Braumann et al., J. Chromatogr , 350, 105-118 (1985)). The Log K _w value for the parent cGMP is 0.85.

Die Isolation von cGMP-abhängiger Proteinkinase Typ I aus Rin derlunge und von cAMP-abhängiger Proteinkinase Typ II aus Rin derherz erfolgt in an sich bekannter Weise (Walter et al., J. Biol. Chem. 255, 3757-3762 (1980)). Die Messung der Proteinkina se-Aktivität wird nach der Methode von Roskoski (Methods Enzy mol. 99, 3-6 (1983)) durchgeführt. Die in vitro-Messungen an humanen Thrombozyten-Membranen werden in an sich bekannter Weise durchgeführt (Halbrügge et al., Eur. J. Biochem. 185, 41-50, (1989)).Isolation of cGMP-dependent protein kinase type I from Rin derlunge and cAMP-dependent protein kinase type II from Rin derherz takes place in a manner known per se (Walter et al., J. Biol. Chem. 255, 3757-3762 (1980)). Measurement of protein kinase se activity is determined by the method of Roskoski (Methods Enzy mol. 99, 3-6 (1983)). The in vitro measurements on human platelet membranes are in a conventional manner (Halbrügge et al., Eur. J. Biochem. 185, 41-50, (1989)).

cGK-Antagonisten hemmen konzentrationsabhängig die cGMP-abhängi ge Phosphorylierung einer 46/50 kDa-Bande, nicht aber die cAMP-spezifische Phosphorylierung der 22 kDa- und der 240 kDa-Bande. Besonders gut membrangängige Verbindungen werden in vivo an intakten humanen Thrombozyten in an sich bekannter Weise (Hal brügge et al., J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990)) untersucht.cGK antagonists inhibit the cGMP dependence depending on the concentration ge phosphorylation of a 46/50 kDa band, but not the cAMP-specific phosphorylation of the 22 kDa and 240 kDa bands. Particularly well membrane permeable compounds are in vivo intact human platelets in a conventional manner (Hal Bruegge et al., J. Biol. Chem. 265, 3088-3093 (1990)).

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.The invention will be explained below with reference to examples.

reference example Cyclic 8-bromoguanosine 3 ', 5'-monophosphorothioate, R _P and S _P diastereomer (R _P - / S _P -8-Br-cGMPS)

Die Synthese der Verbindungen erfolgt in an sich bekannter Weise durch Cyclothiophosphorylierung von 8-Bromguanosin in Trialkyl phosphaten mit PSCl₃ (Genieser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988); WO 89/07108; DE-OS 38 02 685). Das Reaktionsgemisch enthält neben den Zielverbindungen unter anderem die in Position 8 chlorierten R_P- und S_P-Diastereomeren (R_P-/S_P-8-Cl-cGMPS). Chro matographie an Rp-18 Reversed Phase-Kieselgel (Laufmittel: 10% Methanol/100 mM Triethylammoniumformiat-Puffer) und Lyophilisie ren der produkthaltigen Fraktionen ergibt jeweils Gemische aus R_P-8-Br/Cl-cGMPS und S_P-8-Br/Cl-cGMPS, die jeweils durch erneute, präparative Chromatographie an Rp-18 Kieselgel (Laufmittel: 7%- bzw. 8%-Methanol/100 mM Triethylammoniumformiat-Puffer) getrennt werden. Die durch Vereinigen und Lyophilisieren produkthaltiger Fraktionen gewonnenen Diastereomeren von 8-Br-cGMPS werden gege benenfalls durch nochmalige Chromatographie unter denselben Bedingungen weiter aufgereinigt. R_P-8-Br-cGMPS enthält keine nachweisbaren Spuren der kinaseaktiven S_P-Diastereomeren S_P-8-Cl/Br-cGMPS und weniger als 0,05% des normalen Cyclophosphats 8-Cl/Br-cGMP. Die Reinheit ist < 98%. Ausbeute: 6% der Theorie, als Triethylammoniumsalz. S_P-8-Br-cGMPS enthält keine nachweis baren Spuren der entsprechenden R_P-Diastereomeren. Die Reinheit ist < 98%. Ausbeute: 5% der Theorie, als Triethylammoniumsalz.The synthesis of the compounds is carried out in a conventional manner by cyclothiophosphorylation of 8-bromoguanosine in trialkyl phosphates with PSCl₃ (Genieser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988); WO 89/07108; DE-OS 38 02 685). In addition to the target compounds, the reaction mixture contains, inter alia, the R _P and S _P diastereomers chlorinated in position 8 (R _P - / S _P -8-Cl-cGMPS). Chromatography on Rp-18 reversed phase silica gel (eluent: 10% methanol / 100 mM triethylammonium formate buffer) and lyophilization of the product-containing fractions gives mixtures of R _P -8-Br / Cl-cGMPS and S _P -8-Br / Cl-cGMPS, which are each separated by renewed preparative chromatography on Rp-18 silica gel (mobile phase: 7% or 8% methanol / 100 mM triethylammonium formate buffer). The diastereomers of 8-Br-cGMPS obtained by combining and lyophilizing product-containing fractions are further purified, if appropriate, by repeated chromatography under the same conditions. R _P -8-Br-cGMPS contains no detectable traces of the kinase-active S _P diastereomers S _P -8-Cl / Br-cGMPS and less than 0.05% of the normal cyclophosphate 8-Cl / Br-cGMP. The purity is <98%. Yield: 6% of theory, as the triethylammonium salt. S _P -8-Br-cGMPS contains no detectable traces of the corresponding R _P diastereomers. The purity is <98%. Yield: 5% of theory, as triethylammonium salt.

Summenformel: C₁₀H₁₁O₆N₅SPBr (MG: 440,12; freie Säure), UV (H₂O):λ_max = 260 nm (ε = 15.000 bei pH 7) FAB-MS (Glycerin):Molecular Formula: C₁₀H₁₁O₆N₅SPBr (MW: 440.12, free acid), UV (H₂O): λ _max = 260 nm (ε = 15,000 at pH 7) FAB-MS (glycerol):

R_P-8-Br-cGMPS S_P-8-Br-cGMPSR _P -8-Br-cGMPS S _P -8-Br-cGMPS

Negative mode
m/z = 228/230 (20%: Base -H)⁻ m/z = 228/230 (10%: Base -H)⁻
m/z = 360 (30%: M- Br -H)⁻ m/z = 360 (20%: M-Br-H)⁻
m/z = 438/440 (60%: M-H)⁻ m/z = 438/440 (35%: M-H)⁻Negative mode
m / z = 228/230 (20%: base -H) ⁻ m / z = 228/230 (10%: base -H) ⁻
m / z = 360 (30%: M-Br-H) ⁻ m / z = 360 (20%: M-Br-H) ⁻
m / z = 438/440 (60%: MH) ⁻ m / z = 438/440 (35%: MH) ⁻

Positive mode
m/z = 440/442(1%: M+M)⁺ m/z = 440/442(1%: M+H)⁺
¹H-NMR (DMSO-d₈/TMS):
R_P-8-Br-cGMPS: δ = 5,97 ppm (s: H1′) S_P-8-Br-cGMPS: δ = 5,98 ppm (s:H1′)
³¹P-NMR (MeOH/H₃PO₄):
R_P-8-Br-cGMPS: δ = 58,5 ppm S_P-8-Br-cGMPS: δ = 56,3 ppmPositive mode
m / z = 440/442 (1%: M + M) ⁺ m / z = 440/442 (1%: M + H) ⁺
1 H-NMR (DMSO-d₈ / TMS):
R _P -8-Br-cGMPS: δ = 5.97 ppm (s: H1 ') S _P -8-Br-cGMPS: δ = 5.98 ppm (s: H1')
31 P-NMR (MeOH / H₃PO₄):
R _P -8-Br-cGMPS: δ = 58.5 ppm S _P -8-Br-cGMPS: δ = 56.3 ppm

Lipophile Bestimmung:
R_P-8-Br-cGMPS: Log K_w = 1,31 S_P-8-Br-cGMPS: Log K_w = 1,39.Lipophilic determination:
R _P -8-Br-cGMPS: Log K _w = 1.31 S _P -8-Br-cGMPS: Log K _w = 1.39.

Biological measurements

R_P-8-Br-cGMPS erweist sich als Antagonist der cGK mit einer Inhi bitionskonstante von K_i = 4 µM.R _P -8-Br-cGMPS proves to be an antagonist of the cGK with an inhibition constant of K _i = 4 μM.

An der cAMP-abhängigen Proteinkinase II zeigt die Verbindung erst bei hohen Konzentrationen partielle agonistische Eigen schaften (K_a = 60 µM).On cAMP-dependent protein kinase II, the compound shows partial agonistic properties only at high concentrations (K _a = 60 μM).

R_P-8-Br-cGMPS hemmt die Phosphorylierung einer 46/50 kDa-Bande in humanen Thrombozytenmembranen.R _P -8-Br-cGMPS inhibits the phosphorylation of a 46/50 kDa band in human platelet membranes.

Die cAMP-abhängige Phosphorylierung der 22 bzw. 240 kDa-Banden wird nicht beeinflußt.The cAMP-dependent phosphorylation of the 22 and 240 kDa bands, respectively is not affected.

S_P-8-Br-cGMPS ist im Vergleich zu cGMP ein geringfügig schlech terer Aktivator der cGK und kann auch die cAK II bei ähnlicher Konzentration aktivieren.S _P -8-Br-cGMPS is a slightly lower activator of cGK than cGMP and can also activate cAK II at a similar concentration.

example 1 Cyclic 8- (4-chlorophenylthio) guanosine 3 ', 5'-monophosphoroethioate R _P diastereomer (R _P -8-pCPT-cGMPS)

Die Synthese der Verbindung erfolgt entweder durch Substitution des in 8-Position halogenierten cGMPS-Derivats (R_P-8-Chlor/Brom cGMPS) mit 4-Chlorthiophenol (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) oder durch Cyclothiophosphorylierung des durch Substitution von 8-Bromguanosin mit 4-Chlorthiophenol gewonnenen 8-(4-Chlorophenylthio)-guanosin (Genieser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988)). Präparative Chromatographie an Rp-18 Re versed Phase-Kieselgel (Laufmittel: 30% Methanol/100 mM Triethyl ammoniumformiat-Puffer) und Lyophilisieren der vereinigten pro dukthaltigen Fraktionen ergibt das Produkt, das gegebenenfalls durch erneute Chromatographie unter denselben Bedingungen weiter aufgereinigt wird. Ausbeute: 62% der Theorie (Substitution) bzw. 5% der Theorie (Cyclothiophosphorylierung), (jeweils als Triethylammoniumsalz; Reinheit: < 98% (HPLC)). Das Produkt ent hält keine nachweisbaren Spuren des kinaseaktiven S_P-Diastereo meren S_P-8-pCPT-cGMPS und weniger als 0.05% 8-pCPT-cGMP.The synthesis of the compound is carried out either by substitution of the 8-position halogenated cGMPS derivative (R _P -8-chloro / bromo cGMPS) with 4-chlorothiophenol (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) or by Cyclothiophosphorylation of 8- (4-chlorophenylthio) guanosine obtained by substitution of 8-bromoguanosine with 4-chlorothiophenol (Genieser et al., Tetrahedron Lett. 29, 2803 (1988)). Preparative chromatography on Rp-18 Re versed phase silica gel (eluent: 30% methanol / 100 mM triethyl ammonium formate buffer) and lyophilization of the combined product-containing fractions gives the product, which is optionally further purified by rechromatography under the same conditions. Yield: 62% of theory (substitution) or 5% of theory (cyclothiophosphorylation), (in each case as triethylammonium salt, purity: <98% (HPLC)). The product contains no detectable traces of kinase-active S _P -diastereo mers S _P -8-pCPT-cGMPS and less than 0.05% 8-pCPT-cGMP.

Summenformel:Molecular formula: C₁₆H₁₅O₆N₅S₂PCl (MG: 503.9; freie Säure)C₁₆H₁₅O₆N₅S₂PCl (MW: 503.9, free acid) UV: (H₂O):UV: (H₂O): λ_max = 276 nm (ε = 21.500 bei pH 7).λ _max = 276 nm (ε = 21,500 at pH 7). FAB- MS (Glycerin): @FAB-MS (glycerol): @ Negative modeNegative mode m/z = 292 (10%: Base -H)⁻m / z = 292 (10%: base -H) ⁻ m/z = 502 (55%: M-H)⁻m / z = 502 (55%: M-H) ⁻ m/z = 594 (35%: M-H+ Gly)⁻m / z = 594 (35%: M-H + Gly) ⁻ Positive modePositive mode m/z = 294 (30%: B + H)⁺m / z = 294 (30%: B + H) ⁺ m/z = 504 (15%: M + H)⁺m / z = 504 (15%: M + H) ⁺ m/z = 526 (20%: M+Na)⁺m / z = 526 (20%: M + Na) ⁺ m/z = 548 (20%: M + 2Na)⁺m / z = 548 (20%: M + 2Na) ⁺ ¹H-NMR (DMSO-d₆/TMS):1 H-NMR (DMSO-d₆ / TMS): δ = 5,85 ppm (s: H1′)δ = 5.85 ppm (s: H1 ') ³¹P-NMR (MeOH/H₃PO₄):31 P-NMR (MeOH / H₃PO₄): δ = 58,4 ppm.δ = 58.4 ppm.

Biological properties

R_P-8-pCPT-cGMPS erweist sich als Antagonist der cGK mit einer Inhibitionskonstante von K_i = 0,7 µM, an der cAMP-abhängigen Kinase zeigt die Verbindung erst bei hohen Konzentrationen schwache agonistische Eigenschaften (400 µM).R _P -8-pCPT-cGMPS proves to be an antagonist of cGK with an inhibition constant of K _i = 0.7 μM; on cAMP-dependent kinase, the compound shows weak agonistic properties (400 μM) only at high concentrations.

R_P-8-pCPT-cGMPS hemmt die Phosphorylierung einer 46/50 kDa-Bande in humanen Thrombozytenmembranen, die cAMP-abhängige Phosphory lierung der 22 bzw. 240 kDa-Banden wird nicht beeinflußt.R _P -8-pCPT-cGMPS inhibits the phosphorylation of a 46/50 kDa band in human platelet membranes, the cAMP-dependent phosphorylation of the 22 and 240 kDa bands is not affected.

Die Verbindung ist ausreichend membrangängig und hemmt die cGK Phosphorylierung in intakten humanen Thrombozyten. The compound is sufficiently membranous and inhibits the cGK Phosphorylation in intact human platelets.

Example 2 (Submitted, received on 30.6.97) Cyclic 8- (4-chlorophenylthio) guanosine 3 ', 5'-monophosphorothioate, R _P - / S _P - diastereomer (R _P - / S _P -8-pCPT-CGMPS)

Die Synthese der Verbindung erfolgt entweder durch Substitution des in 8-Position halogenierten cGMPS-Derivats (R_P-8-Cl/Br cGMPS) mit 4-Chlorthiophenol (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) oder durch Cyclothiophosphorylierung des durch Substitution von 8-Bromguanosin mit 4-Chlorthiophenol ge wonnenen 8-(4-Chlorophenylthio)-guanosin (Genieser et al., Te trahedron Lett., 29, 2803 (1988)). Präparative Chromatographie an Rp-18 Reversed Phase - Kieselgel (Laufmittel: 30% Methanol/ 100 mM Triethylammoniumformiat Puffer) und Lyophilisieren der vereinigten produkthaltigen Fraktionen ergibt die beiden diaste reomeren Produkte, die gegebenenfalls durch erneute Chromatogra phie unter denselben Bedingungen weiter aufgereinigt werden. Ausbeute: 62% der Theorie (Substitution) bzw. 5% der Theorie (Cyclothiophosphorylierung) für beide Isomere, (jeweils als Triethylammoniumsalz; Reinheit 98% (HPLC)). R_P-8-pCPT-cGMPS ent hält keine nachweisbaren Spuren des kinaseaktiven S_P-Diastereo meren S_P-8-pCPT-cGMPS und weniger als 0.05% 8-pCPT-cGMP. S_P-8-pCPT-cGMPS enthält keine nachweisbaren Spuren des R_P-Diastereo meren R_P-8-pCPT-cGMPS und weniger als 0.05% an 8-pCPT-cGMP.The synthesis of the compound is carried out either by substitution of the 8-position halogenated cGMPS derivative (R _P -8-Cl / Br cGMPS) with 4-chlorothiophenol (Miller et al., Biochemistry 12, 5310-5319 (1973)) or by Cyclothiophosphorylation of 8- (4-chlorophenylthio) -guanosine obtained by substitution of 8-bromoguanosine with 4-chlorothiophenol (Genieser et al., Te trahedron Lett., 29, 2803 (1988)). Preparative chromatography on Rp-18 reversed phase silica gel (eluent: 30% methanol / 100 mM triethylammonium formate buffer) and lyophilization of the combined product-containing fractions gives the two diaste monomeric products, which are optionally further purified by re Chromatogra phie under the same conditions. Yield: 62% of theory (substitution) or 5% of theory (cyclothiophosphorylation) for both isomers (each as triethylammonium salt, purity 98% (HPLC)). R _P -8-pCPT-cGMPS contains no detectable traces of kinase-active S _P -diastereo mers S _P -8-pCPT-cGMPS and less than 0.05% 8-pCPT-cGMP. S _P -8-pCPT-cGMPS contains no detectable traces of R _P -diastereo mers R _P -8-pCPT-cGMPS and less than 0.05% of 8-pCPT-cGMP.

Summenformel:Molecular formula: C₁₆H₁₅O₆N₅S₂PCl (MG: 503.9; freie Säure)C₁₆H₁₅O₆N₅S₂PCl (MW: 503.9, free acid) UV: (H₂O):UV: (H₂O): λ_max = 276 nm (ε = 21500 bei pH 7).λ _max = 276 nm (ε = 21,500 at pH 7). FAB-MS (Na-Salz in Glycerin): @FAB-MS (Na salt in glycerol): @ R_P-8-pCPT-cGMPSR _P -8-pCPT-cGMPS S_P-8-pCPT-cGMPSS _P -8-pCPT-cGMPS Negative mode @Negative mode @ m/z = 292 (10%: Base-H)⁻m / z = 292 (10%: base H) ⁻ m/z = 292 (10%: Base-H⁻)m / z = 292 (10%: base H⁻) m/z = 502 (55%: M-H)⁻m / z = 502 (55%: M-H) ⁻ m/z = 502 (30%: M-H⁻)m / z = 502 (30%: M-H⁻) m/z = 594 (35%: M-2H+ Gly)⁻m / z = 594 (35%: M-2H + Gly) ⁻ m/z = 524 (10%: M-2H + Na)⁻m / z = 524 (10%: M-2H + Na) ⁻ Positive mode @Positive mode @ m/z = 294 (30%: B + H)⁺m / z = 294 (30%: B + H) ⁺ m/z = 504 (1%: M+H)⁺m / z = 504 (1%: M + H) ⁺ m/z = 504 (15%: M + H)⁺ @m / z = 504 (15%: M + H) ⁺ @ m/z = 526 (20%: M + Na)⁺ @m / z = 526 (20%: M + Na) ⁺ @ m/z = 548 (20%: M + 2Na)⁺ @m / z = 548 (20%: M + 2Na) ⁺ @ ¹H-NNR (DMSO-D₆/TMS): @1 H-NNR (DMSO-D₆ / TMS): @ R_P-8-pCPT-GMPS:R _P -8-pCPT-GMPS: δ = 5.85 ppm (s: H1′)δ = 5.85 ppm (s: H1 ') S_P-8-pCPT-cGMPS:S _P -8-pCPT-cGMPS: δ = 5.89 ppm (s: H1′)δ = 5.89 ppm (s: H1 ') ³¹P-NMR (NeOH/H₃PO₄): @31 P-NMR (NeOH / H₃PO₄): @ R_P-8-pCPT-cGMPS:R _P -8-pCPT-cGMPS: δ = 58.4 ppmδ = 58.4 ppm S_P-8-pCPT-cGMPS:S _P -8-pCPT-cGMPS: δ = 56.5 ppmδ = 56.5 ppm Lipophilie-Bestimmung: @Lipophilicity determination: @ R_P-8-pCPT-cGMPS:R _P -8-pCPT-cGMPS: Log K_w = 2.82Log K _w = 2.82 S_P-8-pCPT-cGMPS:S _P -8-pCPT-cGMPS: Log K_w = 2.84.Log K _w = 2.84.

Biological properties

R_P-8-pCPT-cGMPS erweist sich als kommpetitiver Inhibitor der cGK mit einer Inhibitionskonstante Kⁱ von 0,7 µM, an der cAMP-ab hängigen Kinase zeigt die Verbindung erst bei hohen Konzentra tionen schwache agonistische Eigenschaften (400 µM). Rp-8-pCPT-cGMPS hemmt die Phosphorylierung einer 46/50 kDa-Bande in huma nen Thrombozytenmembranen, die cAMP-abhängige Phosphorylierung der 22- bzw. 240 kDa-Banden wird nicht beeinflußt. Die Verbin dung ist ausreichend membrangängig und hemmt die cGK Phosphory lierung in intakten humanen Thrombozyten. Sp-8-pCPT-cGMPS ist ausreichend membrangängig und ein Aktivator sowohl für isolierte cGK als auch für die cGMP-abhängige Phosphorylierung in intakten humanen Thrombozyten. Beide Verbindungen werden nicht von Ca/ Calmodulin-abhängiger Phosphodiesterase abgebaut. R _P -8-pCPT-cGMPS proves to be a cPK inhibitory inhibitor with an inhibition constant K ⁱ of 0.7 μM; the cAMP-dependent kinase shows weak agonistic properties only at high concentrations (400 μM). Rp-8-pCPT-cGMPS inhibits the phosphorylation of a 46/50 kDa band in human platelet membranes, the cAMP-dependent phosphorylation of the 22 and 240 kDa bands is not affected. The compound is sufficiently membranous and inhibits cGK phosphorylation in intact human platelets. Sp-8-pCPT-cGMPS is sufficiently membrane-permeable and an activator for both isolated cGK and cGMP-dependent phosphorylation in intact human platelets. Both compounds are not degraded by Ca / calmodulin-dependent phosphodiesterase.

Reference Example 2 Immobilization of R _P -8-Br-cGMPS to a Support Material for Affinity Chromatography

200 ml Fraktogel TSK AF Amino 650® (Merck) werden in einer Glas sinterfritte mit Wasser gewaschen und anschließend in einem 250 ml 2-Halskolben in 100 ml Natriumacetatpuffer (20 mM) sus pendiert. 280 mg R_P-8-Br-cGMPS (500 µmol Triethylammoniumsalz) werden hinzugefügt und die Suspension bei 80°C unter Rückfluß kühlung mäßig gerührt. Die Abnahme an nicht umgesetzten R_P-8-Br-cGMPS wird mit Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie kontrol liert (Rp-18, 10% Methanol/100 mM Triethylammoniumformiatpuf fer). Nach 48 Stunden wird die Suspension filtriert, der Rück stand mit Wasser bis zur Absorptionskonstanz bei 260 nm gewa schen und mit 1 mM Natriumacid gegen mikrobiellen Befall ge schützt. 200 ml of Fraktogel TSK AF Amino 650® (Merck) are washed with water in a sintered glass frit and then suspended in 100 ml of sodium acetate buffer (20 mM) in a 250 ml 2-necked flask. 280 mg of R _P -8-Br-cGMPS (500 .mu.mol of triethylammonium salt) are added and the suspension is stirred moderately at 80.degree. C. under reflux. The decrease in unreacted R _P -8-Br-cGMPS is controlled by high pressure liquid chromatography (Rp-18, 10% methanol / 100 mM triethylammonium formate buffer). After 48 hours, the suspension is filtered, the residue was washed with water to constant absorption at 260 nm and protected with 1 mM sodium azide against microbial infestation ge.

Comparative tests (Submitted, received on 30.6.97) Use of the compound of the invention in the thrombosis for research

R_P-8-pCPT-cGMPS ist ein kompetitiver Inhibitor (ki = 0,5 µM) der cGMP- abhängigen Proteinkinase (Fig. 1). Zum Vergleich sind die Inhi bitionskonstanten anderer getesteter Cyclonukleotide in der folgenden Tabelle gezeigt. Es ist ersichtlich, daß die Wirksam keit und die Selektivität von R_P-8-pCPT-cGMPS erheblich größer ist als für R_P-cGMPS. In Übereinstimmung mit früheren Untersu chungen führt die Aktivität der cAMP-abhängigen Proteinkinase in Thrombozytenmembranen durch cAMP zu einer Phosphorylierung von spezifischen Substratproteinen mit den Massen 22, 24, 50, 68, 130 und 240 kDa (Fig. 2). Im Gegensatz dazu erzeugt cGMP über die Aktivität der cGMP-abhängigen Proteinkinase die Phosphory lierung von drei Proteinen der Massen 46, 50 und 130 kDa (Fig. 2). Eine Präinkubation der Thrombozytenmembranen mit R_P-8-pCPT-cGMPS inhibierte die cGMP-stimulierte Phosphorylierung des 46 kDa Proteins bei 10 µM während die cAMP-abhängige Phosphory lierung bis hinauf zu 100 µM kaum beeinflußt wurde (Fig. 2). R _P -8-pCPT-cGMPS is a competitive inhibitor (ki = 0.5 μM) of the cGMP-dependent protein kinase ( Figure 1). For comparison, the inhibition constants of other cyclonucleotides tested are shown in the following table. It can be seen that the potency and selectivity of R _P -8-pCPT-cGMPS is significantly greater than for R _P -cGMPS. Consistent with previous studies, cAMP-dependent protein kinase activity in platelet membranes by cAMP results in phosphorylation of specific substrate proteins of masses 22, 24, 50, 68, 130, and 240 kDa ( Figure 2). In contrast, cGMP via the activity of the cGMP-dependent protein kinase produces the phosphorylation of three proteins of masses 46, 50 and 130 kDa ( FIG. 2). Preincubation of the platelet membranes with R _P -8-pCPT-cGMPS inhibited cGMP-stimulated phosphorylation of the 46 kDa protein at 10 μM while cAMP-dependent phosphorylation was scarcely affected up to 100 μM ( Figure 2).

Tabelle table

Die Inhibition der Thrombozytenmembranen durch den cGMP-Spiegel erhöhende Substanzen wie Natriumnitroprussid (SNP) oder durch den cAMP-Spiegel erhöhende Verbindungen wie etwa Prostacyclin (PG-E₁) wird der Beteiligung von cGK bzw. cAK zugeschrieben. Eines der Hauptsubstrate für Proteinkinasen in intakten mensch lichen Thrombozyten ist das 46/50 kDa Protein, das auch VASP genannt wird. Die Phosphorylierung von VASP durch cGK bzw. cAK zu einer Verschiebung der Molekülmasse auf dem Gel von 46 zu 50 kDa.The inhibition of platelet membranes by the cGMP level increasing substances such as sodium nitroprusside (SNP) or by cAMP level enhancing compounds such as prostacyclin (PG-E₁) is attributed to the involvement of cGK or cAK. One of the main substrates for protein kinases in intact human platelets is the 46/50 kD protein, which is also VASP is called. Phosphorylation of VASP by cGK or cAK to a shift in molecular weight on the gel from 46 to 50 kDa.

Um den inhibitorischen Effekt von R_P-8-pCPT-cGMPS in intakten Zellsystem zu ermitteln, wurden gewaschene, menschliche Thrombo zyten mit R_P-8-pCPT-cGMPS (1 mM) vorbehandelt und mit 0,2 mM des zellmembran-gängigen cGK-spezifischen Aktivator 8-pCPT-cGMP stimuliert. Während Präparationen ohne den Inhibitor etwa 40% Umwandlung von VASP mit 46 kDa zu 50 kDa zeigten, gab es keine Veränderung bei Anwesenheit von R_P-8-pCPT-cGMPS (Fig. 3), was auf eine Inhibierung der cGK im letzteren Fall schließen läßt.To assess the inhibitory effect of R _P -8-pCPT-cGMPS in intact cell systems, washed human thrombocytes were pretreated with R _P -8-pCPT-cGMPS (1 mM) and 0.2 mM of the cell membrane-common cGK -specific activator 8-pCPT-cGMP stimulated. While preparations without the inhibitor showed about 40% conversion of 46 kDa to 50 kDa VASP, there was no change in the presence of R _P -8-pCPT-cGMPS ( Figure 3), suggesting inhibition of cGK in the latter case leaves.

Im Gegensatz dazu führt die Stimulation mit einem spezifischen cAK-Aktivator (S_P-5,6-DCl-cBIMPS, 0,1 mM) oder mit dem cAMP erhöhenden PG-E₁ (1 µM) innerhalb von 10 Minuten zu 60% bzw. 100% Umwandlung von VASP in die 50 kDa Form, gleichgültig, ob R_P-8-pCPT-cGMPS anwesend ist oder nicht (Fig. 3 B und C).In contrast, the stimulation with a specific cAK activator (S _P -5,6-DCl-cBIMPS, 0.1 mM) or cAMP-enhancing PG-E₁ (1 μM) within 60 minutes leads to 60% or 100% conversion of VASP to the 50 kDa form, whether R _P -8-pCPT-cGMPS is present or not ( Figures 3 B and C).

Effect of cyclonucleotides on phosphodiesterases

R_P-8-pCPT-cGMPS wurde in einer Studie auf seine Eigenschaften als Inhibitor verschiedener Phosphodiesterasen (PDE) hin untersucht. Da Cyclonukleotid-abhängige Phosphodiesterasen für den Abbau von cAMP und cGMP in der Zelle verantwortlich sind, führt eine Stimulation oder Inhibition dieser Enzyme ebenfalls zu einer Beeinflussung des Signalübertragungsweges. Besonders die cGMP- inhibierte PDE (cGI-PDE) ist hier interessant, da sie, gesteuert durch cGMP, cAMP abgebaut wird und damit zu einer Verzahnung beider Signalwege führt.R _P -8-pCPT-cGMPS was evaluated in a study for its properties as an inhibitor of various phosphodiesterases (PDE). Since cyclonucleotide-dependent phosphodiesterases are responsible for the degradation of cAMP and cGMP in the cell, stimulation or inhibition of these enzymes also affects the signal transduction pathway. In particular, the cGMP-inhibited PDE (cGI-PDE) is of interest because it is degraded by cGMP, cAMP and thus leads to a dovetailing of both signaling pathways.

Die erfindungsgemäße Verbindung R_P-8-pCPT-cGMPS hemmt die cGMP- inhibierte PDE (cGI-PDE) schlecht, im Gegensatz zu der bereits bekannten Verbindung 8-pCPT-cGMP. Eine ungehemmte cGI-PDE bleibt aber für die natürliche Regulation des cAMP-Spiegels verfügbar und ist somit vorteilhaft.The compound R _P -8-pCPT-cGMPS according to the invention poorly inhibits the cGMP-inhibited PDE (cGI-PDE), in contrast to the already known compound 8-pCPT-cGMP. However, an unrestrained cGI-PDE remains available for the natural regulation of the cAMP level and is thus advantageous.

cGI-PDE (0,03 µM)cGI-PDE (0.03 μM) Derivatederivatives I_c50-Werte in µMI _c 50 values in μM cGMPcGMP 0,010.01 cAMPcAMP 11 6-SH-cGMP6-SH-cGMP 0,50.5 1-CH₃-cGMP1-CH₃-cGMP 0,20.2 8-Cl-cGMP8-Cl-cGMP 2525 8-Br-cGMP8-Br-cGMP 2727 8-CH₃-cGMP8-CH₃-cGMP 4040 8-pCPT-cGMP8-pCPT-cGMP 3535 R_p-8-pCPT-cGMPR _p -8-pCPT-cGMP 200200

Claims

1. guanosine-3 ', 5'-phosphorothioate of the general formula I. in the
R¹ and R² are hydrogen and X is the 4-chlorophenylthio radical, or the general formula II in the X -Br is,
Kat⁺ is a proton, a physiologically acceptable metal cation or a trialkylammonium ion.

2. Compounds according to claim 1, characterized in that the sulfur atom of the Thiophosphatrests is in equatorial position (R _P isomers).

3. Compounds according to claim 1, characterized in that the sulfur atom of the Thiophosphatrests in axial posi tion is (S _P isomers).

4. Compounds according to claims 1 to 3, characterized in that Kat⁺ Na⁺, K⁺, Li⁺, ½ Ca ²⁺ or ½ Mg ²⁺ is.

5. Use of compounds according to claim 2 or R _p- konfi gurierten compounds according to claim 4 as inhibitors of cGMP-dependent protein kinases.

6. Use of compounds according to claim 3 or S _P- konfi gurierten compounds according to claim 4 as activators cGMP-dependent protein kinases.

7. Use of compounds according to claims 1 to 4 as enzymatically hydrolysis-resistant ligands in the liquid keits- or affinity chromatography or for the preparation of stationary phases for the fluid or affini Chromatography, wherein the compounds to a insoluble polymeric matrix of silica gel, glass, silicone polymers, Polyacrylamide, polystyrene, ethylene glycol-methacrylic acid Copolymer, agarose, cellulose or dextran are bound and the matrix suitable spacers for binding ligands wearing.