DE4203315A1

DE4203315A1 - Recovery of pancreatin from aq. pancreas tissue suspension autolysate(s) - by cross-current ultrafiltration to give retentate enriched in amylase, lipase and protease which is then spray dried

Info

Publication number: DE4203315A1
Application number: DE19924203315
Authority: DE
Inventors: Kurt Chodzinski; Helmer Rasche; Reimar Musall; Monika Grossmann
Original assignee: Kali Chemie Pharma GmbH
Current assignee: Abbott Products GmbH
Priority date: 1991-02-14
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 1992-08-20

Abstract

Process comprises sepns. an autolysate of pH 6.5-8.0 and dry substances content 3-30 wt.% into a retentate which, compared to the autolysate, is enriched in enzymatically active dry substance components and is depleted in non-enzymatically active dry substance components and permeate, then drying the retentate. Sepn. is by cross current ultra filtration using a semi-permeable membrane of fluorinated organic polymer membrane material e.g. PTFE and PVDF or inorganic opt. coated membrane of Al203, S.C or C, silicon with a molar mass exclusive limit of 5000-200000 at a transmembrane pressure of 1-7 bar and an axial flow rate of 2-8 m/s. USE/ADVANTAGE - Facilitates the recovery of pancreatia from pancreas gland tissue which can then be used as a pharmaceutical for the treatment of digestive disorders in cases of pancreas insufficiency. Process is simple and effective and give high yields of pancreatia of higher enzymatic activity which is free from inactive pancreas tissue comp

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von Pankreatin aus Pankreas-Drüsengewebe.The present invention relates to the extraction of Pancreatin from pancreatic tissue.

Als Pankreatin werden aus Pankreas-Drüsen von Säuge tieren stammende Enzymgemische mit amylolytischer, lipoly tischer sowie proteolytischer Aktivität bezeichnet. Pankrea tin kann als Arzneimittelwirkstoff zur Behandlung von Ver dauungsstörungen bei Pankreas-Insuffizienz eingesetzt wer den. Das Pankreatin wird aus Pankreas-Drüsengewebe insbeson dere von Schweinen und Rindern gewonnen. Aufgrund der ähn lichen Zusammensetzung von Schweinepankreatin und mensch lichen Pankreassekret dienen zur Herstellung von pharmazeu tisch verwendetem Pankreatin als Ausgangsmaterial gewöhnlich Schweinepankreas-Drüsen, die fast ausschließlich in Groß schlachthöfen gesammelt werden. Heute werden die Schlacht tiere in der Massentierhaltung zunehmend bei fettarmer Schweinemast gehalten. Dadurch ist der Enzymgehalt im Schweinepankreas-Gewebe im Verlauf der letzten Jahre stetig gesunken. Daher wird mit den bisher bekannten Herstellungs verfahren Pankreatin mit immer geringeren Gehalten an enzy matisch aktiven Bestandteilen (Amylasen, Proteasen, Lipasen) erhalten.As pancreatin, pancreas glands become sucked animal-derived enzyme mixtures with amylolytic, lipoly designated as well as proteolytic activity. Pankrea tin can be used as an active pharmaceutical ingredient in the treatment of ver dysfunction of the pancreatic insufficiency the. The pancreatin is made from pancreatic gland tissue in particular obtained from pigs and cattle. Because of the similar composition of pig pancreatin and human Pancreatic secretions are used to manufacture pharmazeu Table pancreatin usually used as a starting material Porcine pancreas, almost exclusively in large slaughterhouses are collected. Today the battle animals in factory farming are increasingly low in fat Pig feed kept. As a result, the enzyme content in the Porcine pancreatic tissue has been steadily increasing over the past few years sunk. Therefore, with the previously known manufacturing process pancreatin with ever lower levels of enzy matically active ingredients (amylases, proteases, lipases) receive.

Zur Gewinnung von Pankreatin wird üblicherweise Pan kreasgewebe von Rindern oder Schweinen vorzugsweise in gefrorenem Zustand gemahlen, mit Wasser versetzt, die erhal tene Gewebesuspension entfettet und einer Reifung überlas sen. Während dieses Reifungsprozesses findet eine Autolyse statt, bei der Proteine und Gewebereste zu Peptiden und Aminosäuren abgebaut werden. Aus dem Autolysat wird an schließend das Pankreatin z. B. durch Sprühtrocknung gewon nen. Das aus dem Autolysat abgetrennte Pankreatin enthält neben enzymatisch aktiven Bestandteilen auch noch enzyma tisch inaktive Bestandteile wie Gewebefasern, bei der Auto lyse freigesetzte inaktive Proteinfragmente, kleinere Pep tide und Aminosäuren. Die enzymatische Aktivität des End produktes pro Gewichtseinheit wird durch derartige Nebenbe standteile stark herabgesetzt. Bei Pankreasdrüsen-Ausgangs material, das auf Grund der geänderten Mastbedingungen immer weniger Pankreatin enthält, wirkt sich dieser Umstand besonders nachteilig aus. Es ist daher wünschenswert, ein Pankreatin-Produkt mit möglichst geringem Gehalt an Neben bestandteilen zu gewinnen. Zu diesem Zweck ist bereits vor geschlagen worden, aus dem Autolysat mit Hilfe eines orga nischen Lösungsmittels eine enzymreiche Fraktion auszufäl len, abzutrennen und zu trocknen. Derartige Verfahren haben den Nachteil, daß mehrere Verfahrensschitte (Mischen, Sedi mentieren, Filtrieren, Waschen, usw.) mit z. T. hohem tech nischem Aufwand erforderlich sind und ein kontinuierliches Verfahren schwer zu realisieren ist. Bei einer anschließen den Trocknung können zudem von nicht vollständig entfernten Resten des als Fällungsreagenz eingesetzten organischen Lösungsmittels Explosionsgefahren ausgehen.Pan is usually used to obtain pancreatin cattle or pork tissues preferably in frozen state ground, mixed with water, the obtained The tissue suspension is degreased and left to mature sen. Autolysis takes place during this ripening process instead, where proteins and tissue residues become peptides and Amino acids are broken down. The autolysate becomes closing the pancreatin z. B. won by spray drying nen. The pancreatin separated from the autolysate contains in addition to enzymatically active ingredients, also enzyma table inactive components such as fabric fibers, in the car lysis released inactive protein fragments, smaller pep tide and amino acids. The enzymatic activity of the end Product per unit weight is by such Nebenbe components greatly reduced. With pancreatic gland output material due to the changed mast conditions This fact affects less and less pancreatin particularly disadvantageous. It is therefore desirable to have one Pancreatin product with the lowest possible level of secondary components to win. For this purpose is already in front been beaten out of the autolysate with the help of an orga African solvent to precipitate an enzyme-rich fraction len, separate and dry. Such procedures have the disadvantage that several process steps (mixing, Sedi ment, filter, wash, etc.) with z. T. high tech nical effort are required and a continuous Procedure is difficult to implement. Connect to one drying can also be removed from incompletely removed Remains of the organic used as a precipitation reagent Solvent explosion hazard.

Aufgabe der Erfindung war es, ein einfaches und mög lichst effektives Verfahren zu finden, nach dem sich Pankre atin in hoher Ausbeute, mit hoher enzymatischer Aktivität und weitgehend frei von inaktiven Pankreasgewebebestand teilen gewinnen läßt.The object of the invention was to make it simple and possible to find the most effective method according to which Pankre atin in high yield, with high enzymatic activity and largely free of inactive pancreatic tissue share wins.

Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von Pankrea tin aus einem wäßrigen Autolysat einer Pankreasgewebesuspen sion gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein auf einen pH-Wert von 6,5 bis 8,0 und einen Trockensubstanz gehalt von 3 bis 30 Gew.-% eingestelltes Autolysat durch eine Querstrom-Ultrafiltration unter Verwendung einer semi permeablen Membran, bestehend aus fluoriertem organischen Polymembranmaterial aus der Gruppe Polytetrafluorethylen (PTFE) und Polyvinylidenfluorid (PVDF) oder anorganischem gegebenenfalls beschichteten Membranmaterial aus der Gruppe Aluminiumoxid, Siliciumcarbid und Kohlenstoff, mit einer Molmassenausschlußgrenze im Bereich von 5000 bis 200 000 bei einem transmembralen Druck von 1 bis 7 bar und einer axialen Strömungsgeschwindigkeit von 2 bis 8 m/s in ein gegenüber dem Autolysat an enzymatisch aktiven Trockensub stanzbestandteilen angereichertes und an nicht enzymatisch aktiven Trockensubstanzbestandteilen abgereichertes Retentat und ein Permeat trennt, und das Retentat trocknet.There has now been a process for obtaining pancreas tin from an aqueous autolysate of a pancreatic tissue specimen sion found, which is characterized in that one to a pH of 6.5 to 8.0 and a dry substance content of 3 to 30% by weight of autolysate cross-flow ultrafiltration using a semi permeable membrane consisting of fluorinated organic Polymembrane material from the group polytetrafluoroethylene (PTFE) and polyvinylidene fluoride (PVDF) or inorganic optionally coated membrane material from the group Alumina, silicon carbide and carbon, with one Molecular mass exclusion limit in the range from 5000 to 200,000 at a transmembral pressure of 1 to 7 bar and one axial flow velocity from 2 to 8 m / s in one compared to the autolysate on enzymatically active dry sub punch components enriched and non-enzymatic active retentate depleted in dry matter and a permeate separates and the retentate dries.

Es ist überraschend, daß eine Querstrom-Ultrafiltra tion zur Auftrennung eines Pankreasgewebeautolysats im Zusammenhang mit der Pankreatin-Gewinnung eingesetzt werden kann. Aufgrund der inhomogenen Zusammensetzung der Autoly satsuspension schien die Gefahr von Verstopfungen der Mem branen als sehr wahrscheinlich und eine kontinuierliche und wirtschaftliche Prozeßführung damit nicht möglich. Auch konnte nicht erwartet werden, daß ein Membrantrennverfahren wie die Ultrafiltration überhaupt ohne größere Verluste an Enzymaktivität für die Aufreinigung eines so hochempfindli chen Enzymgemisches wie Pankreatin durchführbar ist. Dement gegen wurde nun gefunden, daß nach der erfindungsgemäßen Lehre die Querstrom-Ultrafiltration dennoch zur Aufreinigung der enzymatisch aktiven Bestandteile des Pankreatins geeig net ist. Nach der erfindungsgemäßen Lehre wird durch die Querstrom-Ultarafiltration sogar eine überraschend hohe Anreicherung der Enzymaktivität erreicht.It is surprising that a cross-flow ultrafiltra tion for the separation of a pancreatic tissue autolysate in the In connection with the pancreatin extraction can. Due to the inhomogeneous composition of the Autoly satsuspension seemed to risk clogging the mem branches as very likely and a continuous and economic litigation is therefore not possible. Also could not be expected to use a membrane separation process like ultrafiltration at all without major losses Enzyme activity for the purification of such a highly sensitive Chen enzyme mixture such as pancreatin is feasible. Dement against it has now been found that according to the invention Teach cross-flow ultrafiltration for purification of the enzymatically active components of pancreatin is not. According to the teaching of the invention Crossflow Ultarafiltration even a surprisingly high one Enrichment of enzyme activity achieved.

Erfindungsgemäß werden semipermeable Membranen mit einer Molmassenausschlußgrenze von 5000 bis 200 000 ver wendet. Dies entspricht mittleren Porendurchmessern von 1 nm bis 50 nm. Häufig werden Membranen mit Molmassenaus schlußgrenzen von 10 000 bis 20 000 eingesetzt.According to the invention, semipermeable membranes are used a molecular weight exclusion limit of 5000 to 200,000 ver turns. This corresponds to average pore diameters of 1 nm to 50 nm. Often membranes are made with molecular weights final limits of 10,000 to 20,000 are used.

Pankreatin enthält als enzymatisch aktive Komponenten Lipase, Amylase und Protease, welche sich in ihren Moleku largewichten voneinander unterscheiden. Je nach Trennbereich der eingesetzten Membran können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in dem Retentat alle im Ausgangsautolysat enthal tenen Enzyme gleichermaßen zurückgehalten und angereichert werden, oder es können selektiv in dem Retentat nur Lipase oder auch Lipase und gegebenenfalls Amylase weitgehend zurückgehalten und angereichert werden.Pancreatin contains enzymatically active components Lipase, amylase and protease, which are in their molecule Differentiate lar weights from each other. Depending on the separation area the membrane used can according to the invention Procedures in the retentate all included in the starting autolysate enzymes are equally retained and enriched or only lipase can be selectively in the retentate or also largely lipase and optionally amylase withheld and enriched.

So eignen sich zur Herstellung von Produkten, in wel chen alle drei vorgenannten Enzyme gegenüber der Zusammen setzung des Trockensubstanzgehaltes des Ausgangsautolysats gleichermaßen angereichert sind, Membranen mit mittleren Molmassenausschlußgrenzen von vorzugsweise unter 20 000, insbesondere im Bereich von 10 000 bis 20 000. Zur Herstel lung von Produkten, in welchen nur der Proteasegehalt im Verhältnis zu den anderen beiden Enzymen abgereichert ist, eignen sich Membranen mit Molmassenausschlußgrenzen im Bereich von 20 000 bis 50 000. Zur Herstellung von Produk ten, in welchen selektiv Lipase im Verhältnis zu den anderen Enzymen angereichert ist, eignen sich Membranen mit Molmas senausschlußgrenzen ab 50 000, insbesondere im Bereich von 50 000 bis 200 000. So lassen sich mit Hilfe des erfindungs gemäßen Verfahrens Endprodukte mit unterschiedlich abge stimmter Lipase-, Protease- bzw. Amylase-Aktivität herstel len. Hier liegt ein wesentlicher Vorteil des erfindungsge mäßen Verfahrens gegenüber den herkömmlichen Herstellungs verfahren, die keine derartige Variation bezüglich der ein zelnen Aktivitäten der Enzymbestandteile des Pankreatin- Präparates gestatten.So are suitable for the production of products in which Chen all three of the above enzymes compared to the total setting the dry matter content of the starting autolysate are equally enriched, membranes with medium Molar mass exclusion limits of preferably less than 20,000 especially in the range of 10,000 to 20,000 development of products in which only the protease content in the Relationship with the other two enzymes is depleted, membranes with molecular weight exclusion limits are suitable Range from 20,000 to 50,000. For the production of produc in which selectively lipase in relation to the others Enriched with enzymes, membranes with molmas are suitable Exclusion limits from 50,000, especially in the range of 50,000 to 200,000. So with the help of the Invention according process end products with different abge produce certain lipase, protease or amylase activity len. Here is a major advantage of the fiction method compared to conventional manufacturing procedures that have no such variation with respect to the one individual activities of the enzyme components of the pancreatin Allow preparation.

Durch die Wahl von Membranen unterschiedlicher Molmas senausschlußgrenzen können bei der Querstrom-Ultrafiltration auch Unterschiede in der jeweiligen Zusammensetzung der Autolysat-Suspensionen ausgeglichen werden und damit das erfinderische Verfahren auch zur Herstellung einheitlicher Produkte aus durch unterschiedliche Autolyseverfahren erhal tene Autolysate abgestimmt werden. So ermöglicht die Wahl der Membranen die vorteilhafte weite Anwendung des erfin dungsgemäßen Verfahrens. By choosing membranes of different molmas Exclusion limits can be found in cross-flow ultrafiltration also differences in the respective composition of the Autolysate suspensions are compensated for and thus the inventive methods also for producing uniform Products obtained through different autolysis processes autolysates. So the choice allows of the membranes the advantageous wide application of the inventions method according to the invention.

Zusammensetzung und Viskosität der autolysierten Pan kreas-Gewebesuspension können je nach Art des eingesetzten Drüsenmaterials, der Entfettungsmethode und der Autolyse bedingungen variieren. Eine Entfettung der antolysierten Pankreas-Gewebesuspension kann mit Hilfe organischer Lö sungsmittel, insbesondere mit teil- oder vollhalogenierten Kohlenwasserstoffen, durchgeführt werden. Als besonders ge eignet erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Auf arbeitung einer autolysierten Pankreas-Gewebesuspension, die durch Extraktion mit einem Gemisch flüssiger Chlorkohlenwas serstoffe und gegebenenfalls flüssiger Fluorchlorkohlenwas serstoffe entfettet wurde. Beispielsweise kann die Entfet tung des Autolysats vor der Querstrom-Ultrafiltration mit einem Gemisch aus Dichlormethan und 1,1,2-Trichlor-1,2,2- trifluorethan oder mit Dichlormethan erfolgt sein.Composition and viscosity of the autolyzed pan kreas tissue suspension can be used depending on the type Glandular material, the degreasing method and autolysis conditions vary. Degreasing the antolyzed Pancreatic tissue suspension can be removed using organic solvents means, especially with partially or fully halogenated Hydrocarbons. As particularly ge the method according to the invention proves to be suitable working an autolyzed pancreatic tissue suspension, the by extraction with a mixture of liquid chlorinated coal hydrocarbons and possibly liquid chlorofluorocarbons was degreased. For example, the degreasing treatment of the autolysate before cross-flow ultrafiltration a mixture of dichloromethane and 1,1,2-trichloro-1,2,2- trifluoroethane or with dichloromethane.

Der Trockensubstanzgehalt der in die Ultrafiltration eingehenden Autolysatsuspension variiert üblicherweise zwischen 3 bis 30 Gew.-%.The dry matter content in the ultrafiltration incoming autolysate suspension usually varies between 3 to 30% by weight.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Membranen sollten zweckmäßigerweise gegen das zur Entfettung der autolysier ten Pankreas-Gewebesuspension eingesetzte organische Lösungsmittel, wie z. B. Lösungsmittelgemische halogenierter Kohlenwasserstoffe, beständig sein. Geeignete Membranen sind Membranen aus fluorierten organischem Polymermembran material, wie z. B. Polytetrafluorethylen (PTFE) oder Poly vinylidenfluorid (PVDF), oder Membranen aus anorganischem gegebenenfalls beschichteten Membranmaterial, wie z. B. Aluminiumoxid, Siliciumcarbid oder Kohlenstoff. Die Mem branen können dabei eine symmetrische Porenstruktur oder vorzugsweise eine asymmetrische Porenstruktur, z. B. als Composite-Membranen, aufweisen. Das Membranmaterial kann z. B. so beschaffen sein, daß auf einer porösen Träger schicht, die beispielsweise aus Aluminiumoxid, Silicium carbid und/oder Kohlenstoff besteht, eine Metalloxidbe schichtung aufgetragen ist. Beispielsweise können Membranen mit Metalloxidbeschichtungen aus Titandioxid oder Zir koniumdioxid eingesetzt werden. In einer besonders bevor zugten Ausgestaltung wird eine Kohlenstoffmembran mit aktiver ZrO₂-Beschichtung verwendet.The membranes used according to the invention should advantageously be used against the organic solvent used for degreasing the autolysed pancreas tissue suspension, such as, for. B. solvent mixtures of halogenated hydrocarbons, be stable. Suitable membranes are membranes made of fluorinated organic polymer membrane material, such as. B. polytetrafluoroethylene (PTFE) or poly vinylidene fluoride (PVDF), or membranes made of inorganic optionally coated membrane material, such as. B. alumina, silicon carbide or carbon. The membranes can be a symmetrical pore structure or preferably an asymmetrical pore structure, e.g. B. as composite membranes. The membrane material can e.g. B. be such that a layer is applied to a porous carrier layer, which consists for example of aluminum oxide, silicon carbide and / or carbon. For example, membranes with metal oxide coatings made of titanium dioxide or zirconium dioxide can be used. In a particularly preferred embodiment, a carbon membrane with an active ZrO ₂ coating is used.

Die Querstrom-Ultrafiltration kann mit Membranmo dulen unterschiedlicher Ausführungsform wie z. B. Wickel-, Schlauch-, Hohlfaser- oder Rohrmembranmodulen ausgeführt werden, wobei die Zwischenräume zwischen den Membranwänden ausreichend groß sein müssen, um eine ungehinderte Passage des Autolysats zu ermöglichen. In bevorzugter Ausführung erfolgt die Ultrafiltration mit Rohrmembranmodulen, die sich aus Rohrmembranen mit Innendurchmessern im Bereich von 3 mm bis 30 mm je Rohrmembran zusammensetzen. Die Durchfüh rung kann dabei mit einem Rohrmembranmodul oder mit mehre ren zu einer Trennstufe zusammengefaßten hintereinander geschalteten Rohrmembanmodulen erfolgen.Cross-flow ultrafiltration can be done with membrane mo dulen different embodiment such. B. winding, Hose, hollow fiber or tubular membrane modules be, the spaces between the membrane walls must be large enough to allow unhindered passage of the autolysate. In a preferred version the ultrafiltration takes place with tubular membrane modules that are made of tubular membranes with inner diameters in the range of Assemble 3 mm to 30 mm per tube membrane. The implementation tion can be with a tubular membrane module or with several ren combined into a separation stage one behind the other switched tubular membrane modules.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei einem trans membralen Druck von 1 bis 7 bar, insbesondere 2 bis 5 bar, durchgeführt. Der transmembrale Druck bildet sich in Abhän gigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit im Zusammenwirken mit den übrigen Parametern wie z. B. dem Membrantyp, der Mo dulart und der Membranporengrößenverteilung. Zur Erzielung des gewünschten transmembralen Druckes kann die axiale Strömungsgeschwindigkeit im Bereich von 2 bis 8 m/s, insbe sondere 3 bis 5 m/s, je nach Autolysatbeschaffenheit und Membrantyp variiert werden. Als besonders zweckmäßig erweist sich die Durchführung des Verfahrens mit Rohrmembranmodulen, zusammengesetzt aus Rohrmembranen, die einen Innendurchmes ser im Bereich von 3 mm bis 30 mm, vorzugsweise 4 bis 8 mm, aufweisen, in einem Strömungsgeschwindigkeitsbereich von 3 bis 5 m/s.The method according to the invention is used in a trans membrane pressure from 1 to 7 bar, in particular 2 to 5 bar, carried out. The transmembrane pressure is dependent interaction flow rate with the other parameters such as B. the membrane type, the Mo dulart and the membrane pore size distribution. To achieve the desired transmembral pressure can be the axial Flow speed in the range of 2 to 8 m / s, esp special 3 to 5 m / s, depending on the nature of the autolysate and Membrane type can be varied. Has proven to be particularly useful the implementation of the process with tubular membrane modules, composed of tubular membranes that have an inside diameter water in the range from 3 mm to 30 mm, preferably 4 to 8 mm, have, in a flow rate range of 3 to 5 m / s.

Der Temperaturbereich, in dem die Ultrafiltration durchgeführt werden kann, liegt zwischen 0 bis 40°C. Die untere Temperatur wird durch die Zunahme der Viskosität des Autolysats bei tieferen Temperaturen vorgegeben. Die obere Temperatur ergibt sich durch die starke Abnahme der Enzym stabilität im Temperaturbereich von 35 bis 40°C. Vorzugs weise wird bei Temperaturen von 10 bis 20°C gearbeitet.The temperature range in which the ultrafiltration can be carried out, is between 0 to 40 ° C. The lower temperature is increased by the viscosity of the Autolysate specified at lower temperatures. The upper Temperature results from the sharp decrease in the enzyme stability in the temperature range from 35 to 40 ° C. Preferential is worked at temperatures of 10 to 20 ° C.

Der pH-Wert kann in dem Bereich von 5,0 bis 8,5 variieren. Besonders geeignet für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein pH-Wert im Bereich von 6,5 bis 8,0. Es ist überraschend, daß das erfindungsgemäße Verfahren in dem angegebenen pH-Wertbereich von 6,5 bis 8,0 mit guten Ausbeuten an enzymatisch aktiven Pankreatin durchgeführt werden kann. Denn der für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete pH-Wertbereich von 6,5 bis 8,0 liegt außerhalb des pH-Bereiches, in dem Pankreatin in wäßriger Lösung stabil ist.The pH can range from 5.0 to 8.5 vary. Particularly suitable for carrying out the The inventive method is a pH in the range of 6.5 to 8.0. It is surprising that the invention Process in the specified pH range from 6.5 to 8.0 with good yields of enzymatically active pancreatin can be carried out. Because that for the invention Suitable pH value range from 6.5 to 8.0 outside the pH range, in which pancreatin in aqueous Solution is stable.

Um eine möglichst hohe Anreicherung der enzymatisch aktiven Bestandteile der Autolysesuspension im Retentat der Ultrafiltration zu erreichen, wird die Ultrafiltration gegebenenfalls mit einer sogenannten Diafiltration gekop pelt. Hierbei wird das in der Ultrafiltration erhaltene Retentat mit Wasser, insbesondere entmineralisiertem oder dialysiertem Wasser, verdünnt und anschließend erneut ultra filtriert, wodurch niedermolekulare Bestandteile von den im Retentat verbleibenden enzymatisch aktiven Bestandteilen ausgewaschen und in das Permeat überführt werden. Die zur Diafiltration eingesetzte Wassermenge sollte zweckmäßiger weise 10 bis 70 Vol% der in die Ultrafiltration eingehenden Autolysatsuspension betragen. Gewünschtenfalls kann dieser Vorgang des Verdünnens des Retentats mit Wasser und erneuter Ultrafiltration auch mehrmals hintereinander wiederholt wer den. In einer weiteren Ausführungsform kann die Diafiltra tion auch als sogenannte Batch-Diafiltration erfolgen, wobei die Wasserzugabe zur in die Ultrafiltration eingehenden Autolysatsuspension in genau der Menge erfolgt, die man als Permeat nach Ultrafiltration der Autolysatsuspension erhält.In order to maximize the enzymatic enrichment active components of the autolysis suspension in the retentate of To achieve ultrafiltration is ultrafiltration optionally with a so-called diafiltration pelt. This is what is obtained in the ultrafiltration Retentate with water, especially demineralized or dialyzed water, diluted and then ultra again filtered, whereby low molecular weight components from the im Retentate remaining enzymatically active ingredients washed out and transferred to the permeate. The for Diafiltration amount of water used should be more appropriate as 10 to 70 vol% of the ultrafiltration Autolysate suspension amount. If desired, this can Process of diluting the retentate with water and renewed Ultrafiltration can also be repeated several times in a row the. In a further embodiment, the diafiltra tion also take place as so-called batch diafiltration, where the addition of water to the ultrafiltration Autolysate suspension takes place in exactly the amount that one as Permeate obtained after ultrafiltration of the autolysate suspension.

Im Anschluß an die Querstrom-Ultrafiltration kann das Pankreatin durch Trocknung des Retentats gewonnen wer den. Die Trocknung des Retentats kann auf an sich bekannte Weise, vorzugsweise durch Sprühtrocknung, erfolgen.Following the cross-flow ultrafiltration can the pancreatin is obtained by drying the retentate the. The drying of the retentate can be known Way, preferably by spray drying.

Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Aufarbeitung einer autolysierten Pankreas-Gewebesuspension kann eine vorteilhafte Pankreatingewinnung z. B. folgendermaßen durch geführt werden: Die tiefgefrorenen Schweinepankreas-Drüsen werden tiefgekühlt, z. B. in flüssigem Stickstoff, grob vor gebrochen und anschließend fein gemahlen. Das gemahlene Ma terial wird einem Mischer zugeführt, in dem es mit Wasser, dem gegebenenfalls NaCl zugegeben wurde, vermischt wird. Anschließend wird die Suspension in einem weiteren Mischer mit einem flüssigen Chlorkohlenwasserstoff, beispielsweise Dichlormethan, oder mit einem Gemisch aus flüssigen Chlor kohlenwasserstoffen und gegebenenfalls Fluorchlorkohlenwas serstoffen, beispielsweise mit einem Dichlormethan/R113-Ge misch (R113 = 1,1,2-Trichlor-1,2,2-Trifluorethan) vermischt, wobei die Chlorkohlenwasserstoffe und die Fluorchlorkohlen wasserstoffe in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1 : 0,05 bis 1 : 2 zueinander stehen können. Nach Überführung in einen sog. Reifebehälter wird, gegebenenfalls unter Zugabe von Natrium bicarbonat, bei langsamen Rühren für ca. 9 Stunden die Auto lyse durchgeführt. Nach der Autolyse erfolgt eine zweistu fige Gegenstromextraktion, bei der mit dem Chlorkohlenwas serstoff oder dem Gemisch aus Chlorkohlenwasserstoffen und gegebenenfalls Fluorchlorkohlenwasserstoffen das Fett aus der Pankreasgewebe-Suspension extrahiert wird. Gleichzeitig erfolgt in diesem Verfahrensschritt die Entkeimung der Pan kreasgewebesuspension. Die fettbeladene organische Lösungs mittelphase wird abgezogen, und aus der zurückbleibenden wäßrigen Suspension, die die Pankreas-Enzyme sowie die schon benannten unerwünschten Nebenprodukte der Autolyse enthält, werden noch verbliebene größere Anteile der organischen Lösungsmittel durch Strippen und/oder Kurzzeiteindampfung größtenteils entfernt. Danach kann die gegebenenfalls noch geringe Lösungsmittelanteile enthaltende wäßrige Suspension der Querstrom-Ultrafiltration direkt zugeführt werden. Nach der Ultrafiltration können im Retentat möglicherweise noch enthaltene geringe Restanteile an organischen Lösungsmitteln durch geeignete Verfahren, z. B. Durchblasen von Stickstoff (= Strippen), ausgetrieben werden. Anschließend wird das an enzymatisch aktiven Bestandteilen angereicherte Retentat auf an sich bekannte Weise möglichst schonend getrocknet, zweck mäßigerweise in einer Sprühtrocknunganlage, wobei das Pan kreatin als Pulver erhalten wird. Das erfindungsgemäße Ver fahren ist besonders schonend und kann kontinuierlich ausge führt werden. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß auch Ausgangsmaterial mit geringem Enzymgehalt verarbeitet werden kann. Durch den Anreicherungseffekt der Ultrafiltration können auch aus der artigem Ausgangsmaterial Pankreatin-Produkte mit hoher enzy matischer Aktivität gewonnen werden.Using the workup according to the invention an autolyzed pancreatic tissue suspension can be one advantageous pancreatin extraction z. B. as follows The frozen pork pancreas glands are frozen, e.g. B. in liquid nitrogen, roughly before broken and then finely ground. The ground Ma material is fed to a mixer in which it is mixed with water, to which NaCl has optionally been added, is mixed. Then the suspension is in another mixer with a liquid chlorinated hydrocarbon, for example Dichloromethane, or with a mixture of liquid chlorine hydrocarbons and optionally chlorofluorocarbons serstoffe, for example with a dichloromethane / R113-Ge mixed (R113 = 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) mixed, the chlorinated hydrocarbons and the chlorofluorocarbons Hydrogen in a weight ratio of about 1: 0.05 to Can stand 1: 2 to each other. After transfer to a so-called Maturation container is, optionally with the addition of sodium bicarbonate, with slow stirring for about 9 hours the car performed lysis. After autolysis there is a two step countercurrent extraction, in which with the chlorinated coal hydrogen or the mixture of chlorinated hydrocarbons and optionally chlorofluorocarbons the fat the pancreatic tissue suspension is extracted. At the same time The disinfection of the pan takes place in this process step kreas tissue suspension. The fat-laden organic solution middle phase is subtracted, and from the remaining one aqueous suspension containing the pancreatic enzymes as well contains named undesired by-products of autolysis, remaining larger portions of the organic Solvent by stripping and / or short-term evaporation mostly removed. After that, if necessary aqueous suspension containing small amounts of solvent the cross-flow ultrafiltration can be fed directly. To of ultrafiltration may still be in the retentate contained small residual proportions of organic solvents by suitable methods, e.g. B. nitrogen blowing (= Stripping). Then that is on Enzyme-enriched retentate in a known manner dried as gently as possible, purpose moderately in a spray drying system, the pan creatine is obtained as a powder. The Ver driving is particularly gentle and can be done continuously leads. A particular advantage of the invention The method is that starting material with low enzyme content can be processed. By the Enrichment effect of ultrafiltration can also be seen from the pancreatin products with high enzy matical activity.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Pankreatin fällt als keimarmes Pulver an. Es läßt sich gut zu Arzneimitteln mit hohem enzymatischen Wirkstoffgehalt verarbeiten. Die galenischen Zubereitungen können nach be kannten Methoden unter Verwendung der üblichen pharmazeuti schen Hilfs-und Trägerstoffe hergestellt werden.The manufactured according to the inventive method Pancreatin is obtained as a low-germ powder. It works well on drugs with a high enzymatic active ingredient content to process. According to be known methods using the usual pharmaceutical auxiliaries and carriers are produced.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung er läutern, ohne sie jedoch in ihrem Umfang einzuschränken.The following examples are intended to illustrate the invention refine without restricting their scope.

example 1 A) Preparation of the starting autolysate

Tiefgefrorene in Blöcken angelieferte Schweinepankreas- Drüsen wurden unter direkter Kühlung mit flüssigem Stick stoff grob vorgebrochen und anschließend fein gemahlen. Das gemahlene Material wurde in einem Durchlaufmischer mit Wasser (0,5 l/kg Schweinepankreas-Drüsen) von 20°C, dem NaCl (1 g/kg Schweinepankreas-Drüsen) zugegeben wurde, vermischt. Die entstandene Suspension wurde in einem zweiten Mischer mit einem Dichlormethan/R113-Gemisch (1,7 l/kg SchweinePankreas-Drüsen; Gewichtsverhältnis Dichlormethan zu R113 ca. 1 : 0,05; R113 = 1,1,2-Trichlor-1,2,2-Trifluor ethan) gemischt und in einen Reifebehälter gefördert. Nach Zugabe von 0,25 Gew.-% Natriumbicarbonat (bezogen auf die Menge an Schweinpankreas-Drüsen) wurde bei ca. 15°C und 9 Stunden mittlerer Verweilzeit unter intermedierendem langsamen Rühren die Autolyse durchgeführt. Anschließend wurde in einer zweistufigen Gegenstromextraktionsanlage das Fett aus der Suspension mit einem Dichlormethan/R113-Gemisch (12,1 l/kg Schweinepankreas-Drüsen; Gewichtsverhältnis Di chlormethan zu R113 ca. 1 : 0,05) extrahiert. Dadurch wurde gleichzeitig auch die Entkeimung erzielt.Frozen pork pancreas delivered in blocks Glands were under direct cooling with a liquid stick roughly pre-broken fabric and then finely ground. The ground material was in a continuous mixer with water (0.5 l / kg porcine pancreas) at 20 ° C, to which NaCl (1 g / kg porcine pancreas) was added, mixed. The resulting suspension was in a second Mixer with a dichloromethane / R113 mixture (1.7 l / kg Porcine pancreatic glands; Weight ratio dichloromethane too R113 approx. 1: 0.05; R113 = 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoro ethane) mixed and conveyed into a ripening container. To Add 0.25% by weight sodium bicarbonate (based on the Amount of porcine pancreas) was at approx. 15 ° C and 9 hours average residence time with intermediate slow stirring the autolysis is carried out. Subsequently was in a two-stage countercurrent extraction plant Fat from the suspension with a dichloromethane / R113 mixture (12.1 l / kg porcine pancreas; weight ratio Di chloromethane to R113 approx. 1: 0.05) extracted. This was disinfection achieved at the same time.

Das fettbeladene Lösungsmittel wurde von der wäßrigen Pha se mit Tellerseparatoren abgetrennt. Aus der Fett-Lösungs mittelphase wurde das Lösungsmittelgemisch durch Destil lation zurückgewonnen und dem Prozeß wieder zugeführt.The fat-laden solvent was removed from the aqueous Pha se separated with plate separators. From the fat solution middle phase was the solvent mixture by distil lation recovered and returned to the process.

Die wäßrige Phase wurde bei ca. 30°C und einem Druck von ca. 0,55 bar über eine Kurzzeiteindampfungsanlage gegeben, wobei der größte Teil des Restlösungsmittels ausgetrieben wurde. Die aus der Anlage abfließende Suspension hatte einen Trockensubstanzgehalt von 12,25 Gew.-%. Dieser Suspension wurde für die Ultrafiltration eine Teilmenge entnommen.The aqueous phase was at about 30 ° C and a pressure of given about 0.55 bar via a short-term evaporation plant, the majority of the residual solvent being driven off has been. The suspension flowing out of the plant had one Dry matter content of 12.25% by weight. This suspension a portion was removed for ultrafiltration.

B) Further processing of the autolysate

Eine Teilmenge von 138 l der unter Beispiel 1A erhaltenen Autolysatsuspension wurde für die Querstrom-Ultrafiltration eingesetzt.A 138 l aliquot of that obtained in Example 1A Autolysate suspension was used for cross-flow ultrafiltration used.

Die Ultrafiltrationsanlage bestand aus einem Vorlagebehäl ter, einer Drehkolbenpumpe als Kreislaufpumpe, einem Rohr bündelwärmeaustauscher, um die eingetragene Wärme abzufüh ren und die Temperatur konstant zu halten, und zwei hin tereinandergeschalteten Rohrmodulen als Trennstufe mit einer Gesamtfiltrationsfläche von 1,6 m². Für die Ultrafiltration von größeren Mengen an Autolysat konnten mehrere dieser Trennstufen auch parallel betrieben werden.The ultrafiltration system consisted of a storage tank, a rotary lobe pump as a circulation pump, a tube bundle heat exchanger to remove the heat input and to keep the temperature constant, and two tube modules connected in series as a separation stage with a total filtration area of 1.6 m ² . Several of these separation stages could also be operated in parallel for the ultrafiltration of large quantities of autolysate.

Die Rohrmembranen waren aus Kohlenstoff als Stützmaterial und Zirkoniumoxid als aktive Trennschicht mit einem Innen durchmesser von 6 mm je Rohr gefertigt. Die Molmassenaus schlußgrenze lag bei 10 000.The tubular membranes were made of carbon as a support material and zirconium oxide as an active separating layer with an interior diameter of 6 mm per tube. The molar masses final limit was 10,000.

Die Suspension wurde bei einer Temperatur von ca. 12°C und einer transmembralen Druckdifferenz von 3,2 bar zwi schen Permeat- und Retentatseite mit einer Strömungsge schwindigkeit von 4,8 m/s durch die Rohrmembranmodule ge leitet. Der pH-Wert der Suspension betrug 6,8.The suspension was at a temperature of approximately 12 ° C and a transmembral pressure difference of 3.2 bar between Permeate and retentate side with a flow ge speed of 4.8 m / s through the tubular membrane modules directs. The pH of the suspension was 6.8.

Man erhielt 46 l eines Permeats mit einem Trockensubstanz gehalt von 8,5 Gew.-% und 92 l eines Retentats mit einem Trockensubstanzanzgehalt von 14,98 Gew.-%. Das so aufkon zentrierte Retentat wurde in einer Sprühtrocknungsanlage getrocknet, wobei das angereicherte Pankreatinprodukt als Pulver erhalten wurde.46 l of a permeate with a dry substance were obtained content of 8.5 wt .-% and 92 l of a retentate with a Dry matter content of 14.98% by weight. Make that up Centered retentate was in a spray dryer dried, the enriched pancreatin product as Powder was obtained.

C) Determination of the enzymatic activities

Zum Nachweis der Anreicherung der enzymatischen Aktivität im Produkt wurden Proben vom Ausgangsautolysat (unmittel bar vor der Ultrafiltration), Permeat (unmittelbar nach der Ultrafiltration) und Retentat (unmittelbar vor der Sprühtrocknung) genommen, die in einer Gefriertrocknungs anlage getrocknet wurden. Anschließend wurde die enzyma tische Aktivität der gefriergetrockneten Proben nach den Vorschriften der Federation Internationale Pharmaceutique (Hennrich, Pharm. Ind. 31 (1969), S. 228) bestimmt und pro Gramm Trockensubstanz berechnet. Die aus dem Retentat erhaltene Probe zeigte gegenüber der aus dem Ausgangsauto lysat erhaltenen Probe eine deutlich gesteigerte Enzymakti vität. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. To demonstrate the enrichment of the enzymatic activity Samples of the starting autolysate (immediate bar before ultrafiltration), permeate (immediately after ultrafiltration) and retentate (immediately before Spray drying) taken in a freeze dryer were dried. Then the enzyma table activity of the freeze-dried samples after the Regulations of the Federation Internationale Pharmaceutique (Hennrich, Pharm. Ind. 31 (1969), p. 228) and per Grams of dry matter calculated. The one from the retentate obtained sample showed compared to that from the original car lysate obtained a significantly increased enzyme share vity. The results are summarized in Table I.

Tabelle I Table I

Enzymeinheiten in FIP*)-Einheiten/g Trockensubstanz Enzyme units in FIP *) units / g dry substance

Examples 2-13

Analog Beispiel 1A erhaltene Autolysate wurden, wie in Bei spiel 1B beschrieben, mit Membranen des gleichen Typs ultra filtriert. Proben aus den jeweiligen Ausgangsautolysaten und Retentaten wurden gefriergetrocknet und ihre enzymatische Aktivität miteinander verglichen. Tabelle II zeigt die für die einzelnen Beispiele erhaltenen Ergebnisse zur jeweils erzielten Anreicherung. Autolysates obtained analogously to Example 1A were, as in Bei game 1B, with membranes of the same type ultra filtered. Samples from the respective original autolysates and Retentates were freeze-dried and their enzymatic Activity compared. Table II shows the for the results obtained for each of the individual examples achieved enrichment.

Tabelle II Table II

Enzymeinheiten in FIP-Einheiten/g Trockensubstanz Enzyme units in FIP units / g dry substance

Example 14 Cross flow ultrafiltration with additional diafiltration

Ein analog Beispiel 1B erhaltenes Retentat wurde zusätzlich mit 30 l Wasser verdünnt und nochmals auf der Ultrafiltra tionsanlage analog Beispiel 1B ultrafiltriert. Der trans membrale Druck betrug hierbei 2,6 bis 2,8 bar.A retentate obtained analogously to Example 1B was additionally obtained diluted with 30 l water and again on the Ultrafiltra tion system ultrafiltered analogously to Example 1B. The trans membrane pressure was 2.6 to 2.8 bar.

Man erhielt dabei 93 l Permeat mit einem Trockensubstanz gehalt von 6,14 Gew.-% und 66 l Retentat mit einem Trocken substanzgehalt von 14,47 Gew.-%, das anschließend sprühge trocknet wurde.This gave 93 l of permeate with a dry substance content of 6.14 wt .-% and 66 l retentate with a dry substance content of 14.47 wt .-%, which then spray was dried.

Proben aus dem Ausgangsautolysat und dem nach Ultrafiltra tion mit zusätzlich durchgeführter Diafiltration erhaltenen Endpermeat und Endretentat wurden gefriergetrocknet, deren enzymatische Aktivität bestimmt und pro Gramm Trockensub stanz berechnet. Die Enzymaktivität der Probe aus dem End retentat ist deutlich erhöht. Tabelle III zeigt die erhal tenen Ergebnisse.Samples from the starting autolysate and the Ultrafiltra tion obtained with additional diafiltration Final permeate and final retentate were freeze-dried, their enzymatic activity determined and per gram of dry substance punch calculated. The enzyme activity of the sample from the end Retentate is significantly increased. Table III shows the results results.

Tabelle III Table III

Examples 15-17

Analog Beispiel 14 wurden weitere Ultrafiltrationen mit zusätzlicher Diafiltration durchgeführt. Es wurden jeweils Proben der Ausgangsautolysate und der Endretentate gefrier getrocknet und ihre enzymatische Aktivität pro Gramm Troc kensubstanz verglichen. Tabelle IV zeigt die für die ein zelnen Beispiele erhaltenen Ergebnisse.Analogous to Example 14, additional ultrafiltration was carried out additional diafiltration carried out. There have been Freeze autolysate and final retentate samples dried and their enzymatic activity per gram of Troc compared substance. Table IV shows those for the one results obtained from individual examples.

Tabelle IV Table IV

Claims

1. A process for obtaining pancreatin from an aqueous autolysate of a pancreatic tissue suspension, characterized in that an autolysate adjusted to a pH of 6.5 to 8.0 and a dry matter content of 3 to 30% by weight a cross-flow ultra filtration using a semipermeable membrane consisting of fluorinated organic polymer membrane material from the group polytetrafluoroethylene (PTFE) and polyvinylidene fluoride (PVDF) or inorganic optionally coated membrane material from the group aluminum oxide, silicon carbide and carbon with a molecular weight exclusion limit in the range of 5000 to 200,000 at a transmembrane pressure of 1 to 7 bar and an axial flow velocity of 2 to 8 m / s into a retentate enriched with respect to the autolysate of enzymatically active dry substance constituents and depleted with non-enzymatically active dry substance constituents and a permeate, and the re tentat dries.

2. The method according to claim 1, characterized in that that cross-flow ultrafiltration using a semipermeable membrane with a molecular weight cutoff from 10,000 to 20,000.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized net that membranes made of aluminum oxide, silicon carbide and / or Carbon are used, which may be a metal have oxide coating.

4. The method according to claim 3, characterized in that a membrane made of carbon with a surface zirconia layer is used.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cross-flow ultrafiltra tion with tube membranes combined into tube membrane modules branches.

6. The method according to claim 5, characterized in that you can cross-flow ultrafiltration with Rohrmembranmodu len at an axial flow rate of 3 to 5 m / s.

7. The method according to claim 6, characterized in that that tubular membranes made of carbon with a surface Layering made of zirconium dioxide with an inner diameter from 3 to 30 mm per tube membrane at a flow rate speed of 3 to 5 m / s can be used.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cross-flow ultrafiltra tion is carried out at a temperature of 0 to 40 ° C.

9. The method according to claim 8, characterized in that the cross-flow ultrafiltration at one temperature from 10 to 20 ° C.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the retentate of the cross-flow Ultrafiltration diluted with water, another cross Stream ultrafiltration according to one or previous claims subjects and then dries the final retentate.

11. The method according to claim 10, characterized in that the retentate with water, the amount 10 to 70 Vol .-% of the autolysate used in the ultrafiltration suspension is diluted.

12. The method according to claim 1, characterized in that that by retentate the cross-flow ultrafiltration Spray drying dries.

13. The method according to claim 1, characterized in that one with a mixture of liquid chlorinated hydrocarbon substances and possibly liquid chlorofluorocarbons cross-flow ultrafiltration degreased autolysate submits.

14. The method according to claim 13, characterized in that you have an autolysate with a weight ratio from 1: 0.05 to 1: 2 mixture of dichloromethane and 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane was degreased, starts.

15. The method according to claim 13, characterized in net that an autolysate degreased with dichloromethane starts.