DE4126692C2 - Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons - Google Patents

Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons

Info

Publication number
DE4126692C2
DE4126692C2 DE19914126692 DE4126692A DE4126692C2 DE 4126692 C2 DE4126692 C2 DE 4126692C2 DE 19914126692 DE19914126692 DE 19914126692 DE 4126692 A DE4126692 A DE 4126692A DE 4126692 C2 DE4126692 C2 DE 4126692C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
antigen
biosensor
immunosensor device
immunosensor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19914126692
Other languages
German (de)
Other versions
DE4126692A1 (en
Inventor
Frieder Prof Dr Scheller
Florian Dr Schubert
Rainer Dr Hintsche
Ulla Dr Wollenberger
Reinhard Dr Renneberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BST BIO SENSOR TECHNOLOGIE GMBH, 13156 BERLIN, DE
Original Assignee
BST Bio Sensor Tech GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BST Bio Sensor Tech GmbH filed Critical BST Bio Sensor Tech GmbH
Priority to DE19914126692 priority Critical patent/DE4126692C2/en
Publication of DE4126692A1 publication Critical patent/DE4126692A1/en
Application granted granted Critical
Publication of DE4126692C2 publication Critical patent/DE4126692C2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/946—CNS-stimulants, e.g. cocaine, amphetamines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft eine Immunosensor-Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen < 2000 Dalton, wie Rauschmittel, Herbizide, Sprengstoffe. Anwendung findet die Erfindung vorwiegend in der Umweltanalytik und Rauschgift­ detektion.The invention relates to an immunosensor device and a Methods for the determination of antigens <2000 daltons, such as Intoxicants, herbicides, explosives. The Invention mainly in environmental analysis and drugs detection.

Bekannt sind indirekte Immunosensoren, die Markersysteme zur Quantifizierung der Antigen-Antikörper-Reaktion nutzen, d. h. auch zur Konzentrationsbestimmung. Dabei besitzen Enzyme als Marker den entscheidenden Vorteil, daß sie als Biokatalysato­ ren die Bildung eines leicht anzeigbaren Produktes kataly­ sieren, wobei die Produktmenge der Enzymaktivität proportio­ nal ist und damit in einem direkten oder indirekten Verhält­ nis zur Antigenmenge steht.Indirect immunosensors are known, the marker systems for Use quantitation of the antigen-antibody response, d. H. also for determining the concentration. Enzymes have as Marker has the decisive advantage that it is a biocatalyst The formation of an easily displayable product catalyzes sieren, the product amount of the enzyme activity proportio nal and thus in a direct or indirect relationship stands for the amount of antigen.

Ein Nachweis von kleinen Mengen an Rauschgift und anderen Um­ weltgiften ist äußerst kompliziert. Es handelt sich dabei um Antigene mit relativ kleinen Molekulargewichten, zu deren Nachweis nur kompetitive oder Verdrängungsimmunoassays in Be­ tracht kommen. Um Spuren dieser Mittel nachweisen zu können, ist eine Verstärkung notwendig.Evidence of small amounts of drug and other order world toxins is extremely complicated. It is about Antigens with relatively small molecular weights Detection of only competitive or displacement immunoassays in Be come. In order to be able to prove traces of these agents, reinforcement is necessary.

Eine Kopplung von einem Enzymimmunoassay und enzymatischer bzw. chemisch/enzymatischer Signalverstärkung ist für Sandwich-Assays bekannt, wobei als Markerenzym alkalische Phosphatase benutzt wird (EP 60 123: C. Stanley. F. Paris, A. Plumb, A. Weleb and A. Johannsson. Amer. Biotechnol. Lab. May/June 1985).A coupling of an enzyme immunoassay and an enzymatic one or chemical / enzymatic signal amplification is for Sandwich assays are known, being alkaline as a marker enzyme Phosphatase is used (EP 60 123: C. Stanley. F. Paris, A. Plumb, A. Weleb and A. Johannsson. Amer. Biotechnol. Lab. May / June 1985).

Dieses Sandwich Assay ist jedoch nur anwendbar zur Bestimmung von Antigenen mit hohen Molekulargewichten (<10 000 Dalton). Außerdem ist ein Immunosensor zur kontinuierlichen Anzeige von Analytkonzentrationen in einem Medienstrom bekannt (W. Schramm und Se-Hwan Paek, Reproductive Sciences Program and Bioengineering Program. 300 N. Ingalls, University of Michigan, Ann Arbor. MI 48 105, USA). However, this sandwich assay is only applicable for determination of antigens with high molecular weights (<10,000 daltons). There is also an immunosensor for continuous display of analyte concentrations in a media stream (W. Schramm and Se-Hwan Paek, Reproductive Sciences Program and Bioengineering Program. 300 N. Ingalls, University of Michigan, Ann Arbor. MI 48 105, USA).  

Dieser Immunosensor besteht in seinen Grundkomponenten aus einer Kombination von 2 monoklonalen Antikörpern, die an separaten Sensoren immobilisiert sind, und einem heterobifunktionellen Konjugat zwischen dem Analyt und einem Enzym (Enzym-Analyt- Konjugat), wobei das Medium von den Sensorabteilungen durch eine semipermeable Membran getrennt ist. Dieser Immunosensor hat den Nachteil, daß wegen des langsamen Abdissoziierens des Antigens der Meßprozeß sehr zeitaufwendig ist. Weiterhin wird die Empfindlichkeit durch die katalytische Aktivität des Markerenzyms bestimmt, d. h., es wird keine enzymatische Verstärkungsreaktion eingesetzt.The basic components of this immunosensor consist of one Combination of 2 monoclonal antibodies on separate Sensors are immobilized, and a heterobifunctional Conjugate between the analyte and an enzyme (enzyme analyte Conjugate), whereby the medium from the sensor departments through a semipermeable membrane is separated. This immunosensor has that Disadvantage that because of the slow dissociation of the antigen the measuring process is very time consuming. Furthermore, the Sensitivity due to the catalytic activity of the Marker enzyme determined, d. that is, it does not become enzymatic Reinforcement reaction used.

Eine Immunosensor-Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen <2000 Dalton ist aus US 4859583 bekannt, die aus einem Enzym- Immunoreaktor und einem Biosensor, der mit mindestens einem Biokatalysator (GOD) beschichtet ist, besteht. Die Meßlösung, der ein Substrat für ein Enzymkonjugat des Enzymreaktors und gegebenenfalls Cosubstrate für die Biokatalysatoren zugesetzt sind, gelangt von dem Immunoreaktor zum Biosensor. Zur Bindung des aus dem Immunosensor freigesetzten Enzymkonjugats weist die Biosensor-Oberfläche Antikörper auf. Der Fluß der Meßlösung kommt durch Diffusion zustande.An immunosensor device for the determination of antigens <2000 Dalton is known from US 4859583, which consists of an enzyme Immunoreactor and a biosensor that works with at least one Biocatalyst (GOD) is coated. The measuring solution, which is a substrate for an enzyme conjugate of the enzyme reactor and optionally added cosubstrates for the biocatalysts are from the immunoreactor to the biosensor. For binding of the enzyme conjugate released from the immunosensor shows the Biosensor surface antibodies. The flow of the measurement solution comes about through diffusion.

In US 4277560 ist eine Immunosensor-Vorrichtung beschrieben, die aus einem Enzym-Immunoreaktor und einem Biosensor besteht, wobei die Meßlösung, der ein Substrat für ein Enzymkonjugat des Immunoreaktors zugesetzt ist, vom Immunoreaktor zum Biosensor fließt. Das Sustrat kann nach dem Passieren des Immunoreaktors in den Fluß injiziert werden. Diese Vorrichtung ist jedoch nur in begrenztem Maße für die Bestimmung von Antigenen, die <2000 Dalton sind, einsetzbar.US 4277560 describes an immunosensor device which consists of an enzyme immunoreactor and a biosensor, where the measuring solution, which is a substrate for an enzyme conjugate of the Immunoreactor is added from the immunoreactor to the biosensor flows. The Sustrat can be after passing the immunoreactor be injected into the river. However, this device is only to a limited extent for the determination of antigens that are <2000 Dalton are usable.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Immunosensor- Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen <2000 Dalton zu entwickeln.The object of the invention is to provide an immunosensor Device and method for determining antigens <2000 to develop Dalton.

Die erfindungsgemäße Immunosensor-Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen <2000 Dalton besteht aus einem oder zwei Enzym- Immunoreaktoren (IR), die mit Enzymkonjugaten des Analyten mit Pyruvatkinase, Oxalacetatdecarboxylase, Phosphatase, oder Arylsulfatase beladen sind; einem Biosensor, der in einer Enzymschicht Lactatoxidase und Lactatdehydrogenase, Cytochrom b₂ und Lactatdehydrogenase oder Laccase enthält und einer Meßlösung mit den Substraten Phosphoenolpyruvat, Oxalacetat oder Brenzkatechin für das jeweilige Enzymkonjugat. Die Meßlösung fließt von den Immunoreaktoren zum Biosensor.The immunosensor device according to the invention for determining Antigens <2000 daltons consists of one or two enzyme Immunoreactors (IR) using enzyme conjugates of the analyte with pyruvate kinase, Oxaloacetate decarboxylase, phosphatase, or aryl sulfatase are loaded; a biosensor in an enzyme layer  Lactate oxidase and lactate dehydrogenase, cytochrome b₂ and Contains lactate dehydrogenase or laccase and a measuring solution with the substrates phosphoenol pyruvate, oxaloacetate or pyrocatechol for the respective enzyme conjugate. The measuring solution flows from the Immunoreactors for the biosensor.

Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche 1, 11 und 12 realisiert. Die Unteransprüche 2 bis 10 sind entsprechende vorteilhafte Ausführungen.The invention is implemented according to claims 1, 11 and 12. The sub-claims 2 to 10 are corresponding advantageous Executions.

Es wird folgendes Prinzip realisiert: Das zu bestimmende Antigen (AG) wird in einen Enzym-Immunoreaktor gegeben. Dieser besteht aus an unlöslichen Trägermaterialien nach bekannten Methoden immobilisierten Antikörpern (Ak), die vor dem Meßvorgang mit einem Enzymkonjugat (Ag-Eg) des zu bestimmenden Antigens beladen werden. Die Affinität der immobilisierten Antikörper wird so gewählt, daß bei Anwesenheit der zu bestimmenden Antigene bereits bei der Schwellkonzentration die Enzymkonjugate verdrängt werden.The following principle is implemented: The antigen to be determined (AG) is placed in an enzyme immunoreactor. This exists from insoluble carrier materials by known methods immobilized antibodies (Ak) with the before the measurement process an enzyme conjugate (Ag-Eg) of the antigen to be determined become. The affinity of the immobilized antibodies becomes like this chosen that in the presence of the antigens to be determined the enzyme conjugates already at the threshold concentration to be ousted.

Die Verdrängung des Enzymkonjugats wird nach Verlassen des Immunoreaktors mittels eines Biosensors (Amplifizierungs- Enzymsensor), der mit Biokatalysatoren (mindestens 1 Enzym) beschichtet ist, hoch empfindlich angezeigt. Dazu wird das Substrat S des Enzymkonjugates nach dem Passieren des Immun­ reaktors in den Fluß injiziert. Nur in Gegenwart des zu be­ stimmenden Antigens wird daraus das Produkt P gebildet, das als gemeinsamer Reaktionspartner zyklisch durch die Biokata­ lysatoren, vorzugsweise 2 Amplifizierungsenzyme Ea1 und Ea2 unter Bildung oder Verbrauch eines elektrodenaktiven Cosub­ strates Cx umgesetzt wird. Die Signalverstärkung beruht dar­ auf, daß in jedem Reaktionszyklus ein Teilchen des Coreaktan­ den C umgesetzt wird.The displacement of the enzyme conjugate is displayed after leaving the immunoreactor with a biosensor (amplification enzyme sensor), which is coated with biocatalysts (at least 1 enzyme), highly sensitive. For this purpose, the substrate S of the enzyme conjugate is injected into the river after passing through the immune reactor. Only in the presence of the antigen to be determined the product P is formed, which is cyclically converted as a common reaction partner by the biocatalysts, preferably 2 amplification enzymes Ea 1 and Ea 2, with the formation or consumption of an electrode-active cosub strate C x . The signal amplification is based on the fact that a particle of the coreactane is converted to the C in each reaction cycle.

Schema Scheme

Bei Verwendung eines 2. Immunoreaktors enthält dieser die gleichen Antikörper wie der 1. Immunoreaktor oder Antikörper gegen ein anderes Epitop des Antigen-Enzymkonjugates, die die Aktivität des Markerenzyms bei der Bindung nicht ernie­ drigen.If a second immunoreactor is used, it contains the same antibodies as the 1st immunoreactor or antibody against another epitope of the antigen-enzyme conjugate, the the activity of the marker enzyme in binding does not decrease drigen.

Die eingesetzten Biosensoren sind Elektroden, ionensensitive Feldeffekttransistoren oder Thermistoren mit immobilisierten Enzymen. Diese Biosensoren gewährleisten eine Amplifizierung. Die verwendeten Biosensoren sind z. T. bekannt, so aus DD 2 22 896, DD 2 22 897, DD 2 72 311 und DE-OS 39 40 072. The biosensors used are electrodes, ion-sensitive Field effect transistors or thermistors with immobilized Enzymes. These biosensors ensure amplification. The biosensors used are e.g. T. known, so from DD 2 22 896, DD 2 22 897, DD 2 72 311 and DE-OS 39 40 072.  

Mit der erfindungsgemäßen Immunosensor-Vorrichtung ist es möglich, niedermolekulares Antigen und auch bereits Antigen­ spuren aus der Luft nachzuweisen. Durch die enzymatische Ver­ stärkung wird eine Signalamplifizierung um den Faktor 10-20 (bei Verwendung eines Enzyms) und um den Faktor 100-1000 durch den Einsatz von Biosensoren mit 2 Enzymen erreicht. Dies führt zu einer beträchtlichen Verkürzung der Inkubationszeit. Besonders geeignet ist die Erfindung für den Nachweis von Rauschmitteln, Herbiziden und Sprengstoffen.It is with the immunosensor device according to the invention possible, low molecular weight antigen and already antigen evidence of traces from the air. Due to the enzymatic ver Signal amplification by a factor of 10-20 is strengthened (when using an enzyme) and by a factor of 100-1000 achieved by using biosensors with 2 enzymes. this leads to to a considerable reduction in the incubation period. The invention is particularly suitable for the detection of Intoxicants, herbicides and explosives.

AusführungsbeispieleEmbodiments Beispiel 1example 1

Monoklonale Antikörper gegen Cocain werden nach bekannten Verfahren (G. Wemhoff et al, NRL Review 1991, 103-105) an hydrophile Träger gebunden und die Partikel in eine Säule von 100 µl Innenvolumen eingefüllt. Dieser Immunoreaktor wird mit einer Durchflußmeßzelle verbunden, die die bekannte "Ver­ stärkungsenzymelektrode auf der Basis von LOD/LDH enthält. Die amperometrische Elektrode ist auf -600 mV polarisiert und an einen üblichen Meßverstärker angeschlossen. Der Träger­ strom (0,05 mM Trispuffer, pH 8) wird mittels Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min aus dem Vorratsgefäß durch das Probeninjektionsventil, den Immunoreaktor, ein Injektions-T- Stück und die Meßzelle mit Verstärkungsenzymelektrode ge­ pumpt.Monoclonal antibodies against cocaine are known according to Methods (G. Wemhoff et al, NRL Review 1991, 103-105) hydrophilic carrier bound and the particles in a column of 100 µl internal volume filled. This immunoreactor will connected to a flow measuring cell, the well-known "Ver strengthening enzyme electrode based on LOD / LDH contains. The amperometric electrode is polarized to -600 mV and connected to a common measuring amplifier. The carrier current (0.05 mM Tris buffer, pH 8) is pumped with a Speed of 0.5 ml / min from the storage vessel through the Sample injection valve, the immunoreactor, an injection T Piece and the measuring cell with reinforcing enzyme electrode ge pumps.

Zum Erzielen der Meßbereitschaft wird der Immunoreaktor mit einem Konjugat aus Cocain und alkalischer Phosphatase bela­ den, wozu 1 ml einer konjugatenthaltenden Lösung durch den Immunoreaktor mit sehr niedriger Fließgeschwindigkeit (0,1 ml/min) gepumpt wird, wobei die Konjugatlösung die Fließapparatur über das T-Stück vor der Verstärkungsenzym­ elektrode verläßt. Danach wird mit 10 ml Trägerlösung ge­ spült, und vor der Injektion von Proben, die auf die Gegen­ wart von Cocain geprüft werden, wird über eine 2. Pumpe mit 0,1 ml/min eine 50 μM Phosphoenolpyruvat (PEP)Losung, die 10 mM NADH in Trispuffer enthält, über das Injektions-T-Stück vor der Durchflußmeßzelle in den Trägerstrom kontinuierlich eingebracht.To achieve readiness for measurement, the immunoreactor is used a conjugate of cocaine and alkaline phosphatase bela for which 1 ml of a conjugate-containing solution by the Very low flow rate immunoreactor (0.1 ml / min) is pumped, the conjugate solution the Flow equipment over the T-piece in front of the reinforcing enzyme electrode leaves. Then it is ge with 10 ml of carrier solution rinses, and before injecting samples onto the counter were checked by cocaine, is using a second pump  0.1 ml / min a 50 μM phosphoenolpyruvate (PEP) solution that Contains 10 mM NADH in Tris buffer via the injection tee continuously in front of the flow measuring cell in the carrier stream brought in.

Vor der Messung erfolgt eine Kalibrierung durch die Injektion von 5, 10 und 20 ng Cocain/ml enthaltenden Lösungen über das Probeninjektionsventil. Aus der Stromerniedrigung der Ver­ stärkungsenzymelektrode (O2-Anzeige!) wird eine Kalibrierungs­ kurve erstellt. Das Meßsignal entsteht dadurch, daß Cocain- Phosphatase-Konjugate durch das freie Cocain der Kalibrier- oder Probelösung von den im Immunoreaktor fixierten Antikör­ pern verdrängt werden. Nach Erreichen des Injektionsventils, durch das Phosphoenolpyruvat dem Trägerstrom zugemischt wird, wird Pyruvat unter der Wirkung der Phosphatase aus dem PEP gebildet. Das Pyruvat wird durch die Verstärkungsenzymelek­ trode mit extremer Empfindlichkeit angezeigt, wobei der O₂- Verbrauch durch die LOD-katalysierte Teilreaktion das Meß­ signal liefert.Before the measurement, calibration is carried out by injecting solutions containing 5, 10 and 20 ng of cocaine / ml via the sample injection valve. A calibration curve is created from the current reduction of the amplification enzyme electrode (O 2 display!). The measurement signal arises from the fact that cocaine-phosphatase conjugates are displaced by the free cocaine of the calibration or sample solution from the antibodies fixed in the immunoreactor. After reaching the injection valve through which phosphoenolpyruvate is mixed into the carrier stream, pyruvate is formed from the PEP under the action of the phosphatase. The pyruvate is indicated by the amplification enzyme electrode with extreme sensitivity, the O₂ consumption by the LOD-catalyzed partial reaction providing the measurement signal.

In analoger Weise wie bei den cocainhaltigen Kalibrierungslö­ sungen werden Urinproben (50 µl) in das Fließsystem injiziert. Auch hier führt die oben geschilderte Reaktionskette zur hochempfindlichen Anzeige von Cocain. Nach der Untersu­ chung von 50 Meßproben wird das System erneut kalibriert. Hat die Gegenwart hoher Cocainkonzentrationen zur weitgehenden Verdrängung der Enzymkonjugate im Immunoreaktor geführt, wird bei der Kalibrierung eine erniedrigte Empfindlichkeit gefun­ den. Danach erfolgt die erneute Beladung des Immunoreaktors mit dem Enzymkonjugat, wie oben beschrieben wurde.In an analogous manner to the calibration solutions containing cocaine urine samples (50 µl) are injected into the flow system. The reaction chain described above also leads here for the highly sensitive display of cocaine. After the Untersu After 50 measuring samples, the system is recalibrated. Has the presence of high concentrations of cocaine to a large extent Displacement of the enzyme conjugates in the immunoreactor is carried out found a lower sensitivity during calibration the. Then the immunoreactor is loaded again with the enzyme conjugate as described above.

Beispiel 2Example 2

Der in Beispiel 1 beschriebene Immunoreaktor mit monoklonalen Antikörpern gegen Cocain wird in einer analogen Fließappara­ tur eingesetzt. Die Durchflußzelle mit der Verstärkungsenzym­ elektrode besitzt zusätzlich eine semipermeable Membran vor der Enzymschicht, an deren Lösungsseite nichtinhibierende An­ tikörper gegen alkalische Phosphatase kovalent fixiert sind. Weiterhin befindet sich ein Injektionsventil für die PEP- und NADH-haltige Lösung (anstelle des T-Stücks in Beispiel 1) be­ ziehungsweise eine Glycin-HCl-Lösung von pH 2,5 zwischen Im­ munoreaktor und Durchflußmeßzelle.The monoclonal immunoreactor described in Example 1 Antibodies to cocaine are placed in an analog flow apparatus tur used. The flow cell with the enhancement enzyme electrode also has a semipermeable membrane  the enzyme layer, on the solution side of which non-inhibiting An antibodies against alkaline phosphatase are covalently fixed. There is also an injection valve for the PEP and NADH-containing solution (instead of the T-piece in Example 1) be or a glycine-HCl solution of pH 2.5 between Im Munoreaktor and flow measuring cell.

Die Kalibrierung und Untersuchung von Proben erfolgt analog zu Beispiel 1. Allerdings wird bei dieser Anordnung die PEP- und NAPH-haltige Tris-Lösung nicht kontinuierlich dem Träger­ strom nach Verlassen des Immunoreaktors zugemischt, sondern es erfolgt nur nach jeder Injektion einer Kalibrierungslösung oder Probe eine Injektion zum Nachweis von aus dem Immuno­ reaktor verdrängten Enzymkonjugaten, die dann unmittelbar auf der semipermeablen antikörpertragenden Membran vor der Enzym­ schicht gebunden werden. Dadurch wird eine um den Faktor 20 höhere Empfindlichkeit gegenüber der in Beispiel 1 beschrie­ benen Anordnung erreicht.The calibration and examination of samples is carried out analogously to example 1. However, with this arrangement the PEP and NAPH-containing Tris solution is not continuous to the wearer current mixed after leaving the immunoreactor, but it only occurs after each injection of a calibration solution or sample an injection to detect from the immuno Reactor displaced enzyme conjugates, which are then immediately on the semi-permeable antibody-bearing membrane in front of the enzyme layer bound. This makes it a factor of 20 higher sensitivity to that described in Example 1 arrangement reached.

Nach dem Vermessen cocainhaltiger Lösungen werden die Enzym­ konjugate von der Ak-Membran auf der Amplifizierungsenzym­ elektrode durch Spülen mit Glycin-HCl-Puffer von pH 2,5 ge­ spalten und damit aus dem Meßsystem entfernt.After measuring solutions containing cocaine, the enzyme conjugate from the Ak membrane to the amplification enzyme electrode by rinsing with glycine-HCl buffer of pH 2.5 ge split and thus removed from the measuring system.

Claims (12)

1. Immunosensor-Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen <2000 Dalton, bestehend aus
  • - einem oder zwei Enzym-Immunoreaktoren (IR), die mit Enzymkonjugaten des Analyten mit Pyruvatkinase, Oxalazetatdecarboxylase, Phosphatase oder Arylsulfatase beladen sind,
  • - einem Biosensor, der in einer Enzymschicht Lactatoxidase und Lactatdehydrogenase, Cytochrom b₂ und Lactatdehydrogenase oder Laccase enthält und
  • - einer Meßlösung mit den Substraten Phosphoenolpyruvat, Oxalazetat oder Brenzkatechin für das jeweilige Enzymkonjugat, wobei die Meßlösung von den Immunreaktoren zum Biosensor fließt.
1. Immunosensor device for the determination of antigens <2000 daltons, consisting of
  • one or two enzyme immunoreactors (IR) loaded with enzyme conjugates of the analyte with pyruvate kinase, oxaloacetate decarboxylase, phosphatase or aryl sulfatase,
  • - A biosensor which contains lactate oxidase and lactate dehydrogenase, cytochrome b₂ and lactate dehydrogenase or laccase in an enzyme layer and
  • - A measuring solution with the substrates phosphoenol pyruvate, oxaloacetate or pyrocatechol for the respective enzyme conjugate, the measuring solution flowing from the immune reactors to the biosensor.
2. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Meßlösung Cosubstrate für die Meßlösung zugesetzt sind.2. Immunosensor device according to claim 1, characterized in that that the measurement solution cosubstrate for the measurement solution are clogged. 3. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Adenosindiphosphat als Cosubstrat für Pyruvatkinase zugesetzt ist.3. Immunosensor device according to claim 2, characterized in that that adenosine diphosphate as a cosubstrate for Pyruvate kinase is added. 4. Immunosensor-Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzym-Immunoreaktoren an unlösliche Trägermaterialien immobilisierte Antikörper (AK) enthalten, wobei die AK des 1. IR mit einem Enzymkonjugat des zu bestimmenden Antigens beladen sind.4. Immunosensor device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the enzyme immunoreactors insoluble carrier materials immobilized antibodies (AK) included, the AK of the 1st IR with an enzyme conjugate of the determining antigen are loaded. 5. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Antikörper des 1. IR mit dem Enzymkonjugat vollständig abgesättigt sind und eine solche Affinität besitzen, daß bei Anwesenheit der zu bestimmenden Antigene bereits bei Schwellwertkonzentration die Enzymkonjugate verdrängt werden.5. Immunosensor device according to claim 4, characterized characterized in that the immobilized antibodies of the 1st IR with the enzyme conjugate are completely saturated and such Have affinity that in the presence of those to be determined Antigens already at the threshold concentration the enzyme conjugates to be ousted. 6. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der 2. IR die gleichen AK wie im 1. IR oder AK gegen ein anderes Epitop des Antigen-Enzym-Konjugates enthält, die die Aktivität des Markerenzyms bei der Bindung nicht erniedrigen. 6. Immunosensor device according to claim 4, characterized indicates that the 2nd IR is the same AK as in the 1st IR or AK against another epitope of the antigen-enzyme conjugate, which does not interfere with the activity of the marker enzyme humiliate.   7. Immunosensor-Vorrichtung nach nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor als Transduktor Elektroden, ionensensitive Feldeffekttransistoren oder Thermistoren besitzt und als Biokatalysatoren Enzyme und gegebenenfalls auch Antikörper in immobilisierter Form verwendet sind.7. Immunosensor device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the biosensor acts as a transducer Electrodes, ion sensitive field effect transistors or Has thermistors and as biocatalysts enzymes and where appropriate, antibodies are used in immobilized form are. 8. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor mit einer Enzymmembran beschichtet ist, die aus an Polyethylenglykol gebundenes NAD⁺ zusammen mit einer Oxidase und zwei Dehydrogenasen besteht.8. Immunosensor device according to claim 1 to 7, characterized in that the biosensor with an enzyme membrane is coated, the NAD⁺ bound to polyethylene glycol together with an oxidase and two dehydrogenases. 9. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Biosensor vor der Enzymschicht AK gegen das Antigen-Enzymkonjugat besitzt.9. Immunosensor device according to claim 8, characterized in that that the biosensor in front of the enzyme layer AK against the Possesses antigen-enzyme conjugate. 10. Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß für Laccase in Kombination mit Brenzkatechin als Substrat und Arylsulfatase als Enzymkonjugat eine Redoxelektrode im Biosensor eingesetzt ist.10. Immunosensor device according to claim 1 to 7, characterized in that for laccase in combination with pyrocatechol as a substrate and arylsulfatase as an enzyme conjugate Redox electrode is used in the biosensor. 11. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen < 2000 Dalton mittels Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Probe in einen Immunoreaktor gibt, der aus an einem unlöslichen Trägermaterial immobilisierten Antikörpern gegen das zu bestimmende Antigen besteht, die vor der Messung vollständig mit einem Enzymkonjugat (Antigen-Enzym) abgesättigt werden, so daß in Gegenwart des Antigens das Antigen-Enzym verdrängt wird und das freigesetzte Antigen-Enzym-Konjugat in einem 2. IR oder durch AK auf der Biosensoroberfläche gebunden wird und nach Verlassen des 1. Immunoreaktors man der Probelösung das Substrat S für das Enzymkonjugat zusetzt und das dadurch gebildete Produkt mittels Biosensor amplifiziert.11. Method for the determination of antigens <2000 daltons using Immunosensor device according to claim 1 to 10, characterized characterized in that the sample to be determined in a The immunoreactor gives out on an insoluble carrier material immobilized antibodies against the antigen to be determined consists completely of an enzyme conjugate before the measurement (Antigen enzyme) are saturated, so that in the presence of Antigen the antigen enzyme is displaced and the released Antigen-enzyme conjugate in a 2nd IR or by AK on the Biosensor surface is bound and after leaving the 1st Immunoreactor one the sample solution for the substrate S Enzyme conjugate and the product formed by means Biosensor amplified. 12. Verwendung einer Immunosensor-Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 10 zur Bestimmung von Rauschmitteln, Herbiziden und Sprengstoffen.12. Use of an immunosensor device according to claim 1 to 10 for the determination of intoxicants, herbicides and Explosives.
DE19914126692 1991-08-13 1991-08-13 Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons Expired - Fee Related DE4126692C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19914126692 DE4126692C2 (en) 1991-08-13 1991-08-13 Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19914126692 DE4126692C2 (en) 1991-08-13 1991-08-13 Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE4126692A1 DE4126692A1 (en) 1993-02-18
DE4126692C2 true DE4126692C2 (en) 1995-05-11

Family

ID=6438177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19914126692 Expired - Fee Related DE4126692C2 (en) 1991-08-13 1991-08-13 Immunosensor device and method for determining antigens <2,000 daltons

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE4126692C2 (en)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19545974C2 (en) * 1995-07-15 2000-06-15 Frieder Scheller Highly sensitive enzyme immunoassay for the determination of haptens and antigens and their use
US6294281B1 (en) 1998-06-17 2001-09-25 Therasense, Inc. Biological fuel cell and method
US7005273B2 (en) 2001-05-16 2006-02-28 Therasense, Inc. Method for the determination of glycated hemoglobin
US7368190B2 (en) 2002-05-02 2008-05-06 Abbott Diabetes Care Inc. Miniature biological fuel cell that is operational under physiological conditions, and associated devices and methods
DE102005007724A1 (en) 2005-02-18 2006-08-31 Heinrich Meurer Airborne hydrocarbon exploration process
DE102005007723A1 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Heinrich Meurer Airborne landmine detection method
US7673551B2 (en) 2007-08-15 2010-03-09 Heinrich Meurer Aerial-supported procedure for the detection of landmines
US7528949B2 (en) 2007-08-15 2009-05-05 Heinrich Meurer Aerial-supported procedure for exploration of hydrocarbon deposits
US20100213057A1 (en) 2009-02-26 2010-08-26 Benjamin Feldman Self-Powered Analyte Sensor

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4277560A (en) * 1978-10-24 1981-07-07 Technicon Instruments Corporation Enzyme immunoassays using immobilized reagents in a flowing stream
EP0060123B1 (en) * 1981-03-07 1986-10-29 Colin Henry Self Assay and use
DD222896A1 (en) * 1984-02-13 1985-05-29 Akad Wissenschaften Ddr METHOD FOR THE ELECTROCHEMICAL DETERMINATION OF LACTAT, PYRUVATE AND THE ACTIVITY OF ALANINAMINOTRANSFERASE
DD222897A1 (en) * 1984-02-13 1985-05-29 Akad Wissenschaften Ddr METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF SUBSTRATES
US4859583A (en) * 1985-02-25 1989-08-22 Amoco Corporation Chemiluminescent immunochemical technique for low molecular weight antigens
DE3723726A1 (en) * 1987-07-17 1989-02-16 Pfeiffer Bioanalytik Kg Dr METHOD FOR PRODUCING SPECIFIC, SIDE-DIFFERENTIATING DETECTION REAGENTS AND THEIR USE
DD272311A1 (en) * 1988-05-13 1989-10-04 Akad Wissenschaften Ddr BIOSENSOR FOR SENSITIVE DETERMINATION OF SUBSTANCES
DE3940072A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-06 Biotechnolog Forschung Gmbh Enzymatic indicator reaction of immobilised oxidase and dehydrogenase - for substrate recycling, with immobilisation of co-factor and additional dehydrogenase for co-factor regeneration
DE4000773A1 (en) * 1990-01-12 1990-08-09 Pfeiffer Bioanalytik Kg Dr Highly sensitive immunological detection method - esp. for low mol.wt. pollutants, with extra wash stage between addn. of sample and tracer
DE4013004C2 (en) * 1990-04-24 1993-10-21 Elvira Schecklies Method for the quantitative determination of low molecular weight organic substances
DE4110548A1 (en) * 1991-03-30 1992-10-01 Biotechnolog Forschung Gmbh Competitive binding assay for herbicides - by competition with quinone aldehyde for photo-system II receptors

Also Published As

Publication number Publication date
DE4126692A1 (en) 1993-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE68916423T2 (en) ENZYMATICALLY REINFORCED, PIEZOELECTRICAL, SPECIFIC BINDING TEST.
DE69219686T2 (en) Method and device for use in specific binding tests
DE69731306T2 (en) METHOD AND KIT FOR DETERMINING AN ANALYSIS BY MEANS OF MASS ASSESSMENT
EP0912897B1 (en) Enzymatic-electrochemical one-shot affinity sensor for the quantitative determination of analytes in aqueous media and affinity assay
DE69404653T2 (en) SENSORS BASED ON POLYMER CONVERSION
DE60029957T2 (en) METHOD AND KIT FOR DETECTING COMPOUNDS CONTAINING BETALACTAM
DE4126692C2 (en) Immunosensor device and method for determining antigens &lt;2,000 daltons
EP3649252B1 (en) Device and method for detecting a specific analyte in a liquid sample and uses of said device
DE69012552T2 (en) AVIDIN-BIOTIN ASSISTED IMMUNASSAY PROCEDURE.
EP2016410A1 (en) Method for the coupled enzyme immunochemical assay of analytes by means of endogenous calibrators
EP2167965B1 (en) Method for detecting analytes
EP1385002A1 (en) Biosensor
Zhou et al. An amperometric immunosensor based on an electrochemically pretreated carbon–paraffin electrode for complement III (C3) assay
López et al. Electrochemical immunosensor for the detection of atrazine
Köneke et al. Reversible coupling of glucoenzymes on fluoride-sensitive FET biosensors based on lectin-glucoprotein binding
DE69211371T2 (en) Determination of high molecular weight analytes
Sun et al. A simple, highly sensitive, and label-free impedimetric immunosensor for detection of microcystin-LR in water
EP0571939A1 (en) Method and means for the determination of an analyte
DE4344646A1 (en) Device for a competitive immuno-assay for the detection of hapten(s)
DE4216980C2 (en) Immunosensory detection method
Nagy et al. Bioelectroanalytical sensors and analytical problems in their application
DE19545974C2 (en) Highly sensitive enzyme immunoassay for the determination of haptens and antigens and their use
Suresh et al. Detection of ricin in water samples using disposable screen-printed electrodes
Reshetilov Biosensor development in Russia
DE4214822C2 (en) Method and device for the continuous determination of substrates of oxidoreductases

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8127 New person/name/address of the applicant

Owner name: BST BIO SENSOR TECHNOLOGIE GMBH, 13156 BERLIN, DE

D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee