DE4117234A1

DE4117234A1 - Compsn. for heavy metal bio:sorption - comprises an alginate gel insoluble in water

Info

Publication number: DE4117234A1
Application number: DE19914117234
Authority: DE
Inventors: Winfried Prof Dr Ing Hartmeier
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-05-27
Filing date: 1991-05-27
Publication date: 1992-12-03

Abstract

Compsn. is of an alginate gel which does not dissolve in water. In application, it contains at least 150 g. as a dry alginate content per litre of gel vol. ADVANTAGE - The substance takes up at least 10 g. of heavy metals per 100 g. of the dry biosorbent mass and in a bed reactor, achieves a biosorption of at least 20 g. heavy metals per litre of reactor vol.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Präparat zur Biosorption von Schwermetallen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung sowie ein Verfahren zur Anwendung dieses Präparates.The invention relates to a preparation for the biosorption of heavy metals. Furthermore, the invention relates to a process for the preparation and a method for the use of this preparation.

Die zur Zeit gängigen Verfahren der Schwermetallentfernung aus Trinkwasser, Abwasser oder anderen Lösungen basieren überwiegend auf dem Einsatz von Ionen austauschern. Die Austauscherharze ermöglichen aber nur eine Reduktion des Schwermetallgehaltes bis in die Größenordnung von einigen Milligramm pro Liter. Die Restschwermetallentfernung bis unter die z. B. für Trinkwasser zulässigen Grenzwerte ist mit dieser Methode nicht möglich. Diese Restschwermetalle werden heute meistens durch eine nachträgliche Fällung z. B. mit Schwefelverbindungen ent fernt. Diese Verfahren sind sehr aufwendig und etwa für die Trinkwasser- oder Getränkebehandlung zum Teil nicht anwendbar oder zumindest bedenklich. Physika lisch-chemische Verfahren versagen oder sie werden extrem kostenaufwendig, wenn die Schwermetalle in nur geringer Konzentration, z. B. um oder unter 1 mg/l, vorliegen.The current methods of heavy metal removal from drinking water, Wastewater or other solutions are mainly based on the use of ions exchangers. However, the exchange resins only allow a reduction of the Heavy metal content up to the order of a few milligrams per liter. The residual heavy metal removal to below the z. B. permissible for drinking water Limits is not possible with this method. These residual heavy metals will be Today mostly by a subsequent precipitation z. B. ent with sulfur compounds removed. These processes are very complicated and about for the drinking water or Beverage treatment partly not applicable or at least questionable. Physika Chemical-chemical processes fail or they become extremely expensive if the heavy metals in low concentration, z. At or below 1 mg / L, available.

Neben Ionenaustausch- und Fällungsmethoden wird neuerdings auch die Biosorption mit Mikroorganismen in Betracht gezogen (RÖHRICHT ET AL., 1990). Schwermetalle adsorbieren bekanntermaßen z. B. an Bestandteile der Zelloberfläche oder andere Strukturelemente und auch an Ausscheidungsprodukte von Zellen. Hierzu gibt es Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen. KUYUCAK VOLESKY (1988) fanden z. B. die Cobalt-Biosorption an marinen Algen. LUEF ET AL. (1991) berichten über die Zinkbindung durch Pilzmycelien aus der Fermentationsindustrie. KUHN & PFISTER (1989) konnten mit dem Gram-negativen Bakterium Zoogloeo ramigera Cadmium ad sorbieren.In addition to ion exchange and precipitation methods, biosorption is becoming more and more popular with microorganisms considered (RÖHRICHT ET AL., 1990). heavy metals are known to adsorb z. B. to components of the cell surface or others Structural elements and also on excretion products of cells. There are Investigations of various working groups. KUYUCAK VOLESKY (1988) z. B. the cobalt biosorption on marine algae. LUEF ET AL. (1991) report the Zinc binding by mushroom mycelia from the fermentation industry. KUHN & PFISTER (1989) were able to cope with the Gram-negative bacterium Zoogloeo ramigera cadmium ad sorb.

Viele der bisherigen Verfahren zur Biosorption sind schon deshalb bedenklich, weil die zum Teil lebend eingesetzten Organismen mit ihrem Stoffwechsel auch uner wünschte Veränderungen im behandelten Medium bewirken können. Ein entschei dender Nachteil aller bisher bekannten Methoden der Biosorption ist ihre pro Reaktorvolumen nur geringe Schwermetall-Bindungsfähigkeit. Es gelingt bisher nämlich allenfalls einige Gramm Schwermetall pro Liter eines mit Biosorptionsmittel gefüllten Reaktors zu binden. Im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit der Biosorption wäre es aber wünschenswert, daß deutlich mehr als 10 Gramm Schwermetall pro Liter Reaktorvolumen gebunden werden können.Many of the previous methods for biosorption are already questionable, because the partially living organisms used with their metabolism also uner desired to effect changes in the treated medium. A decision The disadvantage of all previously known methods of biosorption is their pro Reactor volume only low heavy metal binding ability. It succeeds so far namely at most a few grams of heavy metal per liter of one with Biosorptionsmittel to bind to filled reactor. With regard to the economics of biosorption but it would be desirable that significantly more than 10 grams of heavy metal per Liter of reactor volume can be bound.

Es ist bekannt, daß das häufig zur Immobilisierung von Organismen als Hüllsubstanz verwendete Alginat in beschränktem Umfang Schwermetalle sorbieren kann. Für Alginatgel mit Zellen von Bacillus subtilis fanden RÖHRICHT ET AL. (1990) z. B. eine Biosorptionsleistung von 0,115 Gramm Schwermetall pro Liter Reaktorvolumen. Diese Schwermetallmenge wurde nach Aussage der Autoren aber nur zu 13% vom Alginatgel aufgenommen. Das heißt, durch Alginatgel wurden nur nur etwa 0,015 g Schwermetall pro Liter Reaktorvolumen gebunden. Die verwendeten Alginatgel kugeln wiesen dabei einen Trockensubstanzgehalt von 5% auf.It is known that this is often used to immobilize organisms as a shell substance used alginate can sorb in a limited extent heavy metals. For Alginate gel with cells from Bacillus subtilis found RÖHRICHT ET AL. (1990) z. Legs Biosorption capacity of 0.115 gram of heavy metal per liter of reactor volume. This amount of heavy metal, according to the authors, but only 13% of Alginate gel added. That is, alginate gel was only about 0.015 g Heavy metal bound per liter of reactor volume. The alginate gel used balls had a dry matter content of 5%.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe war es, ein immobilisier tes Präparat zur Biosorption von Schwermetallen herzustellen, das die oben ange führten Nachteile bisher bekannter Biosorbentien nicht aufweist. Die Schwermetall- Aufnahmekapazität des Biosorbens sollte mindestens 10 Gramm pro 100 g Biosor bens-Trockenmasse betragen. Bei Einsatz in einem Bettreaktor sollte mindestens eine Biosorption von 20 g Schwermetall pro Liter Reaktorvolumen erreicht werden. Des weiteren sollte ein Verfahren zur Herstellung sowie ein Verfahren zur wirt schaftlichen Anwendung des erfindungsgemäßen Präparates erstellt werden.The object underlying the present invention was to immobilize To prepare the preparation for the biosorption of heavy metals, the above ange has shown disadvantages of previously known Biosorbentien not. The heavy metal Absorption capacity of the biosorbent should be at least 10 grams per 100 g Biosor amount of dry matter. When used in a bed reactor, at least a biosorption of 20 g heavy metal per liter reactor volume can be achieved. Furthermore, a process for the production and a method of Wirt should Economic application of the preparation of the invention are created.

Das erfindungsgemäße Präparat besteht aus durch ionotrope Gelbildung und/oder durch andere, z. B. quervernetzende Maßnahmen, wasserunlöslich gemachtem Alginatgel, das im befeuchteten Zustand einen Alginat-Trockensubstanzgehalt von mindestens 150 Gramm pro Liter Gelvolumen aufweist. Dabei ist mit Gelvolumen dasjenige Volumen des Präparates gemeint, das sich unter Anwendungsbedingungen in der zu behandelnden schwermetallhaltigen Lösung einstellt. Vorzugsweise beträgt der Trockensubstanzgehalt des Gels gemäß der Erfindung 200 bis 350 Gramm pro Liter Gelvolumen unter Anwendungsbedingungen.The preparation according to the invention consists of ionotropic gel formation and / or by others, e.g. B. cross-linking measures, made insoluble in water Alginate gel which, when moistened, has an alginate dry matter content of has at least 150 grams per liter of gel volume. It is with gel volume that volume of the preparation meant under conditions of use in the heavy metal-containing solution to be treated. Preferably the dry matter content of the gel according to the invention 200 to 350 grams per Liters of gel volume under conditions of use.

Überraschend wurde gefunden, daß mit Alginatgel - entgegen der Literaturmeinung - nicht nur Bruchteile eines Gramms sondern über 15 Gramm Schwermetall pro 100 Gramm Trockensubstanz sorbiert werden können. Das Alginatgel muß dazu aller dings auf eine deutlich höhere als die übliche Dichte gebracht und zur Biosorption eingesetzt werden. Mit einem derartigen Präparat, das vorzugsweise 200 bis 300 Gramm Alginat-Trockensubstanz pro Liter Gelvolumen unter Anwendungs bedingungen aufweist, werden bei Einsatz in einem Bettreaktor mehr als 25 g Schwermetall pro Liter Reaktorvolumen aufgenommen.Surprisingly it was found that with alginate gel - contrary to the literature - not just fractions of a gram but over 15 grams of heavy metal per 100 Grams of dry matter can be sorbed. The alginate gel must do all of this recently brought to a much higher than the usual density and for biosorption be used. With such a preparation, preferably 200 to 300 Grams of alginate dry matter per liter gel volume under application conditions when used in a bed reactor more than 25 g Heavy metal added per liter of reactor volume.

Das erfindungsgemäß Präparat ist regenerierbar, das heißt gebundenes Schwermetall kann durch geeignete Maßnahmen, wie z. B. die Spülung mit angesäuerter Calcium chloridlösung, wieder entfernt worden. Das auf diese oder eine andere Weise regenerierte Präparat kann erneut zur Schwermetallbiosorption eingesetzt werden. Gewünschten falls kann das in der Waschlösung konzentriert vorliegende Schwermetall aus dieser Waschlösung gewonnen werden. Eine Metallgewinnung ist mit dem erfindungs gemäßen Präparat aber auch durch Verbrennung des metallbeladenen Präparates nach der Biosorption möglich. Das Schwermetall bleibt dann als unverbrennbarer Rückstand zurück.The preparation according to the invention is regenerable, that is bound heavy metal can by suitable measures, such as. As the rinse with acidified calcium chloride solution, again removed. That regenerated in this or another way The preparation can be used again for heavy metal biosorption. desired if the heavy metal concentrated in the washing solution can be made from this Wash solution can be obtained. A metal extraction is with the invention proper preparation but also by burning the metal-loaded preparation possible after biosorption. The heavy metal then remains as incombustible Backlog.

Das erfindungsgemäße Präparat kann dadurch hergestellt werden, daß normalem Alginatgel Wasser entzogen und/oder die Kugeln mit Vernetzungsmitteln behandelt werden. Der Wasserentzug aus dem immobilisierten Alginat kann auf verschiedene Weise, z. B. durch normale Trocknung, durch Vakuumtrocknung oder durch Behandlung mit entwässernden Lösungsmitteln erfolgen. Durch den Wasserentzug soll der Restfeuchtegehalt des Präparates auf unter 20%, vorzugsweise auf weniger als 12% abgesenkt werden. Der mehr oder weniger vollständige Entzug des Wassers aus dem Alginatgel hat zur Folge, daß das Alginatgel auch bei Wiedereinbringung in wäßrige, z. B. schwermetallhaltige, Lösungen nicht wieder auf sein ursprüngliches Volumen anschwillt sondern eine deutlich höhere Dichte als ein unbehandeltes Gel behält. Die Schwermetall-Aufnahmefähigkeit dieses verdichteten Gels ist um mehrere Zehnerpotenzen gegenüber normalem Alginatgel gesteigert.The preparation according to the invention can be prepared by using normal Alginate gel deprived of water and / or the balls treated with crosslinking agents become. The dehydration of the immobilized alginate can be on different Way, z. B. by normal drying, by vacuum drying or by Treatment with dehydrating solvents. By the dehydration The residual moisture content of the drug should be less than 20%, preferably less be lowered as 12%. The more or less complete withdrawal of the water from the Alginatgel has the consequence that the Alginatgel even when reintroduced in aqueous, z. B. containing heavy metals, solutions not back to its original Volume swells but a much higher density than an untreated gel reserves. The heavy metal uptake capacity of this compacted gel is around several orders of magnitude increased compared to normal alginate gel.

Eine alleinige oder zusätzliche Stabilisierung des Alginatgels kann auch durch Vernetzung mit bi- oder mehrfunktionellen Rewagenzien erfolgen. Als vernetzende Reagenzien kommen Glutardialdehyd, Epichlorhydrin, Diisocyanate, Diisothio cyanate und andere in Betracht. Die Vernetzung kann vor oder nach den obener wähnten Wasserentziehungsmaßnahmen erfolgen.A sole or additional stabilization of the alginate gel can also by Crosslinking with bi- or polyfunctional Rewagenzien done. As networking Reagents include glutaraldehyde, epichlorohydrin, diisocyanates, diisothio cyanate and others. The networking can be done before or after the above mentioned dehydration measures take place.

Gewünschtenfalls kann das Alginatgel mit anderen, auch biologisch aktiven, Substan zen zusammen zur Anwendung gebracht werden. Das erfindungsgemäße Präparat kann in verschiedenen Formen, z. B. als Kugeln, Fäden, Folien o. ä., hergestellt werden. Als Reaktoren, in denen die Anwendung erfolgen kann, kommen insbeson dere Pack- und Fließbettreaktoren, aber auch andere Reaktortypen in Betracht. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, daß die Präparate in Kugelform vorliegen, die in Kartuschen gepackt werden. Diese Kartuschen können in geeigneten Reak toren leicht eingebracht und ausgetauscht werden.If desired, the alginate gel with other, even biologically active, Substan be applied together. The preparation according to the invention can in different forms, eg. B. as balls, threads, films o. Ä., Made become. As reactors in which the application can take place, in particular other packing and fluidized bed reactors, but also other types of reactors. A particular embodiment of the invention provides that the preparations in spherical form present, which are packed in cartridges. These cartridges can react in suitable easily inserted and replaced.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern ohne sie zu beschränken.The following examples are intended to illustrate the invention without limiting it.

Example 1: Preparation of the preparation according to the invention

26 g eines handelsüblichen Natriumalginates ("Manugel DJX" von Kelco Int. Ltd., Rödlingsmarkt 52, 2000 Hamburg 11) werden in 1 Liter destilliertes Wasser eingerührt. Unter weiterem Rühren wird die Mischung auf etwa 80°C erwärmt und solange weiter gerührt bis das Alginat nach einigen Minuten in Lösung gegangen ist. Die Lösung wir 20 Minuten bei 121°C in einem Autoclav sterilisiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Alginatlösung durch Injektionsspritzen ohne Kanüle aus etwa 10 cm Höhe in 1 molare Calciumchloridlösung tropfen gelassen. Dabei wir die Calciumchloridlösung stets schwach gerührt. Nach mindestens 1-stündiger Aus härtung in der 1 molaren Calciumchloridlösung, werden die Kugeln entnommen, mit dest. Wasser abgespült und, ausgebreitet auf Filterpapier, im Trockenschrank 24 Stunden bei 80°C getrocknet. Durch die Trocknung schrumpfen die Alginatgelkugeln von einem Durchmesser von etwa 4 auf etwa 1 mm. Bei anschließender Wiederein bringung in Wasser schwellen die Alginatgelkugeln nicht wieder auf ihr ursprüng liches Feuchtvolumen an, sondern sie erreichen einen Durchmesser von etwa 2 mm und einen Trockensubstanzgehalt von etwa 25 g pro 100 ml Gelvolumen.26 g of a commercially available sodium alginate ("Manugel DJX" from Kelco Int Ltd., Rödlingsmarkt 52, 2000 Hamburg 11) are in 1 liter of distilled water stirred. With further stirring, the mixture is heated to about 80 ° C and while stirring until the alginate has gone into solution after a few minutes. The solution is sterilized for 20 minutes at 121 ° C in an autoclave. After cooling At room temperature, the alginate solution is injected by syringes without cannula from about 10 cm high in 1 molar calcium chloride solution drop. Here we The calcium chloride solution is always stirred gently. After at least 1 hour off hardening in the 1 molar calcium chloride solution, the balls are removed, with least. Rinse off water and, spread on filter paper, in the drying cabinet 24 Hours dried at 80 ° C. Drying shrinks the alginate gel beads from a diameter of about 4 to about 1 mm. With subsequent Wiedererein In water, the alginate gel balls do not swell back to their original shape Weish wet volume, but they reach a diameter of about 2 mm and a dry matter content of about 25 g per 100 ml gel volume.

Example 2: Application of the preparation according to the invention

15 g der gemäß Beispiel 1 hergestellten getrockneten Alginatgelkugeln werden 30 Minuten lang durch Einbringen in Wasser rehydratisiert und dann in eine 100 ml Gesamtvolumen aufweisende Säule mit 2 cm Innendurchmesser und 32 cm Länge eingefüllt. Die Säule wird am unteren und am oberen Ende mit einem Sieb von 0,2 mm Maschenweite begrenzt, so daß die Alginatgelperlen nicht austreten können. Durch die mit den Alginatgelkugeln beladene Säule wird mittels Schlauchpumpe eine wäßrige Kupfersulfatlösung von unten nach oben mit einer Pumprate von 100 ml/h durchgepumpt. Die wäßrige Kupfersulfatlösung ist auf einen Cu⁺⁺-Gehalt von genau 300 mg/l eingestellt. In Abständen wird der Kupfergehalt im Auslauf des Säulenreaktors geprüft. Tabelle 1 zeigt die durch Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) ermittelten Werte. 15 g of the dried alginate gel beads prepared according to Example 1 are rehydrated for 30 minutes by introduction into water and then filled into a 100 ml total volume column with 2 cm inner diameter and 32 cm in length. The column is bounded at the bottom and at the top with a sieve of 0.2 mm mesh size, so that the alginate gel beads can not escape. Through the column loaded with the alginate gel balls, an aqueous copper sulphate solution is pumped from the bottom to the top by means of a peristaltic pump at a pumping rate of 100 ml / h. The aqueous copper sulfate solution is adjusted to a Cu ⁺⁺ content of exactly 300 mg / l. At intervals, the copper content in the outlet of the column reactor is checked. Table 1 shows the values obtained by atomic absorption spectrometry (AAS).

Zeit [h]Time [h] Kupfer im Auslauf [mg/l]Copper in the outlet [mg / l] 11 0,040.04 22 0,050.05 55 0,020.02 2424 0,050.05 4848 0,030.03 7272 0,030.03 9696 0,060.06 120120 1,621.62 144144 286286

Die Ergebnisse von Beispiel 2 zeigen, daß unter den gewählten Bedingungen mehr als 3 g Kupfer durch das erfindungsgemäße Präparat in der 100 ml-Säule also über 30 Gramm pro Liter Reaktor-Gesamtvolumen - zurückgehalten werden. Das Beispiel belegt damit die hohe Biosorptionsleistung des erfindungsgemäßen Präparates. Wei terhin wird deutlich, daß der Schwermetallgehalt wäßriger Lösungen von dem hohen Ausgangswert von 300 mg/l auf unter 0,05 mg/l in einem einzigen Durchlauf gesenkt wird.The results of Example 2 show that under the chosen conditions more than 3 g of copper through the preparation of the invention in the 100 ml column so over 30 grams per liter of reactor total volume - to be retained. The example thus proves the high biosorption performance of the preparation according to the invention. Wei terhin it becomes clear that the heavy metal content of aqueous solutions of the high Baseline value decreased from 300 mg / l to less than 0.05 mg / l in a single run becomes.

Example 3: Regeneration and renewed use of the preparation according to the invention

Regenerierung. Aus dem Anwendungsversuch gemäß Beispiel 2 wird durch die nach 144 h Gebrauch kupferbeladene Gelfüllung mit 600 ml Waschlösung mit einer Fließ rate vom 200 ml/h durchgespült. Die Waschlösung besteht aus 2-molarer mit HCl auf pH 1,5 angesäuerter Calciumchloridlösung. Die gesammelte Waschlösung weist einen Kupfergehalt von 4 g/l auf. Dann werden die Alginatgelkugeln aus dem Reaktor ent nommen, in 600 ml frischer Waschlösung suspendiert. Nach 60 Minuten werden die Gelkugeln mit dest. Wasser abgespült und wieder in den Reaktor eingebracht. Ab schließend erfolgt eine weitere Spülung mit 300 ml Waschlösung und 300 ml Wasser.Regeneration. From the application experiment according to Example 2 is by 144 h Use copper-loaded gel filling with 600 ml washing solution with one pour rate of 200 ml / h rinsed. The wash solution consists of 2 molar HCl pH 1.5 acidified calcium chloride solution. The collected wash solution has one Copper content of 4 g / l. Then the alginate gel beads are removed from the reactor taken, suspended in 600 ml of fresh washing solution. After 60 minutes, the Gel balls with dist. Rinsed off water and introduced back into the reactor. from Finally, a further rinse with 300 ml of washing solution and 300 ml of water.

Erneuter Einsatz. Durch die mit den regenerierten Alginatgelkugeln beladene Säule wird mittels Schlauchpumpe eine wäßrige Kupfersulfatlösung von unten nach oben mit einer Pumprate von 500 ml/h durchgepumpt. Die wäßrige Kupfersulfatlösung ist auf einen Cu⁺⁺-Gehalt von 3 mg/l eingestellt. In Abständen wird der Kupfergehalt im Auslauf des Säulenreaktors geprüft. Tabelle 2 zeigt die durch Atomabsorptions spektrometrie (AAS) ermittelten Werte.Reuse. By means of the column loaded with the regenerated alginate gel balls, an aqueous copper sulphate solution is pumped from bottom to top by means of a peristaltic pump at a pumping rate of 500 ml / h. The aqueous copper sulfate solution is adjusted to a Cu ⁺⁺ content of 3 mg / l. At intervals, the copper content in the outlet of the column reactor is checked. Table 2 shows the values determined by atomic absorption spectrometry (AAS).

Zeit [h]Time [h] Kupfer im Auslauf [mg/l]Copper in the outlet [mg / l] 11 0,040.04 2424 0,050.05 4848 0,040.04 7272 0,020.02 9696 0,060.06 120120 0,030.03 144144 0,040.04

Neben der Regenerierbarkeit zeigt das Beispiel 3 auch die Möglichkeit des Einsatzes des erfindungsgemäßen Präparates für stark verdünnte Schwermetallösungen.In addition to the regenerability, Example 3 also shows the possibility of use of the preparation according to the invention for highly diluted heavy metal solutions.

Quoted literature

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Claims

1. preparation for the biosorption of heavy metals, characterized in that it consists essentially of water-insoluble alginate gel, the conditions of use at least 150 g alginate dry matter content per liter gel volume.

2. Preparation according to claim 1, characterized in that it is under use conditions an alginate dry matter content between 200 and 350 grams per Liter.

3. A preparation according to claim 1 and / or 2, characterized in that it is spherical with 0.3 to 3 mm diameter under application conditions.

4. A process for the preparation of a preparation for the biosorption of heavy metals, characterized in that prepared in a conventional manner Alginatgel is subjected to drying, the moisture content of the preparation to below 20%, preferably lowered to less than 12%.

5. The method according to claim 4, characterized in that the drying by thermal treatment is carried out under normal pressure or under vacuum.

6. The method according to claim 4, characterized in that the drying by dehydrating solvent takes place.

7. The method according to one or more of claims 4 to 6, characterized marked records that the preparation additionally cross-linking measures with bi- or is subjected to polyfunctional reagents.

8. A process for the biosorption of heavy metals, characterized in that to a preparation according to claim 1, 2 or 3 is used.

9. The method according to claim 8, characterized in that the heavy metal biosorption is carried out in a reactor containing a preparation according to one of Claims 1, 2 or 3 in a packing density of at least 100 grams dry contains substance per liter.

10. The method according to claim 8 and / or 9, characterized in that the Präpa rat in an exchangeable cartridge in one for receiving this cartridge suitable reactor is applied.