DE4115297A1 - Assay to distinguish Corynebacteria and Brevibacteria - by differences in growth and homo-serine dehydrogenase gene fragments for C. glutamicum, B. flavum and B. lactofermentum - Google Patents

Assay to distinguish Corynebacteria and Brevibacteria - by differences in growth and homo-serine dehydrogenase gene fragments for C. glutamicum, B. flavum and B. lactofermentum

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Abstract

An assay to distinguish Corynebacterium glutamicum (C. glut.), Brevibacterium flavum (B. fla.) and B. lactofermentum (B. Lac.) by the determn. of the optical density after growth (i) in suitable medium without C-source, (ii) with trehalose as a C-source, (iii) pref. in the medium BMCG (Liebl et al, Appl. Microbil. Biotechnology (1989), 32: 205-210) with (ii) or without a C-source, (iv) pref. in either of (i)-(iii), followed by growth on plates contg. ethionine in the medium and by the determn. of colony growth. Also claimed is a detection assay for the presence of 5'-DNA of the hom-gene (homoserine dehydrogenase from C. glut). The assays above can be used individually or in combination with another method. USE/ADVANTAGE - The mentioned bacteria are useful in industry for the prodn. of L-aminoacids. Provides the first method for a taxonomic distinction between the 3 species and any mutants developed can be distinguished

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Unterscheidung von Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium flavum sowie Brevibacterium lactofermentum.The invention relates to a method for Distinction of Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum.

Coryneforme Bakterien sind pleomorph, asporogen und gram-positiv. Unter den 22 Gattungen, die unter der Bezeichnung Corynebakterien zusammengefaßt werden (Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology (1986) befinden sich die industriell sehr bedeutenden Species Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum und Brevibacterium lactofermentum. Diese Species werden für die Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Glutaminsäure, L-Lysin u. a. eingesetzt. Die Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium sind Ausgangspunkt zahlreicher Entwicklungslinien zu Mutanten mit industriell wichtigen Produktions­ eigenschaften. Zu nennen sind hier vor allem die von der Stammsammlung ATCC erhältlichen Stämme Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) Brevibacterium flavum (ATCC 14067) und Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) Trotz dieser industriellen Bedeutung ist die taxonomische Unterscheidung der Gattungen Brevibacterium und Corynebacterium bis heute nicht für alle Species dieser Gattungen möglich. So bezeichnet ATCS den Stamm ATCC 14067 nach wie vor als Brevibac­ teriumn flavum, während der Katalog der Stammsammlung DSM diese Zuordnung als "invalid species" verwirft. R. Keddie und D. Jones bezeichnen Corynebacterium gluta­ micum und Brevibacterium flavum als synonyme Namen (in The Prokaryotes; eds. Starr, Stolp, Trüper, Ba­ lows, Schlegel: Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York (1981), Vol. II, Seite 1838 ff.).Coryneform bacteria are pleomorphic, asporogenous and Gram-positive. Among the 22 genera under the Name Corynebacteria be summarized (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986) are the industrially very important species Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum. These species will for the production of L-amino acids, in particular L-glutamic acid, L-lysine and the like a. used. The Genera Corynebacterium and Brevibacterium are Starting point of numerous development lines too Mutants with industrially important production properties. To mention here are especially those of Strains ATCC available strains Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) Brevibacterium flavum (ATCC 14067) and Brevibacterium lactofermentum (ATCC 13869) Despite this industrial importance is the taxonomic distinction of the genera Brevibacterium and Corynebacterium not until today all species of these genera possible. So called ATCS the strain ATCC 14067 still as Brevibac teriumn flavum, while the catalog of the trunk collection DSM rejects this assignment as "invalid species". R. Keddie and D. Jones refer to Corynebacterium gluta micum and Brevibacterium flavum as synonymous names  (in The Prokaryotes, eds. Starr, Stolp, Trüper, Ba lows, Schlegel: Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York (1981), Vol. II, page 1838 ff.).

Zur selben Aussage kommen R. Keddie und G. Cure (in: Coryneform Bacteria; eds. Bousfield und Callely; Academic Press London, Hew York, San Francisco (1978) Seite 47 ff.). In der 8. Auflage von Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology (1974) werden Brevibacterium flavum und Brevibacterium lactofermentum unter Species incertae sedis genannt; in Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol. II (1986) fehlen diese Species.R. Keddie and G. Cure (in: Coryneform bacterium; eds. Bousfield and Callely; Academic Press London, Hew York, San Francisco (1978) Page 47 ff.). In the 8th edition of Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum called species incertae sedis; in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. II (1986) these species are missing.

Aufgrund der industriellen Bedeutung wäre es wünschenswert, die angesprochenen Gattungen taxonomisch unterscheiden zu können.Because of the industrial significance it would be desirable, the mentioned genera to distinguish taxonomically.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Methode zur Unterscheidung dieser Species bereitzustellen.The object of the invention is therefore to provide a method for To provide differentiation of these species.

Es wurde gefunden, daß es drei Wege gibt, um die Zugehörigkeit oder Nichtzugehörigkeit zu einer der genannten Species festzustellen.It has been found that there are three ways around the Belonging or not belonging to one of the ascertained species.

Den sichersten Rückhalt bietet natürlich die Kombi­ nation aller drei Methoden, wobei aber auch die Einzelprüfungen im allgemeinen eine hinreichende Aussage über die Einordnung ermöglichen. Of course, the safest support is the station wagon nation of all three methods, but also the Individual tests in general a sufficient Allow statement about the classification.  

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Unterscheidung von Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium flavum sowie lactofermentum in einem oder mehreren Verfahrensschritten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die zu untersuchenden Stämme in einem geeigneten Testmedium ohne C-Quelle bzw. mit Trehalose als C Quelle bebrütet, die optische Dichte während der Anzucht bzw. an deren Endpunkt bestimmt und die gefundenen Werte miteinander vergleicht.The invention relates to a method for Distinction of Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium flavum and lactofermentum in one or a plurality of method steps thereby characterized in that one to be examined Strains in a suitable test medium without C source or incubated with trehalose as C source, the optical Density during cultivation or at its endpoint determined and the values found together compares.

Geeignet heißt in diesem Fall, daß die Stämme in dem Medium wachsen, die jeweils geeignete Temperatur ist dann dem Fachmann bekannt.Suitable in this case means that the strains in the Grow medium, each of which is suitable temperature then known to the skilled person.

Ein geläufiges Anzuchtmedium ist z. B. das bei Liebl et al., Appl. Microbil. Biotechnol. (1989) 32:205-210, beschriebene Medium BMCG.A common culture medium is z. B. in Liebl et al., Appl. Microbil. Biotechnol. (1989) 32: 205-210, described medium BMCG.

Als besonders brauchbar für die Unterscheidung haben sich Trehalose-Konzentrationen von 0,1 bis 10 g/l, insbesondere 2 bis 5 g/l erwiesen.To be particularly useful for the distinction trehalose concentrations of 0.1 to 10 g / l, in particular 2 to 5 g / l proved.

Besonders zweckmäßig ist es, die optische Dichte mindestens über ca. 7 h hinweg ca. alle 60 Minuten zu bestimmen und/oder einen Endpunkt nach mindestens 10 bis 24 h zu messen.It is particularly useful, the optical density at least for about 7 hours approximately every 60 minutes determine and / or an endpoint after at least 10 to measure until 24 h.

Das Animpfen und Bebrüten des Testmediums erfolgt nach allgemein üblichen Methoden.The inoculation and incubation of the test medium takes place after common methods.

Es zeigt sich, daß die optische Dichte der mit Corynebacterium glutamicum beimpften Medien sich nur geringfügig unterscheidet, gleichgültig ob diese Trehalose enthalten oder von C-Quellen frei sind. Dabei findet man mit Trehalose-haltigen Medien häufig sogar niedrigere optische Dichten (s. Tab. 1). It turns out that the optical density of the Corynebacterium glutamicum inoculated media only slightly different, regardless of whether this Contain trehalose or are free from C sources. One finds frequently with trehalose-containing media even lower optical densities (see Table 1).  

Im Gegensatz dazu steigt die opitsche Dichte deutlich an, wenn ein solches Medium mit Brevibacterium flavum oder lactofermentum beimpft wurde.In contrast, the opitsche density increases clear when using such a medium Inoculated Brevibacterium flavum or lactofermentum has been.

Diese Verhalten ermöglicht die Unterscheidung, insbesondere bei prototrophen Stämmen. Aber auch auxotrophe Stämme sind so zu überprüfen, wenn sichergestellt ist, daß die benötigten Supplemente nicht als C-Quelle verwertet werden.This behavior allows the distinction especially in prototrophic strains. But also auxotrophic strains are to be checked so if it is ensured that the required supplements not be used as C source.

Um aber das Ergebnis des beschriebenen Verfahrens zu bestätigen, insbesondere auch für auxotrophe Stämme, wird bei erhöhten Anforderungen das Testmedium, bevorzugt das Gleiche wie im ersten Test, mit 0,1 bis 0,6 g/l des Methionin-Analogons Ethionin versetzt, mit den zu untersuchenden Stämmen bespatelt und das Wachstum im allgemeinen nach 24 h und 48 h (insbesondere bei 30°C) beurteilt.But to the result of the method described confirm, especially for auxotrophic strains, if the test medium becomes more demanding, prefers the same as in the first test, with 0.1 to 0.6 g / l of methionine analog ethionine added, with bespatelt the strains to be examined and the Growth generally after 24 h and 48 h (especially at 30 ° C) assessed.

Dabei zeigt sich, daß Stämme von Corynebacterium glutamicum resistent gegen Ethionin sind, während Brevibacterium flavum oder lactofermentum sensibel reagieren.It shows that strains of Corynebacterium glutamicum are resistant to ethionin while Brevibacterium flavum or lactofermentum sensitive react.

Bevorzugt werden mit diesem Verfahrens schritt Stämme überprüft, die nicht gegen ein gegen Ethionin kreuz­ resistentes Aminosäureanalogon resistent sind (z. B. AHVr).Preferably, this method is used to check strains which are not resistant to an amino acid analogue that is cross resistant to ethionine (eg AHV r ).

In einer bevorzugten Variante schließt man zur weiteren Absicherung der vorher gewonnenen Aussagen eine Untersuchung von Genomfragmenten an.In a preferred variant, one concludes the further protection of the previously obtained statements an investigation of genomic fragments.

Es wurde nämlich gefunden, daß Unterschiede im 5′- Bereich der DNA vor dem hom-Gen die eindeutige Einordnung der drei Species ermöglichen. It was found that differences in the 5 ' Range of DNA before the hom gene the unique Classify the three species.  

Mit Hilfe der an sich bekannten Hybridisierungstechnik und einer geeigneten DNA-Probe aus dem angesprochenen Genombereich können Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum und Brevibacterium lactofermentum einfach und schnell voneinander unterschieden werden.With the help of the known hybridization technique and a suitable DNA sample from the mentioned Genome area can Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum easily and quickly from each other be differentiated.

Die Proben hybridisieren in Corynebacterium glutamicum Stämmen gegen eine 2,75 kb und eine 0,68 kb chromosomale DNA-Bande, in Brevibacterium flavum Stämmen gegen eine 2,35 kb und eine 0,68 kb Bande und in Brevibacterium lactofermentum Stämmen gegen eine 5,2 kb und eine 0,68 kb Bande.The samples hybridize in Corynebacterium glutamicum Strains against a 2.75 kb and a 0.68 kb chromosomal DNA band, in Brevibacterium flavum Strains against a 2.35 kb and a 0.68 kb band and in Brevibacterium lactofermentum strains against a 5.2 kb and a 0.68 kb band.

BeispieleExamples

Die Beispiele beziehen sich auch folgende Stämme:The examples also refer to the following strains:

Corynebacterium glutamicumCorynebacterium glutamicum ATCC13032ATCC13032 Corynebacterium glutamicumCorynebacterium glutamicum ATCC13287ATCC13287 Corynebacterium glutamicumCorynebacterium glutamicum ASO19ASO19 Corynebacterium glutamicumCorynebacterium glutamicum DM368-3DM368-3 Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum ATCC14067ATCC14067 Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum ATCC21128ATCC21128 Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum ATCC21269ATCC21269 Brevibacterium lactofermentumBrevibacterium lactofermentum ATCC13869ATCC13869 Brevibacterium lactofermentumBrevibacterium lactofermentum ATCC21086ATCC21086

1. Optische Dichte (OD) in Abhängigkeit von der 6-Quelle Trehalose.
Medium BMCG (Liebl et al. ) ohne C-Quelle, bzw. 3 g/l Trehalose wird mit dem Teststamm angeimpft, so daß die optische Dichte bei 600 nm und der Schichtdicke 1 cm ca. 0,4 beträgt. Die Bebrütung erfolgt unter Schütteln bei 30°C. Die optische Dichte wird über mindestens 7 h alle 60 Minuten bestimmt oder nur der Endpunkt nach mindestens 24 h gemessen.1. Optical density (OD) as a function of the 6-source trehalose.
Medium BMCG (Liebl et al.) Without C source, or 3 g / l trehalose is inoculated with the test strain, so that the optical density at 600 nm and the layer thickness 1 cm is about 0.4. The incubation takes place with shaking at 30 ° C. The optical density is determined for at least 7 h every 60 minutes or only the end point is measured after at least 24 h.

Die Entwicklung der OD von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacteriumn flavum ATCC 14067 und Brevibacterium lactofermentum ATCC 13089 zeigen die Abb. 1 bis 3. Die optische Dichte anderer Teststämme nach 24 h ist in der Tabelle 1 aufgelistet und der Zuwachs an optischer Dichte im Vergleich zum Medium ohne C-Quelle in Abb. 4 grafisch dargestellt. The development of the OD of Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Brevibacterium flavum ATCC 14067 and Brevibacterium lactofermentum ATCC 13089 are shown in Figures 1 to 3. The optical density of other test strains after 24 hours is listed in Table 1 and the increase in optical density compared to the medium without C source in Fig. 4 graphically displayed.

In den vorliegenden Beispielen werden nur prototrophe Stämme, die keine als C-Quelle verwertbare Supplemente benötigen, aufgeführt. ATCC13287 (hse-) und ATCC21086 (val-, ile-) fehlen in der Tabelle, obwohl sie sich entsprechend den erfindungsgemäßen Merkmalen verhalten, da die Verwertung der notwendigen Supplemente aufgrund der ansonsten vorhandenen Nachweise nicht mehr überprüft wurde.In the present examples, only prototrophic strains that do not require supplements useful as C source are listed. ATCC13287 (hse - ) and ATCC21086 (val - , ile - ) are missing in the table, although they behave according to the characteristics of the invention, since the utilization of the necessary supplements was no longer checked due to the otherwise existing evidence.

Tabelle 1 Table 1

OD in Medium ohne C-Quelle, mit Saccharose oder mit Trehalose nach 24 h OD in medium without C source, with sucrose or with trehalose after 24 h

Die optische Dichte von Corynebacterium glutamicum und abgeleiteten Mutanten steigt in Trehalose­ haltigem Medium nicht, während die OD von Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium flavum mit der C-Quelle zunimmt. The optical density of Corynebacterium glutamicum and derived mutants increase in trehalose medium, while the OD of Brevibacterium lactofermentum and Brevibacterium flavum increases with the C source.  

2. Resistenz gegen Ethionin Gradientenplatten mit 0 bis 0,5 g/l Ethionin in Medium BMCG (Liebl et al) werden mit dem Teststamm bespatelt und das Koloniewachstum nach 24 h und 48 h (30°C) beurteilt. Das Ergebnis für die drei Wildstämme und abgeleitete Mutanten zeigt Tab. 2. Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) ist resistent, während Brevibacterium flavum (ATCC14067) und Brevibacterium lactofermentum (ATCC13869) sensibel sind.2. Resistance to ethionine Gradient plates with 0 to 0.5 g / l ethionin in Medium BMCG (Liebl et al) are used with the test strain bespatelt and the colony growth after 24 h and 48 h (30 ° C) assessed. The result for the three Wild strains and derived mutants are shown in Tab. 2. Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) resistant while Brevibacterium flavum (ATCC14067) and Brevibacterium lactofermentum (ATCC13869) are sensitive.

Tabelle 2 Table 2

Wachstum auf Ethionin-Gradientenplatten Growth on ethionine gradient plates

In diese Untersuchung wurden nur Stämme einbezogen, die nicht gegen ein Ethionin kreuzresistentes Aminosäureanalogen resistent sind. Deshalb fehlen ATCC21269 (AHVr) und DM368-3 (AHVr). Only strains that are not resistant to an ethionin cross-resistant amino acid analogue were included in this study. Therefore, ATCC21269 (AHV r ) and DM368-3 (AHV r ) are missing.

3. Unterschied im Restriktionsmuster eines hom benachbarten Genomfragments bei Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum und Brevibacterium lactofermentum.3. difference in the restriction pattern of a hom neighboring genome fragments in Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum and Brevibacterium lactofermentum.

Je 10 µg chromosomaler DNA von10 μg each of chromosomal DNA from

C. glutamicumC. glutamicum ATCC13032ATCC13032 C. glutamicumC. glutamicum ATCC13287ATCC13287 C. glutamicumC. glutamicum ASO19ASO19 C. glutamicumC. glutamicum DM368-3DM368-3 B. flavumB. flavum ATCC14067ATCC14067 B. flavumB. flavum ATCC21128ATCC21128 B. flavumB. flavum ATCC21269ATCC21269 B. lactofermentumB. lactofermentum ATCC13869ATCC13869 B. lactofermentumB. lactofermentum ATCC21086ATCC21086

werden 120 min in 100 µl Puffer M (Boehringer) bei 37°C mit der Restriktionsendonuklease PvuII behandelt, anschließend mit Ethanol gefällt, in 10 µl 10mM Tris(Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan/1mM EDTA ph 7,6 aufgenommen, auf einem 0,8% Agarosegel der Größe nach aufgetrennt und auf eine Nylonmembrane übertragen. Die chromosomale DNA auf dem Filter wurde anschließend gegen ein 1,3 kb KpnI DNA-Fragment, welches das Gen hom für die Homoserin-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum trägt, hybridisiert und detektiert (DIG DNA Labeling and Detection Kit; Boehringer). are added in 100 μl buffer M (Boehringer) for 120 min 37 ° C with the restriction endonuclease PvuII treated, then precipitated with ethanol, in 10 ul 10 mM Tris (tris- (hydroxymethyl) -aminomethane / 1 mM EDTA ph 7.6 recorded, at 0.8% Agarose gel size separated and on a Transfer nylon membrane. The chromosomal DNA on The filter was then against a 1.3 kb KpnI DNA fragment containing the gene hom for the Homoserine dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum carries, hybridizes and detects (DIG DNA Labeling and Detection Kit; Boehringer).  

Das KpnI-Fragment wird aus pEK-hom-thrB1 isoliert. Es ist beschrieben in B. Eikmanns, M. Metzger, D. Rein­ scheid, M. Kircher, H. Sahm "Amplification of three threonine biosynthesis genes in (orynebacterium glutamicum and its influence on carbon flux in different strains" Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34:617-622.The KpnI fragment is isolated from pEK-hom-thrB1. It is described in B. Eikmanns, M. Butcher, D. Rein Scheid, M. Kircher, H. Sahm "Amplification of three threonine biosynthesis genes in (orynebacterium glutamicum and its influence on carbon flux in different strains "Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34: 617-622.

Abb. 5 zeigt, daß die verwendete Probe in allen Corynebacterium glutamicum Stämmen gegen eine 2,75 kb und eine 0,68 kb chromosomale DNA-Bande, in allen Brevibacterium flavum Stämmen gegen eine 2,35 kb und eine 0,68 kb Bande und in den beiden Brevibacterium lactofermentum Stämmen gegen eine 5,2 kb und eine 0,68 kb Bande hybridisiert. Figure 5 shows that the sample used in all Corynebacterium glutamicum strains against a 2.75 kb and a 0.68 kb chromosomal DNA band, in all Brevibacterium flavum strains against a 2.35 kb and a 0.68 kb band and in the two Brevibacterium lactofermentum strains hybridized against a 5.2 kb and a 0.68 kb band.

Diese Unterschiede im 5′-Bereich der DNA vor dem hom Gen ermöglichen eine Unterscheidung der drei Species. Der gezeigte Unterschied im 5′-Bereich der DNA vor dem hom-Gen kann auch durch Hybridisierung der KpnI-Probe gegen Asp 700 verdaute chromosomale DNA nachgewiesen werden. Hybridisierung gegen Asp 700 verdaute DNA führte bei C. glutamicum zu einem Signal bei 8,7 kb, bei B. flavum bei 8,3 kb und bei B. lactofermentum bei 7,1 kb.These differences in the 5 'region of the DNA before hom Gen enable a distinction of the three species. The difference shown in the 5 'region of the DNA before the hom gene can also be obtained by hybridization of the KpnI sample detected against Asp 700 digested chromosomal DNA become. Hybridization against Asp 700 digested DNA led to a signal at 8.7 kb in C. glutamicum, B. flavum at 8.3 kb and B. lactofermentum at 7.1 kb.

Diese Hybridisierungsdaten führten zu der in Abb. 6 dargestellten Restriktionskarte.These hybridization data resulted in the restriction map shown in FIG .

Claims (10)

1. Verfahren zur Unterscheidung von Cornebacterium glutamicum und Brevibacterium flavum sowie lactofermentum in einem oder mehreren Verfahrens­ schritten, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchen­ den Stämme in einem geeigneten Testmedium ohne C-Quelle bzw. mit Trehalose als C-Quelle bebrütet, die optische Dichte während der Anzucht bzw. an deren Endpunkt bestimmt und die gefundenen Werte miteinander vergleicht.1. A method for distinguishing Cornebacterium glutamicum and Brevibacterium flavum and lactofermentum in one or more process steps, characterized in that the incubate the strains to be examined in a suitable test medium without C source or with trehalose as C source, the optical Density determined during cultivation or at its end point and the found values compared with each other. 2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man prototrophe Stämme einsetzt.2. Method according to claim 1 characterized in that one prototrophic strains starts. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man auxotrophe Stämme einsetzt, die die benötigten Supplemente nicht als C-Quelle verwerten.3. The method according to claim 1 characterized in that auxotrophic strains does not use the required supplements as Reuse C source. 4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man 0, 1 bis 10 g/l Trehalose zusetzt.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that one 0, 1 to 10 g / l Trehalose added. 5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Testmedium BMCG (Liebl et al. 1989) einsetzt. 5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that as a test medium BMCG (Liebl et al., 1989).   6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend ein mit Ethionin versetztes Testmedium verwendet, dieses mit den zu untersuchenden Stämmen bespatelt, und das Koloniewachstum in regelmäßigen Zeiträumen untersucht.6. Process according to claims 1 to 5, characterized in that one subsequently using ethionine-added test medium, bespatelt this with the strains to be examined, and colony growth at regular intervals examined. 7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man 0, 1 bis 0,6 g/l Ethionin zusetzt.7. The method according to claim 6, characterized in that one 0, 1 to 0.6 g / l Add ethionin. 8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 und/oder 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Restriktions­ karte der zu untersuchenden Stämme im 5′-Bereich der DNA vor dem hom-Gen ermittelt.8. Process according to claims 1 to 5 and / or 6 and 7, characterized in that the restriction map of the strains to be examined in the 5 'region the DNA is detected before the hom gene. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man chromosomale DNA der zu untersuchenden Stämme mit der Restriktions­ endonuklease Pvu II behandelt, diese anschließend gegen ein 1,3 kb KpnI DNA-Fragment, welches das Gen(hom) für die Homoserin-Dehydrogenase aus Corynebacterium glutamicum trägt, hybridisiert und detektiert.9. The method according to claim 8, characterized in that chromosomal DNA of the strains to be examined with the restriction treated endonuclease Pvu II, this subsequently against a 1.3 kb KpnI DNA fragment containing the Gen (hom) for homoserine dehydrogenase Corynebacterium glutamicum carries, hybridizes and detected. 10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, 6 und 7, oder 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß man sie allein oder in Kombination mit einem der anderen Verfahren zur Unterscheidung einsetzt.10. The method according to claims 1 to 5, 6 and 7, or 8 and 9, characterized in that they are used alone or in Combination with one of the other procedures for Distinction.
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