DE4105531C2 - 4-aminocalcein, process for its preparation and use - Google Patents

4-aminocalcein, process for its preparation and use

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Description

Die Erfindung betrifft ein 4-Aminocalcein gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zu seiner Herstellung sowie eine Verwendungsmöglich­ keit von Aminocalcein.The invention relates to a 4-aminocalcein according to claim 1, a Process for its preparation and a possible use of aminocalcein.

Aus der Veröffentlichung mit dem Titel "Fluorescence Techni­ ques in the Microdetermination of Metals in Biological Materi­ als" von Donald F. Hoelzl Wallach und Theodore L. Steck, Ana­ lytical Chemistry, Vol 35, Nr. 8, July 1963, ist Calcein, seine Verwendbarkeit zur Analyse von Zink(II)-Ionen und ein Verfah­ ren zu seiner Herstellung bekannt. Die Autoren geben für Cal­ cein die folgende Strukturformel an:From the publication entitled "Fluorescence Techni ques in the Microdetermination of Metals in Biological Materi as "by Donald F. Hoelzl Wallach and Theodore L. Steck, Ana Lytical Chemistry, Vol 35, No. 8, July 1963, is calcein, its Utility for the analysis of zinc (II) ions and a method ren known for its production. The authors give for Cal cein the following structural formula:

Diese Formel scheint die Struktur von Calcein jedoch nur unzu­ reichend wiederzugeben. Offensichtlich enthält Calcein zwar zwei Iminodiessigsäurereste, doch können deren Stellungen nicht genau lokalisiert werden. Möglicherweise ist Calcein ein isomeres Gemisch von zweifach mit Iminodiessigsäureresten sub­ stituiertem Fluorescein.This formula, however, seems to negatively affect the structure of calcein to reproduce. Obviously, Calcein contains two iminodiacetic residues, but their positions can not be pinpointed. Maybe Calcein is a isomeric mixture of twice with iminodiacetic acid residues sub substituted fluorescein.

Im folgenden wird unter Calcein ein im Xanthen-Ringsystem mit zwei Iminodiessigsäureresten substituiertes Fluorescein ver­ standen, wobei die Stellung der Reste offen bleibt. The following is under calcein in the xanthene ring system with two iminodiacetic acid residues substituted fluorescein ver stood, the position of the remains remains open.  

Zur Analyse von Zinkionen wurden in der genannten Veröffentli­ chung Calceinlösungen eingesetzt. Es wurde beobachtet, daß im pH-Bereich zwischen 5,5 und 3,5 die Fluoreszenz von freiem Calcein stark abnimmt, während der Chelatkomplex des Calceins mit Zink(II)-Ionen in diesem pH-Bereich fluoresziert. Die Au­ toren sind jedoch der Ansicht, daß dieses Phänomen von geringem Nutzen für die Analytik ist, weil die Affinität von Calcein für Zink in diesem pH-Bereich sehr gering ist (vgl. Seite 1039, rechte Spalte). Deshalb wird vorgeschlagen, einen Cal­ cein-Chelatkomplex mit zweiwertigem Kobalt vorzulegen. In ei­ nem solchen Komplex kann Zink das Kobalt verdrängen. Somit könnte durch Einstrahlen von Licht und Bestimmen der Intensi­ tät des Fluoreszenzlichts auf die Zink-Konzentration geschlos­ sen werden, wenn ein solcher Kobaltkomplex verwendet wird.For the analysis of zinc ions were in the mentioned Publli Calcein solutions were used. It was observed that in pH range between 5.5 and 3.5 the fluorescence of free Calcein decreases sharply, while the chelate complex of calcein fluoresces with zinc (II) ions in this pH range. The Au However, it is felt that this phenomenon is of low Benefits to the analysis is because the affinity of calcein for zinc in this pH range is very low (see page 1039, right column). Therefore, it is proposed to use a Cal to present a chelate complex with divalent cobalt. In egg In such a complex zinc can displace the cobalt. Thus could by irradiating light and determining the Intensi fluorescence light to the zinc concentration when such a cobalt complex is used.

Ein solches Verfahren könnte jedoch nicht reversibel durchge­ führt werden. Für jede Analyse müßte ein Kobalt-Calceinkomplex vorgelegt und die zu analysierende Lösung zugegeben werden.However, such a method could not be reversible be led. For each analysis, a cobalt-calcine complex would have to be used submitted and the solution to be analyzed are added.

Aus der Veröffentlichung mit dem Titel "Immobilized Calcein for Metal Ion Preconcentration" von L. A. Saari und W. R. Seitz, Analytical Chemistry, Vol. 56, Nr. 4, April 1984 ist ein Sensor der eingangs genannten Art bekannt, bei dem Calcein durch eine chemische Reaktion an eine Matrix aus Cellulose ge­ bunden ist. Die Matrix wird auf das Ende eines sich verzwei­ genden Lichtleiters aufgebracht. Ein Zweig des Lichtleiters dient der Einstrahlung von Licht einer geeigneten Wellenlänge, während mit dem anderen Zweig die emittierte Fluoreszenzstrah­ lung transportiert und an dessen Ende gemessen wird. Bei pH- Werten zwischen etwa 5 und 7 ist die Bindung von Übergangsme­ tallionen an Calcein jedoch so stark, daß die Übergangsmetal­ lionen vollständig aus der Metallionen-Lösung extrahiert wer­ den. Ein solcher Sensor ist unter diesen Bedingungen nicht re­ versibel. Um immobilisiertes Calcein in einem reversiblen Sen­ sor zu nutzen, schlagen die Autoren vor, bei einem niedrigeren pH-Wert zu arbeiten. Bezüglich der Analyse von Zink(II)-Ionen greifen die Autoren den oben erwähnten Vorschlag auf, mit Co(II)-Ionen beladenes Calcein einzusetzen. Jedoch wäre ein solcher Sensor ebenfalls nicht reversibel.From the publication entitled "Immobilized Calcein for Metal Ion Preconcentration "by L.A. Saari and W.R. Seitz, Analytical Chemistry, Vol. 56, No. 4, April 1984 a sensor of the aforementioned type known in the calcein by a chemical reaction to a matrix of cellulose ge is bound. The matrix will be on the end of a verzwei applied light guide. A branch of the light guide serves the irradiation of light of a suitable wavelength, while with the other branch the emitted fluorescence beam transported and measured at the end. At pH Values between about 5 and 7 is the binding of transition metals However, the presence of calcium ions on calcein is so strong that the transition metal Lions completely extracted from the metal ion solution who the. Such a sensor is not re in these conditions reversibly. To immobilized calcein in a reversible Sen The authors suggest using it at a lower pH to work. Regarding the analysis of zinc (II) ions  the authors take up the above-mentioned proposal with Co (II) ions loaded calcein use. However, one would be such sensor also not reversible.

Aufgabe der Erfindung ist, neben Calcein einen weiteren Stoff bereitzustellen, mit dessen Hilfe ein optischer Sensor herge­ stellt werden kann.The object of the invention is, in addition to calcein another substance provide, with the help of an optical sensor Herge can be made.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Stoff 4-Aminocalcein gemäß dem ersten Patentanspruch gelöst. Die weiteren Ansprüche geben ein Verfahren zur Herstellung von Aminocalcein und eine Verwendung von Aminocalcein an.The object is achieved by the substance 4-aminocalcein solved according to the first claim. The other claims give a process for the preparation of aminocalcein and a Use of aminocalcein.

Überraschenderweise kann Aminocalcein durch die in der erstge­ nannten Veröffentlichung skizzierte Reaktion aus Amino­ fluorescein mit Iminodiessigsäure hergestellt werden, ohne daß es zur Reaktion mit der Aminogruppe des Aminofluoresceins kommt.Surprisingly, Aminocalcein can by the erstge in the called publication outlined reaction from amino fluorescein be prepared with iminodiacetic acid, without it reacts with the amino group of the aminofluorescein comes.

Aminofluorescein kann kovalent, vorzugsweise über ein bewegli­ ches Brückenmolekül, über seine Aminogruppe an die Oberfläche von porösem Glas gebunden werden.Aminofluorescein can covalently, preferably via a bewegli bridge molecule, via its amino group to the surface be bound by porous glass.

Hierdurch wird ein reversibler Sensor erhalten, mit dessen Hilfe Metallionen, insbesondere Zink(II)-Ionen, quantitativ nachgewiesen werden können.As a result, a reversible sensor is obtained, with its Help metal ions, in particular zinc (II) ions, quantitatively can be detected.

Bei einem solchen Sensor kann auf den Einsatz von weiteren Me­ tallionen verzichtet werden.In such a sensor can on the use of additional Me tallionen be waived.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen und ei­ ner Figur näher erläutert.The invention is described below by way of examples and egg ner figure explained in more detail.

Die Figur zeigt eine Meßanordnung mit einem mit Aminocalcein hergestellten Sensor. The figure shows a measuring arrangement with one with aminocalcein manufactured sensor.  

Die Meßanordnung besteht aus einer Lichtquelle 1, aus der mit Hilfe eines Filters 2 ein monochromatischer Strahl der Wellen­ länge 488 nm ausgeblendet wird. Der Strahl trifft innerhalb einer Küvette 5, die die Probelösung enthält, auf den erfin­ dungsgemäßen Sensor 4, der auf einem optisch transparenten Me­ dium 3, beispielsweise einer Glasplatte, mit Hilfe von Silikonkautschuk aufgebracht ist. Die entstehende Fluoreszenzstrahlung der Wellenlänge 508 nm wird nach Durch­ gang durch einen weiteren Monochromator (nicht dargestellt) mit einem geeigneten Photomultipier 6 und entsprechenden Auswerteeinrichtungen detektiert, wobei die Intensität ein Maß für die Konzentration der Metallionen darstellt.The measuring arrangement consists of a light source 1 , from which by means of a filter 2, a monochromatic beam of wavelengths 488 nm is hidden. The beam impinges within a cuvette 5 containing the sample solution on the inventions to the invention sensor 4 , which is applied to an optically transparent Me medium 3 , for example a glass plate, with the aid of silicone rubber. The resulting fluorescence radiation of wavelength 508 nm is detected by passage through another monochromator (not shown) with a suitable photomultipier 6 and corresponding evaluation, wherein the intensity is a measure of the concentration of metal ions.

Beispielexample Herstellung von 4-AminocalceinPreparation of 4-aminocalcein

7,3 g (0,02 mol) kommerziell erhältliches 4-Aminofluorescein werden in 20 ml 60%igem Ethanol gelöst. Es werden 6 ml 30%ige Natronlauge zugegeben (Lösung 1).7.3 g (0.02 mol) of commercially available 4-aminofluorescein are dissolved in 20 ml of 60% ethanol. It will be 6 ml 30% Sodium hydroxide solution added (solution 1).

10,6 g (0,08 mol) Iminodiessigsäure werden in 15 ml destil­ liertem Wasser gelöst und mit 12 ml 30%iger Natronlauge gelöst (Lösung 2).10.6 g (0.08 mol) of iminodiacetic acid are distilled in 15 ml dissolved water and dissolved with 12 ml of 30% sodium hydroxide solution (Solution 2).

Die Lösungen 1 und 2 werden auf 4°C gekühlt und unter Rühren vermischt.Solutions 1 and 2 are cooled to 4 ° C and stirred mixed.

Anschließend werden 7,5 g 37%iges Formaldehyd tropfenweise un­ ter Rühren zugegeben, wobei die Temperatur der Reaktionsmi­ schung unter 4°C gehalten wird.Then 7.5 g of 37% formaldehyde dropwise un Stir, the temperature of the Reaktionsmi is kept below 4 ° C.

Die Reaktionsmischung wird danach auf 70°C erwärmt und 8 Stunden bei 70°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtempera­ tur wird auf 1000 ml verdünnt und mit 3,5 n Salzsäure bis zum Ausfallen des Rohprodukts versetzt (pH ca. 2,5). Der Nieder­ schlag wird abfiltriert und mit 2 l Wasser gewaschen und an der Luft trocknen gelassen. The reaction mixture is then heated to 70 ° C and 8 Stirred at 70 ° C for hours. After cooling to room temperature is diluted to 1000 ml and washed with 3.5 N hydrochloric acid until Failure of the crude product added (pH about 2.5). The low The precipitate is filtered off and washed with 2 l of water and on allowed to air dry.  

Zur Reinigung wird das Rohprodukt in 50 ml heißem 70%igem Ethanol gelöst und sofort filtriert. Das Produkt fällt nach dem Abkühlen des Filtrats aus. Es wird abgetrennt und 3mal aus 70%igem Ethanol umkristallisiert.For purification, the crude product in 50 ml of hot 70% Dissolved ethanol and filtered immediately. The product falls cooling the filtrate. It is separated and 3 times recrystallized from 70% ethanol.

Verwendungsbeispielusage example Herstellung eines Sensors mit Hilfe von 4-AminocalceinProduction of a sensor using 4-aminocalcein

Sogenanntes "Controlled Porous Glas" (CPG) mit Poren eines mittleren Durchmessers von 770 nm (77 A) und einer spezifi­ schen Oberfläche von 182 m²/g wird mit N-(Aminoethyl)-Amino­ propyl-Triethoxysilan silanisiert (Schritt a). Hierzu werden 3,5 g CPG in 150 ml Toluol p.a. unter Rühren auf 80°C er­ hitzt. Die Suspension wurde mit trockenem Stickstoff gespült, bis die Reaktionstemperatur erreicht war. Nach Zugabe von 1,632 g des Silans wurde bei 80°C vier Stunden lang gerührt. Das CPG wurde abfiltriert, mit 50 ml Toluol und 100 ml Aceton gewaschen und bei 90°C vier Stunden lang getrocknet. Das physisorbierte Silan wurde durch 4-tägige Heißextraktion mit Methanol entfernt.So-called "Controlled Porous Glass" (CPG) with pores of one average diameter of 770 nm (77 A) and a specifi surface area of 182 m² / g is treated with N- (aminoethyl) amino silylated propyl triethoxysilane (step a). To do this 3.5 g CPG in 150 ml toluene p.a. with stirring to 80 ° C he hitzt. The suspension was rinsed with dry nitrogen, until the reaction temperature was reached. After adding 1.632 g of the silane was stirred at 80 ° C for four hours. The CPG was filtered off, with 50 ml of toluene and 100 ml of acetone washed and dried at 90 ° C for four hours. The Physisorbed silane was by 4-day hot extraction with Removed methanol.

Die auf dem CPG chemisch fixierten Aminogruppen werden mit Thiophosgen in Phosphatpuffer pH 6,88 zu Isothiocyanatgruppen umgesetzt (Schritt b). Das nach den Schritten a und b grenz­ flächenmodifizierte CPG wird mit Aminocalcein zur Reaktion ge­ bracht, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht (Schritt c).The chemically fixed on the CPG amino groups are with Thiophosgene in phosphate buffer pH 6.88 to isothiocyanate groups implemented (step b). That after the steps a and b border surface-modified CPG is reacted with aminocalcein to give a thiourea derivative (step c).

Hierzu wurden 37,6 mg Aminocalcein in 5 ml Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst. Es wurden 68,8 mg des nach Schritt b erhaltenen Produkts zugegeben und 30 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 500 ml bidestilliertem Was­ ser gewaschen und 3 Tage mit Aceton heißextrahiert.To this was added 37.6 mg of aminocalcein in 5 ml of phosphate buffer pH 8.0 solved. There were 68.8 mg of the obtained after step b Product was added and stirred for 30 hours at room temperature. The product was filtered off, with 500 ml bidistilled What washed and hot extracted with acetone for 3 days.

Nachweis der Reversibilität des gemäß dem Verwendungsbeispiel erhaltenen SensorsProof of the reversibility of the sensor obtained according to the example of use

In einer Meßanordnung gemäß Fig. 1 wurde der erfindungsgemäße Sensor wechselweise mit einer Zn(II)-Ionen enthaltenden Lösung und mit einer Blindlösung in Kontakt gebracht. Die Blindlösung bestand aus einer Pufferlösung mit einem pH von 4,7. Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammenge­ faßt:In a measuring arrangement according to FIG. 1, the sensor according to the invention was brought into contact alternately with a solution containing Zn (II) ions and with a blank solution. The blank solution consisted of a buffer solution with a pH of 4.7. The test results are summarized in the following table:

Meßbedingungenmeasurement conditions Spaltbreitegap width Anregung (488 nm):Excitation (488 nm): 1,5 nm1.5 nm Emission (508 nm):Emission (508 nm): 3,0 nm3.0 nm pH-Wert der Zn-Lösung:pH of the Zn solution: 4,74.7 Nachweisgrenze (3 Sigma):Detection limit (3 sigma): 0,5 ppm0.5 ppm Meßfehler:measurement error: 3%3%

Claims (3)

1. 4-Aminocalcein der Formel wo zwei der Reste R jeweils einen Iminodiessigsäurerest [-CH₂-N(CH₂COOH)₂] und die übrigen Wasserstoff bedeuten.1. 4-aminocalcein of the formula where two of the radicals R each represent a Iminodiessigsäurerest [-CH₂-N (CH₂COOH) ₂] and the remaining hydrogen. 2. Verfahren zur Herstellung von 4-Aminocalcein gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 4-Aminofluorescein mit über­ schüssiger Iminodiessigsäure und überschüssigem Formaldehyd zu 3′,6′-Dihydroxy-2′,4′bis-[N,N′-di(carboxymethyl)amino­ methyl]-4-aminofluoran (= 4-Aminocalcein) umgesetzt wird.2. A process for the preparation of 4-aminocalcein according to claim 1, characterized in that 4-aminofluorescein with over schüssiger iminodiacetic acid and excess formaldehyde to 3 ', 6'-dihydroxy-2', 4'bis [N, N'-di (carboxymethyl) amino methyl] -4-aminofluoran (= 4-aminocalcein) is reacted. 3. Verwendung des 4-Aminacalceins nach Anspruch 1 zur Her­ stellung von optischen Sensoren.3. Use of the 4-aminacalcine according to claim 1 for Her position of optical sensors.
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