DE4017344A1 - Antibodies specific to highly conserved aminoacid sequences - Google Patents
Antibodies specific to highly conserved aminoacid sequencesInfo
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Abstract
Description
Es ist bekannt, daß zum qualitativen und quantitativen Nachweis von immunogenen Substanzen, wie Antigenen, in immer größerem Maße immunometrische Methoden herangezogen werden. Diese Methoden beruhen auf der Bildung eines Komplexes der immunogenen Substanz mit einem oder mehreren Antikörpern, wobei einer der Bindungspartner zwecks Detektion markiert ist. Dadurch ist es möglich, festzustellen, ob und in welcher Menge sich ein Komplex aus der immunogenen Substanz und einem oder mehreren Antikörpern gebildet hat. Entscheidende Verbesserungen der immunometrischen Bestimmungsverfahren gelangen mit der Einführung monoklonaler Antikörper durch Milstein und Köhler, deren Anwendung in immunometrischen Assays in der deutschen Offenlegungsschrift 31 30 834 eingehend beschrieben ist. Auch immunometrische Verfahren zur Bestimmung von Insulinen bestimmter Spezies sind bereits beschrieben (J. Havrankova et al., Journal of Immunoassay, 5 (182), 131-144 (1984)). Diese Antikörper wurden durch Immunisierung mit den verschiedenen Insulinen als Immunogen erhalten. Die Verwendung von Antipeptidantikörpern, welche durch Immunisierung mit Bruchstücken des betreffenden Proteins (Antigens) erhalten wurden, zur Identifizierung von nativen Proteinen brachten weitere Verbesserungsmöglichkeiten hinsichtlich der Universalität immunometrischer Bestimmungen. Solche Antipeptidantikörper sind mittlerweise ein wichtiges Werkzeug bei der Identifikation von Peptiden und damit Gensequenzen.It is known to be qualitative and quantitative Detection of immunogenic substances, such as antigens, in always immunometric methods are used to a greater extent. These methods are based on the formation of a complex of immunogenic substance with one or more antibodies, one of the binding partners is marked for detection. This makes it possible to determine whether and in what quantity a complex of the immunogenic substance and one or has formed several antibodies. Crucial improvements of the immunometric methods of determination come with the Introduction of monoclonal antibodies by Milstein and Köhler, their use in immunometric assays in the German Laid-open specification 31 30 834. Also immunometric methods for the determination of insulins certain species have already been described (J. Havrankova et al., Journal of Immunoassay, 5 (182), 131-144 (1984)). These Antibodies were raised by immunization with the various Get insulins as an immunogen. The use of Antipeptide antibodies, which by immunization with Obtain fragments of the protein in question (antigen) were used to identify native proteins further improvement possibilities with regard to the Universality of immunometric determinations. Such Antipeptide antibodies are now an important tool in the identification of peptides and thus gene sequences.
Von besonderem Interesse sind diese Antikörper auch für die Bestimmung von Substanzen, gegen die auf herkömmliche Weise keine oder nur in beschränktem Umfang Antiseren generiert werden können, weil diese - als vollständige Proteine injiziert - entweder in den benötigten Konzentrationen schon zu hoch wirksam sind, z. B. Peptidhormone, Neuropeptide oder zu toxisch wirken, z. B. Diphtheria Toxin, Viren und andere Mikroorganismen. Bei der Entwicklung von "Synthetischen Impfstoffen" (J. G. Sutcliff et al., Science, Vol. 219, 660 (1983)) konnten solche Antipeptidantikörper ebenfalls erfolgreich eingesetzt werden. Für die Auswahl der Peptidsequenz gegen welche auf literaturbekannte Weise polyklonale oder monoklonale Antikörper gewonnen werden sollen, scheint es vorteilhaft zu sein, daß zumindest ein Teil dieser Sequenz an der Oberfläche des nativen Proteins lokalisiert - d. h. exponiert - ist und somit vermehrt geladene oder stark polare funktionelle Gruppen enthält. Es wird hierbei im Stand der Technik jedoch ausdrücklich darauf verwiesen, daß Peptidbruchstücke, die evolutionär hochkonservierte Aminosäuresequenzen darstellen, sehr schlechte Immunogene sind (s. G. Walter, J. Immunol. Med. 88, (1986), 149-161). Unter evolutionär hochkonservierten Aminosäuresequenzen werden hierbei solche Sequenzen eines gegebenen Proteins verstanden, die sich im Verlauf der Evolution nicht oder nur wenig verändert haben. So unterscheiden sich beispielsweise Pferde- und Kaninchen- Cytochrom C in einigen Aminosäuresequenzen. Andere Sequenzen dieses Proteins aus den beiden Tierspezies sind hingegen identisch. Es wurde beobachtet, daß das Immunsystem der einen Tierspezies keine Antikörper gegen diese identischen Regionen des Cytochrom C der anderen Spezies bildet, da diese Sequenz ja auch in dem körpereigenen Cytochrom C vorkommt. Es gilt als Regel, daß die Immunantwort auf ein Antigen um so besser ist, je größer der evolutionäre Abstand zwischen immunisierendem Protein und dem entsprechenden körpereigenen Protein ist.These antibodies are also of particular interest for Determination of substances against the conventional way no antisera generated or only to a limited extent can be because of this - as complete proteins injected - either in the required concentrations are too effective, e.g. B. peptide hormones, neuropeptides or act toxic, e.g. B. Diphtheria toxin, viruses and others Microorganisms. When developing "Synthetic Vaccines "(J.G. Sutcliff et al., Science, Vol. 219, 660 (1983)) could also do such antipeptide antibodies successfully used. For the selection of the Peptide sequence against which in a manner known from the literature polyclonal or monoclonal antibodies can be obtained , it seems to be advantageous that at least part this sequence on the surface of the native protein localized - d. H. exposed - is and therefore increasingly charged or contains highly polar functional groups. It will in the prior art, however, expressly on this referenced peptide fragments that are evolutionary represent highly conserved amino acid sequences, very much are bad immunogens (see G. Walter, J. Immunol. Med. 88, (1986), 149-161). Among evolutionarily highly conserved Amino acid sequences become such sequences of one given protein understood, which in the course of Not changed evolution or changed little. So differ for example horse and rabbit Cytochrome C in some amino acid sequences. Other sequences this protein from the two animal species, however, are identical. It has been observed that the immune system of one Animal species do not have antibodies against these identical regions of the cytochrome C of the other species because of this sequence yes also occurs in the body's own cytochrome C. It is considered Rule that the immune response to an antigen is all the better the greater the evolutionary distance between immunizing Protein and the corresponding body's protein.
Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, Antikörper zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, sowohl mit einem nativen Protein, als auch mit Derivaten, Mutanten, denaturierten Produkten, Fragmenten oder (synthetischen) Vorstufen Immunkomplexe zu bilden.The invention was based on the object of antibodies To provide who are able to work with both native protein, as well as with derivatives, mutants, denatured products, fragments or (synthetic) Precursors to form immune complexes.
Insbesondere bestand die Aufgabe darin, Antikörper zur Verfügung zu stellen, welche mit gentechnologisch hergestellten Produkten der verschiedensten Spezies sowie deren Derivaten, denaturierten Vorstufen und Fragmenten Immunkomplexe bilden. Besonderes Interesse galt hierbei den gentechnisch hergestellten Proteinen, wie Insulin.In particular, the task was to use antibodies for To provide which with genetic engineering manufactured products of various species as well their derivatives, denatured precursors and fragments Form immune complexes. Particular interest was given to the genetically engineered proteins such as insulin.
Eine weitere Aufgabe bestand darin, ein immunometrisches Meßverfahren zu entwickeln, welches die Messung der Initialausbeute von gentechnologisch hergestellten Produkten, die in Mikroorganismen als schwerlösliche "Inclusion bodies" anfallen, erlaubt - was mit immunologischen Meßverfahren gemäß Stand der Technik bisher nicht möglich ist - und gleichzeitig in der Lage ist, die Proteinkonzentrationen in den einzelnen Aufarbeitungsstufen mit dem gleichen Meßverfahren zu messen. Unter Initialausbeute wird diejenige Ausbeute verstanden, welche direkt nach der Fermentation effektiv vorhanden ist. Sie ist nicht verfälscht durch Verluste in der Probenaufbereitung und durch Aufbereitungsstufen.Another task was to do an immunometric To develop measuring methods, which the measurement of the Initial yield of genetically engineered products, which are poorly soluble "inclusion bodies" in microorganisms accrued, allowed - what with immunological measurement methods according to State of the art is not yet possible - and at the same time is able to determine the protein concentrations in each Measure processing stages with the same measuring method. Initial yield is understood to mean the yield which is effectively present immediately after fermentation. It is not adulterated by losses in the Sample preparation and preparation stages.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Antikörper, welche durch Immunisierung mit hochkonservierten Peptidbruchstücken des betreffenden nativen Proteins erhalten wurden, die obengenannte Aufgabe erfüllen.Surprisingly, it has now been found that antibodies which by immunization with highly preserved peptide fragments of the native protein in question were obtained perform the above task.
Die Erfindung betrifft somit Antikörper, welche durch Immunisierung mit einem Peptidbruchstück, welches eine hochkonservierte Aminosäuresequenz eines nativen Proteins darstellt, erhalten werden.The invention thus relates to Antibodies, which by immunization with a Peptide fragment, which is a highly preserved one Represents amino acid sequence of a native protein will.
Insbesondere betrifft die Erfindung solche Antikörper, die durch Immunisierung mit hochkonservierten Peptidbruchstücken des Insulins erhalten werden. In particular, the invention relates to those antibodies which by immunization with highly preserved peptide fragments of insulin can be obtained.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung obengenannter Antikörper sowie die Verwendung derselben in immunometrischen Meßverfahren.The invention further relates to a method for manufacturing above-mentioned antibody and the use thereof in immunometric measurement method.
Im vorstehenden wie im folgenden werden unter hochkonservierten Aminosäuresequenzen solche Proteinfragmente eines gegebenen, in mehreren Spezies - wenn auch mehr oder weniger leicht modifiziert - vorkommenden Proteins verstanden, welche sich im Verlaufe der Evolution nicht oder gegebenenfalls nur unwesentlich verändert haben. Als Beispiel sei hier das Octapeptid (14-21) der Insulin-A-Kette genannt (Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn), welches in vielen bekannten Insulinen, wie Human-, Schweine-, Schaf-, Pferd-, Rinder-, Huhn-, Enten-, Truthahn-, Gans-, Aligator-, Klapperschlangen-, Colubrit-Snake-, Sei Whale-, Elefanten-, Ziegen-, Hunde-, Affen-, Sperm Whale-, Fin Whale-, Ratten-, Maus-, Hamster-, Kaninchen-Insulin unverändert vorkommt.In the above as below, below highly conserved amino acid sequences of such protein fragments of a given, in several species - albeit more or less easily modified - understood occurring protein, which do not change in the course of evolution or may have changed only slightly. As an an example the octapeptide (14-21) of the insulin A chain may be mentioned here (Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn), which is known in many Insulins, such as human, pig, sheep, horse, cattle, Chicken, duck, turkey, goose, aligator, rattlesnake, Colubrit snake, be whale, elephant, goat, dog, Monkey, sperm whale, fin whale, rat, mouse, hamster, Rabbit insulin occurs unchanged.
Unter einem nativen Protein wird ein natürliches vorkommendes Protein verstanden.A native protein becomes a naturally occurring one Protein understood.
Unter Peptidbruchstücken, Peptidfragmenten, Proteinbruchstücken und Proteinfragmenten werden Teile eines betreffenden Peptids/Proteins verstanden, die natürlicher Bestandteil dieses Peptid/Proteins sind. Es handelt sich hierbei um zusammenhängende Aminosäuren (eine sogenannte Aminosäuresequenz), die einen Ausschnitt oder einen Anfang oder ein Ende des Peptids/Proteins darstellen.Among peptide fragments, peptide fragments, Protein fragments and protein fragments become parts of one understood peptide / protein concerned, the more natural Are part of this peptide / protein. It is about related amino acids (a so-called Amino acid sequence), which is a section or a beginning or represent an end of the peptide / protein.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper gegen hochkonservierte Aminosäuresequenzen von nativen Proteinen geht man am besten folgendermaßen vor:To produce the antibodies against highly conserved amino acid sequences of native proteins the best thing to do is:
- a) Die betreffende Sequenz sollte bevorzugt exponiert sein, d. h., sie sollte sich an der Oberfläche des nativen Proteins befinden, welches bevorzugt dann der Fall ist, wenn die Sequenz vermehrt geladene oder stark polare funktionelle Gruppen enthält oder wenn die Sekundärstruktur des Proteins Schleifen aufweist, welche bevorzugt aus dem Molekül herausragen. Diese Bedingung ist meist dann erfüllt, wenn beispielsweise Asparagin (Asn), Asparaginsäure (Asp), Prolin (Pro), Glutamin (Gln), Glutaminsäure (Glu) und/oder Glycin (Gly) vermehrt in der betrachteten Sequenz vorkommen.a) The sequence in question should preferably be exposed, d. that is, it should be on the surface of the native Protein, which is then preferably the case if the sequence is increasingly charged or strongly polar contains functional groups or if the Secondary structure of the protein has loops, which preferably protrude from the molecule. This condition is usually fulfilled if, for example, asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), proline (Pro), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu) and / or glycine (Gly) increasingly occur in the sequence under consideration.
- b) Die Zahl der potentiellen Epitope auf dem ausgewählten Peptidbruchstück soll einerseits möglichst klein sein, andererseits soll das Peptidbruchstück aber groß genug für eine Immunantwort sein. Die ausgewählte Sequenz sollte 20, bevorzugt 12, besonders bevorzugt 10, ganz besonders bevorzugt 8 Aminosäuren nicht überschreiten und nicht kürzer sein als 4, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 6 Aminosäuren. Bewährt haben sich Peptidbruchstücke mit 6-13, bevorzugt 7-11, insbesondere 8-10 Aminosäuren.b) The number of potential epitopes on the selected one On the one hand, the peptide fragment should be as small as possible, on the other hand, the peptide fragment should be large enough for an immune response. The selected sequence should be 20, preferably 12, particularly preferably 10, whole particularly preferably not exceed 8 amino acids and not shorter than 4, preferably 5, especially preferably 6 amino acids. Have proven themselves Peptide fragments with 6-13, preferably 7-11, especially 8-10 amino acids.
- c) Bevorzugt sollte die ausgewählte Sequenz nicht am N- oder C-Terminus des betreffenden nativen Proteins liegen, wobei unter N- und C-Terminus hier die entsprechenden Termini des gesamten nativen Proteins verstanden werden. Ist dieses gesamte Protein aus mehreren miteinander verknüpften Proteinen aufgebaut, so kann die Sequenz selbstverständlich an einem innenliegenden N- oder C-Terminus dieses integrierten Proteins liegen.c) The selected sequence should preferably not be on the N- or C-terminus of the native protein in question lie, where the N and C terminus here corresponding terms of the entire native protein be understood. This entire protein is out several linked proteins built up, so can of course the sequence on one internal N or C terminus of this integrated Protein.
Zur Herstellung des ausgewählten Proteinbruchstückes bietet sich beispielsweise die literaturbekannte Peptidsynthese nach Merryfield an. Es ist aber auch durchaus möglich, geeignete Fragmente aus einer enzymatischen oder chemischen Spaltung des nativen Proteins zu erhalten. Kurze Sequenzen können auch rein chemisch synthetisiert werden.To produce the selected protein fragment the peptide synthesis known from the literature, for example Merryfield. But it is also quite possible to find suitable ones Fragments from an enzymatic or chemical cleavage of the to obtain native protein. Short sequences can also be used be chemically synthesized.
Insbesondere bei kurzen Proteinfragmenten, die selbst gar keine oder nur eine unzureichende Immunantwort provozieren, aber auch bei immunogenen Fragmenten empfiehlt es sich, einen Carrier an das ausgewählte Proteinbruchstück zu koppeln. Diese Ankopplung geschieht nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise über Kopplungsreagenzien wie Glutaraldehyd oder 1-Hydroxy-2-nitrobenzol-4-sulfonsäure-N- maleinimido-6-caproyl-ester-natriumsalz (mal-sac-HNSA). Als Carrier können beispielsweise eingesetzt werden: Polymere wie Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin oder Fettsäurederivate wie PAM-3-Cys (PAM=Palmitoyl) oder Proteine wie Rinderserumalbumin (BSA) oder Keyhole Limpet Hemocyanine (KLH).Especially in the case of short protein fragments, which are themselves provoke no or only an insufficient immune response, but also with immunogenic fragments it is advisable to use one Coupling the carrier to the selected protein fragment. These Coupling takes place according to methods known to the person skilled in the art are, for example via coupling reagents such as Glutaraldehyde or 1-hydroxy-2-nitrobenzene-4-sulfonic acid-N- maleinimido-6-caproyl ester sodium salt (mal-sac-HNSA). As Carriers can be used for example: polymers such as Polyethylene glycol, polyacrylamide or poly-d-glutamine-d-lysine or fatty acid derivatives such as PAM-3-Cys (PAM = palmitoyl) or Proteins such as bovine serum albumin (BSA) or keyhole limpet Hemocyanins (KLH).
Bevorzugt werden mehrere Moleküle des Proteinfragments an den Carrier gekoppelt.Several molecules of the protein fragment are preferred on the Carrier coupled.
Die Immunisierung einer Spezies mit dem Proteinbruchstück bzw. mit dem carrier-gebundenen Proteinbruchstück geschieht nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise durch intramuskuläre Injektion des Immunogens, gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans wie KFA (komplettes Freundsches Adjuvans) oder IFA (inkomplettes Freundsches Adjuvans). Sofern erforderlich, kann nach Erhalt der Immunantwort ein- oder mehrmals "geboostert" werden. Die Auswahl der Spezies ist nicht kritisch, beispielsweise eignen sich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe oder Ziegen. Zwecks Herstellung größerer Mengen an antikörper-enthaltenden Seren ist es jedoch vorteilhaft, größere Tiere, wie Schafe oder Ziegen, einzusetzen.The immunization of a species with the protein fragment or happens with the carrier-bound protein fragment methods known from the literature, for example by intramuscular injection of the immunogen, if necessary together with an adjuvant like KFA (complete Freundsches Adjuvant) or IFA (incomplete Freund's adjuvant). Provided required, can be on or after receiving the immune response be "boosted" several times. The choice of species is not critical, for example mice, rats, Rabbits, sheep or goats. In order to manufacture larger ones However, it does contain amounts of antibody-containing sera advantageous, larger animals, such as sheep or goats, to use.
Prinzipiell nach Erhalt der ersten Immunantwort kann das Antiserum abgenommen werden. Je nach verwendeter Tierspezies erhält man höhere Titer jedoch erst nach ein- oder mehrmaligem Boostern mit dem entsprechenden Immunogen. Je nach Verwendungszweck wird das Serum gereinigt und angereichert oder aber direkt ohne weitere Reinigung im Assay-Medium verdünnt und eingesetzt. Insbesondere für die Herstellung von Sandwichassays empfiehlt sich die Reinigung und Anreicherung des Serums. Dies kann beispielsweise durch Ammoniumsulfatfällung und anschließende Auftrennung auf einer Affinitätssäule erfolgen, auf der ein entsprechendes Antigen immobilisiert ist. Hierbei werden alle Proteine abgetrennt, welche mit dem immobilisierten Protein keine Wechselwirkung zeigen. Die Antikörper, die das betreffende Protein erkennen - und somit an dem immobilisierten Protein gebunden sind - können dann von der Säule eluiert werden.In principle, after receiving the first immune response, this can Antiserum can be removed. Depending on the animal species used however, higher titres are only obtained after one or more repetitions Boosters with the appropriate immunogen. Depending on Intended use, the serum is cleaned and enriched or directly without further purification in the assay medium diluted and used. Especially for the production of Sandwich assays recommend cleaning and enrichment of the serum. This can be done, for example, by Ammonium sulfate precipitation and subsequent separation on a Affinity column take place on which an appropriate antigen is immobilized. Here all proteins are separated, which has no interaction with the immobilized protein demonstrate. The antibodies that recognize the protein in question - and are therefore bound to the immobilized protein - can then be eluted from the column.
Alternativ zu der oben unter 5. beschriebenen Methode der Gewinnung polyklonaler Antikörper können natürlich auch monoklonale Antikörper hergestellt werden. Dies geschieht beispielsweise durch Immunisierung von Mäusen, wie oben unter 4. beschrieben und anschließender Fusion der Mäusemilzzellen beispielsweise mit NS 1 Myelomzellen und Klonierung von geeigneten Zellen. Gegebenenfalls können die so gewonnenen monoklonalen Antikörper beispielsweise durch Injektion in Nacktmäuse vermehrt werden. Prinzipiell ist die Herstellung solcher monoklonalen Antikörper dem Fachmann bekannt und in der Literatur beschrieben. Die Aufarbeitung und Reinigung kann dann wie oben unter 5. beschrieben, erfolgen.As an alternative to the method described in section 5 above Obtaining polyclonal antibodies can of course also monoclonal antibodies are produced. this happens for example by immunizing mice as described above under 4. described and subsequent fusion of the mouse spleen cells for example with NS 1 myeloma cells and cloning of suitable cells. If necessary, the so obtained monoclonal antibodies, for example by injection into Nude mice are reproduced. The principle is the manufacture such monoclonal antibodies known to those skilled in the art described in the literature. Refurbishing and cleaning can then as described above under 5.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Herstellung von Immunoassays verwendet werden. Bei solchen Immunoassays können beispielsweise die erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Antigen auf einer Festphase immobilisiert sein. Verfahren zur Immobilisierung von Antigenen und Antikörpern auf Festphasen wie synthetischen oder natürlichen Polymeren wie Polystyrol, Polypropylen, PVC oder Latex in verschiedenen geometrischen Ausführungsformen, wie Röhrchen, Kugeln oder Mikrotitrationsplatten sind dem Fachmann bekannt. Der Immunoassay kann beispielsweise ein kompetitiver Assay oder ein Sandwichassay sein. In beiden Fällen ist ein Bestandteil - entweder das Antigen oder der Antikörper - zum Zwecke der Detektion markiert. Die Markierung erfolgt meist über ein radioaktives, chemilumineszentes oder enzymatisches Label. Auch solche Verfahren zur Markierung von Antigenen und Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Da die erfindungsgemäßen Antikörper in der Lage sind, sowohl die nativen Proteine einer Spezies als auch die korrespondierenden nativen Proteine anderer Spezies und sogar Derivate, Fragmente, synthetische und natürliche Vorstufen oder denaturierte Produkte dieser Proteine - sofern sie das zur Immunisierung verwendete Peptidbruchstück oder zumindest Unterbruchstücke davon, die mindestens 60-80% des zur Immunisierung verwendeten Peptidbruchstücke entsprechen, aufweisen zu erkennen, ist es vorteilhaft, zur Herstellung eines Multi-Spezies-Immunoassays die erfindungsgemäßen Antikörper zu markieren und damit nach literaturbekannten Verfahren einen RIA (Radioimmunoassay) CIA/LIA ((Chemi)- Lumineszenzimmunoassay) oder EIA (Enzymimmunoassay) aufzubauen.The antibodies of the invention can be used to produce Immunoassays can be used. Such immunoassays can for example the antibodies according to the invention or a Antigen immobilized on a solid phase. Procedure for Immobilization of antigens and antibodies on solid phases like synthetic or natural polymers like polystyrene, Polypropylene, PVC or latex in various geometrical shapes Embodiments, such as tubes, balls or Microtitration plates are known to the person skilled in the art. The Immunoassay can be, for example, a competitive assay or be a sandwich assay. In both cases there is a component - either the antigen or the antibody - for the purpose of Detection marked. The marking is usually done with a radioactive, chemiluminescent or enzymatic label. Such methods for labeling antigens and Antibodies are known to the person skilled in the art. Since the Antibodies according to the invention are able to both native proteins of a species as well as the corresponding ones native proteins of other species and even derivatives, Fragments, synthetic and natural precursors or denatured products of these proteins - if they are used for Immunization used peptide fragment or at least Fragments thereof, which are at least 60-80% of the to Immunization used peptide fragments correspond have to recognize, it is advantageous to manufacture a multi-species immunoassay according to the invention Mark antibodies and thus according to literature Procedure for a RIA (Radioimmunoassay) CIA / LIA ((Chemi) - Luminescence Immunoassay) or EIA (Enzyme Immunoassay) build up.
Als besonders vorteilhaft für die Bestimmung von gentechnologisch hergestellten Produkten, welche in Mikroorganismen als schwerlösliche "Inclusion bodies" anfallen, in einem RIA, hat sich ein Puffersystem erwiesen, welches neben üblichen Puffersystemen wie Phosphatpuffer (Na₂HPO₄ , NaH₂PO₄), Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) oder Barbiturat-Puffer (beispielsweise Natriumdiethylbarbiturat), mindestens ein Protein wie Rinderserumalbumin (BSA), Milcheiweiß, Ovalbumin, Eiereiweiß, Trockenmilchpulver oder Gelatine und mindestens ein ionisches Detergens wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder ein Gallensalz und/oder mindestens ein nicht-ionisches Detergens wie ®Nonidet P40, ®Triton X100 oder ®Tween 20 enthält.As particularly advantageous for the determination of genetically engineered products, which in Microorganisms as poorly soluble inclusion bodies accumulate in a RIA, a buffer system has proven which in addition to common buffer systems such as phosphate buffer (Na₂HPO₄, NaH₂PO₄), Tris buffer (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) or barbiturate buffer (e.g. Sodium diethyl barbiturate), at least one protein like Bovine serum albumin (BSA), milk protein, ovalbumin, egg protein, Dry milk powder or gelatin and at least one ionic Detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS), Hexadecyltrimethylammonium bromide or a bile salt and / or at least one non-ionic detergent such as ®Nonidet P40, ®Triton X100 or ®Tween 20 contains.
In einer besonderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung Antikörper, welche sowohl mit Insulinen verschiedener Spezies als auch mit Insulinderivaten, Fragmenten, synthetischen und natürlichen denaturierten Insulin-Vorstufen und Derivaten dieser denaturierten Insulin-Vorstufen Immunkomplexe bilden. Zur Herstellung dieser "Multi-Spezies-Insulin-Antikörper" wird als Immunogen ein Insulinfragment gemäß obengenannter Kriterien 1a-b ausgewählt. Geeignet sind beispielsweise die Sequenzen A₁-A₇ oder A₁₁-A₁₇ oder A₁₁-A₂₁ der Insulin-A- Kette sowie die Regionen um die Cysteine der B-Kette. Als besonders geeignet hat sich das Insulin-A-Kette-(14-21)- OctapeptidIn a particular embodiment, the invention relates Antibodies with both insulins of different species as well as with insulin derivatives, fragments, synthetic and natural denatured insulin precursors and derivatives of these denatured insulin precursors form immune complexes. To produce these "multi-species insulin antibodies" as an immunogen an insulin fragment according to the above Criteria 1a-b selected. For example, the Sequences A₁-A₇ or A₁₁-A₁₇ or A₁₁-A₂₁ of insulin A- Chain and the regions around the cysteines of the B chain. As the insulin A chain (14-21) - has been particularly suitable Octapeptide
Tyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnTyr-Glu-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
erwiesen. Dieses Octapeptid kann nach literaturbekannten Verfahren (W. König, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247) hergestellt werden. Die Carrierankopplung, Immunisierung und Antikörpergewinnung erfolgt nach den oben angegebenen Verfahrensschritten 3-5. Auch ohne zusätzliche Aufarbeitung und Reinigung können die erhaltenen Insulin- Antikörper zur Herstellung eines Mulit-Spezies-Insulin-Assays verwendet werden.proven. This octapeptide can be found in the literature Procedure (W. König, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247). The carrier coupling, Immunization and antibody recovery is done according to the above specified process steps 3-5. Even without additional The insulin obtained can be worked up and cleaned. Antibodies for the preparation of a multi-species insulin assay be used.
Ein solcher Multi-Spezies-Insulin-Assay kann beispielsweise als RIA, CIA/LIA oder EIA nach literaturbekannten Verfahren aufgebaut werden. Dabei können die erfindungsgemäßen Insulin- Antikörper sowohl in freier Lösung (beispielsweise in einem Fällungs-RIA) oder an einer Festphase gebunden (immobilisiert) vorliegen. Für den Fällungs-RIA eignen sich dann beispielsweise radioaktiv, bevorzugt Radiojod markierte Insuline, Insulinfragmente, Insulinderivate, natürliche oder synthetische Insulinvorstufen oder beispielsweise das radioaktiv markierte Peptidbruchstück, welches zur Generierung der erfindungsgemäßen Insulin-Antikörper verwendet wurde, insbesondere das Radiojod markierte Insulin-A-Kette-(14-21)- Octapeptid. Für die Herstellung eines Sandwich-Immunoassays werden zwei Antikörper verwendet, von denen einer - meist der nicht-Festphasen gebundene - markiert ist. Die beiden Antikörper können gegen das gleiche Epitop des Insulins gerichtet sein, bevorzugt sind sie jedoch gegen unterschiedliche Epitope des Insulins gerichtet. Für solch einen Sandwich Immunoassay, bei dem die beiden verwendeten Antikörper gegen verschiedene Epitope gerichtet sind, verwendet man bevorzugt polyklonale oder monoklonale, affinitätsgereinigte, Radiojod markierte Antikörper. Die Markierung der Antikörper bzw. Antigene (Insulin, Insulinfragmente, Insulinderivate, natürliche oder synthetische Vorstufen) erfolgt nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise kann für die Radiojodmarkierung die Jodogenmethode angewandt werden.Such a multi-species insulin assay can, for example as RIA, CIA / LIA or EIA according to procedures known from the literature being constructed. The insulin Antibodies both in free solution (e.g. in a Precipitation RIA) or bound to a solid phase (immobilized) are available. Then are suitable for the precipitation RIA for example radioactive, preferably labeled radioiodine Insulins, insulin fragments, insulin derivatives, natural or synthetic insulin precursors or for example that radioactively labeled peptide fragment, which is used for generation the insulin antibody according to the invention was used, especially the radio iodine-labeled insulin A chain- (14-21) - Octapeptide. For the preparation of a sandwich immunoassay two antibodies are used, one of which - mostly the non-solid phase bound - is marked. The two Antibodies can against the same epitope of insulin be directed, but they are preferred against different epitopes of insulin. For such a sandwich immunoassay using the two Antibodies against different epitopes, preferably polyclonal or monoclonal, affinity-purified, radioiodine-labeled antibodies. The Labeling of the antibodies or antigens (insulin, Insulin fragments, insulin derivatives, natural or synthetic precursors) takes place according to literature Methods, for example, for radio iodine labeling Iodogen method can be used.
Der erfindungsgemäße Multi-Spezies-Insulin-Assay weist gegenüber Insulinassays gemäß Stand der Technik den Vorteil auf, daß mit ihm sowohl Insuline verschiedener Spezies, als auch Insulinderivate, Insulinfragmente, synthetische und natürliche denaturierte Insulinvorstufen und Derivate dieser denaturierten Insulinvorstufen gemessen und bestimmt werden können.The multi-species insulin assay according to the invention has the advantage over insulin assays according to the prior art that with him insulin of different species, as well as also insulin derivatives, insulin fragments, synthetic and natural denatured insulin precursors and derivatives thereof denatured insulin precursors are measured and determined can.
Es hat sich gezeigt, daß sogar solche Proteine nachgewiesen und bestimmt werden können, welche Aminosäuresequenzen enthalten, die nur 60-80% des Peptidbruchstücks darstellen, welches zur Immunisierung (und damit zur Antikörpergenerierung) verwendet wurde. So lassen sich beispielsweise mit dem Multi Spezies-Insulin-Assay, welcher Antikörper enthält, die durch Immunisierung mit dem Insulin-A- Kette-(14-21)-Octapeptid erhalten wurden, auch solche Proteine bestimmen, welche nur das Hexapeptid (16-21) enthalten. Folgende Insuline, Insulinderivate oder vom Insulin abgeleitete Proteine können beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Multi-Spezies Insulinassay bestimmt werden:It has been shown that even such proteins are detected and can determine which amino acid sequences contain only 60-80% of the peptide fragment, which for immunization (and thus for Antibody generation) was used. So you can for example with the multi-species insulin assay, which Contains antibodies raised by immunization with the insulin A Chain (14-21) octapeptide were obtained, including such proteins determine which only contain the hexapeptide (16-21). Following insulins, insulin derivatives or from insulin derived proteins can, for example, with the Multi-species insulin assay according to the invention can be determined:
- 1. β-Galaktosidase-Insulin-Fusionen expremiert in E. coli P1, P6, P1-Trimer-Des-Met-Des-Cys, P1-Trimer-Des-Met, P1-Poly- Gly-Des-Met, P1-Poly-Gly-Des-Met-Des-Cys, P-Lz-gamma;1. β-galactosidase-insulin fusions expressed in E. coli P1, P6, P1-Trimer-Des-Met-Des-Cys, P1-Trimer-Des-Met, P1-Poly- Gly-Des-Met, P1-Poly-Gly-Des-Met-Des-Cys, P-Lz-gamma;
- 2. Interleukin-2 Insulin-Fusionen expremiert in E. coli pB40, pK52, pGF12, pIK10, pSW3, pSW2; pSW3*M;2. Interleukin-2 insulin fusions expressed in E. coli pB40, pK52, pGF12, pIK10, pSW3, pSW2; pSW3 * M;
- 3. trp-Insulin-Fusionen expremiert in E. coli pB70, pINT 14, pINT 30, pINT 41, pSL 27; pINT 91;3. trp-insulin fusions expressed in E. coli pB70, pINT 14, pINT 30, pINT 41, pSL 27; pINT 91;
- 4. Insuline verschiedener Spezies Human-Insulin, Schweine- Insulin, Schaf-Insulin, Pferd-Insulin, Rind-Insulin, Huhn- Insulin, Ente-Insulin, Truthahn-Insulin, Gans-Insulin, Alligator-Insulin, Klapperschlange-Insulin, Colubrid- Snake-Insulin, Sei Whale-Insulin, Elefant-Insulin, Ziege- Insulin, Hund-Insulin, Affe-Insulin, Sperm Whale-Insulin, Fin Whale-Insulin, Ratte-Insulin, Hamster-Insulin, Kaninchen-Insulin;4. Insulins of Different Species Human Insulin, Pig Insulin, sheep insulin, horse insulin, beef insulin, chicken Insulin, duck insulin, turkey insulin, goose insulin, Alligator Insulin, Rattlesnake Insulin, Colubrid Snake insulin, be whale insulin, elephant insulin, goat Insulin, dog insulin, monkey insulin, sperm whale insulin, Fin whale insulin, rat insulin, hamster insulin, Rabbit insulin;
-
5. Insulinderivate
B31-Mono-Arg-Human-Insulin, B31, B32-Di-Arg-Human-Insulin, B1-Des-Phe-Schweine-Insulin, A14-Monojodo-Human-Insulin;5. Insulin derivatives
B31-Mono-Arg-Human insulin, B31, B32-Di-Arg-Human insulin, B1-Des-Phe-pig insulin, A14-Monojodo-Human insulin; -
6. Insulin-Fragmente
Insulin-A-Kette-Tetrasulfonat (Rind), Insulin-A-Kette- Tetrasulfonat (Mensch), Insulin-A-Kette-(14-21)-Octapeptid, Insulin-A-Kette-(16-21)-Hexapeptid;6. Insulin fragments
Insulin A chain tetrasulfonate (bovine), insulin A chain tetrasulfonate (human), insulin A chain (14-21) octapeptide, insulin A chain (16-21) hexapeptide; -
7. Insulin-Vorstufen
Prä-Pro-Insulin-S-Sulfonat (P1), Prä-Pro-Insulin (P1), Prä- Pro-Insulin (pSW 3), Pro-Insulin (Schwein).7. Insulin precursors
Pre-pro-insulin S-sulfonate (P1), pre-pro-insulin (P1), pre-pro-insulin (pSW 3), pro-insulin (pig).
Weiterhin weist der erfindungsgemäße Multi-Spezies-Insulin- Assay den Vorteil auf, daß auch in Gegenwart von ionischen und nicht-ionischen Detergenzien, Hilfsproteinen, Detergenzmischungen sowie Detergenz-Hilfsprotein Mischungen gemessen werden kann. Als Detergenzien können beispielsweise Natriumdodecylsulfat (SDS), ®Triton X 100 oder ®Nonidet P 40 und als Hilfsproteine Rinderserumalbumin (BSA), Hühnereiweiß, Ovalbumin oder E. coli-Proteine eingesetzt werden. Ionische Detergenzien können bevorzugt im Bereich von 0-0,3%, nichtionische Detergenzien bevorzugt im Bereich von 0-2% und Hilfsproteine bevorzugt im Bereich von 0-3% eingesetzt werden (Prozentangaben in w/v=weight/volume). Die Messung in Gegenwart dieser Substanen hat den Vorteil, daß auch beispielsweise schwerlösliche Produkte aus gentechnologischer Herstellung der Messung zugänglich sind, ohne den Assay wesentlich zu stören, was mit immunometrischen Verfahren gemäß Stand der Technik bisher nicht möglich war. Weder Hilfsproteine oder Fremdproteine wie Calcitonin oder das Nonapeptid Buserelin, noch übliche Puffersysteme stören den Multi-Spezies Assay wesentlich. So hat sich beispielsweise für die radioimmunologische Bestimmung (RIA-Bestimmung) von gentechnologisch hergestellten Produkten, welche in Mikroorganismen als schwerlösliche "Inclusion bodies" anfallen, ein Puffersystem als sehr geeignet erwiesen, welches neben den üblichen Puffersubstanzen wie Phosphatpuffer (Na₂HPO₄, NaH₂PO₄), Tris-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) oder Barbiturat-Puffer (beispielsweise Natriumdiethylbarbiturat), mindestens ein Protein wie Rinderserumalbumin (BSA), Milcheiweiß, oder Ovalbumin und mindestens ein ionisches Detergens wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder ein Gallensalz und/oder mindestens ein nicht-ionisches Detergens wie ®Nonidet P 40, ®Triton X 100 oder ®Tween 20 enthält.Furthermore, the multi-species insulin Assay the advantage that even in the presence of ionic and non-ionic detergents, auxiliary proteins, Detergent mixtures and detergent auxiliary protein mixtures can be measured. As detergents, for example Sodium dodecyl sulfate (SDS), ®Triton X 100 or ®Nonidet P 40 and as auxiliary proteins bovine serum albumin (BSA), chicken egg white, Ovalbumin or E. coli proteins can be used. Ionic Detergents can preferably range from 0-0.3%, nonionic Detergents preferably in the range of 0-2% and Auxiliary proteins are preferably used in the range of 0-3% (Percentages in w / v = weight / volume). The measurement in The presence of these substances has the advantage that for example, poorly soluble products from genetic engineering Making the measurement are accessible without the assay significantly interfere with what according to immunometric methods The prior art was not possible until now. Neither Auxiliary proteins or foreign proteins such as calcitonin or that Nonapeptide buserelin, still common buffer systems interfere with Multi-species assay essential. For example, for the radioimmunological determination (RIA determination) of genetically engineered products, which in Microorganisms as poorly soluble inclusion bodies a buffer system has proven to be very suitable, which in addition to the usual buffer substances such as phosphate buffers (Na₂HPO₄, NaH₂PO₄), Tris buffer (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) or barbiturate buffer (e.g. Sodium diethyl barbiturate), at least one protein like Bovine serum albumin (BSA), milk protein, or ovalbumin and at least one ionic detergent such as sodium dodecyl sulfate (SDS), hexadecyltrimethylammonium bromide or a bile salt and / or at least one non-ionic detergent such as ®Nonidet P 40, ®Triton X 100 or ®Tween 20 contains.
Da die erfindungsgemäßen Insulin-Antikörper zur gleichwertigen Erfassung von erheblich unterschiedlichen antigenen Insulinen herangezogen werden können, eignen sie sich auch in Kombination mit bisher bekannten hochspezifischen Insulin Antikörpern zur Untersuchung der Tertiärstruktur und der Lokalisierung von essentiellen und weniger essentiellen Strukturmerkmalen im Insulinmolekül.Since the insulin antibodies according to the invention are equivalent Detection of significantly different antigenic insulins can also be used in Combination with previously known highly specific insulin Antibodies to study the tertiary structure and the Localization of essential and less essential Structural features in the insulin molecule.
Das geschützte Insulin-A-Kette-(14-21)-Octapeptid wird nach W.
König, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227-247
synthetisiert. Zur Konjugation an BSA als Carrier-Molekül wird
das geschützte Insulin-A-Kette-(14-21)-Octapeptid Ddz-
Tyr(tBu)-Gln-Leu-Glu(OtBu)-Asn-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-AsnOtBu durch
Behandlung mit einer Mischung aus Trifluoressigsäure und
Ethanthiol aller Schutzgruppen entledigt (nach W. König, K.
Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247). Das
resultierende Produkt wird dann mit Hilfe des bifunktionellen
Kupplungsreagenz 1-Hydroxy-2-nitrobenzol-4-sulfonsäure-N-
maleinimido-6-caproyl-ester Natriumsalz (mal-sac-HNSA) an BSA
kovalent gebunden. Dafür werden 55 mg mal-sac-HNSA zu einer
Lösung von 111 mg BSA (entspricht 95 equivalenten Lysin) in 10 ml
0,1 molaren Phosphatpuffer bei pH 7,4 gegeben. Nach 60
Minuten Rühren bei Raumtemperatur wird die Reaktionsmischung
über Sephadex G 25 in 0,1 molaren Phosphatpuffer bei pH 6,2
chromatographiert und der zuerst eluierende Peak gesammelt. Zu
dieser Lösung werden 67 mg (65 µmol) Insulin-A-Kette-(14-21)-
Octapeptid gegeben. Danach läßt man über Nacht bei
Raumtemperatur stehen. Die Reaktionsmischung wird nun gegen
Wasser dialysiert und die resultierennde Lösung lyophylisiert.
Ausbeute: 122 mg,
Proteingehalt: 83%,
15 Moleküle Octapeptid pro Molekül BSA (bestimmt durch
Aminosäureanalyse).
The protected insulin A chain (14-21) octapeptide is according to W. Koenig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem. 1979, 227-247. For conjugation to BSA as a carrier molecule, the protected insulin A chain (14-21) octapeptide Ddz-Tyr (tBu) -Gln-Leu-Glu (OtBu) -Asn-Tyr (tBu) -Cys (Trt ) -AsnOtBu eliminated by treatment with a mixture of trifluoroacetic acid and ethanethiol of all protective groups (according to W. Koenig, K. Kernebeck, Liebigs Ann. Chem., 1979, 227-247). The resulting product is then covalently bound to BSA using the bifunctional coupling reagent 1-hydroxy-2-nitrobenzene-4-sulfonic acid N-maleimido-6-caproyl ester sodium salt (mal-sac-HNSA). For this, 55 mg mal-sac-HNSA are added to a solution of 111 mg BSA (corresponds to 95 equivalent lysine) in 10 ml 0.1 molar phosphate buffer at pH 7.4. After stirring for 60 minutes at room temperature, the reaction mixture is chromatographed on Sephadex G 25 in 0.1 molar phosphate buffer at pH 6.2 and the first eluting peak is collected. 67 mg (65 μmol) of insulin A chain (14-21) octapeptide are added to this solution. Then allowed to stand overnight at room temperature. The reaction mixture is now dialyzed against water and the resulting solution is lyophilized.
Yield: 122 mg,
Protein content: 83%,
15 molecules of octapeptide per molecule of BSA (determined by amino acid analysis).
Zur Immunisierung wurden drei Tierarten verwendet, und zwar mischrassige Hauskaninchen (Zahl der Individuen=3) und je ein Schaf und eine Ziege. Die Immunisierung wurde bei allen Tieren gleichzeitig begonnen, wobei den Kaninchen je 0,1 mg des Octapeptid/BSA-Konjugats aus Beispiel 1 in KFA (komplettes Freundsches Adjuvants, Difco) und Schaf und Ziege je 2,5 mg des Octapeptid/BSA-Konjugats in KFA als Initialdosis intramuskulär appliziert wurde. In der dritten Woche nach Erstapplikation wurde mit der gleichen Menge Octapeptid/BSA- Konjugat in IFA (Inkomplettes Freundsches Adjuvans, Behring) geboostert und dieser Vorgang in der 4., 8., 13., 18. und 25. Woche wiederholt. In der 27., 32. und 37. Woche wurde mit der gleichen Menge an reinem nicht-BSA-konjugiertem Octapeptid in IFA geboostert. Die Abnahme der Antiseren erfolgte jeweils zum ersten Mal in der 10. Woche und dann jeweils zehn Tage nach dem Boostern. Die Titerbestimmung erfolgte wie in der Literatur beschrieben (T. Chard, "An introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1987), S. 101-102). Dabei wurde eine Verdünnungsreihe (1 : 10-1 : 10⁶) des abgenommenen Serums in MSTB-Puffer (Zusammensetzung des Puffers s. Beispiel 3) angesetzt und die Menge an jeweils gebundenem Tracer unter Assaybedingungen (s. Beispiel 3) bestimmt. Der Titer ist dann derjenige Wert, bei der die Antikörper des jeweiligen Serums bei einer gegebenen Verdünnung 50% des eingesetzten Tracers binden. Der Titer wird als reziproker Wert angegeben. Die Seren der oben beschriebenen immunisierten Tiere hatten Titer von 1 : 500-1 : 10 000.Three animal species were used for immunization, namely mixed-breed domestic rabbits (number of individuals = 3) and each a sheep and a goat. The immunization was done at all Animals started at the same time, the rabbits each 0.1 mg of the octapeptide / BSA conjugate from Example 1 in KFA (complete Freund's adjuvant, Difco) and sheep and goat each 2.5 mg of the octapeptide / BSA conjugate in KFA as an initial dose was applied intramuscularly. In the third week after First application was carried out with the same amount of octapeptide / BSA Conjugate in IFA (Incomplete Freund's adjuvant, Behring) boosted and this process in the 4th, 8th, 13th, 18th and 25th Repeated week. In the 27th, 32nd and 37th week, the equal amount of pure non-BSA conjugated octapeptide in IFA boosted. The antisera were removed at each first in the 10th week and then ten days after the booster. The titer was determined as in the Literature described (T. Chard, "An introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques ", Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1987), pp. 101-102). One was Dilution series (1: 10-1: 10⁶) of the removed serum in MSTB buffer (composition of the buffer see example 3) and the amount of tracer bound in each case Assay conditions (see Example 3) determined. The titer is then the value at which the antibodies of the respective serum at a given dilution 50% of the tracer used tie. The titer is given as a reciprocal value. The Sera from the immunized animals described above had titers from 1: 500-1: 10,000.
Zur Herstellung eines Radioimmunoassays wurde ein Schafantiserum (S 239) mit einem Titer von 1 : 500 verwendet. Das eingesetzte Antiserum wurde ohne weitere Reinigung direkt eingesetzt. Die Verdünnung des Serums betrug 1 : 20 (in MSTB- Puffer); es wurde bei -20°C gelagert. Die Gebrauchsverdünnung betrug 1 : 500 (in MSTB-Puffer).A was used to produce a radioimmunoassay Sheep antiserum (S 239) with a titer of 1: 500 was used. The antiserum used became direct without further purification used. The dilution of the serum was 1:20 (in MSTB- Buffer); it was stored at -20 ° C. The usage dilution was 1: 500 (in MSTB buffer).
Der verwendete MSTB-Puffer bestand aus:The MSTB buffer used consisted of:
0.1 M Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) eingestellt auf pH
7.5 mit 1 M NaOH
2,5% (w/v) Rinderserumalbumin
0,2% (w/v) Natriumdodecylsulfat
0,2% (w/v) ®Triton X-100
0,04% (w/v) Natriumazid0.1 M morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) adjusted to pH 7.5 with 1 M NaOH
2.5% (w / v) bovine serum albumin
0.2% (w / v) sodium dodecyl sulfate
0.2% (w / v) ®Triton X-100
0.04% (w / v) sodium azide
Zur Assaydurchführung wurde eine Immunglobulinlösung in einer Konzentration von 10 mg/ml bidest. Wasser verwendet.To carry out the assay, an immunoglobulin solution in a Concentration of 10 mg / ml bidist. Water used.
Als Tracer wurde ¹²⁵J-markiertes Schweineinsulin (Behringwerke AG, Marburg, Prod.-Nr. OCSM) verwendet (10 ng<74 KBq Lyophilisat).¹²⁵J-labeled pig insulin (Behringwerke AG, Marburg, Prod.No. OCSM) used (10 ng <74 KBq Lyophilisate).
Pro Teströhrchen wurde eine Totalaktivität von 20 000-30 000 counts eingesetzt.There was a total activity of 20,000-30,000 per test tube counts used.
Die Standards wurden zunächst auf ihren Proteingehalt untersucht. Anschließend wurde der Gehalt an später im RIA zu bestimmender Substanz (Insuline verschiedener Spezies, 16 Insulinderivate, Insulinvorstufen etc.) festgestellt. Dann wurden die Standards auf eine Konzentration von 2000 ng/ml in MSTB-Puffer eingestellt. Für die Aufnahme der Standardkurven wurde jeweils eine geometrische Verdünnungsreihe in folgenden Konzentrationen (Angaben in ng/ml MSTB-Puffer) hergestellt: 3.71; 7.5; 15; 30; 60; 120; 240; 480; 960; 1920.The standards were initially based on their protein content examined. Subsequently, the salary was later increased in the RIA determining substance (insulins of different species, 16 Insulin derivatives, insulin precursors, etc.) found. Then the standards were adjusted to a concentration of 2000 ng / ml MSTB buffer set. For the inclusion of the standard curves was a geometric dilution series in the following Concentrations (given in ng / ml MSTB buffer): 3.71; 7.5; 15; 30; 60; 120; 240; 480; 960; 1920.
Zur Ermittlung der Standardkurven wurden jeweils 100 µl Standard, 100 µl Tracer und 100 µl Antiserum in ein Röhrchen (Fa. Sarstedt, Best.-Nr. 55-535) pipettiert. Die Probe wurde gut durchmischt und über Nacht (18 Stunden) bei Raumtemperatur (18-25°C) stehengelassen. Vor dem Ausfällen mit 1000 µl Polyethylenglykol (Molekulargewicht ca. 4000) wurde mit 50 µl Immunglobulinlösung versetzt und gut durchmischt. Nach 20 Minuten wurde mit 1500×g abzentrifugiert und der Überstand abdekantiert. Das Präzipitat wurde dann im Gamma-Counter (Gamma-Counter 1277, Pharmacia LKB) 1 Minute gemessen. Es kam jeweils eine Doppelbestimmung zur Auswertung.To determine the standard curves, 100 µl was used Standard, 100 µl tracer and 100 µl antiserum in one tube (Sarstedt, Order No. 55-535) pipetted. The sample was well mixed and overnight (18 hours) at room temperature (18-25 ° C) left. Before the breakdown with 1000 µl Polyethylene glycol (molecular weight approx. 4000) was with 50 ul Immunoglobulin solution added and mixed well. After 20 The mixture was centrifuged at 1500 × g for minutes and the supernatant decanted. The precipitate was then in the gamma counter (Gamma counter 1277, Pharmacia LKB) measured for 1 minute. It came one double determination each for evaluation.
Zur Ermittlung des Leerwerts wurde wie oben unter "Aufnahme der Standardkurven" beschrieben, verfahren. Anstelle des Standards wurde hier jedoch 100 µl MSTB-Puffer eingesetzt.To determine the blank value, use the "Recording of the standard curves " However, 100 µl MSTB buffer was used as standard.
Anhand der Standards mit zuvor bestimmem Gehalt an Insulin
bzw. vom Insulin abgeleitetem Protein (s. Beispiel 3:
Standards), wurden für folgende Insuline Standardkurven
aufgenommen:
Humaninsulin (Fig. 1), Schweineinsulin (Fig. 2), Rinderinsulin
(Fig. 3), Schafinsulin (Fig. 4), Hühnerinsulin (Fig. 5) und
Pferdeinsulin (Fig. 6), die Derivate Des-Phe-B1-
Schweineinsulin (Fig. 7), Di-Arg-B31-B32-Humaninsulin (Fig. 8),
Mono-Arg-B31-Humaninsulin (Fig. 9), Pro-Schweineinsulin
(Fig. 10) sowie Insulin-A-Kette-Tetra-Sulfonat (Fig. 11) und
14-21-Octapeptid (Fig. 12) und 16-21-Hexapeptid (Fig. 13).Using the standards with a previously determined content of insulin or protein derived from the insulin (see example 3: standards), standard curves were recorded for the following insulins:
Human insulin (Fig. 1), porcine insulin (Fig. 2), bovine insulin (Fig. 3), sheep insulin (Fig. 4), chicken insulin (Fig. 5) and horses insulin (Fig. 6), the derivatives of des-Phe-B1 Pig insulin ( Fig. 7), Di-Arg-B31-B32 human insulin ( Fig. 8), Mono-Arg B31 human insulin ( Fig. 9), Pro-pig insulin ( Fig. 10) and insulin A chain - Tetra sulfonate ( Fig. 11) and 14-21 octapeptide ( Fig. 12) and 16-21 hexapeptide ( Fig. 13).
Die in den Figuren angegebenen Werte B/B₀ geben den Quotienten aus gemessener Aktivität B und maximaler Aktivität B₀ (komplette Sättigung des Antikörpers mit Tracer) an. Die in den Fig. 1-13 dargestellten Standardkurven belegen deutlich, daß mit dem erfindungsgemäßen RIA unter Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper eine empfindliche Nachweismethode für eine Vielzahl von Insulinen zur Verfügung gestellt wurde.The values B / B₀ given in the figures indicate the quotient of measured activity B and maximum activity B₀ (complete saturation of the antibody with tracer). The standard curves shown in FIGS. 1-13 clearly demonstrate that the RIA according to the invention using the antibodies according to the invention provided a sensitive detection method for a large number of insulins.
Der Einfluß von Fremdproteinen und des Puffersystems auf die Messungen wurde untersucht und es wurde festgestellt, daß weder hohe Konzentrationen an BSA noch an E. coli-Proteinen den Assay stören. Als Negativ-Kontrolle, um den Nachweis einer fehlenden Kreuzreaktivität mit kleinen Peptid-Strukturen zu erbringen, wurde Calcitonin und Buserelin in gleichen Konzentrationen wie das Octapeptid dem Testansatz zugesetzt. Es zeigte sich keine Kreuzreaktivität (s. Fig. 14 und Fig. 15).The influence of foreign proteins and the buffer system on the measurements was investigated and it was found that neither high concentrations of BSA nor of E. coli proteins interfere with the assay. As a negative control in order to provide evidence of a lack of cross-reactivity with small peptide structures, calcitonin and buserelin were added to the test mixture in the same concentrations as the octapeptide. There was no cross-reactivity (s. Fig. 14 and Fig. 15).
Claims (25)
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