DE4015851C1

DE4015851C1 - Prepn. of hydroxy-(di):carboxylic acid - by treating 2-alkanol, with same number of carbon atmos. as prod. with mutant yeast with interrupted beta-oxidn. route

Info

Publication number: DE4015851C1
Application number: DE19904015851
Authority: DE
Inventors: Horst Dr. 4010 Hilden De Eierdanz; Peter Dr. 4018 Langenfeld De Lorenz; Franz Dr. Meussdoerffer; Joachim Dr. 4010 Hilden De Schindler; Gerhard Dr. 4052 Korschenbroich De Stoll; Heinrich Dr. 4018 Langenfeld De Waldhoff
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 1990-05-17
Filing date: 1990-05-17
Publication date: 1991-08-22
Anticipated expiration: 2010-05-18

Abstract

Prepn. of hydroxycarboxylic acid or hydroxydicarboxylic acid comprises treating a 2-alkanol II (with the same number of carbon atoms as the prod) with a mutant yeast with an interrupted beta-oxidn. route. The II are pref. prepd. by a Guerbet dimerisation reaction of linear, primary (un)satd alcohols with 12-40C. The yeast is pref a mutant of Candida, Pichia or Saccharomyces, esp. Candida lipolytica or C. tropicalis, produced by classical mutagenesis or gene technology. USE/ADVANTAGE - The prodn. of dicarboxylic acids with more than 10C is difficult by classic preparative chemistry. The process is a simpler way of fermentative prepn than prior art fermentations.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a method according to the preamble of claim 1.

Dicarbonsäuren mit mehr als 10 C-Atomen sind nach Methoden der prä parativen organischen Chemie im technischen Maßstab schwer herstell bar. Dies gilt insbesondere für Dicarbonsäuren, die außer den beiden endständigen Carboxylgruppen noch weitere funktionelle Gruppen wie Doppelbindungen oder Hydroxylgruppen aufweisen.Dicarboxylic acids with more than 10 carbon atoms are by methods of the pre difficult to manufacture parative organic chemistry on an industrial scale bar. This is especially true for dicarboxylic acids other than the two terminal carboxyl groups and other functional groups such as Have double bonds or hydroxyl groups.

Man hat daher versucht, aus gut zugänglichen Rohstoffen mit Hilfe der Stoffwechselleistungen verschiedener Mikroorganismen lineare Dicarbonsäuren präparativ zu erzeugen. So wird in der deutschen Pa tentschrift 21 40 133 vorgeschlagen, auf Alkane, primäre Alkanole oder Carbonsäuren eine Hefe der Gattung Candida und Pichia unter Fermentationsbedingungen einwirken zu lassen. Bei Einsatz von zum Beispiel einem speziellen Stamm von Candida lipolytica entstehen dabei Dicarbonsäuren, deren C-Kette gegenüber dem Ausgangsmaterial nicht oder nicht wesentlich abgebaut ist und auch ansonsten keine Veränderungen wie Einführen neuer funktioneller Gruppen aufweist. Ähnliche Verfahren, bei denen spezielle andere Mikroorganismen ein gesetzt werden, sind beschrieben in den US-Patenten 39 75 234 und 43 39 536, in der britischen Patentschrift 14 05 026 sowie in den deutschen Offenlegungsschriften 21 64 626, 28 53 847, 29 37 292 und 29 51 177.Attempts have therefore been made to obtain from easily accessible raw materials linear metabolism of various microorganisms To produce dicarboxylic acids preparatively. So in the German Pa tentative document 21 40 133 proposed on alkanes, primary alkanols or carboxylic acids a yeast of the genus Candida and Pichia under To let fermentation conditions take effect. When using the Example of a special strain of Candida lipolytica thereby dicarboxylic acids, their C chain compared to the starting material is not or not significantly degraded and otherwise none Changes such as introducing new functional groups. Similar procedures involving special other microorganisms are described in U.S. Patents 3,975,234 and 43 39 536, in British Patent Specification 14 05 026 and in German Offenlegungsschriften 21 64 626, 28 53 847, 29 37 292 and 29 51 177.

Das US-Patent 44 74 882 hat ungesättigte Dicarbonsäuren zum Gegen stand. Diese werden gewonnen, indem ein Stamm der Spezies Candida tropicalis zur Umwandlung von ungesättigten Monocarbonsäuren mit 14 bis 22 C-Atomen eingesetzt wird. Die ungesättigten Dicarbonsäuren entsprechen in der Anzahl und Lage der Doppelbindung den Ausgangs materialien.The US patent 44 74 882 counteracts unsaturated dicarboxylic acids was standing. These are obtained from a strain of the Candida species tropicalis for the conversion of unsaturated monocarboxylic acids with 14 up to 22 carbon atoms is used. The unsaturated dicarboxylic acids correspond to the starting point in the number and position of the double bond materials.

In der deutschen Offenlegungsschrift 35 40 834 wird ein Ver fahren zur Umwandlung von Alkanen und/oder Monocarbonsäuren in Di carbonsäuren angegeben, bei dem mit einer Blockmutante von Candida lipolytica gearbeitet wird, wobei Dicarbonsäuren entstehen, die zu sätzliche Doppelbindungen aufweisen.In German Offenlegungsschrift 35 40 834 a Ver drive to convert alkanes and / or monocarboxylic acids into Di carboxylic acids specified in which with a block mutant of Candida lipolytica is worked, whereby dicarboxylic acids are formed which lead to have additional double bonds.

Ein Verfahren, bei dem keine zusätzlichen Doppelbindungen eingefügt werden, wird in der deutschen Offenlegungsschrift 37 21 119 be schrieben, die einen Mikroorganismenstamm Candida tropicalis be trifft, der die Fähigkeit aufweist, insbesondere Methylmyristat in Tetradecandisäure umzuwandeln.A process in which no additional double bonds are inserted are, in the German Offenlegungsschrift 37 21 119 be wrote that a microorganism strain Candida tropicalis be who has the ability, especially methyl myristate in To convert tetradecanedioic acid.

Schließlich beschreibt die deutsche Offenlegungsschrift 37 38 812 einen Stamm Candida tropicalis, der die Fähigkeit besitzt, Ketten längen spezifisch Methyllaurat in die entsprechende Dicarbonsäure umzusetzen. Finally, German Offenlegungsschrift 37 38 812 describes a strain of Candida tropicalis that has the ability to chain specifically lengthen methyl laurate in the corresponding dicarboxylic acid to implement.

Eine Literaturübersicht über das Gesamtgebiet findet sich bei H.J. Rehm und G. Reed (Herausgeber), Biotechnology, Vol. 6a, Kapitel 9, Seiten 329 ff., Verlag Chemie Weinheim 1984).A literature review of the entire area can be found at H.J. Rehm and G. Reed (Editor), Biotechnology, Vol. 6a, Chapter 9, Pages 329 ff., Verlag Chemie Weinheim 1984).

Der gesamten Vorliteratur ist nicht zu entnehmen, daß mit Hilfe von Hefe-Mutanten deren β-Oxidation geblockt ist, auch verzweigte Alko hole wie 2-Alkylalkanole in entsprechende Carbonsäuren, also Hydro xymonocarbonsäuren bzw. Hydroxydicarbonsäuren, umgewandelt werden können. Derartige Hydroxymonocarbonsäuren bzw. Hydroxydicarbonsäuren stellen jedoch wertvolle Rohstoffe dar. Überdies hätte der Fachmann erwartet, daß beim Einsatz von 2-Ethylalkanolen in erster Linie die Oxidation der CH₂-OH-Gruppe zu einer Carboxylgruppe stattfindet, nicht aber, daß diese Gruppe erhalten bleibt.The entire preliminary literature does not show that with the aid of yeast mutants whose β-oxidation is blocked, branched alcohols such as 2-alkylalkanols can also be converted into corresponding carboxylic acids, that is to say hydroxymonocarboxylic acids or hydroxydicarboxylic acids. However, such hydroxymonocarboxylic acids or hydroxydicarboxylic acids are valuable raw materials. In addition, the person skilled in the art would have expected that when using 2-ethylalkanols the oxidation of the CH ₂ OH group to a carboxyl group takes place, but not that this group is retained.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, diese Verbin dungen durch Fermentationen in einfacher Weise zu gewinnen.The invention lies the task of providing a method, this verb to gain easily through fermentations.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Umwandlung von Alkanen und/oder ihren Derivaten in Dicarbonsäuren oder Derivate mit zumindest vorwiegend gleicher Anzahl an C-Atomen in Gegenwart von Hefe-Mutanten, deren β-Oxidationsweg unterbrochen ist, dadurch ge kennzeichnet, daß man 2-Alkylalkanole in Hydroxymonocarbonsäuren und/oder Hydroxydicarbonsäuren umwandelt.The invention thus relates to a method for converting Alkanes and / or their derivatives in dicarboxylic acids or derivatives with at least predominantly the same number of carbon atoms in the presence of Yeast mutants whose β-oxidation path is interrupted thereby ge indicates that 2-alkylalkanols in hydroxymonocarboxylic acids and / or hydroxydicarboxylic acids.

Bei den erfindungsgemäß als Ausgangsstoffe eingesetzten Verbindungen handelt es sich um 2-Alkylalkanole. Bevorzugt sind solche 2-Alkyl alkanole, die durch Dimerisierung und insbesondere durch Guerbet-Re aktion aus primären linearen Alkoholen hergestellt werden können und technisch verfügbar sind. Unter diesen Verbindungen sind die durch Guerbet-Reaktion hergestellten Dimerisierungsprodukte von Fettalko holen bzw. Fettalkoholgemischen besonders bevorzugt. Derartige aus Fettalkoholen hergestellte 2-Alkylalkanole können auch noch Doppel bindungen enthalten. In the compounds used as starting materials according to the invention it is 2-alkylalkanols. Such 2-alkyl are preferred alkanols produced by dimerization and in particular by Guerbet-Re action can be prepared from primary linear alcohols and are technically available. Among these connections are the through Guerbet reaction produced dimerization products from fatty alcohol get or fatty alcohol mixtures particularly preferred. Such from 2-Alkylalkanols produced from fatty alcohols can also double bindings included.

Neben oder anstelle dieser Verbindungen können aber auch andere 2-Alkylalkanole eingesetzt werden, insbesondere Produkte mit einer kürzeren Alkylverzweigung in 2-Stellung. Dabei hat sich im erfin dungsgemäßen Verfahren herausgestellt, daß kurzkettige Alkylver zweigungen, also etwa Methyl- oder Ethylgruppen, nicht oder nur in geringem Umfang zu Carboxylgruppen oxidiert werden. Längerkettige Verzweigungen werden jedoch zu Produkten mit endständiger Carboxyl gruppe umgewandelt.In addition to or instead of these connections, others can also 2-alkylalkanols are used, in particular products with a shorter alkyl branch in the 2-position. It has invented Process according to the invention found that short-chain alkylver branches, i.e. about methyl or ethyl groups, not or only in are oxidized to a small extent to carboxyl groups. Longer chain However, branches become products with a terminal carboxyl group converted.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Fachmann auf eine Vielzahl von bekannten Hefemutanten, bei denen der β-Oxi dationsweg durch klassische Mutagenese oder genetische Manipulation unterbrochen ist, zurückgreifen. So sind prinzipiell eine Vielzahl von Mutanten von Stämmen einsetzbar, die den Gattungen Candida, Pichia oder Saccharomyces angehören.The person skilled in the art can carry out the method according to the invention to a large number of known yeast mutants in which the β-oxi dationsweg by classic mutagenesis or genetic manipulation is interrupted, fall back. In principle, there are many mutants of strains which are of the genera Candida, Pichia or Saccharomyces belong to it.

Mit besonderem Vorteil können Mutanten von Stämmen Candida lipoly tica oder Candida tropicalis eingesetzt werden. So kann beispiels weise der in der DE 35 40 834 A1 genannte Stamm DSM 3581 oder der in der DE 37 38 812 A1 genannte Stamm DSM 4277 bzw. Mutanten oder Varian ten dieser Sämme mit Erfolg bevorzugt eingesetzt werden.Mutants of Candida lipoly strains can be used with particular advantage tica or Candida tropicalis can be used. For example as the strain DSM 3581 mentioned in DE 35 40 834 A1 or in strain DSM 4277 or mutants or variants called DE 37 38 812 A1 Ten of these seeds are preferably used with success.

Das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Fermentationsmedium entspricht den für die Anzucht von Candida-Arten bekannten und beschriebenen Medien. Geeignete Fermentationsmedien enthalten die üblichen Spurenelemente, eine Stickstoffquelle und eine zusätzliche, mit dem zu transformierenden Substrat nicht identische Kohlenstoffquelle. Unter Spurenelementen sind hier beispielsweise Salze der Kationen, Ammonium, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium und Mangan mit den Anionen wie Phosphat, Sulfat, Chlorid zu verstehen. Als Stickstoffquelle können neben anorgani schen Verbindungen wie zum Beispiel (NH₄)₂SO₄ auch Pepton oder Hefeextrakt eingesetzt werden. The fermentation medium used to carry out the process according to the invention corresponds to the media known and described for the cultivation of Candida species. Suitable fermentation media contain the usual trace elements, a nitrogen source and an additional carbon source that is not identical to the substrate to be transformed. Here, trace elements are understood to mean, for example, salts of the cations, ammonium, potassium, sodium, magnesium, calcium and manganese with the anions such as phosphate, sulfate, chloride. In addition to inorganic compounds such as (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , peptone or yeast extract can also be used as the nitrogen source.

Die Fermentationslösung enthält weiterhin als Kohlenstoffquelle ein Cosubstrat. Als Cosubstrat kann beispielsweise Natriumacetat einge setzt werden. Weiterhin ist es möglich, daß als Cosubtrat übliche Zucker wie Glucose, Fructose, Maltose, Trehalose und dergleichen eingesetzt werden. Ein besonders bevorzugtes Cosubstrat ist Gly cerin.The fermentation solution also contains a carbon source Co-substrate. Sodium acetate, for example, can be used as the cosubstrate be set. It is also possible that the usual cosubtrate Sugars such as glucose, fructose, maltose, trehalose and the like be used. A particularly preferred cosubstrate is Gly cerin.

Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, den zur Umwandlung vorgesehenen Ausgangsverbin dungen zur besseren Verteilung im Fermentationsmedium Emulgatoren zuzufügen. So werden günstige Ergebnisse erzielt, wenn insgesamt 0,1 bis 3 Gew.-%, bezogen auf Fermentationsmedium, an Emulgatoren vorhanden sind. Geeignet sind hier physiologisch verträgliche Emul gatoren und insbesonders physiologisch verträgliche nichtionische Emulgatoren. So können beispielsweise Zuckerester oder auch Sor bitanester, ethoxylierte Zuckerester, ethoxylierte Sorbitanester oder auch Alkylglycoside eingesetzt werden.According to a further embodiment of the method according to the invention it is preferred to use the output connector provided for conversion for better distribution in the fermentation medium emulsifiers inflict. In this way, favorable results are achieved when overall 0.1 to 3% by weight, based on the fermentation medium, of emulsifiers available. Physiologically compatible emuls are suitable here gators and in particular physiologically compatible nonionic Emulsifiers. For example, sugar esters or Sor bitan esters, ethoxylated sugar esters, ethoxylated sorbitan esters or alkylglycosides can also be used.

Die erfindungsgemäß hergestellten Hydroxycarbonsäuren bzw. Hydroxy dicarbonsäuren können als Ausgangsstoffe für die Herstellung von Polyestern oder auf dem Schmiermittelsektor Verwendung finden. The hydroxycarboxylic acids or hydroxy produced according to the invention Dicarboxylic acids can be used as starting materials for the production of Polyesters or in the lubricant sector.

Examples Medium A

"Yeast-Nitrogen-Base" Medium, pH 6.8, supple mentiert mit 1,3% Glucose, 4,5% Glycerin, 0,3% Na-Acetat, 0,3% Pepton und 0,6% Hefeextrakt sowie 0,5% Transformationsedukt."Yeast Nitrogen Base" medium, pH 6.8, supple mentored with 1.3% glucose, 4.5% glycerin, 0.3% Na acetate, 0.3% Peptone and 0.6% yeast extract and 0.5% transformation adduct.

Medium B

0.2M Phosphatpuffer, pH 7,8 mit "Yeast nitrogen base w/o aminoacids", 0,3% ethoxylierter Sorbitanester, MYRJ52® und 3% Substrat.0.2M phosphate buffer, pH 7.8 with "Yeast nitrogen base w / o aminoacids ", 0.3% ethoxylated sorbitan ester, MYRJ52® and 3% substrate.

example 1

Candida lipolytica DSM 3581 wurde in 100 ml YM-Nährbouillion (500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen) angeimpft und für 36 h bei 140 UpM geschüttelt. Aus dieser Vorkultur wurde ein Aliquot (10 ml) zur Beimpfung von 100 ml Medium A verwendet. Diese Kultur wurde 36 h bei 30°C geschüttelt. Danach wurden 50 ml der erhaltenen Zellsuspension mit 50 ml Medium B in neue, sterile 500 ml-Erlen meyerkolben gegeben und bei 30°C geschüttelt. Als Substrate wurden entweder 2-Octyldodecanol (Eutanol®G20) oder 2-Hexyldecanol (Eutanol®G16) eingesetzt. Nach 6 h fand eine erste pH-Kontrolle statt, gleichzeitig wurden weitere 3% des Edukts und 1% Glycerin als Cosubstrat zugegeben.Candida lipolytica DSM 3581 was in 100 ml YM broth (500 ml Erlenmeyer flask with baffles) inoculated and for 36 h shaken at 140 rpm. This pre-culture became an aliquot (10 ml) was used to inoculate 100 ml of medium A. This culture was shaken at 30 ° C for 36 h. Then 50 ml of the obtained Cell suspension with 50 ml medium B in new, sterile 500 ml alder given a flask and shaken at 30 ° C. As substrates were either 2-octyldodecanol (Eutanol® G20) or 2-hexyldecanol (Eutanol®G16). After 6 h a first pH check was carried out instead, at the same time a further 3% of the educt and 1% glycerol added as a cosubstrate.

Die Bildung der Produkte wurde mittels TLC verfolgt. Durch Anfärbung mit 2,7-Dichlorfluorescin und FeCl₃ konnten Verbindungen, die Carb oxylgruppen enthalten (mithin Carbonsäuren, d. h. Produkte), selektiv visualisiert werden. The formation of the products was followed by TLC. By staining with 2,7-dichlorofluorescine and FeCl₃ could compounds that carb contain oxyl groups (hence carboxylic acids, i.e. products), selectively be visualized.

Example 2

Eine Vorkultur einer Mutante von Candida tropicalis DSM 4277 wurde - wie in Beispiel 1 beschrieben - angezogen und zur Beimpfung von 500 ml Medium A im 2 l Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kultur wurde 48 h bei 30°C geschüttelt (140 UpM) und anschließend in 100 ml Ali quots steril abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ml Medium B (500 ml Erlenmeyerkolben) resuspendiert, wobei 2-Octyldodecanol (Eutanol®G20) als Substrat diente. Nach jeweils 24 h wurde der pH des Ansatzes überprüft und bei Bedarf nachgestellt und der Fortgang der Transformation durch TLC mit anschließender Anfärbung auf Carb oxylgruppen überprüft. Das Auftreten positiver Banden nach Anfärbung mit Eisenchlorid zeigte die Bildung von Carbonsäuren an. Nach 60, 80 und 161 h wurden Essigesterextrakte von Aliquots des Ansatzes mit tels HPLC auf ihre Zusammensetzung hin untersucht. Neugebildete Ver bindungen wurden nach der Auftrennung und Derivatisierung mittels GCMS charakterisiert. So konnte nachgewiesen werden, daß sich nach 64 h 0.8 g/l der Monohydroxysäure und 0.8 g/l der Hydroxydicarbon säure gebildet hatten.A pre-culture of a mutant Candida tropicalis DSM 4277 was made - as described in Example 1 - dressed and inoculated with 500 ml of medium A used in a 2 l Erlenmeyer flask. The culture was Shaken for 48 h at 30 ° C (140 rpm) and then in 100 ml ali centrifuged sterile. The cells were in 100 ml of medium B (500 ml Erlenmeyer flask) resuspended, taking 2-octyldodecanol (Eutanol®G20) served as the substrate. After every 24 h the pH the approach checked and adjusted if necessary and the progress the transformation by TLC with subsequent staining for carb checked oxyl groups. The appearance of positive bands after staining with iron chloride indicated the formation of carboxylic acids. After 60, 80 and 161 h were ethyl acetate extracts from aliquots of the batch examined by HPLC for their composition. Newly formed ver After the separation and derivatization, bonds were created using Characterized GCMS. It was thus possible to demonstrate that after 64 h 0.8 g / l of monohydroxy acid and 0.8 g / l of hydroxydicarbon had formed acid.

Example 3

Candida tropicalis (aus Beispiel 2) wurde analog zu Beispiel 2 zur Transformation von Lial®123 einge setzt. Die Analytik der Produkte erfolgte - wie in Beispiel 2 dar gelegt - mit TLC, HPLC und GCMS. Nach 48 h hatten sich 0.4 g/l der C₁₃-Hydroxymonocarbonsäure gebildet.Candida tropicalis (from Example 2) was used analogously to Example 2 to transform Lial®123. The analysis of the products was carried out - as shown in Example 2 - with TLC, HPLC and GCMS. After 48 h, 0.4 g / l of the C ₁₃ hydroxymonocarboxylic acid had formed.

Claims

1. A process for converting alkanes and / or their derivatives into dicarboxylic acids or derivatives with at least predominantly the same number of carbon atoms in the presence of yeast mutants whose β-oxi dationsweg is interrupted, characterized in that 2-alkylalkanols in hydroxymonocarboxylic acids and / or hydroxydi carboxylic acids.

2. The method according to claim 1, characterized in that by Guerbet reaction produced dimerization products more linear primary alcohols with 12 to 40 carbon atoms.

3. The method according to any one of claims 1 and 2, characterized in net that dimerization produced by Guerbet reaction uses products of saturated or unsaturated fatty alcohols.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in net that 2-alkylalkanols with 12 to 40 carbon atoms are used.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in net that one in the presence of a mutant of a strain of the genus Candida, Pichia or Saccharomyces works at which the β-oxidation pathway by classic mutagenesis or by gene technical manipulation is interrupted.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in net that one in the presence of a mutant of Candida lipolytica or Candida tropicalis works.