DE4000247A1 - Additives for increasing activity of enzymes acting on nucleic acids - comprising milk or its components or prods. - Google Patents

Additives for increasing activity of enzymes acting on nucleic acids - comprising milk or its components or prods.

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DE4000247A1 DE19904000247 DE4000247A DE4000247A1 DE 4000247 A1 DE4000247 A1 DE 4000247A1 DE 19904000247 DE19904000247 DE 19904000247 DE 4000247 A DE4000247 A DE 4000247A DE 4000247 A1 DE4000247 A1 DE 4000247A1
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Abstract

Activity-enhancing additives (I) for enzymatic reactions in which the substrate is a nucleotide-contg. mol. comprise milk and/or milk-components or milk prods. USE/ADVANTAGE - (I) are esp. useful for increasing the activity of restriction endonucleases in digesting nucleic acids, thereby reducing the amt. of enzyme required and rendering the digestion more complete (esp. important in studying restriction fragment polymorphism in genomic DNA). They may also increase the activity of ligases, ribonucleases, polynucleotide kinases, DNA and RNA polymerases, exonucleases and topoisomerases. (I) is dried milk powder or a protease-, DNase- and RNase-free milk protein fraction, esp. casein. (I) is added to an aq. buffer soln. of the enzyme and substrate in an amt. of 1-10,000 (esp. 50-300) mg/l. (I) may be formulated as a ready-to-use or concd. soln. in a buffer, pref. stabilised with a detergent and/or antifreeze.

Description

Die Erfindung betrifft eine die Aktivität verbessernde Zu­ satzkomponente für Enzymreaktionen, deren Enzyme als Substrat nukleotidhaltige Moleküle, insbesondere Polynukleotide wie DNA und RNA, haben.The invention relates to an activity improving Zu Set component for enzyme reactions, their enzymes as a substrate nucleotide-containing molecules, in particular polynucleotides such as DNA and RNA, have.

Reaktionslösungen für die obengenannten Enzymreaktionen ent­ halten neben den obligatorischen Pufferkomponenten: pH-ein­ gestellten Good-Puffer, NaCl, MgCl2, etc. (siehe: Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. (1982) "Molecular Cloning", S. 104ff, 453ff), oft auch Zusätze, die zwar kein Cofaktor oder Co­ substrat sind, aber die Enzymreaktion beschleunigen oder das Enzym in der Reaktionslösung stabilisieren (Davies,L.G., Dib­ ner, M.D., Battey, J.F. (1986) "Basic Methods in Molecular Bio­ logy" (Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York) S. 52-53; McCelland, M., Hanish, J., Nelson, M., Patel, Y. (1988) Nucl. Acids Res., 18 (1), 364ff; Dillely, A.G., Woo, S.L.C. (1985) Focus (Bethesda Research Laboratories, USA) 7 (2), 1ff). Be­ kannte Zusätze sind bspw.: bovines Serumalbumin, Spermidin, Polyethylenglykol, Dithioerythrit, Mercaptoethanol, Inhibito­ ren, wie placentaler RNAse-Inhibitor, Proteaseinhibitoren, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), DNAse-Inhibitoren, etc.Reaction solutions for the abovementioned enzyme reactions contain, in addition to the obligatory buffer components: pH-adjusted Good buffer, NaCl, MgCl 2 , etc. (see: Maniatis, T., Fritsch, EF, Sambrook, J. (1982) "Molecular Cloning" , Pp. 104ff, 453ff), often also additives which, although not a cofactor or co-substrate, accelerate the enzyme reaction or stabilize the enzyme in the reaction solution (Davies, LG, Dibner, MD, Battey, JF (1986) "Basic Methods in Molecular Bio-logic "(Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York) pp. 52-53; McCelland, M., Hanish, J., Nelson, M., Patel, Y. (1988) Nucl. Acids Res., 18 (1), 364ff; Dillely, AG, Woo, SLC (1985) Focus (Bethesda Research Laboratories, USA) 7 (2), 1ff). Known additives are, for example: bovine serum albumin, spermidine, polyethylene glycol, dithioerythritol, mercaptoethanol, inhibitors, such as placental RNAse inhibitor, protease inhibitors, such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), DNase inhibitors, etc.

Ferner können auch einzelne Komponenten der Pufferlösung, wie z. B. Natriumchlorid, durch physiologisch verwandte Substanzen ersetzt werden; anstelle von Natriumchlorid wird bspw. Kali­ umglutamat empfohlen. Solche Sonderzusätze sind aber nur bei bestimmten einzelnen Enzymreaktionen förderlich. Bei anderen Reaktionstypen besitzen sie hingegen zumeist eine schädliche, d. h. inhibierende Wirkung und können auch eine Reaktion voll­ ständig verhindern. So fördert bspw. dibasisches Spermidin die Ligation von Oligonukleotiden; es inhibiert aber die Re­ striktion von hochmolekularer DNA, weil damit die DNA-Stränge zu einem unlöslichen Präzipitat vernetzt werden. Manche der Zusätze, wie z. B. Kaliumglutamat oder PMSF, beeinflussen auch bei der gelelektrophoretischen Auftrennung das Laufverhalten der Reaktionsprodukte, z. B. DNA-Fragmente, so daß sie wegen der damit verbundenen Probleme zum allgemeinen Gebrauch unge­ eignet sind.Furthermore, individual components of the buffer solution, such as z. As sodium chloride, by physiologically related substances be replaced; instead of sodium chloride, for example, Kali umglutamate recommended. Such special supplements are only with conducive to certain individual enzyme reactions. For others Reaction types, on the other hand, usually have a harmful, d. H. inhibitory effect and can also complete a reaction constantly prevent. For example, promotes dibasic spermidine the ligation of oligonucleotides; but it inhibits the Re stricture of high-molecular-weight DNA because it causes DNA strands  be crosslinked to an insoluble precipitate. Some of the Additives, such. As potassium glutamate or PMSF, also influence in gel electrophoretic separation, the running behavior the reaction products, for. B. DNA fragments, so that they because the associated problems for general use unge are suitable.

Kommerzielle Enzymhersteller vermeiden daher möglichst Son­ derzusätze in den Reaktionslösungen - bzw. den Vorschriften und Empfehlungen dazu -, weil stets Risiken und Nachteile damit verbunden sind: Unwissenheit der Anwender über die Be­ sonderheiten der einzelnen Enzyme; Verwechslungsgefahr; Kon­ taminationsgefahr; zusätzlicher Aufwand bei der Herstellung der Reaktionspuffer; ungenügender Reinheitsgrad der Sonder­ komponenten; Lagerinstabilitäten, etc. Außerdem sind einige der Sonderzusätze schwer herzustellen und sehr teuer.Commercial enzyme manufacturers therefore avoid Son additives in the reaction solutions - or the regulations and recommendations - because there are always risks and disadvantages associated with this: ignorance of the users about the Be particularities of the individual enzymes; Confusion; Kon decontamination danger; additional effort in the production the reaction buffer; Insufficient degree of purity of the special components; Stock instabilities, etc. Besides, some are the special additives difficult to produce and very expensive.

Bei forensischen und klinischen Untersuchungen müssen aber oft große Mengen genomischer DNA mit verschiedenen DNA-Re­ striktionsendonukleasen gespalten werden. Da aber die meisten Restriktionsenzyme sehr teuer sind, ist es aus Kostengründen erwünscht, die Enzymaktivität mittels eines Sonderzusatzes zu stabilisieren oder ggf. zu erhöhen, wobei die Zusatzkomponen­ te vergleichsweise preiswert sein sollte. Da derartige Enzym­ reaktionen oft sehr schwer und nur bei großen Enzymmengen ab­ laufen, bestand deshalb ein Bedürfnis nach einer allgemeinen, kostengünstigen, die Enzymaktivität verbessernden Zusatzkom­ ponente.In forensic and clinical investigations, however, must often large amounts of genomic DNA with different DNA re cleavage endonucleases. But since most Restriction enzymes are very expensive, it is for cost reasons desired, the enzyme activity by means of a special addition stabilize or increase if necessary, the additional components te should be relatively inexpensive. Because such enzyme Reactions often very difficult and only for large amounts of enzyme from Therefore, there was a need for a general, inexpensive, the enzyme activity improving Zusatzkom component.

Diese Aufgabe wird durch eine Zusatzkomponente nach Patent­ anspruch 1 sowie durch das Verfahren nach Anspruch 6 gelöst. Weitere Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen. This object is achieved by an additional component according to patent claim 1 and solved by the method according to claim 6. Further embodiments of the invention will become apparent from the Dependent claims.  

Die Zusatzkomponente zur Verbesserung der Enzymaktivität be­ steht also im wesentlichen aus Milch und/oder deren Bestand­ teilen oder Produkten derselben. Unter wirtschaftlichen Ge­ sichtspunkten dürfte dabei Kuhmilch bevorzugt sein.The additional component for improving the enzyme activity be So it essentially consists of milk and / or its stock share or products of the same. Under economic Ge In view of this, cow's milk should be preferred.

Die Zusatzkomponente bewirkt nicht nur eine Erhöhung der En­ zymaktivität, insbesondere bei Restriktionsendonukleasen, sondern auch, daß die Reaktion mit dem Substrat vollständiger abläuft. So erfolgt bspw. in vielen Fällen der Restriktions­ verdau von menschlicher genomischer DNA nur unvollständig - die Gründe hierfür sind nicht ganz verstanden -, was dann zu falschen Ergebnissen bei der Untersuchung der Restriktions­ fragmentlängenpolymorphismen (RFLP′s) in der genomischen DNA führt. Die erfindungsgemäße Sonderkomponente im Restriktions­ puffer bewirkt hingegen eine Stabilisierung und Erhöhung der eingesetzten Enzymaktivität, so daß die genomische DNA voll­ ständig gespalten wird.The additional component not only causes an increase in En enzymatic activity, especially in restriction endonucleases, but also that the reaction with the substrate is more complete expires. Thus, for example, in many cases the restriction digestion of human genomic DNA is incomplete - the reasons for this are not completely understood - what then to wrong results in the investigation of the restriction fragment length polymorphisms (RFLP's) in genomic DNA leads. The special component according to the invention in the restriction By contrast, buffer causes stabilization and increase in the used enzyme activity, so that the genomic DNA full is constantly split.

Die Zusatzkomponente ist preiswert zu gewinnen, problemlos in der Anwendung, und sie bewirkt eine erhebliche Reduzierung der Enzymkosten bei wissenschaftlichen, klinischen, forensi­ schen oder anderen DNA/RNA-Untersuchungen, da die Aktivität der relativ teuren Enzyme besser genutzt werden kann.The additional component is inexpensive to win, easily in the application, and it causes a significant reduction the enzyme costs in scientific, clinical, forensi or other DNA / RNA studies, since the activity the relatively expensive enzymes can be better used.

Enzyme, bzw. Reaktionen, die durch die erfindungsgemäße Zu­ satzkomponente im Reaktionspuffer begünstigt werden, sind DNA-Restriktionsendonukleasen, insbesondere Typ-II-Restrik­ tionsendonukleasen, aber auch Typ-I-Restriktionsendonuklea­ sen, die komplexe DNA-Muster erkennen, oder auch Typ-III- Restriktionsendonukleasen, die außerhalb der Erkennungsse­ quenz schneiden. Also beispielsweise folgende Restriktionsendonuklea­ sen: Aac I, Aae I, Aat I, Aat II, Aca I, Acc I, Acc II, Acc III, Acy I, Afl I, Afl II, Afl III, Aha I, Aha II, Aha III, Aim I, Alu I, Ama I, Aor I, Aos I, Aos II, Apa I; Apy I, Aqu I, Asp AI, Ast AI, Asu I, Asu II, Asu III, Atu II, Atu AI, Atu BI, Atu BVI, Atu CI, Atu HAMI, Ava I, Ava II, Ava III, Avr I, Avr II, Bac I, Bal I, Bam FI, Bam HI, Bam KI, Bam NI, Bam Nx, Ban I, Ban II, Bam III, Bbe I, Bbe II, Bbe AI, Bbe AII, Bbi I, Bbi II, Bbi III, Bbi IV, Bbr I, Bbv SI, Bbv I, Bce 170, Bce 1229, Bce14579, Bce FI, Bce R, Bcl I, Bcn I, Bgl I, Bgl II, Bin I, Bin SI, Bin SII, Blo I, Blu I, Blu II, Bme I, Bme 205, Bme 899, Bpe I, Bpr I, Bpu I, Bsa PI, Bse I, Bse II, Bse PI, Bsm I, Bso PI, Bsp 1286, Bsp RI, Bsr HI, Bsr PI, Bsr PII, Bss CI, Bss GI, Bss GII, Bss HI, Bss HII, Bss PI, Bst I, Bst AI, Bsr CI, Bst EI, Bst EII, Bst EIII, Bst GI, Bst GII, Bst HI, Bst NI, Bst PI, Bst TI, Bst XI, Bst XII, Bsu 1076, Bsu 1114, Bsu 1145, Bsu 1192I, Bsu 1192II, Bsu 1193, Bsu 1247, Bsu A259, Bsu 6633, Bsu EII, Bsu FI, Bsu M, Bsu RI, Bth I, Bth II, Bvu I, Cal I, Cau I, Cau II, Cau III, Ccr I, Ccr II, Cfo I, Cfr I, Cfr 4I, Cfr 5I, Cfr 6I, Cfr 7I, Cfr 8I, Cfr 9I, Cfr 10I, Cfr 11I, Cfr 13I, Cfr 14I, Cfu I, Chi I, Chu I, Chu II, Cla I, Clm I, Clm II, Clt I, Clu I, Cpa I, Cpe I, Cpf I, Csc I, Cve I, Cvi I, Cvn I, Dde I, Dde II, Dds I, Dpn I, Dpn II, Dra I, Dra II, Dra III, Eae I, Eae PI, Eca I, Eca II, Ecc I, Ecl I, Ecl II, Eco A, Eco B, Eco DXI, Eco ICRI, Eco K, Eco PI, Eco P15, Eco RI, EcoRI(i), Eco RII, Eco RV, Eco 24I, Eco 25I, Eco 26I, Eco 27I, Eco 32I, Eco 35I, Eco 36I, Eco 38I, Eco 39I, Eco 40I, Eco 41I, Eco 47I, Eco 47II, Eco 47III, Eco 48I, Eco 49I, Eco 50I, Fdi I, Fdi II, Fnu 48I, Fnu 4HI, Fnu AI, Fnu AII, Fnu CI, Fnu DI, Fnu DII, Fnu DIII, Fnu EI, Fok I, Gdi I, Gdi II, Gdo I, Ggl I, Gin I, Gox I, Gsb I, Gsu I, Hae I, Hae II, Hae III, Hag I, Hap I, Hap II, Hga I, Hgi AI, Hgi BI, Hgi CI, Hgi CII, Hgi CIII, Hgi DI, Hgi DII, Hgi EI, Hgi EII, Hgi FI, Hgi GI, Hgi HI, Hgi HII, Hgi HIII, Hgi JI, Hgi JII, Hgi KI, Hha I, Hha II, Hhg I, Hin 173, Hin 1056I, Hin 1056II, Hin bIII, Hin cII, Hin dI, Hin dII, Hin dIII, Hin dIV, Hin eI, Hin fI, Hin fII, Hin fIII, Hin GUI, Hin GUII, Hin HI, Hin JCI, Hin JCII, Hin P₁I, Hin S₁I, Hin S₂, Hpa I, Hpa II, Hph I, Hsu I, Kpn I, Mae I, Mae II, Mae III, Mau I, Mbo I, Mbo II, Mbv I, Mgl I, Mgl II, Mki I, Mla I, Mlu I, Mni I, Mni II, Mnl I, Mnn I, Mnn II, Mnn III, Mnn IV, Mno I, Mno II, Mno III, Mos I, Mph I, Mra I, Msi I, Msi II, Msp I, Mst I, Mst II, Mth I, Mva I, Mvi I, Mvi II, Nae I, Nam I, Nar I, Nba I, Nbl I, Nbr I, Nca I, Nci I, Nco I, Ncu I, Nda I, Nde I, Nde II, Nfl I, Nfl II, Nfl III, Ngi III, Ngo I, Ngo II, Nla I, Nla II, Nla III, Nla IV, Nla SI, Nla SII, Nmi I, Nmu I, Nmu DI, Nmu EI, Nmu EII, Nmu FI, Nmu SI, Noc I, Nop I, Nop II, Not I, Nov I, Nov II, Nru I, Nsi I, Nsi AI, Nsi HI, Nsp (7524)I, Nsp (7524)II, Nsp (7524)III, Nsp (7524)IV, Nsp (7524)V, Nsp BI, Nsp BII, Nsp HI, Nsp HII, Nsu I, Nsu DI, Nun I, Nun II, Oxa I, Oxa II, Pae R7, Pai I, Pal I, Pan I, Pfa I, Pfl I, Pgl I, Pgl II, Pma I, Ppu I, Psp I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Rhe I, Rhp I, Rhp II, Rhs I, Rle I, Rlu I, Rme I, Rrb I, Rrh I, Rrh II, Rro I, Rsa I, Rsh I, Rsp I, Rsr I, Sac I, Sac II, Sac III, Sal I, Sal II, Sal PI, Sau I, Sau 3AI, Sau 96I, Sbo I, Sca I, Sci NI, Scr FI, Scu I, Sdu I, Sdy I, Sex I, Sex II, Sfa I, Sfa GUI, Sfa NI, Sfi I, Sfl I, Sfr I, Sga I, Sgo I, Sgr I, Shy I, Shy TI, Sin I, Sin MI, Sin MII, Ska I, Ska II, Sla I, Slu I, Sma I, Sna I, Sna BI, Sod I, Sod II, Spa I (Xho I), Spa I (Sph I), Sph I, Ssa I, Ssp I, Sst I, Sst II, Sst III, Sst IV, Stu I, Taq I, Taq II, Taq XI, Tfl I, Tgi I, Tha I, Tte I, Tth 111I, Tth 111II, Tth 111III, Tth HB8I, Ttn I, Ttr I, Vha I, Xam I, Xba I, Xho I, Xho II, Xma I, Xma II, Xma III, Xmn I, Xni I, Xor I, Xor II, Xpa I und analoge sowie isoschizomere Enzyme.Enzymes, or reactions, which are favored by the inventive set component in the reaction buffer are DNA restriction endonucleases, in particular type II restriction endonucleases, but also type I restriction endonucleases which recognize complex DNA patterns, or also type antibodies. III restriction endonucleases that cut outside of the recognition sequence. Thus, for example, the following restriction endonucleases: Aac I, Aae I, Aat I, Aat II, Aca I, Acc I, Acc II, Acc III, Acy I, Afl I, Afl II, Afl III, Aha I, Aha II, Aha III Aim I, Alu I, Ama I, Aor I, Aos I, Aos II, Apa I; Apy I, Aqu I, Asp AI, Ast AI, Asu I, Asu II, Asu III, Atu II, Atu AI, Atu BI, Atu BVI, Atu CI, Atu HAMI, Ava I, Ava II, Ava III, Avr I , Avr II, Bac I, Bal I, Bam FI, Bam HI, Bam KI, Bam NI, Bam Nx, Ban I, Ban II, Bam III, Bb I, Bb II, Bb AI, Bb AII, Bbi I, Bbi II, Bbi III, Bbi IV, Bbr I, Bbv SI, Bbv I, Bce 170, Bce 1229, Bce14579, Bce FI, Bce R, Bcl I, Bcn I, Bgl I, Bgl II, Bin I, Bin SI, Bin SII, Blo I, Blu I, Blu II, Bme I, Bme 205, Bme 899, Bpe I, Bpr I, Bpu I, Bsa PI, Bse I, Bse II, Bse PI, Bsm I, Bso PI, Bsp 1286, Ex: RI, Bsr HI, Bsr PI, Bsr PII, Bss CI, Bss GI, Bss GII, Bss HI, Bss HII, Bss PI, Bst I, Bst AI, Bsr CI, Bst EI, Bst EII, Bst EIII, Bst GI Bst GII Bst HI Bst NI Bst PI Bst TI Bst XI Bst XII Bsu 1076 Bsu 1114 Bsu 1145 Bsu 1192I Bsu 1192II Bsu 1193 Bsu 1247 Bsu A259 Bsu 6633 Bsu EII, Bsu FI, Bsu M, Bsu RI, Bth I, Bth II, Bvu I, Cal I, Cau I, Cau II, Cau III, Ccr I, Ccr II, Cfo I, Cfr I, Cfr 4I, Cfr 5I, Cfr 6I, Cfr 7I, Cfr 8I, Cfr 9I, Cfr 10I, Cfr 11I, Cfr 13I, Cfr 14I, Cfu I, Chi I, Chu I, Chu II, Cla I, Clm I, Clm II, Clt I, Clu I, Cpa I, Cpe I, Cpf I, Csc I, Cve I, Cvi I , Cvn I, Dde I, Dde II, Dds I, Dpn I, Dpn II, Dra I, Dra II, Dra III, Eae I, Eae PI, Eca I, Eca II, Ecc I, Ecl I, Ecl II, Eco A, Eco B, Eco DXI, Eco ICRI, Eco K, Eco PI, Eco P15, Eco RI, EcoRI (i) , Eco RII, Eco RV, Eco 24I, Eco 25I, Eco 26I, Eco 27I, Eco 32I, Eco 35I, Eco 36I, Eco 38I, Eco 39I, Eco 40I, Eco 41I, Eco 47I, Eco 47II, Eco 47III, Eco 48I, Eco 49I, Eco 50I, Fdi I, Fdi II, Fnu 48I, Fnu 4HI, Fnu AI, Fnu AII, Fnu CI, Fnu DI, Fnu DII, Fnu DIII, Fnu EI, Fok I, Gdi I, Gdi II, Gdo I, Ggl I, Gin I, Gox I, Gsb I, Gsu I, Hae I, Hae II , Hae III, Hag I, Hap I, Hap II, Hga I, Hgi AI, Hgi BI, Hgi CI, Hgi CII, Hgi CIII, Hgi DI, Hgi DII, Hgi EI, Hgi EII, Hgi FI, Hgi GI, Hgi HI, Hgi HII, Hgi HIII, Hgi JI, Hgi JII, Hgi KI, Hha I, Hha II, Hhg I, Hin 173, Hin 1056I, Hin 1056II, Hin bIII, Hin cII, Hin dI, Hin dII, Hin dIII, Hin dIV, Hin eI, Hin fI, Hin fII, Hin fIII, Hin G UI, Hin GUII, Hin HI, Hin JCI, Hin JCII, Hin P₁I, Hin S₁I, Hin S₂, Hpa I, Hpa II, Hph I, Hsu I, Kpn I, Mae I, Mae II, Mae III, Mau I, Mbo I, Mbo II, Mbv I, Mgl I, Mgl II, Mki I, Mla I, Mlu I, Mni I, Mni II, Mnl I, Mnn I, Mnn II, Mnn III, Mnn IV, Mno I, Mno II , Mno III, Mos I, Mph I, Mra I, Msi I, Msi II, Msp I, Mst I, Mst II, Mth I, Mva I, Mvi I, Mvi II, Nae I, Nam I, Nar I, Nba I, Nbl I, Nbr I, Nca I, Nci I, Nco I, Ncu I, Nda I, Nde I, Nde II, Nfl I, Nfl II, Nfl III, Ngi III, Ngo I, Ngo II, Nla I, Nla II, Nla III, Nla IV, Nla SI, Nla SII, Nmi I, Nmu I, Nmu DI, Nmu EI, Nmu EII, Nmu FI, Nmu SI, Noc I, Nop I, Nop II, Not I, Nov I , Nov II, Nru I, Nsi I, Nsi Al, Nsi HI, Nsp (7524) I, Nsp (7524) II, Nsp (7524) III, Nsp (7524) IV, Nsp (7524) V, Nsp BI, Nsp BII, Nsp HI, Nsp HII, Nsu I, Nsu DI, Nun I, Nun II, Oxa I, Oxa II, Pae R7, Pai I, Pal I, Pan I, Pfa I, Pfl I, Pgl I, Pgl II, Pma I, Ppu I, Psp I, Pst I, Pvu I, Pvu II, Rhe I, Rhp I, Rhp II, Rhs I, Rle I, Rlu I, Rme I, Rrb I, Rrh I, Rrh II , Rro I, Rsa I, Rsh I, Rsp I, Rsr I, Sac I, Sac II, Sac III, Sal I, Sal II, Sal PI, Sau I, Sau 3AI, Sau 96I, Sbo I, Sca I, Sci NI, Scr FI, Scu I, Sdu I, Sdy I, Sex I, Sex II, Sfa I, Sfa GUI, Sfa NI, Sfi I, Sfl I, Sfr I, Sga I, Sgo I, Sgr I, Shy I, Shy TI, Sin I, Sin MI, Sin MII, Ska I, Ska II, Sla I, Slu I, Sma I, Sna I, Sna BI, Sod I, Sod II, Spa I (Xho I), Spa I (Sph I), Sph I, Ssa I, Ssp I, Sst I, Sst II, Sst III, Sst IV, Stu I, Taq I, Taq II, Taq XI, Tfl I, Tgi I, Tha I, Tte I, Tth 111I , Tth IIIII, Tth IIIIII, Tth HB8I, Ttn I, Ttr I, Vha I, Xam I, Xba I, Xho I, Xho II, Xma I, Xma II, Xma III, Xmn I, Xni I, Xor I, Xor II, Xpa I and analogous and isoschizomere enzymes.

Bei allen bislang untersuchten Restriktionsendonukleasen wird eine Steigerung der Enzymaktivität festgestellt. Eine Inhi­ bierung der Reaktion durch die erfindungsgemäße Zusatzkompo­ nente war nie zu beobachten. Das Ausmaß der Aktivitätsstei­ gerung ist vom jeweiligen Enzym abhängig, wobei auch der Her­ steller eine Rolle spielt; gleiche Enzyme unterschiedlicher Hersteller werden durch die erfindungsgemäße Zusatzkomponente unterschiedlich aktiviert bzw. stabilisiert. Dies deutet da­ rauf hin, daß die Zusatzkomponente vermutlich in der Lage ist, Verunreinigungen in der Enzym- und/oder DNA-Präparation zu binden und zu komplexieren.For all restriction endonucleases investigated so far noted an increase in enzyme activity. An inhi bierung the reaction by the Zusatzkompo invention nente was never observed. The extent of activity depends on the particular enzyme, whereby the Her plays a role; same enzymes different Manufacturers are characterized by the additional component according to the invention activated or stabilized differently. This indicates there up, that the additive component is probably capable of  is, impurities in the enzyme and / or DNA preparation to bind and complex.

Weitere für die Zusatzkomponente geeignete Enzyme sind bspw: Ligasen, wie die T4-DNA-Ligase, E.coli. DNA-Ligase, etc.; RNAsen, wie RNAse A, RNAse P, RNAse H; Kinasen, wie die DNA-Polynukleotidkinase I, RNA-Polynukleotidkinase, T4 Poly­ nukleotidkinase, DNA- und RNA-Polymerasen, insbesondere Tem­ plate abhängige Polymerasen, wie die DNA-Polymerase I, Kle­ now-Fragment der DNA-Polymerase I, Taq-DNA-Polymerase, gen­ technisch modifizierte DNA-Polymerasen, wie Sequenase (Waren­ zeichen der Firma United States Biochemical Corp.), etc.; aber auch Template unabhängige Polymerasen, wie terminale Transferasen; Exonukleasen, wie Bal 31 Nuklease, DNAsen aus Pankreas; oder auch Topoisomerasen, wie die DNA-Topoisomerase I, etc.Further enzymes suitable for the additional component are, for example: Ligases, such as T4 DNA ligase, E. coli. DNA ligase, etc .; RNAses such as RNAse A, RNAse P, RNAse H; Kinases, like the DNA polynucleotide kinase I, RNA polynucleotide kinase, T4 poly nucleotide kinase, DNA and RNA polymerases, especially Tem plate-dependent polymerases, such as DNA polymerase I, Kle now fragment of DNA polymerase I, Taq DNA polymerase, gene technically modified DNA polymerases, such as Sequenase (Waren sign of the company United States Biochemical Corp.), etc .; but also template independent polymerases, such as terminal ones transferases; Exonucleases, such as Bal 31 nuclease, DNAsen Pancreas; or topoisomerases, such as DNA topoisomerase I, etc.

Geeignet sind auch Zusatzkomponenten, die aus Trockenmilch­ pulver, also getrockneter und entfetteter Milch bestehen. Geeignete Trockenmilchpräparate sind bspw. alle handelsüb­ lichen Milchpulver.Also suitable are additional components made from dried milk powder, ie dried and defatted milk. Suitable dry milk preparations are, for example, all commercial milk powder.

Besonders geeignet sind auch Zusatzkomponenten, die weit­ gehend aus Milcheiweiß bestehen. Dabei sind im wesentlich proteasen-, DNAsen- und RNAsen-freie Milcheiweißfraktionen bevorzugt.Particularly suitable are additional components that are far consisting of milk protein. It is essential protease, DNAsen and RNAsen-free milk protein fractions prefers.

Die gezielte Suche nach wirksamen Zusätzen aus der Milch of­ fenbarte, daß insbesondere die Caseine - alpha- und beta-Ca­ sein - der Milcheiweißfraktion hochwirksam und aktivitäts­ steigernd sind, während Lysozym und Lactalbumin nur geringe Wirkung besitzen.The targeted search for effective additives from the milk of showed that in particular the caseins - alpha and beta Ca Its highly effective and activity of milk protein fraction while lysozyme and lactalbumin are low Own effect.

Die Enzymaktivität in der Reaktionslösung wird verbessert, indem die erfindungsgemäße Zusatzkomponente zu einer wäß­ rigen Pufferlösung mit Enzym und Nukleotidsubstrat zugesetzt wird. Für die Steigerung und Stabilisierung der Enzymaktivi­ tät ist es dabei unerheblich, ob die erfindungsgemäße Zusatz­ komponente nachträglich oder gleichzeitig mit dem Enzym in die Reaktionsansätze gegeben wird oder ob die Zusatzkomponen­ te von Anfang an im Reaktionsansatz bzw. im Reaktionspuffer vorliegt.The enzyme activity in the reaction solution is improved, by the additional component according to the invention to an aqueous  added to the buffer solution with enzyme and nucleotide substrate becomes. For the increase and stabilization of enzyme activity it is irrelevant whether the addition of the invention component later or simultaneously with the enzyme in the reaction mixtures is given or whether the additional components te from the beginning in the reaction mixture or in the reaction buffer is present.

Nichtsdestoweniger sind Reaktionsansätze bevorzugt, in denen die erfindungsgemäße Zusatzkomponente in einer Menge von 1 bis 10 000 mg/L, vorzugsweise von 30 bis 3000 mg/L, und be­ sonders bevorzugt von 50 bis 300 mg/L, vorliegt. Die Menge der Zusatzkomponente kann dabei sowohl vom Enzym als vom Sub­ strat abhängen. Generell sind aber physiologisch ähnliche Be­ reiche bevorzugt, da bei diesen Bedingungen zumeist auch das Aktivitätsmaximum der Enzyme liegt. Bevorzugte Konzentratio­ nen der Zusatzkomponente in der Reaktionslösung bei der DNA- Restriktion: 1-1000 mg Casein/L, wobei 10-100 mg Casein­ /L besonders bevorzugt sind.Nevertheless, reaction mixtures are preferred in which the additional component according to the invention in an amount of 1 to 10 000 mg / L, preferably from 30 to 3000 mg / L, and be especially preferably from 50 to 300 mg / L. The amount the additional component can be both the enzyme and the sub strat. Generally, however, are physiologically similar Be rich preferred because under these conditions usually the Maximum activity of the enzymes is. Preferred Concentration of the additional component in the reaction solution in the DNA Restriction: 1-1000 mg casein / L, with 10-100 mg casein / L are particularly preferred.

Die obengenannte Zusatzkomponente wird erfindungsgemäß ver­ wendet, um die Aktivität der Enzyme in der Reaktionslösung zu verbessern und zu stabilisieren. Der aktivitätsverbessernde Zusatz ist dabei insbesondere vorteilhaft bei der enzymati­ schen Behandlung von Plasmid-DNA, Phagen-DNA sowie von geno­ mischer DNA aus Prokaryoten und Eukaryoten. Dabei ist der Reinigungsgrad der DNA unerheblich, d. h., die Zusatzkomponen­ te ist sowohl für im Handel erhältliche DNA als auch für selbst isolierte DNA geeignet.The abovementioned additional component is inventively ver applies to the activity of the enzymes in the reaction solution too improve and stabilize. The activity-improving Addition is particularly advantageous in the enzymati treatment of plasmid DNA, phage DNA and geno mix DNA from prokaryotes and eukaryotes. It is the Degree of purification of the DNA irrelevant, d. h., the additional components te is for both commercially available DNA and for self-isolated DNA suitable.

Die erfindungsgemäße Zusatzkomponente wird zur Reaktions­ lösung vorteilhafterweise in Form einer gebrauchsfertigen oder mehrfach konzentrierten Pufferlösung gegeben. Die Mehr­ fachkonzentration der Pufferlösung liegt dabei vorteilhafter­ weise zwischen 2fach und 25fach, wobei 3fach, 5fach und 10fach besonders bevorzugt sind. Aus Löslichkeitsgründen kann es bevorzugt sein, wenn die Zusatzkomponente und die Puffer/ Salz-Lösung in separaten Behältern gelagert und versandt wer­ den. Generell sind aber gebrauchsfertige bzw. mehrfachkonzen­ trierte Lösungen aus Puffer, Salz und Zusatzkomponente bevor­ zugt. Es versteht sich dabei von selbst, daß alle Lösungen sterilisiert bzw. sterilfiltriert sind und RNAse-frei herge­ stellt werden.The additional component according to the invention becomes the reaction solution advantageously in the form of a ready to use or multiply concentrated buffer solution. The more Special concentration of the buffer solution is more advantageous wise between 2fach and 25fach, whereby 3fach, 5fach and  10 times more preferred. For solubility reasons it is preferred that the additional component and the buffers / Salt solution stored in separate containers and shipped who the. In general, however, are ready to use or Mehrfachkonzen trated solutions of buffer, salt and additional component before Trains t. It goes without saying that all solutions sterilized or sterilized by filtration and RNase-free Herge be presented.

Bei der Zubereitung der gebrauchsfertigen oder mehrfachkon­ zentrierten Puffer/Reaktionslösung kann es vorteilhaft sein, noch schwache, die Enzymreaktion nicht störende Detergentien zuzusetzen, damit die erfindungsgemäße Zusatzkomponente bzw. die Milchproteine beim mehrfachen Einfrieren und Auf­ tauen der mehrfach konzentrierten Reaktionslösung nicht aus­ fallen. Aus gleichem Grund kann es auch vorteilhaft sein, der gebrauchsfertigen oder mehrfachkonzentrierten Puffer/Reak­ tionslösung Antigefriermittel, wie Glycerin, Glykol, etc. zuzusetzen.When preparing the ready-made or Mehrkonkon centered buffer / reaction solution may be advantageous still weak, the enzyme reaction non-interfering detergents add, so that the additional component of the invention or the milk proteins during multiple freezing and Auf Do not thaw the multiply concentrated reaction solution fall. For the same reason, it may also be advantageous, the ready to use or multiply concentrated buffer / reac antifreeze, such as glycerol, glycol, etc. add.

Die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäßen Zusatzkom­ ponente werden nun nachstehend anhand der Beispiele unter Bezugnahme auf die Abbildungen näher beschrieben. Es zeigen:The advantageous effects of Zusatzkom invention Components will now be described below with reference to the examples Reference to the figures described in more detail. Show it:

Fig. 1 die mit Ethidiumbromid angefärbten Restriktions­ fragmente der Lambda-DNA nach Hin dIII-Verdau in An- und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf einem 0,6%igen Agarosegel; Figure 1 shows the ethidium bromide stained restriction fragments of lambda DNA Hin dIII digestion in the presence and absence of the additional component of the invention and after gel electrophoretic separation on a 0.6% agarose gel.

Fig. 2 die mit Ethidiumbromid angefärbten Restriktions­ fragmente der Lambda-DNA nach Eco RI-Verdau in An- und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente und nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf einem 0,6%igen Agarosegel. Fig. 2 shows the ethidium bromide stained restriction fragments of lambda DNA by Eco RI digestion in the presence and absence of the additional component according to the invention and by gel electrophoretic separation on a 0.6% agarose gel.

Fig. 3 die Aktivitäten von Hin dIII beim Verdau von Lamb­ da-DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente; Figure 3 shows the activities of Hin dIII in the digestion of Lamb as DNA in the presence and absence of the additional component according to the invention.

Fig. 4 die Aktivitäten von Eco RI beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente; Figure 4 illustrates the activity of Eco RI in the digestion of lambda DNA in the presence and absence of the additional component according to the invention.

Fig. 5 die Aktivitäten von Pst I beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente; Figure 5 shows the activities at the Pst I digestion of lambda DNA in the presence and absence of the additional component according to the invention.

Fig. 6 die Aktivitäten von Bam HI beim Verdau von Lambda- DNA in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente. Fig. 6 shows the activities of Bam HI in the digestion of lambda DNA in the presence and absence of the additional component according to the invention.

Beispiel 1:Example 1:

5 × 1 µg Lambda-DNA (Medac GmbH/Hamburg) wurden in jeweils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl2, 1 mM β-Mercapto­ ethanol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit fol­ genden Mengen Restriktionsenzym Hin dIII (Boehringer/Mann­ heim): 0,125 U, 0,25 U, 0,5 U, 1,0 U und 2 U, verdaut. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von EDTA (Ethylendiamintetra­ acetat-Dinatriumsalz) gestoppt - die Endkonzentration in der Reaktionslösung betrug 25 mM EDTA - und die Reaktion bis zur Analyse bei 0°C auf Eis aufbewahrt. Die Reaktionslösung wurde dann mit Bromphenolblau gefärbter 30%iger Sucrose-Lösung versetzt, und ein 20 µl Aliquot der angefärbten Lösung auf ein 0,6%iges Ethididumbromid-Agarosegel mit TAE-Laufpuffer: 40 mM Tris-Acetat, pH 8,2; 1 mM EDTA; aufgeladen und elek­ trophoretisch (100 V; 2-3 h) aufgetrennt. Die DNA-Banden im Agarosegel wurden während der Auftrennung durch das anwesende Ethididumbromid (1 ug/ml) angefärbt und das Gel unter UV-Licht (254 nm) mit einem entsprechenden UV-Filter foto­ grafiert.5 × 1 μg lambda DNA (Medac GmbH / Hamburg) were incubated in 50 μl 1 × reaction buffer each (Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (37 ° C), 5 mM MgCl 2 , 1 mM β-mercaptoethanol) with 100 μg / ml casein at 37 ° C. for one hour with subsequent amounts of restriction enzyme Hin dIII (Boehringer / Mann heim): 0.125 U, 0.25 U, 0.5 U, 1, 0 U and 2 U, digested. Thereafter, the reaction was stopped by addition of EDTA (ethylenediaminetetra acetate disodium salt) - the final concentration in the reaction solution was 25 mM EDTA - and the reaction was stored on ice until analyzed at 0 ° C. The reaction solution was then treated with bromophenol blue colored 30% sucrose solution and a 20 μl aliquot of the stained solution on a 0.6% ethididium bromide agarose gel with TAE running buffer: 40 mM Tris-acetate, pH 8.2; 1mM EDTA; charged and elec trophoretisch (100 V, 2-3 h) separated. The DNA bands in the agarose gel were stained during separation by the present ethidide bromide (1 μg / ml) and the gel photographed under UV light (254 nm) with a corresponding UV filter.

Siehe Fig. 1: Die Spuren 7-11 zeigen Hin dIII-Restriktionen der Lambda-DNA, die in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zu­ satzkomponente erfolgt waren:See FIG. 1: Lanes 7-11 show Hin dIII restrictions of lambda DNA which were carried out in the presence of the additive component according to the invention:

Spurtrack Einheiten (U) Hin dIII/µg Lambda-DNAUnits (U) Hin dIII / μg lambda DNA 7|2,0 U7 | 2.0 U 88th 1,0 U1.0 U 99 0,5 U0,5 U 1010 0,25 U0.25 U

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zu­ satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Hin dIII ausreichen, um 1 ug Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spal­ ten; die Aktivität von Hin dIII ist also gegenüber Standard­ bedingungen - gemäß der Definition der Enzymeinheit - etwa verdoppelt.The experiment shows that in the presence of Zu Zu already sufficient 0.5 units Hin dIII to 1 μg lambda DNA completely within one hour to spal th; The activity of Hin dIII is thus compared to standard conditions - according to the definition of the enzyme unit - about doubled.

Vergleichsbeispiel 1:Comparative Example 1

5 ô 1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 1 in je­ weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl2, 1 mM β- Mercaptoethanol) ohne Zusatzkomponente eine Stunde bei 37°C mit Restriktionsenzym Hin dIII (Boehringer/Mannheim) verdaut und wie oben analysiert.5 × 1 μg of lambda DNA (Medac) were mixed analogously to Example 1 in each case 50 μl of 1 × reaction buffer (from Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (37 ° C.); 5 mM MgCl 2 , 1 mM β-mercaptoethanol) without additional component for one hour at 37 ° C with restriction enzyme Hin dIII (Boehringer / Mannheim) digested and analyzed as above.

Siehe Fig. 1: Die Spuren 1-5 zeigen verschiedene Hin dIII- Restriktionen der Lambda-DNA, bei denen keine Zusatzkompo­ nente in der Reaktionslösung vorlag. See Figure 1: Lanes 1-5 show various Hin dIII restrictions of lambda DNA in which no additional component was present in the reaction solution.

Spurtrack Einheiten (U) Hin dIII/µg Lambda-DNAUnits (U) Hin dIII / μg lambda DNA 1|2,0 U1 | 2.0 U 22 1,0 U1.0 U 33 0,5 U0,5 U 44 0,25 U0.25 U 55 0,125 U0.125 U

Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt.It was found a common enzyme activity.

Beispiel 2:Example 2:

5×1µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 1 in je­ weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl2, 1 mM β- Dithioerythritol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Eco RI (Boehrin­ ger/Mannheim) verdaut und wie oben (siehe Fig. 2) analy­ siert. Die Spuren 7-12 zeigen die entsprechenden Eco RI-Re­ striktionen der Lambda-DNA mit der Zusatzkomponente in der Reaktionslösung:5 × 1 μg lambda DNA (Medac) were in each case 50 μl of 1 × reaction buffer (from Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 (37 ° C.), 10 mM MgCl 2 , 1 mM β-dithioerythritol) with 100 ug / ml casein at 37 ° C for one hour with different amounts of restriction enzyme Eco RI (Boehringer ger / Mannheim) digested and as above (see Fig. 2) analysis Siert. Lanes 7-12 show the corresponding Eco RI Re strictions of lambda DNA with the additional component in the reaction solution:

Spurtrack Einheiten (U) Eco RI/µg Lambda-DNAUnits (U) Eco RI / μg lambda DNA 7|2,0 U7 | 2.0 U 88th 1,0 U1.0 U 99 0,5 U0,5 U 1010 0,25 U0.25 U 1111 0,125 U0.125 U 1212 0,0625 U0.0625 U

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zu­ satzkomponente bereits 0,25 Einheiten Eco RI ausreichen, um 1 ug Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Eco RI ist also gegenüber Standardbedingun­ gen - gemäß der Definition der Enzymeinheit - etwa vervier­ facht. The experiment shows that in the presence of Zu Zu 0.25 units of Eco RI is sufficient to produce 1 completely split lambda DNA within one hour; the activity of Eco RI is thus over Standardbedingun gen - according to the definition of the enzyme unit - about four kindled.  

Vergleichsbeispiel 2Comparative Example 2

5×1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 2 in je­ weils 50 µ1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl2, 1 mM β- Dithioerythritol) ohne erfindungsgemäße Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Eco RI (Boehringer/Mannheim) verdaut und wie oben (siehe Fig. 2) analysiert. Die Spuren 1-6 zeigen die entsprechenden Eco RI-Restriktionen der Lambda-DNA ohne Zusatzkomponente in der Reaktionslösung:5 × 1 μg of lambda DNA (Medac) were mixed in each case with 50 μl of reaction buffer (Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 (37 ° C.), 10 mM MgCl 2) 2 , 1 mM β-dithioerythritol) without additional component according to the invention at 37 ° C for one hour digested with various amounts of restriction enzyme Eco RI (Boehringer / Mannheim) and as above (see FIG. 2) analyzed. Lanes 1-6 show the corresponding Eco RI restrictions of the lambda DNA without additional component in the reaction solution:

Spurtrack Einheiten (U) Eco RI/µg Lambda-DNAUnits (U) Eco RI / μg lambda DNA 1|2,0 U1 | 2.0 U 22 1,0 U1.0 U 33 0,5 U0,5 U 44 0,25 U0.25 U 55 0,125 U0.125 U 66 0,0625 U0.0625 U

Beispiel 3:Example 3:

5×1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 1 in je­ weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl2, 1 mM β- Mercaptoethanol) mit 100 µg/ml Casein bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Bam HI (Boehrin­ ger/Mannheim): 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert (siehe Abb.: 5).5 × 1 μg of lambda DNA (Medac) were in each case 50 μl of 1 × reaction buffer (from Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (37 ° C.), 5 mM MgCl 2 , 1 mM β-mercaptoethanol) with 100 μg / ml casein at 37 ° C for one hour with various amounts of restriction enzyme Bam HI (Boehringer / Mannheim): 0.125 U; 0.25 U; 0.5 U; 1.0 U and 2.0 U; digested and analyzed as above (see Fig. 5).

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zu­ satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Bam HI ausreichen, um 1 ug Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Bam HI wurde durch die Zusatzkomponente also in etwa verdoppelt (siehe Abb.: 5). The experiment shows that in the presence of the kit component according to the invention already 0.5 units Bam HI sufficient to completely cleave 1 ug lambda DNA within one hour; the activity of Bam HI was thus approximately doubled by the additional component (see Fig. 5).

Vergleichsbeispiel 3.Comparative Example 3.

5 × 1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog dem Beispiel 3 in jeweils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 (37°C); 5 mM MgCl2, 1 mM β-Mercaptoethanol) ohne erfindungsgemäße Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Bam HI (Boehringer/Mannheim): 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert. Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt (siehe Abb.: 5).5 × 1 μg lambda DNA (Medac) were mixed analogously to Example 3 into 50 μl 1 × reaction buffer each (Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (37 ° C.), 5 mM MgCl 2 , 1 mM β-mercaptoethanol) without additional component according to the invention at 37 ° C. for one hour with various amounts of restriction enzyme Bam HI (Boehringer / Mannheim): 0.125 U; 0.25 U; 0.5 U; 1.0 U and 2.0 U; digested and analyzed as above. It was found a common enzyme activity (see Fig .: 5).

Beispiel 4:Example 4:

5 × 1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 1 in je­ weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl2, 1 mM β- Dithioerythritol) mit 100 µg/ml Casein; bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Pst I (Boehrin­ ger/Mannheim): 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert (siehe Abb.: 6).5 × 1 μg of lambda DNA (Medac) were mixed in each case with 50 μl of 1 × reaction buffer (from Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 (37 ° C.), 10 mM MgCl 2 , 1 mM β-dithioerythritol) with 100 μg / ml casein; at 37 ° C for one hour with different amounts of restriction enzyme Pst I (Boehrin ger / Mannheim): 0.125 U; 0.25 U; 0.5 U; 1.0 U and 2.0 U; digested and analyzed as above (see Fig. 6).

Der Versuch zeigt, daß in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zu­ satzkomponente bereits 0,5 Einheiten Pst I ausreichen, um 1 ug Lambda-DNA vollständig innerhalb einer Stunde zu spalten; die Aktivität von Pst I wurde durch die Zusatzkomponente also in etwa verdoppelt (siehe Abb.: 6).The experiment shows that in the presence of the kit component according to the invention already 0.5 units of Pst I are sufficient to completely cleave 1 ug lambda DNA within one hour; the activity of Pst I was approximately doubled by the additional component (see Fig. 6).

Vergleichsbeispiel 4:Comparative Example 4

5 × 1 µg Lambda-DNA (Medac) wurden analog Beispiel 4 in je­ weils 50 µl 1 × Reaktionspuffer (von Boehringer/Mannheim: 100 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 (37°C); 10 mM MgCl2, 1 mM β- Dithioerythritol) ohne erfindungsgemäßen Zusatzkomponente bei 37°C eine Stunde mit verschiedenen Mengen Restriktionsenzym Pst I (Boehringer/Mannheim): 0,125 U; 0,25 U; 0,5 U; 1,0 U und 2,0 U; verdaut und wie oben analysiert. Es wurde eine übliche Enzymaktivität festgestellt (Abb.: 6). 5 × 1 μg of lambda DNA (Medac) were mixed in each case with 50 μl of 1 × reaction buffer (from Boehringer / Mannheim: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 (37 ° C.), 10 mM MgCl 2 , 1 mM β-dithioerythritol) without additional component according to the invention at 37 ° C. for one hour with various amounts of restriction enzyme Pst I (Boehringer / Mannheim): 0.125 U; 0.25 U; 0.5 U; 1.0 U and 2.0 U; digested and analyzed as above. It was found a common enzyme activity ( Fig .: 6).

Vergleich der Enzymaktivitäten in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente:Comparison of enzyme activities in the presence and absence the additional component according to the invention:

Aus den jeweiligen Fotographien der verschiedenen DNA-Re­ striktionen in Gegenwart und Abwesenheit der erfindungsge­ mäßen Zusatzkomponenten (siehe Beispiele und Vergleichsbei­ spiele 1-4) wurde die Stärke der Lambda-DNA-Fragmente ermit­ telt und daraus jeweils der Anteil verdauter und unverdauter Lambda-DNA bei den verschiedenen Restriktionsversuchen be­ stimmt.From the respective photographs of the different DNA re strictures in the presence and absence of the erfindungsge according to additional components (see Examples and Vergleichsbei 1-4), the strength of the lambda DNA fragments was determined and from this the proportion of digested and undigested Lambda DNA in the various restriction experiments be Right.

Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 3 bis 6 dargestellt. Auf der Abszisse sind die Enzymeinheiten aufgetragen und auf der Ordinate der Prozentsatz der nach einer Stunde verdauten Lambda-DNA. Die unterbrochene Linie steht für Restriktionen in Gegenwart der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente (100 ug/ml Casein); die durchgezogene Linie für die zugehörigen Vergleichsbeispiele ohne die Zusatzkomponente.The results are shown in Figures 3 to 6. On the abscissa, the enzyme units are applied and on the ordinate the percentage of digested after one hour Lambda-DNA. The broken line represents restrictions in the presence of the additional component according to the invention (100 μg / ml Casein); the solid line for the associated Comparative Examples without the additional component.

Das Diagramm in Fig. 3 vergleicht die Aktivitäten von Hin dIII in Gegenwart (Beispiel 1) und Abwesenheit (Ver­ gleichsbeispiel 1) der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente.The diagram in FIG. 3 compares the activities of Hin dIII in the presence (Example 1) and absence (Comparative example 1) of the additional component according to the invention.

Das Diagramm in Fig. 4 vergleicht die Aktivitäten von Eco RI in Gegenwart (Beispiel 2) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 2) der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente.The diagram in FIG. 4 compares the activities of Eco RI in the presence (Example 2) and absence (Comparative Example 2) of the additional component according to the invention.

Das Diagramm in Fig. 5 vergleicht die Aktivitäten von Pst I in Gegenwart (Beispiel 3) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 3) der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente (das zugehörige Photo ist nicht gezeigt).The diagram in FIG. 5 compares the activities of Pst I in the presence (Example 3) and absence (Comparative Example 3) of the additional component according to the invention (the associated photo is not shown).

Das Diagramm in Fig. 6 vergleicht die Aktivitäten von Bam HI in Gegenwart (Beispiel 4) und Abwesenheit (Vergleichsbeispiel 4) der erfindungsgemäßen Zusatzkomponente (das zugehörige Photo ist nicht gezeigt). The diagram in FIG. 6 compares the activities of Bam HI in the presence (Example 4) and absence (Comparative Example 4) of the additional component according to the invention (the associated photo is not shown).

Die quantitative Bestimmung der DNA-Fragmente zeigt, daß ins­ besondere bei niederen Enzymkonzentrationen (siehe: Diagramme 3-4) eine besonders hohe Aktivierung und/oder Stabilisierung der Enzyme auftritt. Aus den Diagrammen ist auch ersichtlich, daß bei allen Konzentrationen eine - meist proportional - er­ höhte Enzymaktivität auftritt, so daß die vorteilhafte Wir­ kung der Zusatzkomponente vermutlich nicht allein auf einer Stabilisierung der Enzyme beruht, sondern zumindest teilweise auch auf einer positiven allosterischen Wirkung auf Enzym und/oder Substrat.The quantitative determination of the DNA fragments shows that ins especially at low enzyme concentrations (see: Diagrams 3-4) a particularly high activation and / or stabilization the enzymes occurs. It can also be seen from the diagrams that at all concentrations one - mostly proportional - he increased enzyme activity occurs, so that the beneficial We kung of the additional component probably not alone on one Stabilization of the enzymes is based, but at least partially also on a positive allosteric effect on enzyme and / or substrate.

Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die hier be­ schriebenen und erläuterten Ausführungsformen beschränkt, die lediglich Erläuterungen der nach diesseitiger Auffassung be­ sten Art der Verwirklichung der Erfindung darstellen, und die Modifikationen in der Reihenfolge, der Mengen und anderer De­ tails unterworfen sein können. Die Erfindung soll derartige Abänderungen, die innerhalb der durch die Ansprüche definier­ ten Bereiche und der Lehre liegen, umfassen.The invention is of course not on the here be described and explained embodiments, the merely explanations of the according to this view be represent the nature of the realization of the invention, and the Modifications in order, quantities, and others tails may be subject. The invention is intended to be such Amendments defined within the scope of the claims areas and teaching.

Claims (10)

1. Aktivität verbessernde Zusatzkomponente für Enzymreak­ tionen, deren Enzyme als Substrat nukleotidhaltige Moleküle, insbesondere Polynukleotide wie Desoxyribonukleinsäuren und Ribonukleinsäuren, haben, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente im wesentlichen aus Milch und/oder deren Bestandteilen oder Produkten derselben besteht. 1. activity-enhancing additive component for Enzymreak tions whose enzymes as a substrate nucleotide-containing molecules, in particular polynucleotides such as deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids, have, characterized in that the additional component consists essentially of milk and / or their components or products thereof. 2. Zusatzkomponente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß sie im wesentlichen aus Trockenmilchpulver besteht.2. Additional component according to claim 1, characterized gekennzeich net, that it consists essentially of dried milk powder. 3. Zusatzkomponente nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie im wesentlichen aus Milcheiweiß besteht.3. Additional component according to claim 1 or 2, characterized gekenn records that it consists essentially of milk protein. 4. Zusatzkomponente nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die sie im wesentlichen aus einer proteasen-, DNAsen- und RNAsen-freien Milcheiweißfraktion besteht.4. Additional component according to one of claims 1 to 3, characterized in that it consists essentially of a protease, DNAsen and RNAsen-free milk protein fraction consists. 5. Zusatzkomponente nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Casein ist.5. Additional component according to one of claims 1 to 4, characterized in that it is casein. 6. Enzymreaktionsverfahren mit einer die Aktivität des Enzyms verbessernden Zusatzkomponente nach einem der Ansprü­ che 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente einer wäßrigen Pufferlösung mit Enzym und nukleotidhaltigem Substrat zugesetzt wird.6. Enzyme reaction method with an activity of Enzyme-enhancing additive component according to one of the claims che 1 to 5, characterized in that the additional component an aqueous buffer solution containing enzyme and nucleotide-containing Substrate is added. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente in einer Menge von 1 bis 10 000 mg/L, vorzugsweise von 30 bis 3000 mg/L, und besonders bevorzugt von 50 bis 300 mg/L, zugesetzt wird.7. The method according to claim 6, characterized in that the additional component in an amount of 1 to 10 000 mg / L, preferably from 30 to 3000 mg / L, and more preferably from 50 to 300 mg / L. 8. Verwendung von Milch und/oder deren Bestandteilen oder Produkten als Zusatzkomponente zur Verbesserung der Aktivität von Enzymen, die als Substrat nukleotidhaltige Moleküle haben.8. Use of milk and / or its components or Products as an additional component to improve the activity of enzymes that act as substrate nucleotide-containing molecules to have. 9. Verwendung nach Anspruch 8 als Zusatzkomponente für eine gebrauchsfertige oder mehrfach konzentrierte Reak­ tionslösung, insbesondere Pufferlösung, für Enzymreaktionen. 9. Use according to claim 8 as an additional component for a ready to use or multiply concentrated reac tion solution, in particular buffer solution, for enzyme reactions.   10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusatzkomponente in der Pufferlösung durch Detergentien und/oder Antigefriermittel stabilisiert ist.10. Use according to claim 9, characterized in that the additional component in the buffer solution by detergents and / or antifreeze is stabilized.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996040899A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Materials and methods for digesting dna or rna using restriction endonucleases
US5792612A (en) * 1994-06-22 1998-08-11 Helsinki University Licensing, Ltd. Use of lipids to improve the polymerse chain reaction

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS ERMITTELT *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5792612A (en) * 1994-06-22 1998-08-11 Helsinki University Licensing, Ltd. Use of lipids to improve the polymerse chain reaction
WO1996040899A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Helsinki University Licensing Ltd. Oy Materials and methods for digesting dna or rna using restriction endonucleases

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