DE3935572A1 - METHOD FOR PEPTID SYNTHESIS AND SUPPORT FOR THIS - Google Patents

METHOD FOR PEPTID SYNTHESIS AND SUPPORT FOR THIS

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Abstract

The invention concerns a process for the fast and, where appropriate, simultaneous synthesis of peptides and suitable rod-like vehicles therefor.

Description

Proteine spielen eine entscheidende Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen: enzymatische Katalyse, Transport- und Speicherung, koordinierte Bewegung, mechanische Stützfunktion, Immunschutz, Nervenreizleitung und Kontrolle von Wachstum und Differenzierung. Proteine sind aufgebaut aus ein oder mehreren linearen Polypeptidketten. Ihre vielfältigen Funktionen bewirken sie durch dreidimensionale Faltung und Assoziation dieser Ketten. Faltung und 3D- Struktur ist determiniert durch die Aminosäureprimärsequenz der Ketten. Die Vielfalt an Proteinstrukturen in der Natur wird erzeugt durch Kombination von zwanzig Aminosäurebausteinen. Kurze Partialsequenzen (Oligopeptide) können zum gewissen Teil die lokale Struktur und Funktion dieser Sequenz im Gesamt­ proteinverband imitieren. Oligopeptide wiederum können durch chemische Synthese hergestellt werden. Synthetische Oligopeptide sind somit ein wichtiges Hilfs­ mittel bei der Strukturfunktionsanalyse von Proteinen.Proteins play a crucial role in practically all biological Processes: enzymatic catalysis, transport and storage, coordinated Movement, mechanical support, immune protection, nerve stimulation and Control growth and differentiation. Proteins are made up of one or several linear polypeptide chains. They have a variety of functions through three-dimensional folding and association of these chains. Folding and 3D Structure is determined by the primary amino acid sequence of the chains. The A variety of protein structures in nature is created by combining twenty amino acid building blocks. Short partial sequences (oligopeptides) can some of the local structure and function of this sequence as a whole imitate protein dressing. In turn, oligopeptides can be synthesized getting produced. Synthetic oligopeptides are therefore an important aid medium in the structural function analysis of proteins.

Aufgrund der Größe und Komplexität der Proteine werden für systematische Studien sehr viele Peptide gebraucht. Due to the size and complexity of the proteins are used for systematic studies very many peptides needed.  

  • A) Lokalisierung einer funktionellen Region innerhalb einer längeren Protein­ kette durch überlappende Peptide (vgl. M. Z. Atassi, Eur. J. Biol. 145, 1- 20 (1984); H. M. Geysen, R. H. Meloen, and S. J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998 (1984).A) Localization of a functional region within a longer protein chain by overlapping peptides (see M. Z. Atassi, Eur. J. Biol. 145, 1- 20 (1984); H.M. Geysen, R.H. Meloen, and S.J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 (1984).
  • B) Entschlüsselung der für die Funktion essentieller Aminosäure durch Substitutionsanalyse [vgl. R. A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5131 (1985); H. M. Geysen, R. H. Meloen, and S. J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 3998 (1984)].B) Deciphering the amino acid essential for the function Substitution analysis [cf. R. A. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5131 (1985); H.M. Geysen, R.H. Meloen, and S.J. Barteling, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3998 (1984)].

Biologische Testreaktionen wie enzymatische Umsetzung, Antikörperbindung etc. sind sehr sensitiv, so daß nur geringe Mengen (ng - µg) Peptidsubstrate ausreichen. Für eine schnelle, einfache Durchführung solcher Tests ist es vorteilhaft, daß das Peptidsubstrat an einem festen Trägermaterial immobilisiert ist und leicht aus der Reaktionslösung entfernt werden kann. Das Erfolgen einer Reaktion mit dem Peptid kann dann entweder in der verbleibenden Reaktionslösung oder durch nachfolgende Analyse des trägergebundenen Materials quantitative vermessen werden.Biological test reactions such as enzymatic conversion, antibody binding etc. are very sensitive, so that only small amounts (ng - µg) of peptide substrates suffice. It is for quick, easy execution of such tests advantageous that the peptide substrate immobilized on a solid support material is and can be easily removed from the reaction solution. Successful one Reaction with the peptide can then either be in the remaining reaction solution or by subsequent analysis of the carrier-bound material quantitative be measured.

Der Umfang mit dem solche systematischen Untersuchungen durchgeführt werden können, hängt im wesentlichen von der Schnelligkeit der Peptidsynthese und von der technischen Konzeption des Trägers ab. Im folgenden wird ein Verfahren beschrieben, mit dem vorteilhaft sehr viele (mehrere Hundert) immobilisierte Oligopeptide pro Arbeitstag in einer für Testzwecke ausreichenden Menge hergestellt werden können.The extent to which such systematic examinations are carried out depends essentially on the speed of peptide synthesis and the technical conception of the carrier. The following is a procedure with which many (several hundred) immobilized advantageously Oligopeptides per working day in an amount sufficient for test purposes can be produced.

Als Trägerelemente werden Stäbe aus geeignetem Material verwendet. Die Stäbe werden am oberen Ende mit einer Nummer versehen, welche die jeweils zu syn­ thetisierende Peptidsequenz bezeichnet. Die Stäbe bleiben mobil und können in ein geeignetes Gestell eingehängt werden. Die Löcher des Gestells sind vor­ zugsweise kompatibel mit der Anordnung von Löchern in einer Mikrotiterplatte. Gemäß einer speziellen Ausführungsform werden als Trägerelemente Glasrundstäbe (Durchmesser 4 mm, Länge 8 cm) mit einem runden und einem flachen Ende verwendet. Das runde Ende wird durch Sandpapier aufgerauht und stellt die Reaktionsfläche für die Peptidsynthese dar. Am anderen Ende wird eine Nummer befestigt. Es werden vorzugsweise zwei O-Ringe aus lösungsmittelresistentem Viton-Material aufgezogen im Abstand ca. 1 cm und ca. 5 cm vom oberen flachen Ende.Rods made of a suitable material are used as carrier elements. The bars are provided with a number at the top, which indicates the respective syn designated thetizing peptide sequence. The bars remain mobile and can be in a suitable rack can be attached. The holes in the frame are in front also compatible with the arrangement of holes in a microtiter plate. According to a special embodiment, glass round rods are used as carrier elements (Diameter 4 mm, length 8 cm) with a round and a flat end used. The round end is roughened by sandpaper and represents the Reaction area for peptide synthesis. At the other end there is a number attached. There are preferably two O-rings made of solvent-resistant Viton material pulled up at a distance of approx. 1 cm and approx. 5 cm from the upper flat The End.

Die Oberfläche der unteren Stäbchenspitzen wird chemisch so modifiziert, daß sie reaktive Funktionen für die kovalente Verankerung von Peptiden erhält. Eine einfache Beladung der Oberfläche mit solchen Funktionen ist ausreichend. Theoretisch kann bei einer Belegung von 1 Funktion je 100 A2 (Abstand = 10 A) bis zu 0,15 nmol pro cm2 erreicht werden. Es wird daher kein Pfropfpolymerisat zur Erhöhung der Funktionalität benötigt (vgl. Geysen et al. 1984). Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird die rauhe Oberfläche der Glasstabspitzen mit Aminopropylfunktionen beladen [vgl. R. H. Aebersold et al., Biochemistry 27, 6860-6867 (1988)]. Alle notwendigen Glasstäbe werden dazu mit dem rauhen Ende nach unten in ein geeignetes Gefäß gestellt (z. B. Becherglas) und den folgenden chemischen Reaktionen unterworfen.The surface of the lower rod tips is chemically modified so that it has reactive functions for the covalent anchoring of peptides. A simple loading of the surface with such functions is sufficient. Theoretically, with an assignment of 1 function per 100 A 2 (distance = 10 A) up to 0.15 nmol per cm 2 can be achieved. There is therefore no need for a graft polymer to increase the functionality (cf. Geysen et al. 1984). According to a special embodiment, the rough surface of the glass rod tips is loaded with aminopropyl functions [cf. RH Aebersold et al., Biochemistry 27, 6860-6867 (1988)]. All the necessary glass rods are placed with the rough end down in a suitable container (e.g. beaker) and subjected to the following chemical reactions.

  • 1. Reinigung durch Laugebehandlung (1 M NaOH über Nacht) Waschen mit Wasser und Aceton, Trocknen an der Luft1. Purification by lye treatment (1 M NaOH overnight) Wash with water and acetone, air dry
  • 2. Säureätzung (2 Stunden reine Trifluoressigsäure, TFA) Trocknen an der Luft2. Acid etching (2 hours pure trifluoroacetic acid, TFA) Air drying
  • 3. Aminopropylierung (2% Aminopropyltriethoxysilan in Wasser über Nacht) Waschen mit Wasser und Aceton, Trocknen an der Luft3. Aminopropylation (2% aminopropyltriethoxysilane in water overnight) Wash with water and acetone, air dry
  • 4. Festigung der Silanbindungen (45 Minuten bei 110°C).4. Strengthening of the silane bonds (45 minutes at 110 ° C).

Es werden so etwa 1 nmol Aminopropylgruppen pro Glasstab erzielt.About 1 nmol of aminopropyl groups per glass rod are thus achieved.

Die Peptide werden dann schrittweise und entsprechend der vorherbestimmten Sequenzen nach bekannten Festphasenpeptidsynthesemethoden (vgl. Merrifield, Wünsch Patent Simultane Peptidsynthese) an den Aminopropylankern aufgebaut. Vorzugsweise wird nach der Fmoc/tBu-Methode verfahren [C.-D. Chang, J. Meien­ hofer, 1978, Int. J. Peptide Protein Res. 11, 246; E. Atherton, H. Fox, D. Harkiss, C. J. Logan, R. C. Sheppard, B. J. Williams. 1978. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 537]. Neben den zwanzig essentiellen Aminosäuren können auch beliebige modifizierte und nicht natürliche Aminosäuren eingebaut werden.The peptides are then gradually and according to the predetermined Sequences according to known solid phase peptide synthesis methods (see Merrifield, Request patent simultaneous peptide synthesis) on the aminopropyl anchors. The Fmoc / tBu method is preferably used [C.-D. Chang, J. Meien hofer, 1978, Int. J. Peptide Protein Res. 11, 246; E. Atherton, H. Fox, D. Harkiss, C.J. Logan, R.C. Sheppard, B.J. Williams. 1978. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 537]. In addition to the twenty essential amino acids, any one can modified and non-natural amino acids are incorporated.

Die notwendigen Aminosäurebausteine (geeignet geschützte und aktivierte Amino­ säurederivate) werden als konzentrierte (0,1-0,3 M) Lösungen in einem geeigneten Lösungsmittel mit vorzugsweise hohem Siedepunkt und geringer Verdampfungsgeschwindigkeit (z. B. N-Methyl-Pyrrolidinon, Kp 203°C) in kleinen verschließbaren Gefäßen vorgegeben.The necessary amino acid building blocks (suitably protected and activated amino acid derivatives) are concentrated (0.1-0.3 M) solutions in one suitable solvent with preferably high boiling point and lower  Evaporation rate (e.g. N-methyl-pyrrolidinone, bp 203 ° C) in small closable vessels specified.

Die Verknüpfung von Aminosäuren zu Peptiden erfolgt schrittweise, beginnend mit dem C-terminalen Ende und parallel für viele Peptide durch zyklische Ausführung von jeweils den gleichen zwei Reaktionsschritten.The linking of amino acids to peptides takes place gradually, starting with the C-terminal end and in parallel for many peptides by cyclic execution of the same two reaction steps each.

  • 1. Peptidbindungsbildung: Die Stäbchenspitzen werden kurz in die entsprechende Lösung der aktivierten Aminosäure eingetaucht. Der an der Spitze verblei­ bende Lösungsfilm (ca. 5 µ1) benetzt die Oberfläche und bildet das Reaktionsvolumen (hängender Tropfen). Während der Reaktion wird das Stäbchen in ein geeignetes konisches Gefäß (z. B. blaue Eppendorfspitze) gestellt. Der untere O-Ring verschließt dabei das Gefäß. Reaktionszeit ist 10-30 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten. Danach werden die Stäbchen einzeln kurz mit Dimethylformamid (DMF) und Dichlormethan gewaschen (Spritzflasche), an der Luft getrocknet und in ein geeignetes Gestell nach Nummern sortiert eingehängt.1. Peptide bond formation: The rod tips are briefly in the corresponding Solution of the activated amino acid immersed. That remains at the top The solution film (approx. 5 µ1) wets the surface and forms it Reaction volume (hanging drop). During the reaction it will Stick in a suitable conical container (e.g. blue Eppendorf tip) posed. The lower O-ring closes the vessel. Response time is 10-30 minutes, preferably 20 minutes. Then the chopsticks individually briefly washed with dimethylformamide (DMF) and dichloromethane (Squeeze bottle), air-dried and placed in a suitable rack Sorted numbers sorted.
  • 2. Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe: Das Gestell mit den Stäbchen wird in eine kleine Wanne mit genügend Abspaltungslösung gestellt, so daß alle Stäbchenspitzen eintauchen. Bei vorzugsweiser Durchführung der Fmoc/tBu- Methode wird die Fmoc-Schutzgruppe mit 20% Piperidin in DMF abgespalten. Nach 2 Minuten wird das Gestell herausgenommen, die Stäbchen mit Dichlor­ methan gewaschen (Spritzflasche) und an der Luft getrocknet.2. Cleavage of the N-terminal protective group: The frame with the rods becomes placed in a small tub with enough cleavage solution so that everyone Dip the stick tips. If the Fmoc / tBu- Method, the Fmoc protective group is split off with 20% piperidine in DMF. After 2 minutes the rack is removed, the sticks with dichlor washed methane (squeeze bottle) and air dried.

Vorzugsweise kann als erste Aminosäure eine ε-(Fmoc-amino) Alkylcarbonsäure als Abstandshalter (Spacer) gekoppelt werden: z. B. ε-(Fmoc-amino)dodekansäure.A ε- (Fmoc-amino) alkylcarboxylic acid can preferably be used as the first amino acid Spacers can be coupled: z. B. ε- (Fmoc-amino) dodecanoic acid.

Sind alle Peptidsequenzen fertiggestellt, werden vorzugsweise die N-terminalen Aminogruppen durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid blockiert. Dazu werden die in das Gestell eingehängten Stäbchen gemeinsam für z. B. 3 Minuten in eine kleine Wanne mit Acetylierungslösung (z. B. 5% Essigsäureanhydrid, 5% Diiso­ propylethylamin in DMF) gestellt und danach mit DMF und Dichlormethan gewaschen (Spritzflasche).When all peptide sequences have been completed, the N-terminal ones are preferably Amino groups blocked by acetylation with acetic anhydride. To do this the chopsticks hooked into the frame together for z. B. 3 minutes in one small tub with acetylation solution (e.g. 5% acetic anhydride, 5% diiso propylethylamine in DMF) and then washed with DMF and dichloromethane (Squirt bottle).

Danach werden die Schutzgruppen an den Aminosäureseitenketten durch geeignete Säurebehandlung abgespalten. Dazu werden die in das Gestell eingehängten Stäbchen gemeinsam für z. B. 10 Minuten in Abspaltungslösung gestellt. Gemäß einer speziellen Ausführungsform unter Verwendung der Fmoc/Bu-Methode (siehe Liste der verwendeten Aminosäurederivate) wird z. B. 50% TFA, 5% Anisol, 1% Thioanisol in Dichlormethan verwendet. Danach werden die Stäbchen mit Dichlor­ methan gewaschen (Spritzflasche) und an der Luft getrocknet.The protective groups on the amino acid side chains are then replaced by suitable ones Split off acid treatment. To do this, hang those in the frame Chopsticks together for z. B. 10 minutes in cleavage solution. According to a special embodiment using the Fmoc / Bu method (see List of amino acid derivatives used) z. B. 50% TFA, 5% anisole, 1%  Thioanisole used in dichloromethane. Then the sticks with dichlor washed methane (squeeze bottle) and air dried.

Alle für die Synthese notwendigen Reaktionsbedingungen lassen die Verankerung der Peptide an der Glasoberfläche intakt, so daß die Peptide kovalent daran gebunden bleiben.All reaction conditions necessary for the synthesis leave the anchoring of the peptides on the glass surface are intact so that the peptides are covalently attached to them stay bound.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann auch vor der eigentlichen Peptidsyn­ these ein sog. Linkerreagenz (vgl. E. Atherton et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1981, 538-546) an die Trägerfunktionen geknüpft werden. Das wiederum daran aufgebaute Peptid kann dann entsprechend der chemischen Natur der Peptid- Linker-Bindung unter geeigneten Reaktionsbedingungen abgespalten werden.According to a special embodiment, the actual peptide syn these a so-called linker reagent (cf. E. Atherton et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1981, 538-546) can be linked to the carrier functions. That in turn peptide built on it can then, depending on the chemical nature of the peptide Linker bond are cleaved under suitable reaction conditions.

Verwendete Aminosäurederivate:Amino acid derivatives used:

ε-(Fmoc-Amino)dodecansäure (Spacer)
Fmoc A1a
Fmoc-Arg(Pmc)
Fmoc-Asn(Tmob)
Fmoc-Asp(OtBu)
Fmoc-Cys(Butthio)
Fmoc-Gln(Tmob)
Fmoc-Glu(OtBu)
Fmoc-Gly
Fmoc-His(Bum)
Fmoc-Ile
Fmoc-Leu
Fmoc-Lys(Boc)
Fmoc-Met
Fmoc-Phe
Fmoc-Pro
Fmoc-Ser(tBu)
Fmoc-Thr(tBu)
Fmoc-Trp
F moc-Tyr(tBu)
Fmoc-Valε- (Fmoc-amino) dodecanoic acid (spacer)
Fmoc A1a
Fmoc-Arg (Pmc)
Fmoc-Asn (Tmob)
Fmoc-Asp (OtBu)
Fmoc-Cys (Butthio)
Fmoc-Gln (Tmob)
Fmoc-Glu (OtBu)
Fmoc-Gly
Fmoc-His (Bum)
Fmoc-Ile
Fmoc-Leu
Fmoc-Lys (Boc)
Fmoc-Met
Fmoc-Phe
Fmoc-Pro
Fmoc-Ser (tBu)
Fmoc-Thr (tBu)
Fmoc-Trp
F moc-Tyr (tBu)
Fmoc-Val

Alle Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten (---) mit Ausnahme von (Butthio) an Cys können mit 50% TFA in Dichlormethan abgespalten werden. Die Butthio- Gruppe kann dann anschließend mit z. B. Dithiothreitol (DTT) oder Dithio­ erythritol (DTE) entfernt werden. Aktivierung der Aminosäurederivate erfolgt nach Standardmethoden, z. B. durch 1,5fachen Überschuß l-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 1,2fachen Überschuß Diisoproylcarbodiimid in N-Methylpyrrolidinon für eine Stunde.All protecting groups of the amino acid side chains (---) with the exception of (Butthio) Cys can be split off with 50% TFA in dichloromethane. The Butthio Group can then with z. B. dithiothreitol (DTT) or dithio erythritol (DTE) can be removed. Activation of the amino acid derivatives takes place according to standard methods, e.g. B. by 1.5 times excess l-hydroxybenzotriazole  (HOBt) and 1.2 times excess diisoproylcarbodiimide in N-methylpyrrolidinone for one hour.

Die so mit spezifischen Peptidsequenzen beladenen Trägerstäbe können nun in beliebiger, für den biologischen Test erforderlichen Anordnung in das Gestell eingehängt werden, so daß sie mit den Spitzen in die Löcher einer Mikrotiter­ platte reichen und für die Testreaktion zur Verfügung stehen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform werden die Peptide einzeln von Trägerstäbchen abge­ spalten und in löslicher Form zu Testzwecken eingesetzt.The support rods thus loaded with specific peptide sequences can now be in any arrangement in the rack required for the biological test be attached so that they tip into the holes of a microtiter plate and are available for the test reaction. According to one In a special embodiment, the peptides are removed individually from support rods split and used in soluble form for test purposes.

Das vorgestellte Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik (Geysen et at.) durch folgende vorteilhafte Merkmale:The method presented differs from the prior art (Geysen et at.) by the following advantageous features:

  • - Verwendung von mobilen, numerierten Trägerelementen (Stäben). Es müssen nur einmal für alle Peptide die notwendigen Lösungen aktivierter Derivate angesetzt werden. Die Stäbe werden entsprechend der zu synthetisierenden Sequenzen den Lösungen zugeführt. Das kann bei manueller Durchführung mit Hilfe einer übersichtlichen Liste schnell und sicher ausgeführt werden. Es entfällt das aufwendige und für jeden Synthesezyklus neu durchzuführenden Verteilen von Lösungen in entsprechende Reaktionsnäpfe bei fest­ installierten Stäben.- Use of mobile, numbered support elements (bars). To have to the necessary solutions of activated derivatives only once for all peptides be scheduled. The rods are made according to the one to be synthesized Sequences fed to the solutions. This can be done with manual execution Can be executed quickly and safely with the help of a clear list. It the elaborate process that has to be carried out for each synthesis cycle is eliminated Distribute solutions into appropriate reaction wells at fest installed rods.
  • - Einfache Belegung der Reaktionsfläche?- Easy assignment of the reaction area?
  • - Die Ausführung der Aminosäurekopplungsreaktion an den Trägerspitzen im hängenden Tropfen. Die dadurch möglichen extrem kleinen Reaktionsvolumina erlauben den Einsatz sehr hoher Konzentrationen an Aminsosäurederivaten und trotzdem sehr geringen Verbrauch an diesen teuren Chemikalien. Die hohen Konzentrationen und Überschüsse an Reagenzin über die umzusetzenden Funktionen am Träger erlauben wiederum sehr kurzen Reaktionszeiten. Dadurch können viel mehr Synthesezyklen pro Zeiteinheit durchgeführt werden.- The execution of the amino acid coupling reaction on the carrier tips in hanging drops. The extremely small reaction volumes possible as a result allow the use of very high concentrations of amino acid derivatives and nevertheless very low consumption of these expensive chemicals. The high Concentrations and excesses of reagent above those to be converted Functions on the carrier in turn allow very short reaction times. Thereby much more synthesis cycles can be performed per unit of time.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform.According to a special embodiment.

  • - Die einfache und billige Herstellung der Glasstäbe.- The simple and cheap manufacture of glass rods.
  • - Einfache und effiziente, in jedem Labor durchführbare Chemie zur Funktiona­ lisierung (Aminopropylierung) der Glasoberfläche.- Simple and efficient chemistry for the function that can be carried out in any laboratory lization (aminopropylation) of the glass surface.
Anwendungsbeispiel:Example of use:

Analyse eines immunogenen Teilabschnittes (CMV26) des 36/40 K-Proteins vom Cytomegalie Virus.Analysis of an immunogenic section (CMV26) of the 36/40 K protein from  Cytomegaly virus.

Abb. 1 Aminosäureprimärsequenz des clonierten, immunogenen Teilabschnittes CMV26. Davon abgeleitet wurden überlappende, um jeweils eine Aminosäure verschobene Dekapetidsequenzen. Fig. 1 Primary amino acid sequence of the cloned, immunogenic section CMV26. Overlapping decapeptide sequences shifted by one amino acid were derived from this.

Abb. 2 Liste aller zu synthetisierenden Dekapeptide mit der zugeordneten Numerierung und Vorschrift für die simultane, parallele Durchführung der Aminosäurekopplungen. Fig. 2 List of all decapeptides to be synthesized with the assigned numbering and instructions for the simultaneous, parallel implementation of the amino acid coupling.

Diese Peptide wurden nach oben beschriebenen Verfahren an Glasstäben syn­ thetisiert und die sequenzspezifische Bindung von anti-CMV26 Antikörpern in einem Kaninchenserum durch ELISA-Test nachgewiesen.These peptides were syn. Syn and the sequence-specific binding of anti-CMV26 antibodies in a rabbit serum detected by ELISA test.

Abb. 3 Schematische Darstellung des ELISA-Test. Die oberflächengebundenen Peptide (P) werden mit dem Kaninchen anti-CMV26 Serum inkubiert, überschüssiges Serum abgewaschen, und danach mit einem anti-Kaninchen Antikörper aus der Ziege, welcher kovalent mit dem Enzym β-Galactosidase verknüpft ist, inkubiert. Nur wenn die anti-CMV26 Antikörper das Peptid binden können, wird über den 2. Antikörper das Enzym gebunden. Dieses kann dann durch seine Aktivität bei der Spaltung von p-Nitrophenyl-β-galactosid in p-Nitrophenolat spektroskopisch nachgewiesen werden (Absorption bei der Wellenlänge 414 nm). Fig. 3 Schematic representation of the ELISA test. The surface-bound peptides (P) are incubated with the rabbit anti-CMV26 serum, excess serum washed off, and then incubated with an anti-rabbit antibody from goat, which is covalently linked to the enzyme β-galactosidase. Only if the anti-CMV26 antibodies can bind the peptide, the enzyme is bound via the 2nd antibody. This can then be detected spectroscopically by its activity during the cleavage of p-nitrophenyl-β-galactoside in p-nitrophenolate (absorption at the wavelength 414 nm).

Abb. 4 Graphische Darstellung der Testergebnisse. Die Peptide an den Glasstäben der Nummern 14-16 und 31-33 reagieren positiv. Vergleich ist: 53 = Dekaglycin,
54 = CMV26-βGalactosidase Fusionsprotein,
55 = Fusionsprotein ohne CMV26-Sequenz. Fig. 4 Graphical representation of the test results. The peptides on the glass rods of numbers 14-16 and 31-33 react positively. Comparison is: 53 = decaglycine,
54 = CMV26-βGalactosidase fusion protein,
55 = fusion protein without CMV26 sequence.

Claims (5)

1. Verfahren zur schnellen und gegebenenfalls simultanen Syn­ these von Peptiden, bei dem man von einem oder von mehreren funktionalisierten Trägern ausgeht und Schritt für Schritt ent­ sprechend den vorgegebenen Aminosäuresequenzen die gewünschten Peptide nach einem geeigneten Syntheseverfahren synthetisiert, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • - stäbchenförmige Träger verwendet,
  • - zur Kopplung die Träger mit ihrer Spitze kurz in eine Lösung der gewünschten Aminosäure oder des gewünschten Di- oder Oligopeptids in Form ihrer aktivierten Derivate eintaucht und
  • - die Kopplungsreaktionen mit Hilfe des (der) frei an den Trägerspitzen hängenden Lösungstropfens (Lösungstropfen) durchführt.
1. A method for the rapid and optionally simultaneous synthesis of peptides, in which one starts from one or more functionalized carriers and step by step according to the predetermined amino acid sequences, the desired peptides are synthesized according to a suitable synthesis process, characterized in that
  • - rod-shaped carriers used,
  • - For coupling, the tip of the carrier is briefly immersed in a solution of the desired amino acid or the desired di- or oligopeptide in the form of its activated derivatives and
  • - Carries out the coupling reactions with the help of the solution drop (solution drop) hanging freely on the carrier tips.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trägerspitze mit einer Fläche im Bereich von 0,01 bis 0,25 oder bis 1,0 cm2 mit der gewünschten Lösung in Berührung bringt.2. The method according to claim 1, characterized in that the carrier tip is brought into contact with the desired solution with an area in the range from 0.01 to 0.25 or to 1.0 cm 2 . 3. Stäbchenförmiger Träger, der zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial zumindest im Bereich der Trägerspitze auf physikalischem, beispielsweise auf mechanischem Wege, oder auf chemischem Wege, beispielsweise durch Ätzen, aufgerauht ist.3. Rod-shaped carrier that is used to carry out the method is suitable according to claim 1 or 2, characterized in that that the carrier material at least in the region of the carrier tip physically, for example mechanically, or  chemically roughened, for example by etching is. 4. Träger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fläche von 0,01 bis 0,25 cm2 oder bis 1,0 oder mehr aufgerauht ist.4. A carrier according to claim 3, characterized in that an area of 0.01 to 0.25 cm 2 or to 1.0 or more is roughened. 5. Träger nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Glas besteht.5. Carrier according to claim 3 or 4, characterized in that the carrier is made of glass.
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