DE3928769A1

DE3928769A1 - Use of pentosan:poly:sulphate and zinc - for inhibition of transformation of b-lymphocytes by Epstein-Barr viruses

Info

Publication number: DE3928769A1
Application number: DE19893928769
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr Med Kuebler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-08-31
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1991-03-14
Also published as: DE3928769C2

Abstract

Application of low mol.wt. polysaccharides (I), pref. pentosan polysulphate (Ia) of mol.wt. 4000-6000, to inhibit transformation of human or mammalian B-lymphocytes by Epstein-Barr virus in vitro at a concn. of 30-200 microg/ml in usual cell culture media is new. (Ia) can also prevent transformation in vivo when administered (as an infusion or other formulation) to maintain a serum level of 30-200 microg/ml. USE/ADVANTAGE - (I) are used in human or veterinary medicine control diseases (such as infectious mononucleosis, Burkitt lymphoma, Hodgkin disease, glomerulonephritis, nasopharyngeal carcinoma or AIDS), caused or promoted by EB virus. The treatment can be combined with admin. of zinc which (a) increases the effect of (I) and (b) restores the Zn level of the serum to its proper level (and thus restores cellular immune function). (I) are also effective against spuma viruses.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung sulfatierter Polysaccharide (sulfatierter Polyanionen), vorzugsweise als Pentose vorliegend, allein und in Kombination mit Zinkionen zur Inhibierung der Transformierung von humanen und tierischen B-Lymphocyten durch das Epstein- Barr-Virus sowie die Wiederherstellung zinkabhängiger zellulärer Immunfunktionen.The present invention relates to the application sulfated polysaccharides (sulfated polyanions), preferably as a pentose, alone and in Combination with zinc ions to inhibit transformation of human and animal B lymphocytes through the Epstein Barr virus as well as restoring zinc-dependent cellular immune functions.

Durch die europäische Patentanmeldung 8 73 00 282.8 des Herrn Ryuzo Ueno ist bekannt, daß natürliche oder synthetische Oligo- oder Polysaccharide, die wenigstens eine S-oxo-saure Gruppe am glykosilierten Kohlenstoffatom tragen, die Infektion von Säugetierzellen durch Retroviren inhibieren können.Through the European patent application 8 73 00 282.8 of Mr. Ryuzo Ueno is known to be natural or synthetic oligosaccharides or polysaccharides, at least an S-oxo-acidic group on the glycosylated carbon atom carry, the infection of mammalian cells by retroviruses can inhibit.

Es wird in der zitierten Patentschrift darauf hingewiesen, daß Dextransulfate mit einem Molekulargewicht kleiner als 10 000 gegen DNA-Viren so gut wie unwirksam seien.It is pointed out in the cited patent specification that dextran sulfates with a molecular weight less than 10,000 against DNA viruses are virtually ineffective.

Überraschenderweise stellte sich durch die nachfolgend beschriebene Versuchsanordnung nun heraus, daß Polysaccharide in Pentose-Form mit niedrigem Molekulargewicht (4000-6000 Dalton) vorliegend allein und in geeigneter Kombination mit Zinkionen die Epstein-Barr-Virus-spezifische Transformierung von humanen B-Lymphozyten weitgehend zu inhibieren vermochte. Daraus ergeben sich Möglichkeiten zur Prophylaxe und Therapie Epstein-Barr-Virus bedingter oder mitbedingter Erkrankungen wie: infektiöse Mononucleose, Burkitt-Lymphom, M. Hodgkin, Epstein-Barr-Virus bedingte Glomerulonephritis, Nasopharynxcarcinom, EBV-Mitbeteiligung beim Aids-Syndrom.Surprisingly, it turned out by the following experimental arrangement described now out that Low pentose form polysaccharides Molecular weight (4000-6000 daltons) alone and in a suitable combination with zinc ions the Epstein-Barr virus-specific transformation of was able to largely inhibit human B lymphocytes. This results in prophylaxis and options Therapy Epstein-Barr virus related or related Diseases such as: infectious mononucleosis, Burkitt's lymphoma, M. Hodgkin, Epstein-Barr virus-related glomerulonephritis, Nasopharynx carcinoma, EBV participation in AIDS syndrome.

Darüber hinaus wird gezeigt, wie durch geeigneten Zusatz von Zinkionen der sich bei Virusinfektionen einstellende zelluläre Serum-Zinkmangel, der die zellulären Immunfunktionen zusätzlich zu beeinträchtigen vermag, verhindern läßt und wie sich durch Zusetzen von Zinksalzen das Ausmaß der Inhibierung der EBV-induzierten Transformierung von B-Lymphozyten steuern läßt. Die gegebenen Beispiele sind nicht auf B-Lymphozyten limitiert, sondern gelten auch für andere Säugetierzellen. In addition, it is shown how by adding suitable Zinc ions that appear in viral infections cellular serum zinc deficiency affecting the cellular Can also impair immune functions, can be prevented and how by adding zinc salts the extent of inhibition of EBV-induced Control transformation of B lymphocytes. The examples given are not on B lymphocytes limited, but also apply to other mammalian cells.

Es kommt nach der Infektion des Organismus mit RNA- und DNA- Viren als Antwort auf die Entzündung oder Transformierung noch vor der Entwicklung des Vollbildes der Erkrankung zu einem rapiden Absinken des Serumzinkspiegels.It comes after infection of the organism with RNA and DNA Viruses in response to inflammation or transformation even before the development of the full screen of the disease a rapid decrease in the serum zinc level.

Einerseits ist dies gemäß der U. S. Patent Anmeldung 9 18 654 vom 14. Oktober 1986) ein biologisch wünschenswerter Effekt, der die weitere maligne Transformierung und Zellvermehrung vermeiden hilft (nachdem, wie in dieser Patentanmeldung beschrieben, Zinkkonzentrationen von 0,2 bis 0,6 mg/l (Zn++) nur schlechte Wachstumsbedingungen für transformierte Zellen bieten).On the one hand, this is according to the U.S. patent application 9 18 654 dated October 14, 1986) a biological desirable effect that further malignant Helps avoid transformation and cell proliferation (after, as described in this patent application, Zinc concentrations of 0.2 to 0.6 mg / l (Zn ++) only bad Provide growth conditions for transformed cells).

Andererseits sollte das Absinken der Serum-Zink- Konzentrationen im Interesse einer Erhaltung immunologischer und zellulärer Basisfunktionen nicht zu weit gehen.On the other hand, the decrease in serum zinc Concentrations in the interest of maintaining immunological and cellular basic functions don't go too far.

Hier sei darauf verweisen, daß das mononukleare Makrophagen- System einerseits zwar durch Reservoirfunktion zum Unterhalt der Infektion Anlaß gibt, andererseits aber durch eben diese Infektion selbst auch progredient zerstört wird.It should be pointed out here that the mononuclear macrophage System on the one hand through reservoir function for maintenance gives rise to the infection, but on the other hand through this Infection itself is also progressively destroyed.

Ein Zinkmangel im Intra- wie auch im Extrazellulärraum trägt dazu bei (Zink-Konzentrationen unter 0,7 mg/l Zn++ führen zum Verlust der Wanderungsfähigkeit der Granulozyten und der Herstellung von Antikörpern in B-Lymphocyten, siehe News Notes April 85: Annual Meeting of the American Association for the Advancement of Sciences, Los Angeles, May 26-31, 1985; De Pasquale-Jardieu, P et al. J. Nutrition, 114: 1762-1769 (1984) and Alcock, N. W. et al., Nutrition Res., Suppl. (1), pp. 244-250 (1985)). Zusätzlich ist bekannt, daß Zinkmangel im Körper eine rapide Thymusatrophie mit nachfolgender T- Helper-Zell-Schwäche induziert (De Pasquale-Jardieu, J. Nutr., 109 (11): 1847-1855, 1979), aber auch die T-Zell- abhängige B-Zell-Aktivierung bremst oder verhindert (Cunningham-Rundless, Effect of Zinc on human b cell activation, Fed Proc; 38 (3, part 2): 936, 1979).A zinc deficiency in both the intracellular and extracellular space contributes to this (zinc concentrations below 0.7 mg / l Zn ++ lead to the loss of the ability of the granulocytes to migrate and the production of antibodies in B lymphocytes, see News Notes April 85: Annual Meeting of the American Association for the Advancement of Sciences, Los Angeles, May 26-31, 1985; De Pasquale-Jardieu, P et al. J. Nutrition, 114: 1762-1769 (1984) and Alcock, N.W. et al., Nutrition Res., Suppl. (1), pp. 244-250 (1985)). In addition, it is known that zinc deficiency in Body has rapid thymic atrophy with subsequent T- Helper cell weakness induced (De Pasquale-Jardieu, J. Nutr., 109 (11): 1847-1855, 1979), but also the T cell dependent B-cell activation slows down or prevents (Cunningham-Rundless, Effect of Zinc on human b cell activation, Fed Proc; 38 (3, part 2): 936, 1979).

Es gilt somit einen Kompromiß zu finden, zwischen jenen Konzentrationen an zweiwertigem Zink, die sowohl zur Erhaltung biologischer Funktionen (vorzugsweise immunologischer), als auch zur Optimierung der die Transformierung inhibierenden Wirkung von sulf. Polysacchariden beitragen, und jenen Konz., die das maligne Wachstum (die maligne Transformierung) fördern würden.So there is a compromise to be found between them Concentrations of divalent zinc, which are used both for Preservation of biological functions (preferably immunological), as well as for optimization the transformation-inhibiting effect of sulf. Polysaccharides, and those conc. That malignant Would promote growth (the malignant transformation).

Der Darlegung dieses Kompromisses dient diese Patentschrift. This patent serves to explain this compromise.

Somit dient diese Patentanmeldung der Offenlegung eines Verfahrens zur Inhibierung der malignen Transformierung mittels Polysacchariden unter gleichzeitigem Erhalt von die Immunfunktionen der Zelle und des Organismus stärkenden Zink-Spiegeln (in Serum und Zelle), in einer Konzentration, die weder die Funktion der anionischen Polysaccharide stören, noch malignes Wachstum fördern.Thus, this patent application serves to disclose one Method for inhibiting malignant transformation using polysaccharides while maintaining the Immune cell and organism strengthening Zinc levels (in serum and cell), in a concentration, that do not interfere with the function of the anionic polysaccharides, promote malignant growth.

Experimental setup

Es wurden frische, menschliche B-Lymphocyten aus Vollblut zum Zwecke der anschließenden in vitro Transformation mit Epstein-Barr Viren gewonnen (in vivo können diese das bekannte Burkitt-Lymphom, aber auch ein Nasopharynx-Carcinom auslösen).Fresh human B-lymphocytes from whole blood were used Purposes of subsequent in vitro transformation with Epstein-Barr viruses obtained (in vivo they can do that known Burkitt lymphoma, but also a nasopharynx carcinoma trigger).

Zu diesem Zwecke wurden ca. 100 ml heparinisiertes Vollblut mit derselben Menge an phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) verdünnt und auf einen Ficollgradienten geladen.For this purpose, about 100 ml of heparinized whole blood with the same amount of phosphate buffered saline (PBS) diluted and loaded onto a Ficoll gradient.

Volumenverhältnis: Ficoll/PBS-Blutmischung: 3 Teile Ficoll: 4 Teile PBS/Blut.Volume ratio: Ficoll / PBS blood mixture: 3 parts Ficoll: 4 parts PBS / blood.

Anschließend wurde für ca. 45 min bei 400 × g zentrifugiert und die opaque-weißliche Zwischenbande (alle Lymphocyten enthaltend) vorsichtig mittels einer Pipette entnommen. Die Lymphocyten wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in Nährmedium (RPMI 1640 mit Zusatz von 10% FKS) aufgenommen.The mixture was then centrifuged at 400 × g for about 45 min and the opaque-white intermediate band (all lymphocytes containing) carefully removed using a pipette. The lymphocytes were washed twice with PBS and then in nutrient medium (RPMI 1640 with the addition of 10% FCS) added.

Konzentration der Zellen 1 × 10 hoch 5 Zellen pro ml.Concentration of cells 1 × 10 5 cells per ml.

Das Nährmedium enthielt neben dem fötalen Kälberserum noch zusätzlich 2 Mikrogramm/ml Cyclosporin A, um die Effektivität der Transformation zu erhöhen (zur Wirkung von Cyclosporin A: M. A. Anderson and J. F. Gusella: Use of Cyclospron A in establishing Epstein Barr virus transformed human lymphoblastoid cell lines, In Vitro 20, (1984), 856- 858).The nutrient medium contained next to the fetal Calf serum additionally 2 micrograms / ml cyclosporin A, to the To increase the effectiveness of the transformation (to the effect of Cyclosporin A: M.A. Anderson and J.F. Gusella: Use of Cyclospron A in establishing Epstein Barr virus transformed human lymphoblastoid cell lines, In Vitro 20, (1984), 856- 858).

Cyclosporin inhibiert die T-Lymphocyten, die die EBV- Transformation von B-Lymphocyten stören.Cyclosporin inhibits the T lymphocytes that Disrupt transformation of B lymphocytes.

Anschließend wurden die Zellen in Multischalen (48 Vertiefungen/Schale) in einer Konzentration von 10 hoch 5 Zellen pipettiert und die entsprechenden, die Transformation potentiell beeinflussenden Zusätze (nachfolgend) hinzugegeben.The cells were then placed in multi-dishes (48 Wells / bowl) in a concentration of 10 to the power of 5 Cells pipetted and the corresponding ones, the transformation potentially influencing additives (hereinafter) added.

Sodann wurde ein transformierender Überstand aus EBV- haltigem Zellkulturmedium (von der Zellinie B 95-6 stammend zu den Zellen gegeben (10 Vol.-%); anschließend wurde bei 37°C, 95 % rel. Luftfeuchte und 6% CO₂ inkubiert.A transforming supernatant from cell culture medium containing EBV (originating from cell line B 95-6) was then added to the cells (10% by volume), followed by incubation at 37 ° C., 95% relative atmospheric humidity and 6% CO ₂ .

Bei diesem Versuchsansatz gehen nicht transformierte B- Lymphocyten zugrunde, d. h. vermehren sich nicht, während transformierte Lymphocyten hinsichtlich des Wachstums die Oberhand über die abgestorbenen B-Lymphocyten gewinnen und sich potentiell unbegrenzt teilen.In this test approach, non-transformed B- Underlying lymphocytes, d. H. don't multiply while transformed lymphocytes for growth Gain the upper hand over the dead B-lymphocytes and potentially share indefinitely.

Dieser Vorgang wurde 22 Tage nach Beginn des Versuchs mit dem Umkehrmikroskop unter Beachtung folgender Kriterien ausgewertet:This process was started 22 days after the start of the experiment with the Reversing microscope considering the following criteria evaluated:

a) Visible clone growth per well
b) Size of the clones: from - / + when the clone is just visible up to ++++ for rapidly growing clones

Results

Kontroll-Ansatz: Ohne jeglichen Zusatz von Pentosanpolysulfat oder Zinksulfat wurde in allen 48 Schalen (48/48) nach 22 Tagen gut wachsende Klone registriert und die Größe der Klone mit ++++ bewertet.Control approach: Without any addition of pentosan polysulfate or zinc sulfate was in all 48 dishes (48/48) after 22 Days of growing clones registered and the size of the clones rated with ++++.

1. with the addition of 100.00 micrograms pentosan polysulfate / ml: 10 clones / in 48 wells (10/48), corresponding to 20.8% of the Control, size of the clones: - / +
2. with the addition of 60.00 micrograms pentosan sulfate / ml: 27 Clones / 48 wells (22/48), corresponding to 56.2% of the Control, Clone size: ++++
3. with the addition of 0.6 mg / l ZnSO 4 : 48 clones in 48 wells (48/48), corresponding to 100% of the control, size of the clones: ++++
4. with the addition of 2.1 mg / l ZnSO 4 : 48 clones / 48 wells, (48/48) corresponding to 100% of the control, size of the clones: ++++
5. with the addition of 4.0 mg / l ZnSO 4 : 48 clones / 48 wells (48/48), corresponding to 100% of the control, size of the clones: ++++
6. with the addition of 60.00 micrograms / ml pentosan sulfate plus 0.6 mg / l ZnSO 4 : 46 clones / 48 wells (46/48), corresponding to 95.8% of the control, size of the clones: +++
7. with the addition of 60.00 micrograms / ml pentosan sulfate plus 2.1 mg / l ZnSO 4 : 48 clones / 48 wells (48/48), corresponding to 100% of the control, size of the clones: ++++
8. with the addition of 60.00 micrograms / ml pentosan sulfate plus 4.0 mg / l ZnSO 4 : 48 clones / 48 wells (48/48), corresponding to 100% of the control, size of the clones: ++++
9. with the addition of 100.00 micrograms / ml pentosan sulfate plus 0.6 mg / l ZnSO 4 : 5 clones / 48 wells (5/48), corresponding to 10.4% of the control, size of the clones: - / +
10. with the addition of 100.00 micrograms / ml pentosan sulfate plus 2.1 mg / l ZnSO 4 : 30 clones / 48 wells (30/48), corresponding to 69.7%, size of the clones: +
11. with the addition of 100.00 micrograms / ml pentosan polysulfate plus 4.0 mg / l ZnSO 4 : 38 clones / 48 wells (38/48), corresponding to 79.1% of the control, size of the clones: ++

evaluation

Zunächst ist anzumerken, daß die Zahl der EBV-transformierten Zellen in der Kontrolle sehr gut war, d. h. in jeder Vertiefung fand sich wenigstens 1 Klon.First of all, it should be noted that the number of EBV-transformed Cells in the control was very good, d. H. in each At least 1 clone was found.

Pentosanpolysulfat inhibiert dosisabhängig die Transformierung von B-Lymphocyten, die maximal erreichte Inhibierung lag bei 20,8% (80% nicht transformierte Zellen).Pentosan polysulfate inhibits dose-dependent Transformation of B lymphocytes, the maximum reached Inhibition was 20.8% (80% untransformed cells).

Zinksulfat inhibierte in allen zugesetzten Konzentrationen die Transformierung in keiner Weise.Zinc sulfate inhibited in all added concentrations the transformation in no way.

In Kombination mit Pentosansulfat antagonisierte Zinksulfat dessen die Transformierung inhibierende Wirkung überraschenderweise dosisabhängig, ab einer Konzentration von ca. 0,6 mg/l Zinksulfat.Zinc sulfate antagonized in combination with pentosan sulfate the effect of which inhibits transformation surprisingly dose dependent, from a concentration of approx. 0.6 mg / l zinc sulfate.

Überraschenderweise wurde für diesen Konzentrationsgehalt von Zink in Kombination mit Pentosanpolysulfat die maximale Inhibierung der Transformierung von 10,4% (90% nicht transformierte Zellen) erreicht. Da bei dieser Kombination im Vergleich zum Einsatz von Pentosanpolysulfat allein nur die halbe Zahl an transformierten Klonen nachgewiesen wurde, handelt es sich um eine Zunahme Transformierungs-Inhibierung um 100 Prozent.Surprisingly, for this concentration level of zinc in combination with pentosan polysulfate the maximum Inhibition of 10.4% transformation (90% not transformed cells). Because with this combination in Compared to the use of pentosan polysulfate only that half the number of transformed clones was detected, it is an increase in transformation inhibition by 100 percent.

Somit sind Zinkionen in diesen Konzentrationen geeignet, die Transformations-inhibierende Wirkung des Pentosansulfates zu steigern und den durch die Infektion und die Transformierung bedingten Zinkmangel in einer die Wirkung von Polysacchariden nicht behindernden Weise auszugleichen, insbesondere nachdem sich die eine Stabilisierung des Immunsystems fordernden Zink-Spiegel in der Zelle und im Körper nicht von selbst einstellen, sondern es einer permanenten Zinkzufuhr im Falle einer chronisch viralen oder transformierenden viralen Infektion bedarf. Nachdem dies auch für den die weitere Transformierung inhibierenden Wirkstoff, die sulfatierten Polysaccharide gilt, sind fixe Stoffkombinationen zu therapeutischen Zwecken vorzuziehen. Dies ist auch für die Therapie der bisher problematischen chronisch-persistierenden Infektion mit Epstein Barr-Viren, sowie für das Burkitt-Lymphom und Nasopharynx-Carcinom bedeutsam. Darüber hinaus steht das Epstein-Barr-Virus im Verdacht, den M. Hodgkin und andere maligne Lymphome zumindest mitauszulösen. Die Bedeutung der Darlegungen für die klassische EBV- Erkrankung, die infektiöse Mononukleose erklärt sich von selbst.Zinc ions are therefore suitable in these concentrations which Transformation-inhibiting effect of the pentosan sulfate increase and that through infection and transformation zinc deficiency in an effect of polysaccharides non-obstructive ways, especially after which demand a stabilization of the immune system Zinc levels in the cell and in the body not by themselves adjust, but there is a permanent zinc supply in the case a chronically viral or transforming viral Infection needed. After this also for the further Transformation inhibiting drug, the sulfated polysaccharides are fixed Prefer combinations of substances for therapeutic purposes. This is also problematic for the therapy of hitherto chronic persistent infection with Epstein Barr viruses, as well as for Burkitt's lymphoma and nasopharynx carcinoma significant. In addition, the Epstein-Barr virus is in the Suspected M. Hodgkin and other malignant lymphomas at least to trigger. The importance of the explanations for the classic EBV Disease that explains infectious mononucleosis self.

Es wird in diesem Zusammenhang darauf verwiesen, daß die humanen B-Lymphozyten an ihrer Oberfläche einen Rezeptor tragen, der für Epstein Barr-Viren spezifisch ist und daß dieser sich vom Rezeptor für Retro-Viren unterscheidet (Lit.: Fingeroth J. D., Weiss, J. J., et al.: Epstein-Barr virus receptor of human B-lymphocytes is the C3d receptor CR2, Proc. Natl. Acad. of Sci USA 1984; 81: 4510-14.In this context, reference is made to the fact that the human B lymphocytes have a receptor on their surface wear that is specific to Epstein Barr viruses and that this differs from the receptor for retro viruses (Lit .: Fingeroth J.D., Weiss, J.J., et al .: Epstein-Barr virus receptor of human B-lymphocytes is the C3d receptor CR2, Proc. Natl. Acad. of Sci USA 1984; 81: 4510-14.

Claims

1. Use of low molecular weight polysaccharides, preferably pentosan polysulfate with a molecular weight of 4000-6000 daltons to inhibit the Transformation of human or mammalian B lymphocytes by Epstein-Barr viruses in vitro in a concentration from 30-200 micrograms / ml in a usual Cell culture medium.

2. Use of pentosan polysulfate, characterized by Claim 1 for inhibiting the transformation of human or mammalian B lymphocytes by Epstein-Barr viruses in vivo in the form of an infusion or other drug Presentation that is suitable for effective levels of 30- To achieve 200 micrograms / ml serum.

3. Use of polysaccharides according to claim 1 with 2 in human or veterinary field against by Epstein-Barr virus caused or promoted Diseases such as AIDS.

4. Reinforcement of the transformation by EB viruses preventive effect of polysaccharides in vitro and in vivo, in the human or veterinary field by adding zinc and / or its salts in one Concentration of 0.6 milligrams / l of a usual Cell culture medium or in the form of an infusion or other medication that is suitable in the Serum to build up those concentrations.

5. Control of a transformation by Epstein-Barr Virus-preventing behavior of pentosan polysulfate by zinc and / or its salts in concentrations of 6.0-4.0 milligrams of zinc / l of a usual Cell culture medium or serum.

6. Use of sulfated polysaccharides, preferably Pentosan polysulfates, in concentrations and combinations according to claims 1 to 5 against spuma viruses.